CN105044301A - 一种三七活血化瘀活性的检测方法 - Google Patents

Abstract

一种三七活血化瘀活性的检测方法，所述方法以三七抑制血小板聚集的效价P_T来评估三七活血化瘀的活性。本申请的效价生物检测法可以准确、快速、定量地分析不同产地、不同生长时间、不同生产批次等的三七的抗血小板聚集活性。在药材生产、加工、销售等环节，效价检测可以作为药材及其提取物质量控制的手段之一。

Description

一种三七活血化瘀活性的检测方法

技术领域

本申请涉及中药材三七的质量控制领域，具体是涉及一种用于评估三七活血化瘀活性的检测方法，特别是涉及一种三七的抗血小板凝聚的生物活性检测方法。

背景技术

三七[panaxNotogrnseng(Burk)F·H·Chen]又名参三七、田七、南方人参，是五加科人参属植物，其根、叶、花等均具有药用价值。三七味甘、微苦，性温，归肝、胃、心、小肠经，具有止血、散瘀、消肿、止痛、补虚、强壮等功效，主治咯血、衄血、外伤出血、跌打肿痛等。医学家李时珍在《本草纲目》中认为三七能治一切血病。清朝医家赵学敏在《本草纲日拾遗》中写到：“人参补气第一，三七补血第一，味同而功亦等”。三七主产于云南、广西及四川等地，云南省文山州为其原产地和主产地。据有关文献记载，三七使用历史近600年，栽培历史近500年。主要含有三七总皂苷及其它物质。根据研究资料证实三七总皂苷能有效改善血液循环的血流动力学，降低血液粘度，降低血脂等为现在常用药物。三七总皂苷是活血化淤的药物，已有药物成品。

现有技术中李春玲的《三七总皂苷的提取及纯化新工艺研究》中详细介绍了三七总皂苷的各种提取和纯化工艺。

目前评价药物活血化瘀活性的方法有很多，常用的有活化部分凝血酶法(APTT)、¹²⁵I-标记栓块溶解法、大鼠急性心肌缺血实验、小鼠急性脑缺血缺氧实验、小鼠体内血栓形成实验、小鼠断头存活实验、家兔体外抗血小板凝聚实验等。

郭玉东等建立了舒血宁注射液(银杏叶提取物)体外抑制血小板聚集的生物活性测定法用于补充银杏提取物的质量控制方法。主要以抑制家兔血小板聚集作用来考察显示舒血宁注射液量效关系和效价测定，标准物质选取了金纳多注射液。

CN1698629A公开了一种三七总皂苷口腔速释制剂，其中每片制剂含有三七总皂苷0.02-0.08g。其中三七总皂苷(血塞通)口腔速释制剂的活血化瘀作用的检测方法是采用TT、PT、APTT、FIB测定试剂盒，来测量对大鼠血凝及血小板聚集的影响，按比浊法测定ADP诱导的血小板聚集率，ADP的终浓度为6mol/l。然而，该方法也是定性指出三七总皂苷能抑制ADP诱导的血小板聚集。

CN1228960A公开一种血塞通胶囊，药液按重量每粒含有三七总皂苷40-250mg，并含有溶剂和稳定剂。其中采用血小板聚集仪来进行抗凝血实验。然而，该专利仅指出三七具有抗凝血活性，并没有公开一种简单、廉价、方便的测定三七活性的检测方法，特别是涉及量反应平行线法。

发明内容

本申请的目的是提供一种用于评估三七活血化瘀活性的方法，特别是提供一种用于评估三七生物活性的检测方法。

本申请采用量反应平行线法。药物对生物体所引起的反应随着药物剂量的增加产生的量变可以测量者，称量反应。量反应检测用平行线测定法，要求在一定剂量范围内，S和T的对数剂量x和反应或反应的特定函数y呈直线关系，当S和T的活性组分基本相同时，两直线平行。此方法简单易行，平行性好，效率高，成本低廉。

具体地，本申请提供一种用于评估三七活血化瘀活性的方法，所述方法以三七抑制体外血小板聚集的效价P_T来评估三七活血化瘀活性，所述P_T按照2010年版《中国药典》生物检测统计法项下的量反应平行线法(3·3)法计算三七供试品的效价及实验误差，可信限率FL％不得超过40％，优选地不超过20％。其中抑制血小板聚集的含三七皂苷类供试品溶液的浓度在0.1-6mg/mL之间。

