CN105061615B - 一种具有抗病毒和增强免疫活性的侧柏叶多糖及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有抗病毒和增强免疫活性的侧柏叶多糖及其制备方法。本发明公开的侧柏叶多糖是由侧柏叶主要经过热水浸提、Savege法除蛋白、乙醇沉淀、离子交换柱层析分离纯化后获得。本发明的侧柏叶多糖分子量均一、纯度高并且热稳定性好、制备工艺合理简单，并且易于实现工业化。本发明制备的侧柏叶多糖具有良好的抗病毒及免疫促进作用，可以作为乙型病毒性肝炎等疾病的辅助治疗药物或者作为具有提高免疫力作用的功能性保健食品。

Description

一种具有抗病毒和增强免疫活性的侧柏叶多糖及其制备方法 和应用

技术领域

本发明涉及多糖领域，具体涉及一种具有增强免疫活性和抗乙型肝炎病毒活性的侧柏叶多糖的制备方法和应用。

背景技术

侧柏（Platycladus orientalis (L.) Franco），别名香柯树、香树、扁桧、香柏、黄柏，隶属于裸子植物门（Gymnospermae）、松柏纲（Coniferopsida）、松杉目 （Coniferales）、柏科（Cupressaceae）、侧柏属（Platycladus）。下级分类有金塔柏、金黄球柏、千头柏、窄冠侧柏。据《中国植物志》记载，侧柏是常绿乔木，高达20 m；小枝片竖直排列。叶鳞片状，长1~3mm，先端微钝，对生，两面均为绿色。球果卵形，长1.5~2 cm，褐色，果鳞木质而厚，先端反曲；种子无翅。原产我国北部，现南北各地普遍栽培。侧柏是常见的园林、造林树种，枝叶药用，能收敛止血、利尿、健胃、解毒散瘀；种子可榨油，入药有滋补强壮、安神、润肠之效。

侧柏叶是传统的中药，也是符合我国卫生部规定的保健食品原料之一。具有凉血止血、清肺止咳、抑菌等功能，其所含的主要成分为黄酮类化合物、鞣质及挥发油类等。侧柏叶中含有多种黄酮类化合物，包括杨梅素、杨梅苷、槲皮素、槲皮苷、阿曼托黄素、新柳杉、双黄酮、扁柏双黄酮、芦丁、柏黄酮和穗花杉双黄酮，其中以槲皮苷的含量最高。侧柏叶还含有多糖、蛋白质等，而这些大分子活性物质的研究与开发尚处于空白阶段。

专利申请公开号为US 5773005的美国专利公开了“一种从侧柏中提取纯化具有5α-还原酶（5α-reductase）抑制活性的黄酮和二萜的方法”，公开日期为1998-06-30，申请人为Takahashi, Hidehiko等。方法如下：取侧柏叶粉，按料液比1:5加入正己烷混合后加热回流，过滤后真空浓缩；滤饼用初始原料2倍体积的60%乙醇溶解后过滤，将滤液真空浓缩得到组分A。正己烷萃取后的滤饼，加入5倍体积的60%乙醇，加热回流然后过滤；取滤饼加入3倍体积的纯净水，加热回流然后过滤；真空浓缩滤饼即得组分B，滤液回收浓缩即得组分C。该专利重点研究提取物对5α-还原酶（5α-reductase）的抑制活性，研究成分为黄酮和二萜。

专利申请公开号为US 20100112107的美国专利公开了“一种具有睡眠促进作用的侧柏提取物的制备方法”，公开日期为2010-05-06，申请人为Xie, Xueji等。该专利发明了一种具有缓解生理睡眠障的侧柏提取物及其组合物。该组合物还可以包括睡眠促进功效的酸枣仁提取物、远志提取物或它们的混合物的至少一个。活性的评价方法为小鼠动物实验，研究巴比妥钠催眠的睡眠时间诱发、对小鼠自由活动的副作用、牵引试验以及斜板爬坡试验。

