KR20110130841A

KR20110130841A - 신경 전구 세포의 증식 및 줄기세포능 개선용 조성물 및 신경 전구 세포의 증식 및 줄기세포능 개선 방법

Info

Publication number: KR20110130841A
Application number: KR1020100050365A
Authority: KR
Inventors: 김정환; 남수완; 최우봉; 김병우; 권현주; 최영현
Original assignee: 동의대학교 산학협력단
Priority date: 2010-05-28
Filing date: 2010-05-28
Publication date: 2011-12-06

Abstract

본 발명은 아스타잔틴을 유효 성분으로 포함하는 신경 전구 세포의 증식 및 줄기세포능을 개선하기 위한 조성물, 신경 전구 세포에 아스타잔틴을 처리하는 단계를 포함하는 신경 전구 세포의 증식 및 줄기세포능 개선 방법, 및 아스타잔틴으로 처리되어 증식 및 줄기세포능이 개선된 신경 전구 세포를 제공한다.

Description

신경 전구 세포의 증식 및 줄기세포능 개선용 조성물 및 신경 전구 세포의 증식 및 줄기세포능 개선 방법{Composition and method for improving proliferation and stem cell potency of neural progenitor cells}

본 발명은 신경 전구 세포(NPC)의 증식 및 줄기세포능 개선용 조성물 및 신경 전구 세포(NPC)의 증식 및 줄기세포능 개선 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 아스타잔틴을 유효 성분으로 포함하는 신경 전구 세포(NPC)의 증식 및 줄기세포능 개선용 조성물 및 아스타잔틴을 이용한 신경 전구 세포(NPC)의 증식 및 줄기세포능 개선 방법, 그리고 증식 개선을 통해 줄기세포능이 개선된 신경 전구 세포에 관한 것이다.

인간 배아 줄기세포는 증식 및 재생 능력이 뛰어나며 인간이 가지고 있는 모든 종류의 세포로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있어 현존하는 다양한 질병들을 치료할 수 있는 세포대체치료제의 가능성을 보여준다. 1998년 미국 톰슨 박사 연구팀에 의한 수정란 유래 인간 배아줄기세포가 세계 최초로 확립된 이래 전 세계적으로 수 백개의 인간 배아줄기세포주가 확립되어 있으며 현재에도 새로운 수정란 유래 인간 배아줄기세포주가 지속적으로 확립되고 있다. 인간 배아줄기세포 연구는 현재 지지세포 연구, 동물유래 인자를 배제한 배양조건 확립, 특정 세포로의 분화기술 등의 연구가 활발히 진행 중이다. 그러나 현재까지는 배아줄기세포가 가진 한계점 때문에 임상적인 접근이 어려운 것이 사실이다. 배아줄기세포는 배반포에서 추출하기 때문에 환자 본인으로부터 유래된 배아줄기세포를 얻을 수 없고 따라서 치료목적으로 사용시 면역거부반응이 일어나게 된다. 또한 배아 파괴가 불러온 생명윤리 논란을 피하기 위한 대안 마련이 필요하다. 현재 면역 문제해결을 위해 이른바 핵이식에 의한 맞춤형 줄기세포에 대한 연구가 이루어지고 있으나 아직 성공을 거두지 못하고 있으며, 면역 및 난자 취득의 윤리적 문제 해결을 위하여 줄기세포능의 개선을 유도하는 물질의 탐색 및 발굴을 통하여 자가세포치료제를 생산하려는 연구가 대안으로 시도되고 있다.