在本领域中，已有授权专利CN103352069A公开了一种用于评估何首乌及其中药制剂肝毒性效价检测方法，其生物毒性效价的计算按照量反应平行线法。

另有专利CN102662037公开了一种龙血竭的生物活性检测方法，其采用量反应平行线法来测定龙血竭的血小板抑制率和血浆复钙时间(PRT)。龙血竭为百合科植物剑叶龙血树的含脂木材经提取得到的树脂，完全不同于三七。

现有技术并没有将量反应平行线法用于三七的活血化瘀活性的测定，更没有对于公开检测方法中具体参数，所述参数对于更直观、快速有效地反应生物活性和疗效至关重要。

本发明另一方面是提供一种经简单、快速提取三七的方法，从而得到苷类，并进行检测的方法，从而用于评估三七的活血化瘀生物活性。

本发明是由以下方案实现的：

所述生物活血化瘀效价检测方法包括下述步骤：

a.配制供试品溶液

制备三七提取物；

用生理盐水或者磷酸盐缓冲液配置所述三七提取物供试品溶液，优选地用生理盐水配置所述三七供试品溶液，超声助溶30min后，离心取上清，以微孔滤膜过滤除菌，备用，优选地用0.22μm微孔滤膜过滤除菌；

b.配制标准品溶液

用生理盐水或者磷酸盐缓冲液配置所述标准物质溶液，所述标准物质为三七皂苷标准物质按比例混合物、三七总皂苷标准物质、三七总皂苷冻干粉，优选三七总皂苷冻干粉；

c.测定

将标准物质溶液和血小板悬液两者加入到安瓿瓶中并混匀，然后将所述混匀的悬液300μL加至血小板聚集仪的供试品池中，用血小板聚集仪来记录经标准物质抑制血小板聚集的曲线；

将三七供试品溶液和血小板悬液两者加入到安瓿瓶中并混匀，然后将所述混匀的悬液300μL加至血小板聚集仪的供试品池中，用血小板聚集仪来记录经三七抑制血小板聚集曲线；

d.生物活血化瘀效价计算

P_T＝A_T×R

$R=\frac{dS3}{dT3}\·anti\lg \frac{\lg r\·4\left(T1+T2+T3-S1-S2-S3\right)}{3\left(T3-T1+S3-S1\right)}$

其中P_T为效价，A_T为估计效价，由于目前三七药材及其制剂在《中国药典》2010年版及国外药典上未见效价的规定，因此假设对照品(S)的A_T效价为100U/mL；R是S和T等反应剂量(d_S、d_T)的比值，r是S和T相邻高低剂量组的比值(本发明r的比值范围也在1:0.7～1:0.5之间)，d_S、d_T为S(标准物质)和T(三七供试品)的等反应剂量。1,2,3顺次由小剂量到大剂量。三个剂量对应高、中、低三个药物效应，且应调整S和T最大剂量比例，保证二者药物效应差别不大。

所述方法以三七抑制体外血小板聚集的效价P_T来评估三七活血化瘀活性，所述P_T按照2010年版《中国药典》生物检测统计法项下的量反应平行线法，通过中国药典生物检测统计软件计算三七供试品的效价及实验误差，可信限率FL％不得超过40％，优选地不超过20％其中抑制血小板聚集的含三七皂苷类供试品溶液的浓度在0.1～6mg/mL之间。

其中，如下获得所述未经药物干预的血小板聚集曲线：

将血小板悬液放入血小板聚集仪的供试品池中，用血小板聚集仪来记录未经药物干预的诱导剂诱导的血小板聚集曲线，记录时间为300s，即得到所述未经药物干预的血小板聚集曲线。

在一些实施方式中，所述血小板悬液可以来源于大鼠、家兔和健康的两周内未服用过抗凝药物的成年人。优选地，血小板悬液来源于大鼠。

可以如下获得所述血小板：

取动物血样，200×g离心，吸取上清液作为富血小板血浆(PRP)，剩余全血2000×g离心，取上清液即为贫血小板血浆(PPP)。亦可将PRP使用血小板洗涤液洗涤，制得洗涤血小板。优选，所述取血为大鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，以枸橼酸纳抗凝腹主动脉取血。

在一些实施方式中，可以如下获得所述未经药物干预的血小板聚集曲线：

将血小板悬液放入血小板聚集仪的供试品池中，用血小板聚集仪来记录未经药物干预的诱导剂诱导的血小板聚集曲线，记录时间为300s，即得到所述未经药物干预的血小板聚集曲线。