专利申请公开号为CN200610026475.3的专利公开了“一种具免疫活性的夏枯草多糖组合物及其制备方法和应用”，授权日期为2010-06-02，申请人为上海中医药大学。该专利公开的夏枯草多糖组合物是由夏枯草的干燥果穗经水煎煮提取、醇沉、透析截取分子量为大于3000 Da的组分，凝胶过滤柱层析纯化后获得。该多糖组合物多糖含量大于50%，多糖分子量均大于5000 Da，主要由组分A、B-1、B-2、C、D组成。本发明夏枯草多糖组合物可明显促进淋巴细胞转化增殖，诱生IFN-Γ，可作为用于制备提高哺乳动物免疫力的药物。

专利申请公开号为CN201110165019.8的公开了“一种具有免疫活性的锦灯笼茎多糖及其制备方法”，授权日期为2013-02-20，申请人为东北师范大学。该发明通过水浸法提取，对水浸液提取物进行沉淀，用酶法和Sevage法联合脱蛋白，干燥得粗多糖；以生理盐水进行洗脱，冷冻干燥后得多糖Q-WSP；经HPLC进一步纯化得到WSP。上述方法获得的WSP经HPLC测定其分子量大约为7000 Da，其组分均一。经气相色谱分析得单糖组分为Rha、Ara、Gal、Glc和GalA。

综上所述，目前关于侧柏叶多糖研究的文献或者专利均无报道。本发明创新性地以侧柏叶为原料，分离提取其中的多糖成分，并系统研究其结构特征、抗病毒活性及免疫增强活性。本发明公开了一种具有抗病毒活性和增强免疫活性的侧柏叶多糖的制备方法和应用，为相关保健食品的开发提供了新思路，为侧柏叶的深加工和综合利用奠定理论基础和技术基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于对侧柏叶中的多糖进行有效提取和分离纯化，并对分离纯化后的侧柏叶多糖的抗病毒活性和免疫活性进行研究，提供一种具有抗病毒和增强免疫活性的侧柏叶多糖及其制备方法和应用。

本发明通过以下技术方案实现。

本发明公开一种具有抗病毒和增强免疫活性的侧柏叶多糖是以侧柏叶为原料，主要经过如下工艺制备：热水浸提、Savege法除蛋白、乙醇沉淀、离子交换柱层析分离纯化、透析、真空冷冻干燥。

进一步地，所述制备方法包括以下步骤：

（1）将侧柏叶于40 ~ 80 °C下干燥2 ~ 8 h，然后用打粉机粉碎；

（2）热水浸提2 ~ 6 h，料液比为1 : 20 ~ 1 : 40 g/mL，热水温度为60 ~ 100 °C，浸提次数为1 ~ 3次；

（3）采用Sevage法对热水浸提物进行脱蛋白处理10 ~ 12次，收集上层多糖溶液然后进行浓缩和干燥；

（4）往脱除蛋白后的粗多糖溶液中加入乙醇溶液，于0 ~ 4 °C下静置过夜；然后进行高速离心，收集沉淀物，真空冷冻干燥后得到侧柏叶粗多糖；

（5）采用离子交换柱层析对冻干后的侧柏叶粗多糖进行分离纯化，收集侧柏叶多糖洗脱峰浓缩后进行透析脱色，再进行真空冷冻干燥得到侧柏叶多糖样品。

进一步优化地，步骤（4）所述的乙醇是体积分数为65% ~ 95%的乙醇或者是无水乙醇，乙醇的加入量为粗多糖溶液体积的2 ~ 5倍。

进一步优化地，步骤（5）中，采用离子交换柱层析分离纯化所用的填料为以下填料中的一种：DEAE Sepharose Fast Flow、DEAE-52、Sepharose XL、CM-52、Q Sepharose FastFlow、ANS Sepharose 4 Fast Flow、Q Sepharose Big Beads；透析温度为0 ~ 4 °C，透析时间为48 ~ 60 h。

进一步优化地，步骤（5）所述纯化是采用去离子水和浓度为0.05mol/L -0.5 mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱。