신경 전구 세포는 자기-재생하여 세포 집단의 증식을 야기할 수 있는 능력을 가지고 있어 큰 관심을 받고 있다. 신경 전구 세포는 또한 원하는 세포 유형으로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있으므로, 이러한 신경 전구 세포의 증식 능력을 개선함으로써 신경 전구 세포의 줄기세포능을 개선하여 신경 전구 세포를 다능성을 가진 줄기세포로 유도할 수 있다면 세포 대체 치료에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

한편, 카로티노이드 계통의 물질인 아스타잔틴(astaxanthin)(3,3'다이하이드록시-β,β-카로틴-4,4'다이온)은 조류, 버섯, 갑각류 등 많은 유기체로부터 얻어지는 자연계에 널리 분포되어 있는 색소로 활성산소 및 자유라디칼 제거능을 나타내며, 다른 카로티노이드계 색소와 비교하여 항산화 활성이 매우 높다. 아스타잔틴의 항산화 활성은 제아잔틴, 루테인, 칸타잔틴, β-카로틴보다 대략 10배 정도 강력하며, α-토코페롤보다는 100배 정도 강력하다고 보고된 바 있다. 아스타잔틴은 항산화제로서 그 응용범위는 실로 매우 넓다. 현재 보고된 바에 의하면 아스타잔틴은 연어의 육질을 높이는 색소로서 그리고 계란의 노른자위의 색소로서 산업적으로 응용되어 왔다. 이에 더하여 아스타잔틴은 면역 증강 및 항암 효과를 비롯한 여러 가지 중요한 생물학적 기능을 가지고 있으며, 심장병, 암, 그리고 위궤양에 좋은 효과를 나타내는 것으로 보고되었다.

본 발명자들은 신경 전구 세포의 줄기세포능을 개선하여 다능성을 가진 줄기세포로 유도할 수 있는 물질을 찾기 위하여 여러가지 후보 물질들을 조사하던 중 아스타잔틴이 신경 전구 세포의 증식을 증가시킴으로써 줄기세포능을 개선시킬 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 신경 전구 세포의 증식 및 줄기세포능을 개선하기 위한 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 신경 전구 세포의 증식 및 줄기세포능 개선 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 증식 개선을 통하여 줄기세포능이 개선된 신경 전구 세포를 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 일 태양에 따라, 본 발명은 아스타잔틴을 유효 성분으로 포함하는 신경 전구 세포의 증식 및 줄기세포능 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 마우스의 신경 전구 세포에 아스타잔틴을 처리한 결과, 신경 전구 세포의 콜로니 형성이 아스타잔틴 미처리 군에 비하여 크게 향상되며(도 2) 증식 관련 인자들(예를 들어, Rex1, CDK1, 및 CDK2)이 상향 조절되는 것을 확인하여(도 3) 아스타잔틴이 신경 전구 세포의 증식능력을 크게 개선시킴을 확인하였다. 또한, 증식 관련 인자들에 더하여, 줄기세포성(stemness) 유전자들(예를 들어, OCT4, SOX2, Nanog, 및 KLF4)의 발현이 증가됨을 확인하여 신경 전구 세포의 줄기세포능이 개선됨을 확인하였다(도 3). 또한 아스타잔틴 처리 결과, PI3K 및 그 다운스트림 매개자들인 p-Rac, p-c-Raf, p-MEK, p-ERK, p-Akt, p-mTOR, 및 p-Stat3이 활성화됨을 확인하였다.

이에 따라 본 발명은 아스타잔틴을 유효 성분으로 포함하는 신경 전구 세포의 증식 및 줄기세포능 개선용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 분리된 신경 전구 세포에 처리되어 신경 전구 세포의 증식을 개선하며, 이를 통하여 신경 전구 세포의 줄기세포능을 개선시켜 세포치료제로 사용될 수 있는 줄기 세포를 제공할 수 있도록 한다.

본 발명에 있어서, 줄기세포능이란 줄기세포의 증식능력과 분화능력을 포괄하는 의미이다.

본 발명 조성물의 유효 성분인 아스타잔틴(3,3'다이하이드록시-β,β-카로틴-4,4'다이온)은 시그마 케미컬스(Sigma Chemicals)(USA) 등과 같은 여러 상업적 공급원으로부터 입수가능하다.

본 발명의 조성물에 있어서 아스타잔틴의 함량은 0.001 내지 100 중량%이다.