本领域的技术人员应当认识到，获得未经三七干预的血小板聚集曲线是为了检验实验系统的可行性，亦可获得三七对血小板聚集的抑制率。

在一些实施方式中，所述用于获得未经药物干预的血小板聚集曲线或经三七干预的血小板聚集曲线的血小板数量范围为30-80万/μL，优选地为40万/μL。

发明人通过实验对诱导剂进行了筛选，从ADP、胶原、花生四烯酸、凝血酶筛选出凝血酶。

在一些实施方式中，所述用于获得未经药物干预的血小板聚集曲线或经三七干预的血小板聚集曲线的诱导剂为凝血酶。

在一些实施方式中，所述三七供试品为三七提取物或三七总皂苷提取物。

在一些实施方式中，所述三七提取物通过以下方法来制备：

称取三七，用甲醇，乙醇或沸水等提取溶剂通过回流、超声或冷浸提取，合并提取液并用滤纸过滤，滤液减压回收水，真空干燥，制得干浸膏；浸膏溶于少量甲醇或水复溶，滴加丙酮或乙醚等有机沉淀剂，使苷类沉淀，收集沉淀即为三七提取物。发明人也通过其他方法如大孔树脂得到三七提取物，经比较，其他方法结合量反应平行线法并不能获得良好的线性，并且提取工艺繁琐，成本高。本发明的提取方法与量反应平行线法结合的检测方法能够直接、快速、有效、便捷的测定三七的活性。

在一些实施方式中，提取溶剂优选地为去离子水。

在一些实施方式中，提取方法优选地为回流提取。

在一些实施方式中，复溶溶剂优选地为去离子水。

在一些实施方式中，有机沉淀剂优选地为丙酮。

在一些实施方式中，三七供试品溶液及标准品溶液与PRP的体积比例优选地为1:10。(V/V)

在一些实施方式中，孵育温度为37℃；孵育时间优选地为4min。

在一些实施方式中，凝血酶的终浓度优选地为3.33U/mL。

在一些实施方式中，血小板聚集的评价指标优选地为最大聚集率。

本申请用于评估三七活血化瘀活性的方法与现有的中药活血化瘀活性评价方法相比，具有以下优点：

1.在本申请的方法中，生物效价检测方法可以通过测定效价来评估药材的质量。

2.在本申请的方法中，生物生价检测方法可用于检测三七抑制血小板聚集活性(活血化瘀活性)效价，使得药物质量与生物活性的结合更为紧密。

3.在本申请的方法中，将药材总体质量以对照品当量表示，可以对药材总体质量统一标示，便于不同供试品质量优劣的比较及药材质量限量的设定。

4.在本申请的方法与化学分析方法相比，能够测定中药的生物活性性，更直观、准确、定量地分析不同产地、不同生长时间、不同制备方法或不同生产批次等药材的质量。

5.本申请的生物效价检测方法操作便捷，用时较短，重现性好，同时实验设施简单，整个实验的经济成本较低，易于推广应用。

本申请的效价生物检测法可以准确、快速地检测三七质量，对药材质量进行统一的效价标示。在药材生产、加工、销售等环节，生物活性效价检测可以作为药材质量控制的手段。在生产过程中，可以根据药材及其提取物的标示效价，调节药材及其提取物的投量，从而保证产品质量的均一。

附图说明

图1仪器稳定性测试结果图。

图2ADP诱导的血小板聚集图。

图3胶原诱导的血小板聚集图。

图4凝血酶诱导的血小板聚集图。

图5凝血酶诱导的洗涤血小板聚集图。

图6三七供试品对不同诱导剂诱导血小板聚集的影响。

图7血小板浓度考察结果图。

图8凝血酶使用浓度考察结果图。

图9不同三七供试品对凝血酶诱导的血小板聚集的影响。

图10标准品和供试品浓度-抑制率曲线图。

图11不同批次三七供试品效价测定结果。

具体实施方式

下面通过实施例来描述本申请的实施方式，本领域的技术人员应当认识到，这些具体的实施例仅表明为了达到本申请的目的而选择的实施技术方案，并不是对技术方案的限制。根据本申请的教导，结合现有技术对本申请技术方案的改进是显然的，均属于本申请保护的范围。

以下实施例中采用的物质，除了注明的之外，其余均为市售。

实施例1

通过以下获得所述血小板：

动物腹腔注射0.12mol/L戊巴比妥钠(60mg·kg-1)麻醉，以0.13mol/L枸橼酸纳1：9抗凝，腹主动脉取血，200×g离心10min，吸取上清液作为富血小板血浆(PRP)，剩余全血2000×g离心10min，取上清液即为贫血小板血浆(PPP)。来源为大鼠、家兔或正常成年人，优选大鼠。