细胞实验证明，所述侧柏叶多糖还可以抑制HepG 2.2.15细胞分泌HBeAg（乙型肝炎E抗原）和HBsAg（乙肝表面抗原），表明其在体外具有抗乙型肝炎病毒的作用。该侧柏叶多糖可以通过激活小鼠巨噬细胞RAW264.7中的白介素-6（IL-6）、白介素-12（IL-12）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和一氧化氮（NO）的分泌量，从而提高机体的免疫能力；

所述的侧柏叶多糖能应用于免疫缺陷类疾病或病毒感染类疾病的辅助治疗中；

所述的侧柏叶多糖能应用于制备抗乙肝病毒、提高免疫功能的保健食品中。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果：

本发明制备的侧柏叶多糖由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖和岩藻糖六种单糖组成，具有分子量均一、纯度高、热稳定性好的优点，并且还具有良好的抗病毒功效和免疫促进作用，可用于乙型病毒性肝炎及免疫缺陷类疾病的辅助治疗，也可用于抗病毒、提高免疫功能的保健食品。本发明的制备工艺简单合理、绿色环保，并且易于实现工业化大生产。

附图说明

图1 为侧柏叶多糖离子交换柱层析洗脱曲线。

图2 为侧柏叶多糖PP1的红外光谱图。

图3 为侧柏叶多糖的热重分析（TG）和差示扫描量热分析（DSC）图。

图4 为侧柏叶多糖PP1的单糖气相色谱图。

图5 为不同浓度侧柏叶多糖PP1对HepG2.2.15细胞毒性的MTT图。

图6 为不同浓度侧柏叶多糖PP1对HepG2.2.15细胞HBeAg分泌量的影响。

图7 为不同浓度侧柏叶多糖PP1对HepG2.2.15细胞HBsAg分泌量的影响。

图8 为不同浓度侧柏叶多糖PP1对小鼠巨噬细胞毒性的MTT图。

图9 为不同浓度侧柏叶多糖PP1对小鼠巨噬细胞IL-12分泌量的影响。

图10 为不同浓度侧柏叶多糖PP1对小鼠巨噬细胞IL-6分泌量的影响。

图11 为不同浓度侧柏叶多糖PP1对小鼠巨噬细胞TNF-α分泌量的影响。

图12 为不同浓度侧柏叶多糖PP1对小鼠巨噬细胞NO分泌量的影响。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的实施作进一步说明，但本发明的实施不限于此。

实施例1：

（1）称取200g 侧柏叶于40 °C下干燥8 h，然后用打粉机粉碎；

（2）利用100 °C热水浸提2 h，料液比为1 : 40 g/mL，浸提次数为1次；4000 r/min离心10 min，收集上清液于65 °C下旋转蒸发减压浓缩。

（3）采用Sevage法对热水浸提物进行脱蛋白处理，Sevage试剂的配制方法为将氯仿、正丁醇按体积比4 : 1混合；Sevage法脱蛋白的方法为多糖与Sevage试剂按体积比1 :1混合，用摇床振摇20 min，4000 r/min离心10 min，取出上层侧柏叶多糖溶液；脱蛋白过程重复进行10次。

（4）往脱除蛋白后的粗多糖溶液中加入2倍体积的无水乙醇，于4 °C下静置48 h；然后以4000 r/min离心15 min，收集沉淀物，真空冷冻干燥后即得侧柏叶粗多糖。

（5）取200 mg步骤（4）得到的粗多糖溶解于10 mL去离子水中，采用DEAESepharose Fast Flow阴离子交换柱层析进行纯化，先后采用去离子水、0.05mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L和0.5 mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱，洗脱液流速为1.0mL/m，收集洗脱液；其中用去离子水洗脱的组分命名为PP1组分，用0.05 mol/LNaCl溶液洗脱的组分命名为PP2组分。本发明主要报道PP1组分，将PP1组分于4 °C下透析48 h，然后对PP1组分进行真空冷冻干燥得到侧柏叶多糖PP1组分成品。侧柏叶多糖离子交换柱层析洗脱曲线如图1。