다른 태양에 따라, 본 발명은 신경 전구 세포의 증식 및 줄기세포능을 개선시키는 방법을 제공한다.

본 방법은 신경 전구 세포에 아스타잔틴을 처리하는 단계를 포함한다. 아스타잔틴의 처리는 신경 전구 세포를 아스타잔틴과 접촉시키는 것으로서, 적절한 완충 용액내의 신경 전구 세포에 아스타잔틴을 처리하거나, 세포의 배양물에 아스타잔틴을 처리하거나, 세포의 배지에 아스타잔틴을 첨가하여 세포를 배양하는 방법 등에 의해 이루어질 수 있다.

신경 전구 세포의 증식과 줄기세포능은 아스타잔틴의 처리량 및 처리 시간에 의존적으로 개선되며, 본 방법에 있어서, 아스타잔틴의 처리량은 1 ng/ml 내지 100 ng/ml 범위가 바람직하며, 5 ng/ml 내지 50 ng/ml 범위가 보다 바람직하며, 10 ng/ml 내지 50 ng/ml 범위가 보다 더 바람직하며, 처리 시간은 1일 이상이 바람직하며, 3일 이상이 보다 바람직하다.

또 다른 태양에 따라, 본 발명은 아스타잔틴으로 처리되어 증식이 개선되고 줄기세포능이 개선된 신경 전구 세포를 제공한다.

증식 개선을 통해 줄기세포능이 개선된 이러한 신경 전구 세포는 면역반응 문제 및 윤리적 문제 없이 배아줄기세포를 대신하여 세포치료제로서 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명의 아스타잔틴을 유효 성분으로 포함하는 신경 전구 세포의 증식 및 줄기세포능 개선용 조성물 및 증식 및 줄기세포능 개선 방법은 신경 전구 세포의 증식 개선을 통하여 신경 전구 세포의 줄기세포능을 개선함으로써 신경 전구 세포를 줄기세포로 유도하여 기존의 배아 줄기세포를 대체하기 위한 줄기세포를 제공할 수 있도록 한다.

도 1은 아스타잔틴이 NPC에서 활발한 세포 증식을 유도함을 보여준다. 데이터는 피셔 테스트 또는 t-테스트를 이용하여 편차를 분석하여 분석하였다. (*P <0.05, **P <0.01).
도 2는 아스타잔틴이 NPC의 증식을 활발하게 자극함을 나타내는 CFU 분석을 보여준다. 데이터는 피셔 테스트 또는 t-테스트를 이용하여 편차를 분석하여 분석하였다. (*P <0.05, **P <0.01).
도 3은 아스타잔틴이 NPC에서 기능성 유전자와 줄기세포성 유전자 및 증식-관련 시그널 단백질의 활발한 발현을 유도함을 보여준다.
(a) 아스타잔틴은 증식-관련 전사 인자들 (Rex1, CDK1, 및 CDK2)의 상향 조절 및 줄기세포성 유전자 (OCT4, SOX2, Nanog, 및 KLF4)의 과발현을 유도한다.
(b) 아스타잔틴은 PI3K 및 그 다운스트림 매개자들, p-Rac, p-c-Raf, p-MEK, p-ERK, p-Akt, p-mTOR, 및 p-Stat3을 시간 의존적 방식으로 유의하게 활성화시킨다.
데이터는 피셔 테스트 또는 t-테스트를 이용하여 편차를 분석하여 분석하였다. (*P <0.05, **P <0.01).
도 4는 아스타잔틴이 PI3K와 MEK 시그널링 경로를 통하여 NPC의 증식을 유도함을 보여준다.
(a) PI3K와 MEK 억제는 아스타잔틴-처리 NPC에서 세포 성장을 억제한다.
(b) LY294002는 PI3K, p-Rac, p-c-Raf, p-MEK, p-ERK, p-Akt, p-mTOR, 및 p-Stat3 단백질의 하향조절을 유도한다.
(c) PD98059는 p-MEK, p-ERK, 및 p-Stat3의 감소를 유도한다.
(d) PD98059는 증식-관련 전사 인자 (Rex1, CDK1, 및 CDK2) 및 줄기세포성 유전자 (OCT4, SOX2, Nanog, 및 KLF4)의 하향조절을 야기한다.
데이터는 피셔 테스트 또는 t-테스트를 이용하여 편차를 분석하여 분석하였다. (*P <0.05, **P <0.01).

