CN105038769A - 一种基于8-氨基喹啉衍生物荧光探针及其合成方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于8-氨基喹啉衍生物的荧光探针及其制备方法和应用，结构式如下：具体制备方法是：以乙腈为溶剂，原料2-氯-N-(喹啉-8-基)乙酰胺和2-丙炔胺的摩尔比按1:1～1.5:1投料，加入一定量的碘化钾(KI)和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)，回流过夜，减压旋出乙腈，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥过夜，过滤，旋出乙酸乙酯，得到的油状物用硅胶柱色谱法进行纯化，用乙酸乙酯和石油醚＝1:1～1:5(v/v)作为洗脱剂进行分离，得到浅黄色固体化合物L。优点是：荧光探针合成简单，有良好的水溶性，可在水环境体系、生物细胞体系中识别Zn²⁺，并可对硫离子及焦磷酸根离子进行监测分析及示踪，具有良好的灵敏度。

Description

一种基于8-氨基喹啉衍生物荧光探针及其合成方法和应用

技术领域

本发明涉及一种基于8-氨基喹啉衍生物荧光探针及其合成方法和应用，用于接力识别锌离子(Zn²⁺)、硫离子(S^2-)和焦磷酸根离子(PPi)。

背景技术

锌元素是生物体内所必需是第二大微量重金属元素和营养素，其在许多生物学过程中起了非常重要的作用，广泛地分布于人体的细胞和体液中，是人体内200多种酶的组成成分，直接参与体内细胞生长发育、生殖和组织修复等各种生命代谢过程。Zn²⁺在细胞的生命活动中起着非常重要的作用，在基因转录、金属酶催化、神经传递等过程中都有Zn²⁺的参与。Zn²⁺同许多生理疾病密切相关，如：老年痴呆症(Alzheimer's)，肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS),帕金森综合症(Parkinson's)，局部缺血以及癫痫等。锌离子在许多生理和病理过程中都起到至关重要的作用，因此对锌离子进行探测和识别有重要理论和实际意义。

硫离子主要是以无机硫化物的形式存在，在生物体系中，S^2-含量超标会刺激粘膜，致人昏迷，呼吸麻痹等危害，因此鉴别和测定S^2-具有重要的意义。

PPi在生物能量学和代谢过程中起到关键作用，在血清中高浓度的PPi与心血管疾病和急性肾功能衰竭相关，在滑膜液中PPi浓度过高与某些疾病如焦磷酸钙脱水晶体的形成和软骨钙质沉着病有关,因此鉴别和测定焦磷酸根离子越来越受到人们的重视。

在所报道的文献中，基于8-氨基喹啉衍生物的荧光探针数量很多，但是绝大多数都是针对某一特定离子的高选择性识别而设计的，少量文献在识别阳离子后，只是单一的接力识别硫离子或者焦磷酸根离子，像这种在同一条件下实现对三种离子连续识别的荧光探针很少被报道，仅有的文献(RSCAdv.,2015,5,10505–10511)也因合成过程复杂使其应用受到限制。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种基于8-氨基喹啉衍生物荧光探针及其合成方法和应用，其合成简单，并赋予它多种识别功能，使其识别操作在同一条件下完成，可大大简化多种离子的识别过程。

其具体技术方案为：

一种基于8-氨基喹啉衍生物荧光探针L，结构式如下：

本发明所述基于8-氨基喹啉衍生物荧光探针的制备方法，其反应式是：

所述方法按如下步骤进行：

以乙腈为溶剂，原料2-氯-N-(喹啉-8-基)乙酰胺和2-丙炔胺的摩尔比按1:1～1.5:1投料，加入一定量的碘化钾(KI)和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)，回流过夜，减压旋出乙腈，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥过夜，过滤，旋出乙酸乙酯，得到的油状物用硅胶柱色谱法进行纯化，用乙酸乙酯和石油醚＝1:1～1:5(v/v)作为洗脱剂进行分离，得到荧光探针2-(2-丙炔氨基)-N-(喹啉-8-基)-乙酰胺。

所述碘化钾(KI)和原料2-丙炔胺的摩尔比为1：5～1：8，N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)和原料2-丙炔胺的摩尔比为1：0.8～1：2。

基于8-氨基喹啉衍生物荧光探针的应用，在pH＝7～9的HEPES缓冲溶液中对锌离子、硫离子以及焦磷酸根离子的检测。

基于8-氨基喹啉衍生物荧光探针的应用，在pH＝7～9的HEPES缓冲溶液对细胞中锌离子进行检测。

与现有技术相比，本发明有益效果为：

本发明提供的多功能荧光探针原料易得，合成方法简单，条件温和，产物分离提纯过程容易。荧光探针L可在水环境中识别Zn²⁺，具有良好的灵敏度，同族的Cd²⁺对识别没有干扰，并可应用到生物细胞体系中检测锌离子。在同一溶剂中，探针L与Zn²⁺形成的络合物可继续监测S^2-和P₂O₇ ^4-。