实施例2：

（1）称取200g 侧柏叶于80 °C下干燥2 h，然后用打粉机粉碎；

（2）利用100 °C热水浸提2 h，料液比为1 : 20 g/mL，浸提次数为3次；4000 r/min离心10 min，收集上清液于65 °C下旋转蒸发减压浓缩。

（3）采用Sevage法对热水浸提物进行脱蛋白处理，Sevage试剂的配制方法为氯仿、正丁醇按体积比4 : 1混合；Sevage法脱蛋白的方法为多糖与Sevage试剂按体积比1 : 1混合，用摇床振摇20 min，4000 r/min离心10 min，取出上层侧柏叶多糖溶液；脱蛋白过程重复进行10次。

（4）往脱除蛋白后的粗多糖溶液中加入5倍体积的乙醇（所用乙醇的体积分数为65%），于4 °C下静置48 h；然后8000 r/min离心10 min，收集沉淀物，真空冷冻干燥后即得侧柏叶粗多糖。

（5）取200 mg步骤（4）得到的粗多糖溶解再10 mL去离子水中，采用DEAE -52 阴离子交换柱层析进行纯化，先后采用去离子水、0.05mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L和0.5 mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱，洗脱液流速为1.0 mL/min；其中用去离子水洗脱的组分命名为PP1组分，用0.05 mol/L的NaCl溶液洗脱的组分命名为PP2组分。本发明主要报道PP1组分，将PP1组分于4 °C下透析48 h，然后对PP1组分进行真空冷冻干燥得到侧柏叶多糖PP1组分成品（侧柏叶多糖离子交换柱层析洗脱曲线可参见图1）。

实施例3：

（1）称取200g 侧柏叶于60 °C下干燥5 h，然后用打粉机粉碎；

（2）利用90 °C热水浸提4 h，料液比为1 : 30 g/mL，浸提次数为2次；4000 r/min离心10 min，收集上清液于65 °C下旋转蒸发减压浓缩。

（3）采用Sevage法对热水浸提物进行脱蛋白处理，Sevage试剂的配制方法为氯仿、正丁醇按体积比4 : 1混合；Sevage法脱蛋白的方法为多糖与Sevage试剂按体积比1 : 1混合，用摇床振摇20 min，3000 r/min离心10 min，取出上层侧柏叶多糖溶液；脱蛋白过程重复进行11次。

（4）往脱除蛋白后的粗多糖溶液中加入3倍体积的乙醇（所用乙醇的体积分数为80%），于4 °C下静置48 h；然后4000 r/min离心15 min，收集沉淀物，真空冷冻干燥后即得侧柏叶粗多糖。

（5）取200 mg步骤（4）得到的粗多糖溶解再10 mL去离子水中，采用Sepharose XL阴离子交换柱层析进行纯化，先后采用去离子水、0.05 mol/L、0.1 mol/L、0.2 mol/L、0.3mol/L和0.5 mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱，洗脱液流速为1.0 mL/min；其中用去离子水洗脱的组分命名为PP1组分，用0.05 mol/L的NaCl溶液洗脱的组分命名为PP2组分。本发明主要报道PP1组分，将PP1组分于4 °C下透析48 h，然后对PP1组分进行真空冷冻干燥得到侧柏叶多糖PP1组分成品（侧柏叶多糖离子交换柱层析洗脱曲线可参见图1）。