이하에서는, 실험예에 의해 아스타잔틴의 신경 전구 세포의 증식 및 줄기세포능 개선 효과를 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실험예는 오직 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실험예에 국한되지 않는다는 것은 당업자에게 있어서 자명하다.

실험예 1. 마우스 신경 전구 세포 (NPC) 배양

NPC의 제조를 위하여, 0.9% 멸균 식염수 중의 펜토바르비탈을 이용하여 마우스를 깊이 마취시키고 단두술에 의해 죽였다. NPC를 얻기 위하여, 마우스의 전체 경부 팽대(complete cervical enlargement)를 잘라냈다. 조직을 잘게 자르고, 멸균 둘베코 인산염 완충 염수(Dulbecco's phosphate buffered saline, DPBS)에서 세척하고 37 ℃에서 30분 동안 행크스 조절 염 용액(Hank's balanced salt solution, HBSS) 중의 0.125% 트립신, Dnase(0.01%, 시그마)의 용액에서 분해시켰다. 무혈청 성장 배지를 함유한 배양 디쉬로 세포를 옮겼으며, 상기 배지는 B27 보충물, bFGF (20 ng/ml), 및 EGF (20 ng/ml)를 가진 NB 배지로 이루어졌다.

실험예 2. NPC에서 아스타잔틴의 처리 및 세포 생존능의 분석

배양된 NPC를 5 x 10⁵의밀도로 10-cm 디쉬에 접종하고 CO₂인큐베이터에서 37 ℃에서 NB 배지에서 배양하였다. 이어서 3일 동안 세포를 다양한 농도의 아스타잔틴(1, 5, 및 10 ng/ml)으로 처리하였다. 트리판 블루 배제와 함께 시각적인 세포 계수에 의해 세포 생존능을 평가하였다. 모든 생존능 분석에서, 각 조건에 대하여 세 벌의 웰을 사용하였으며, 각 실험은 적어도 3회 반복하였다.

실험 결과, 3일 동안 투여된 아스타잔틴은 투여량-의존 및 시간-의존 방식으로 NPC의 증식을 유의하게 증가시켰다. 특히, 3일 동안 투여된 10 ng/ml 아스타잔틴은 NPC의 최고의 증식을 보여주었다(도 1).

실험예 3. 콜로니 -형성 세포( CFU ) 분석

아스타잔틴-처리된 세포에서 콜로니-형성 유닛(CFU)의 증식 효율을 평가하였다. CFU는 단일 세포 집단이므로, CFU 값의 증가는 아스타잔틴이 NPC의 증식을 활발하게 자극할 수 있음을 보여준다. 배양된 NPC를 5 x 10⁵의 밀도로 10-cm 디쉬에 접종하고 CO₂인큐베이터에서 37℃에서 NB 배지에서 배양하였다. 이어서 세포를 3일 동안 아스타잔틴(10 ng/ml)로 처리하였다. CFU 분석을 위하여, 대조 NPC 및 아스타잔틴-처리된 NPC를 2 x 10²의 밀도로 10-cm 디쉬에 접종하고 CO₂ 인큐베이터에서 37℃에서 NB 배지에서 배양하였다. 15일 후, 세포를 실온에서 30분 동안 4% 파라포름알데히드(PFA)로 고정하고 1% PFA 중의 0.1% 톨루이딘 블루로 염색하였다. CFU의 증식 효율을 시각적 콜로니 계수에 의해 평가하였다. 그 결과, 도 2에 나타난 바처럼, 아스타잔틴-처리된 NPC는 대조 NPC에 비하여 콜로니 형성 증가를 나타냈다. 특히, 10 ng/ml 아스타잔틴-처리된 NPC는 콜로니 형성에서 약 2 배 증가를 가졌다(도 2).