实施例2

如下获得所述未经药物干预的血小板聚集曲线(采用ADP诱导)：

将实例1制得的血小板悬液放入血小板聚集仪的供试品池中，用血小板聚集仪来记录未经药物干预的ADP诱导的血小板聚集曲线，记录时间为300s，即得到所述未经药物干预的血小板聚集曲线。参见附图2。

实施例3

如下获得所述未经药物干预的血小板聚集曲线(采用胶原诱导)：

将实例1制得的血小板悬液放入血小板聚集仪的供试品池中，用血小板聚集仪来记录未经药物干预的胶原诱导的血小板聚集曲线，记录时间为300s，即得到所述未经药物干预的血小板聚集曲线。参见附图3。

实施例4

如下获得所述未经药物干预的血小板聚集曲线(采用凝血酶诱导)：

将实例1制得的血小板悬液放入血小板聚集仪的供试品池中，用血小板聚集仪来记录未经药物干预的凝血酶诱导的血小板聚集曲线，记录时间为300s，即得到所述未经药物干预的血小板聚集曲线。参见附图4。

实施例5

如下获得所述未经药物干预的洗涤血小板聚集曲线(采用凝血酶诱导)：

将实例1制得的血小板悬液，采用血小板洗涤液(pH7.2)清洗，离心，重悬计数，制备洗涤血小板悬液，放入血小板聚集仪的供试品池中，用血小板聚集仪来记录未经药物干预的凝血酶诱导的血小板聚集曲线，记录时间为300s，即得到所述未经药物干预的血小板聚集曲线。参见附图5。

实施例6

诱导剂的确定

将实例1制得的血小板悬液中混入不同浓度三七供试品，加入血小板聚集仪的供试品池中，用血小板聚集仪来记录经药物干预的不同诱导剂诱导的血小板聚集曲线，记录时间为300s，即得到不同诱导剂对应的经三七干预的浓度-聚集率曲线。参见附图6和表1。相同剂量的三七供试品抑制凝血酶诱导的血小板聚集作用显著强于三七供试品抑制ADP诱导的血小板聚集(P<0.01)；三七供试品抑制胶原诱导的血小板聚集的变差较大(CV％>40％)。对于三七供试品抑制ADP诱导的血小板聚集，其高浓度的抑制效应(E_max)和低浓度抑制效应(E_min)之间的间隔较小，可信限率超过40％；而对于三七供试品抑制胶原诱导的血小板聚集，由于剂间变异系数较大(CV％>40％)，有时会显著偏离抑制效应的平行直线；综合考虑选择凝血酶作为诱导剂。

表1三七供试品对不同诱导剂诱导血小板聚集的抑制(％)(mean±SD)

实施例6

凝血酶浓度的确定

按照实施例4的方法步骤，首先将凝血酶冻干粉溶(500U)溶于5mL生理盐水，其初始活性单位为100U/ml。选取4个凝血酶溶液体积，考察其诱导血小板聚集的最佳凝血酶活性单位，结果见图8。从图8可以看出，5μl凝血酶溶液加入300μl血小板悬液中(终浓度为1.6U/mL)，血小板未出现无明显聚集；凝血酶10-30μl加入血小板悬液，可以明显有点血小板聚集，并且没有出现解聚，因此选取凝血酶溶液体积为10μl，即终浓度为3.33U/ml。

实施例7

血小板浓度的确定

按照实施例4的方法步骤，选取五个血小板浓度，凝血酶浓度设为3.33U/ml，考察血小板聚集的最佳血小板浓度，结果见图7。从图7可以看出当血小板浓度为40-100万/ml时血小板聚集率呈缓慢上升趋势，但彼此差别不大，因此综合考虑血小板浓度选取40万/ml。

实施例8

凝血酶溶剂的确定

按照实施例4的方法步骤，使用磷酸盐缓冲液及生理盐水配制凝血酶，考察凝血酶配制溶剂，结果显示使用生理盐水配制的凝血酶聚集率更高，因此凝血酶溶剂选择为生理盐水，同时，供试品的溶剂及稀释剂由于同样原因均选择生理盐水。