按以上实施例1制得的侧柏叶多糖通过以下方法进行结构鉴定和活性分析，实施例2和3的结果与实施例1类似。

1、侧柏叶多糖的红外光谱分析

取侧柏叶多糖PP1样品 2.0 mg，加入适量干燥的KBr粉末，混合均匀，在玛瑙研钵中研磨均匀后加入压膜内压片，制成厚约 1 mm、直径约为10 mm 左右的透明压片。用FT-IR（傅里叶变换红外光谱仪，型号为VERTEX 70，德国Bruker公司）对PP1压片在500 ~ 4000cm^-1区间进行扫描，采集样品的红外吸收图谱。由图2侧柏叶多糖PP1的红外光谱图可知，在3427.73 cm^-1附近有一个强而宽的吸收峰，这是属于羟基的伸缩振动特征吸收峰（3600 ~3200 cm^-1）；在2925.77 cm^-1附近的吸收峰是属于C-H伸缩振动吸收峰（2950 ~ 2850 cm^-1）；在1382.79 cm^-1附近的吸收峰是属于C-H面内弯曲振动吸收峰（1380 ~ 1360 cm^-1）；由以上几组吸收峰可以初步判定该物质为糖类化合物；1639.10 cm^-1附近的吸收峰是属于C=C双键的伸缩振动吸收峰（1680 ~ 1620 cm^-1），可推测该糖类含有烯二醇结构； 1029.54 cm^-1附近的吸收峰是属于C-O伸缩振动吸收峰（1080 ~ 1030 cm^-1），这些吸收峰是吡喃环上的醚键C-O-C和醇类的C-O键的特征吸收峰；在1750 ~ 1700 cm^-1无吸收峰，表明该多糖不含糖醛酸。

2、侧柏叶多糖的热稳定性分析

采用DSC/DTA-TG同步热分析仪（STA 449 F3 Jupiter^®，德国耐驰仪器制造有限公司）分析侧柏叶多糖的热稳定性。取10 mg粉末样品置于样品托盘中，在氮气的氛围下从室温（25 °C）升温到600 °C，升温速率为10 °C/min，气体流速为40 mL/min。同步进行热重分析（TG）和差示扫描量热分析（DSC）。由图3及原始数据可知，侧柏叶多糖的质量变化经历了3个阶段：第1阶段的质量变化为11.41%，该阶段主要为样品中水分的挥发，表明冻干样品中水分含量为11.41%。第2阶段的质量变化为77.22%，该阶段为样品中多糖分子发生热降解反应而变成气体挥发；第3阶段后，剩余质量为11.36%，说明多糖样品中的灰分含量为11.36%。从图中的DSC曲线可知，侧柏叶多糖的玻璃化转变温度为57.0 ºC；热分解温度为322.9 ºC，说明该侧柏叶多糖具有良好的热稳定性。

3、侧柏叶多糖的单糖组成分析

采用气象色谱仪测定侧柏叶多糖的单糖组成。称取10.0 mg 侧柏多糖PP1样品置于安倍瓶中，加入4.0 mL的三氟乙酸，在110 °C反应6 h，减压旋转蒸发除去多余的三氟乙酸。然后加入甲醇将剩余物重新溶解，减压旋转蒸发进行浓缩。进行衍生化反应，后利用三氯甲烷萃取，获得三氯甲烷相。气相色谱检测条件为：采用气相色谱仪（GC 7890A，美国安捷伦科技有限公司）进行检测，使用HP-5 石英毛细管柱（30 m × 0.32 mm × 0.25 μm）。恒压模式为20 PSI。FID 检测器的温度设置为250 °C。氮气、氢气和空气的流速分别为25、30和400 mL/min。进样体积1 μL。由图4为侧柏叶多糖PP1的气相色谱图可知，该侧柏多糖主要由葡萄糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖四种单糖组成，还含有少量的鼠李糖和岩藻糖。摩尔比为鼠李糖：阿拉伯糖：岩藻糖：甘露糖：葡萄糖：半乳糖 =1：2.84：2.23：5.33：19.70：2.76。

4、侧柏叶多糖的抗病毒活性测定

实验细胞为HepG2.2.15细胞株，购自中山大学医学院。实验试剂为HBsAg（乙型肝炎表面抗原）和HBeAg（乙型肝炎E抗原）酶联免疫检测试剂盒（ELISA, 上海荣盛生物技术有限公司）；MEM培养基（美国Gibco公司）；胎牛血清（Hyclone公司）；卡那霉素（Amreso公司）；胰蛋白酶（Amreso公司）、3- (4, 5-二甲基噻唑-2) -2, 5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）（Serva公司）; 二甲基亚砜（DMSO）（美国Sigma公司）；G418（美国Sigma 公司）。