실험예 4. RNA 추출 및 RT- PCR ( 역전사 폴리머라제 연쇄 반응)

아스타잔틴 처리된 NPC로부터 전체 세포 RNA를 트리졸(Trizol) (라이프 테크놀로지스(Life Technologies), Frederick, MA)로 추출하였다. RNA의 농도를 분광광도계로 결정하였으며 농도와 완전성은 아가로즈 젤 전기영동에 의해 추가로 체크하였다. 있을 경우, 잔여 DNA는 DNase I(RNase-free, 다카라 바이오 인크.(Takara Bio Inc), Kyoto, Japan)를 이용하여 샘플로부터 제거하였다. 증식-관련 전사 인자들 및 줄기세포성 유전자들 각각을 위하여 20 pM의 특이적 프라이머를 이용한 PCR 35 사이클(94 ℃, 1 min; 55 ℃, 1 min; 72℃, 1 min)에 의해 증폭된 올리고-dT 프라이머를 이용하여 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭을 실시하였다. PCR 효율의 평가를 위해 그리고 1.5% 아가로즈 젤 전기영동에 의한 후속 분석을 위해 대조구로서 프라이머 디자인된 GAPDH를 이용하여 두벌의 PCR 반응물을 증폭시켰다. PCR 생성물을 에티듐 브로마이드로 염색하였다.

그 결과, 도 3a에 나타난 바처럼, 3일 동안 10 ng/ml의 아스타잔틴을 처리한 결과 증식-관련 전사 인자들(Rex1, CDK1, 및 CDK2)의 상향조절, 및 줄기세포성 유전자들 (OCT4, SOX2, Nanog, 및 KLF4)의 과발현을 유도하였다. 특히, Rex1 발현은 아스타잔틴-처리 세포에서 주목할만하게 증가하였다. 이 결과는 Rex1 발현이 NPC의 증식과 밀접하게 관련됨을 보여준다. 이 결과는 Rex1 발현이 지방 조직 스트로마 세포의 증식과 관련된다는 이전의 연구와 일치한다. 이러한 결과는 아스타잔틴이 NPC에서 활발한 세포 증식을 유도하며 줄기세포성 작용 시그널을 통해 줄기 세포능을 개선함을 명확히 보여주었다.

실험예 5. 웨스턴 블롯 분석

배양된 NPC에서 아스타잔틴 (10 ng/ml) 처리 후 차등적으로 발현된 단백질의 확인을 위해, 대조군 NPC 및 아스타잔틴-처리된 NPC를 500 ㎕의 용해 버퍼 (20 mM Tris-HCl [pH 7.5], 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 2.5 mM 소듐 파이로포스페이트, 1 mM EGTA, 1 mM 글리세로포스페이트, 1 mM Na₃VO₄, 및 1 mM PMSF)에서 용해시켰다. 10분 동안 15,000 x g에서 원심분리하여 용해물을 청정화시키고 전체 단백질 함량을 바이오-라드(Bio-Rad)(Millan, Italy) 단백질 분석 키트에 의해 결정하였다. 웨스턴 블롯팅을 위해, 용해 버퍼 중의 동량(40 ㎍)의 단백질 추출물을 10% SDS-PAGE 분석하고 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼다. 이어서, 항-PI3K (1:1000, 셀 시그널링(Cell Signaling)), 항-p-Rac(1:1000, 셀 시그널링), 항-p-c-Raf(1:1000, 셀 시그널링), 항-p-MEK (1:1000, 셀 시그널링), 항-p-ERK (1:1000, 셀 시그널링), 항-p-Stat3 (1:1000, 셀 시그널링), 항-p-Akt(1:1000, 셀 시그널링), p-mTOR(1:1000, 셀 시그널링) 및 항-β-액틴 (1:500, 시그마) 항체를 막과 항온처리하였다. 상대적인 밴드 강도를 콸리티-원(Quality-one) 1-D 분석 소프트웨어(바이오-라드, USA)에 의해 결정하였다.