实施例9

三七供试品的制备

称取三七粉碎至磨口圆底烧瓶中，用水提取1-2次，合并提取液并用滤纸过滤，滤液减压浓缩，滴加丙酮或乙醚，使苷类沉淀，收集沉淀即为三七提取物。若浓缩至浸膏，可以用水复溶。

实施例10

通过以下获得经三七干预的血小板聚集曲线：

用生理盐水配置实施例9制得的三七提取物，超声助溶，离心取上清，以微孔滤膜过滤除菌，即为三七供试品；将三七供试品溶液和血小板悬液两者加入到安瓿瓶中并混匀，然后将所述混匀的悬液加至血小板聚集仪的供试品池中，37度孵育4min，加入实施例6所述的诱导剂，用血小板聚集仪来记录经三七抑制血小板聚集曲线。

实施例11

通过以下获得经标准标准物质干预的血小板聚集曲线：

用生理盐水配置所述标准物质溶液，所述标准物质为三七皂苷标准物质按比例混合物、三七总皂苷标准物质或三七总皂苷冻干粉，考虑到成本及均一性问题，标准物质选择同一批次的三七总皂苷冻干粉。按实施例10所述的步骤记录经标准物质抑制血小板聚集曲线。

实施例12

三七效价的计算

标准物质稀释液为对照组(S)，三七提取物稀释液为供试品组(T)，分别按实施例10、实施例11所述的步骤，记录不同浓度三七提取物及标准物质抑制血小板聚集曲线。定义相同浓度的标准物质效价为100U，将对照品溶液和供试品溶液各设高中低三个剂量组(终浓度2.72、3.85、5.45mg/mL)，随机分组设计实验，每组平行测定4次。

血小板最大聚集率或血小板聚集抑制率均可作为评价指标，选择最大血小板聚集率避免数据处理的繁琐，选择血小板聚集的抑制率更直观。综合考虑评价指标选择血小板最大聚集率。

按中国药典2010版二部附录XIV生物检测统计法中的量反应平行线(3.3)法计算毒性效价。

所测定的不同浓度的供试品稀释液与对照品稀释液的原始数据如表2所示

表2三七供试品及标准品的原始数据

其中，表2中的数据是各浓度所对应的血小板最大聚集率，提供此组数据用于软件计算效价，对每个浓度测量4次以保证数值的准确性，减少误差。

以血小板最大聚集率为指标，以标准品作为参照，采用量反应平行线(3.3)并采用中国药典生物检测统计软件BS2000来计算三七的效价，结果见表3。

表3生物检测可靠性检验结果

从表3的可靠性检验结果可以看出，回归项有非常显著的意义(P<0.01)，说明随着剂量的增加，聚集率规律地减少；剂间(或剂量间，本申请所用的剂间为1:1)差异不显著(P>0.05)，说明试验剂量比例和试验安排合理；偏离平行、二次曲线和反向二次曲线的差异无显著意义(P>0.05)，说明S和T呈平行关系，可用量反应平行线法(3·3)法检测供试品效价。

结果表明，以相同浓度标准品效价为100U，三七效价为94.5U，可信限率FL＝14.269％，说明该方法具有较好的适用性。

实施例13

按照以上“实施例12”所述的步骤，测定不同批次三七供试品的生物效价，其中仅将其中的三七供试品更换成不同批次的三七供试品，且每一个批号的供试品的三个浓度分别测试一次

表4不同批次三七供试品的效价

编号	批次	效价(U/mL)	FL(％)
				1	0114	96.04	15.50
2	0119	116.30	14.15
				3	0120	119.25	9.13
4	0317	103.71	12.33
				5	0318	91.13	12.65
6	0320	93.27	6.82
				7	0324	89.60	17.74
8	0326	96.01	13.60
				9	0331	94.46	14.27
10	0403	89.42	7.63
				11	0410	112.14	11.79
12	0411	101.07	10.26

在表4中，总共考察了12份三七提取物供试品，其中九批为三七药材自行提取得到供试品，三批为市售的三七总皂苷提取物，药材采集涉及了三七主要的生产产地及部分市场采集的药材，在一定程度上较全面的代表了三七药材的实际情况。由效价检测结果可知，12批不同产地的三七提取物的可信限率均小于20％，表明使用本申请的方法测定供试品效价所产生的误差较小，具有较好的适用性。各供试品之间质量差异较小，供试品分布无明显规律性，但市售的三七总皂苷的效价显著大于三七药材自行提取得到的供试品。这样的结果可能归因于市售三七总皂苷经过纯化后杂质减少，相应的有效成分含量增加。