4.1 细胞培养

HepG2.2.15细胞用含15% 胎牛血清、0. 03% L-谷氨酰胺、G418 380 μg /mL、卡那霉素50 U/mL，pH 为7.2 的MEM培养液常规培养。取对数生长期的HepG2.2.15细胞，通过稀释调整细胞浓度为5 ×10⁴ 个/mL。

4.2 细胞毒性MTT试验

细胞接种于96孔板培养24 h 后，加入用完全培养液将侧柏叶多糖稀释成1000,500, 250, 125, 62.5μg/mL的应用液100 μL，连续培养72 h，每孔加入MTT；继续孵育4 h后，吸弃上清液并加入DMSO，震荡使结晶紫完全溶解。全自动酶标仪（检测波长490 nm）读取各孔OD值。

4.3 ELISA（酶联免疫吸附试验）法定量检测HBsAg 和HBeAg

细胞接种于24 孔板培养24 h 后，分别加入用完全培养液将侧柏叶多糖稀释成1000, 500, 250, 125, 62.5 μg/mL的应用液，每个质量浓度设3 个复孔；以拉米夫定（3-TC, 20 μmol/L）为阳性对照药。连续培养72h后吸出上清液，按照ELISA 试剂盒说明书，用酶标仪进行检测，读取450 nm波长下的吸光度值。图5为不同浓度侧柏叶多糖PP1对HepG2.2.15细胞毒性的MTT图，结果表明62.5 ~ 1000 μg/mL的侧柏叶多糖PP1样品无明显细胞毒性。图6和图7分别为不同浓度侧柏叶多糖PP1对HepG 2.2.15细胞HBeAg、HBsAg分泌量的影响。当样品浓度超过500 μg/mL时，细胞的HBeAg分泌量显著降低，而且呈现明显的剂效关系；当样品浓度超过250 μg/mL时，细胞的HBsAg分泌量显著降低，而且呈现明显的剂效关系。说明侧柏叶多糖PP1在一定浓度下可以有效地抑制HepG2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg，具有良好的抗病毒活性。

5、侧柏叶多糖的免疫活性测定

实验细胞为小鼠巨噬细胞RAW264.7，购自中山大学医学院。实验试剂包括：杜尔伯科极限必需培养基（DMEM）、链霉素和青霉素购自美国Gibco公司；胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司；脂多糖（LPS）购自美国Sigma公司；NO检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；小鼠IL-6 ELISA试剂盒、小鼠TNF-α ELISA试剂盒购自欣博盛生物科技有限公司。

5.1 细胞培养

小鼠巨噬细胞RAW264.7用杜尔伯科极限必需培养基（DMEM）进行培养，并且加入10%的胎牛血清（FBS）、100 μg/mL的链霉素和100 U/mL青霉素，放入37 °C、5%CO₂培养箱中静置培养。取对数生长期小鼠巨噬细胞RAW264.7，通过稀释将细胞浓度调整为5×10⁴ 个/mL，接种于96孔板中，孵育24 h更换一次培养液。

5.2 细胞毒性MTT试验

细胞接种于96 孔板培养24 h 后，吸除全部培养液，加入用完全培养液将侧柏叶多糖稀释成1000, 500, 250, 125, 62.5μg/mL的应用液100 μL，连续培养72 h，每孔加入MTT；继续孵育4 h后，吸弃上清液并加入DMSO，震荡使结晶紫完全溶解，全自动酶标仪（检测波长490 nm）读取各孔OD值。