도 3b는 상이한 시간 동안 아스타잔틴으로 처리한 NPC에서의 웨스턴 블롯 결과를 보여주며, 아스타잔틴은 PI3K 및 그 다운스트림 매개자들, p-Rac, p-c-Raf, p-MEK, p-ERK, p-Akt, p-mTOR, 및 p-Stat3을 시간 의존적 방식으로 유의하게 활성화시켰다.

실험예 6. 아스타잔틴 -처리 NPC의 세포 성장 조절과 PI3K 및 MEK 시그널링 경로의 관련성 확인

아스타잔틴-처리된 NPC의 세포 성장의 조절에서 PI3K와 MEK 시그널링 경로가 관련되는지 여부를 확인하기 위하여, 세포를 5 x 10⁵의 밀도로 10-cm 디쉬에 접종하고 CO₂인큐베이터에서 37℃에서 NB 배지에서 배양하였다. 이어서 세포를 1일 동안 아스타잔틴(10 ng/ml)로 처리하였다. 아스타잔틴으로 처리한 NPC를 PI3K 억제제 LY294002 (10 μM; 프로메가(Promega), Madison, WI), MEK 억제제 PD98059(10 μM; 시그마, Mo., USA)로 처리하거나, 처리하지 않고 두었다. 처리 후, 아스타잔틴-처리 NPC의 상대적인 세포 증식을 트리판 블루 배제에 의해 평가하였으며, 그 결과는 도 4a에 나타난다. 도 4a에서 확인되는 바와 같이, PI3K 및 MEK 억제제는 아스타잔틴-처리된 NPC에서 세포 성장의 억제를 야기하는 것으로 나타났다. 또한, 웨스턴 블롯 분석 결과, LY294002는 PI3K, p-Rac, p-c-Raf, p-MEK, p-ERK, p-Akt, p-mTOR, 및 p-Stat3 단백질의 하향조절을 상당히 유도하였으며(도 4b), PD98059는 p-MEK, p-ERK, 및 p-Stat3 단백질의 감소를 상당히 유도하였다(도 4c). RT-PCR의 결과도 PD98059가 증식-관련 전사 인자들(Rex1, CDK1, 및 CDK2) 및 줄기세포성 유전자들(OCT4, SOX2, Nanog, 및 KLF4)의 하향조절을 유도함을 보여주었다(도 4d). 이러한 결과들은 아스타잔틴이 PI3K 및 MEK 시그널링 경로의 활성화를 통해 NPC의 증식을 유도함을 명확히 보여준다.

Claims

아스타잔틴을 유효 성분으로 포함하는 신경 전구 세포의 증식 및 줄기세포능 개선용 조성물.
제1항에 있어서, 아스타잔틴의 함량은 0.001 내지 100 중량%인 조성물.
신경 전구 세포에 아스타잔틴을 처리하는 단계를 포함하는 신경 전구 세포의 증식 및 줄기세포능을 개선시키는 방법.
제3항에 있어서, 아스타잔틴의 처리량은 1 ng/ml 내지 100 ng/ml 범위인 방법.
제4항에 있어서, 아스타잔틴의 처리량은 5 ng/ml 내지 50 ng/ml 범위인 방법.
제5항에 있어서, 아스타잔틴의 처리량은 10 ng/ml 내지 50 ng/ml 범위인 방법.
제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 아스타잔틴의 처리 시간은 1일 이상인 방법.
제7항에 있어서, 아스타잔틴의 처리 시간은 3일 이상인 방법.
아스타잔틴으로 처리되어 증식 및 줄기세포능이 개선된 신경 전구 세포.