以上所述仅为本申请的优选实施例，并非对本申请作出任何形式上和实质上的限制。本领域的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，当可利用以上所揭示的技术内容而作出的些许更改、修饰与演变的等同变化均为本申请的等效实施例；同时，凡依据本申请的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更改、修饰与演变等均在本申请的由权利要求界定的范围内。

Claims (10)

1.一种三七活血化瘀活性的检测方法，所述检测方法包括下述步骤：

a.配制供试品溶液

(1)制备三七提取物；

(2)用生理盐水或者磷酸盐缓冲液配置所述三七提取物的供试品溶液，优选地用生理盐水配置所述三七提取物供试品溶液，超声助溶30min后，离心取上清，以微孔滤膜过滤除菌，备用，优选地用0.22μm微孔滤膜过滤除菌；

b.配制标准品溶液

(1)用生理盐水或者磷酸盐缓冲液配置所述标准物质溶液，所述标准物质为三七皂苷标准物质按比例混合物、三七总皂苷标准物质或三七总皂苷冻干粉，优选三七总皂苷冻干粉；

c.测定

(1)将标准物质溶液和血小板悬液两者加入到安瓿瓶中并混匀，然后将所述混匀的悬液加至血小板聚集仪的供试品池中，用血小板聚集仪来记录经标准物质抑制血小板聚集的曲线；

(2)将三七提取物供试品溶液和血小板悬液两者加入到安瓿瓶中并混匀，然后将所述混匀的悬液加至血小板聚集仪的供试品池中，用血小板聚集仪来记录经三七供试品抑制血小板聚集曲线；

d.生物活血化瘀效价计算

P_T＝A_T×R

$R=\frac{dS3}{dT3}\&CenterDot;anti\lg \frac{\lg r\&CenterDot;4(T1+T2+T3-S1-S2-S3)}{3(T3-T1+S3-S1)}$

其中P_T为效价，A_T为估计效价，R是S和T等反应剂量d_S、d_T的比值，r是S和T相邻高低剂量组的比值，d_S、d_T为标准物质S和三七供试品T的等反应剂量。T1、T2、T3、S1、S2和S3中的1,2,3是顺次由小剂量到大剂量。

所述方法以三七抑制体外血小板聚集的效价P_T来评估三七活血化瘀活性，所述P_T按照2010年版《中国药典》生物检测统计法项下的量反应平行线法(3·3)法计算三七供试品的效价及实验误差，可信限率FL％不得超过40％，优选地不超过20％，其中抑制血小板聚集的含三七皂苷类供试品溶液的浓度在0.1～6mg/mL之间。

2.根据权利要求1所述的方法，血小板来源为大鼠、家兔或正常成年人，优选大鼠。

3.根据权利要求1所述的方法，所述方法中包括获得所述未经药物干预的血小板聚集曲线的步骤：

将血小板悬液放入血小板聚集仪的供试品池中，用血小板聚集仪来记录未经药物干预的诱导剂诱导的血小板聚集曲线，记录时间为300s，即得到所述未经药物干预的血小板聚集曲线，用于检验实验系统的可行性。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，用于获得未经药物干预的血小板聚集曲线、标准物质的血小板聚集曲线或经三七干预的血小板聚集曲线的血小板数量范围为30-80万/μL，优选地为40万/μL。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，用于获得未经药物干预的血小板聚集曲线、标准物质的血小板聚集曲线或经三七干预的血小板聚集曲线时加入血小板聚集诱导剂，所述诱导剂为凝血酶，凝血酶的用量范围为1-3.3U/mL。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，三七供试品为三七提取物或三七总皂苷提取物。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述三七提取物通过以下来制备：

称取三七，用甲醇，乙醇或去离子水等提取溶剂通过回流、超声或冷浸提取，合并提取液并用滤纸过滤，滤液减压回收提取溶剂，真空干燥，制得干浸膏；浸膏溶于少量甲醇或去离子水等复溶溶剂，滴加丙酮或乙醚等有机沉淀剂，使苷类沉淀，收集沉淀即为三七提取物。

其中，提取溶剂优选地为去离子水；提取方法优选地为回流提取；复溶溶剂优选地为去离子水；有机沉淀剂优选地为丙酮。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，三七溶液及标准品溶液与富血小板血浆PRP的比例优选地为1:10；孵育温度为37℃；孵育时间优选地为4min。

9.根据权利要求5所述的方法，其中，凝血酶的终浓度优选地为3.3U/mL。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，血小板聚集的评价指标优选地为最大聚集率。