5.3 NO、肿瘤坏死因子TNF-α和白介素IL-6、IL-12分泌量的测定

试验设为调零组、实验组、对照组和阳性对照组。其中调零组不加细胞，加入100 μL培养液；实验组、对照组和阳性对照组，每孔加入100 μL细胞悬浮液。实验组分别加入62.5, 125, 250, 500, 1000 μg/mL五个浓度梯度的侧柏多糖PP1溶液100 μL，阳性对照组中加入50 μg/mL的脂多糖（LPS）药液100 μL（药液和阳性对照均用不含血清培养基配制），每个不同组分样本设平行的6个孔。图8为侧柏叶多糖PP1对RAW264.7细胞的细胞毒性MTT试验结果图，由图可知在62.5 ~ 1000 μg/mL浓度范围内，侧柏叶多糖PP1对细胞存活率没有显著影响，即无明显细胞毒性。分别用NO检测试剂盒、小鼠TNF-α ELISA试剂盒、小鼠IL-6ELISA试剂盒和小鼠IL-12 ELISA试剂盒检测细胞上清液中IL-12、IL-6、TNF-α、NO的分泌量。对于不同浓度的侧柏叶多糖PP1样品，上清液中IL-12、IL-6、TNF-α、NO的含量分别如图9至图12所示。由图可知，侧柏叶多糖PP1在62.5 ~ 1000 μg/mL范围内，细胞上清液中IL-12、IL-6、TNF-α、NO的含量显著高于对照组（Control），并且呈现剂量效应，随着多糖浓度的升高，IL-12、IL-6、TNF-α、NO的含量也升高。因此侧柏叶多糖PP1能显著提高小鼠巨噬细胞RAW264.7上清液中IL-12、IL-6、TNF-α、NO的含量，具有良好的增强免疫活性。

Claims (5)

1.一种具有抗病毒和增强免疫活性的侧柏叶多糖的制备方法，以侧柏叶为原料，经过如下工艺制备：热水浸提、Savege法除蛋白、乙醇沉淀、离子交换柱层析分离纯化、透析、真空冷冻干燥；其特征在于，具体包括以下步骤：

（1）将侧柏叶在40 ~ 80 ℃下干燥2 ~ 8 h，然后用打粉机粉碎；

（2）热水浸提2 ~ 6 h，料液比为1 : 20 ~ 1 : 40 g/mL，热水温度为60 ~ 100 ℃，浸提次数为1 ~ 3次；

（3）采用Sevage法对热水浸提物进行脱蛋白处理10 ~ 12次，收集上层多糖溶液；

（4）往脱除蛋白后的粗多糖溶液中加入乙醇，于0 ~ 4 ℃下静置过夜；然后进行高速离心，收集沉淀物，真空冷冻干燥后得到侧柏叶粗多糖；

（5）采用离子交换柱层析对冻干后的侧柏叶粗多糖进行纯化，所述纯化是先后采用去离子水、0.05mol/L、 0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L和0.5 mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱，洗脱液流速为1.0 mL/min，收集用去离子水洗脱的组分，浓缩后进行透析，然后真空冷冻干燥得侧柏叶多糖样品。

2.根据权利要求1所述的一种具有抗病毒和增强免疫活性的侧柏叶多糖的制备方法，其特征在于，步骤（4）所述乙醇是体积分数为65% ~ 95%的乙醇溶液或者是无水乙醇，乙醇的加入量为粗多糖溶液体积的2 ~ 5倍。

3.根据权利要求1所述的一种具有抗病毒和增强免疫活性的侧柏叶多糖的制备方法，其特征在于，步骤（5）所述采用离子交换柱层析分离纯化所用的填料为下列填料中的一种：

DEAE Sepharose Fast Flow、DEAE-52、Sepharose XL、CM-52、Q Sepharose FastFlow、ANS Sepharose 4 Fast Flow、Q Sepharose Big Beads；透析温度为0 ~ 4 ℃，透析时间为48 ~ 60 h。

4.由权利要求1所述制备方法制得的一种具有抗病毒和增强免疫活性的侧柏叶多糖。

5.权利要求4所述的一种具有抗病毒和增强免疫活性的侧柏叶多糖在制备抗乙肝病毒、提高免疫功能的保健食品中的应用。