附图说明

图1是本发明荧光探针L的¹HNMR谱图；

图2是本发明荧光探针L的¹³CNMR谱图；

图3是本发明荧光探针L的质谱谱图；

图4是本发明荧光探针L和加入锌离子的荧光发射光谱图；

图5是本发明荧光探针L与Ni²⁺,Hg²⁺,Ca²⁺,Ba²⁺,Mg²⁺,K⁺,Al³⁺,Mn²⁺,Pb²⁺,Na⁺,Sr²⁺,Co²⁺,Cr³⁺,Ag⁺,Fe²⁺,Fe³⁺,Cu²⁺,Zn²⁺,Cd²⁺作用前后的荧光发射光谱图；

图6是本发明荧光探针L对Zn²⁺识别时抗其它金属离子干扰的荧光检测图；

图7是本发明荧光探针L与0μmol/L～60μmol/LZn²⁺作用前后的荧光发射光谱变化图；

图8是本发明荧光探针L+Zn²⁺的质谱谱图；

图9是本发明荧光探针L与Zn²⁺的Job’splot图；

图10是本发明荧光探针L-Zn²⁺与其它阴离子作用前后的荧光发射光谱图；

图11是本发明荧光探针L-Zn²⁺与0μmol/L～60μmol/L的P₂O₇ ^4-作用前后的荧光发射光谱变化图；

图12是本发明荧光探针L-Zn²⁺与0μmol/L～80μmol/L的S^2-作用前后的荧光发射光谱变化图；

图13是荧光探针L在芽孢杆菌中检测Zn²⁺的荧光成像图。

图14是荧光探针L在金黄色葡萄球菌中检测Zn²⁺的荧光成像图。

图15是本发明荧光探针L和加入锌离子及L+Zn²⁺后加入焦磷酸根离子和硫离子的荧光发射光谱图；

图16是本发明荧光探针L识别锌离子、硫离子和焦磷酸根离子的原理图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

实施例1

(1)合成一种基于8-氨基喹啉衍生物荧光探针的反应式：

(2)合成一种基于8-氨基喹啉衍生物荧光探针的具体步骤：

称取2-氯-N-(喹啉-8-基)乙酰胺330mg和2-丙炔胺55mg，溶解于20ml乙腈中，加入30mg的碘化钾(KI)和150mg的N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)，回流10小时，旋出乙腈，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸出溶剂，得到的油状物用硅胶柱色谱法进行纯化，用乙酸乙酯和石油醚＝1:1(v/v)作为洗脱剂进行分离，得到179mg浅黄色固体化合物即荧光探针L，产率75％。

荧光探针L的基本数据：

¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ11.106(s,1H),8.855(dd,J＝4.2,1.6Hz,1H),8.816(dd,J＝6.9,2.1Hz,1H),8.156(dd,J＝8.3,1.6Hz,1H),7.536(m,2H),7.450(dd,J＝8.3,4.2Hz,1H),3.696(s,2H),3.617(d,J＝2.4Hz,2H),2.283(t,J＝2.4Hz,1H),1.953(s,1H)，如图1。

实施例2

称取2-氯-N-(喹啉-8-基)乙酰胺396mg和2-丙炔胺82mg，溶解于25ml乙腈中，加入35mg的碘化钾(KI)和165mg的N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)，回流15小时，旋出乙腈，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸出溶剂，得到的油状物用硅胶柱色谱法进行纯化，用乙酸乙酯和石油醚＝1:3(v/v)作为洗脱剂进行分离，得到280mg浅黄色固体化合物即荧光探针L，产率78％。

¹³CNMR(101MHz,CDCl₃)δ169.707(s),148.525(s),138.859(s),136.219(s),134.115(s),128.020(s),127.260(s),121.816(s),121.534(s),116.646(s),81.196(s),72.141(s),52.133(s),38.228(s)，如图2。

实施例3

称取2-氯-N-(喹啉-8-基)乙酰胺528mg和2-丙炔胺110mg，溶解于35ml乙腈中，加入50mg的碘化钾(KI)和258mg的N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)，回流18小时，旋出乙腈，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸出溶剂，得到的油状物用硅胶柱色谱法进行纯化，用乙酸乙酯和石油醚＝1:5(v/v)作为洗脱剂进行分离，得到406mg浅黄色固体化合物即荧光探针L，产率85％。

实施例3的高分辨质谱(电喷雾，正模式)：荧光探针L的计算值[L+H]⁺:240.1059，实测值240.1157，如图3。

实施例3的荧光探针L对Zn²⁺选择性的检测：

10μmol/L的荧光探针L的HEPES(pH＝7.4)缓冲溶液，该荧光探针的荧光发射光谱如图4所示。分别加入6倍的金属离子(Ni²⁺,Hg²⁺,Ba²⁺,Mg²⁺,K⁺,Al³⁺,Mn²⁺,Pb²⁺,Na⁺,Sr²⁺,Co²⁺,Cr³⁺,Ag⁺,Fe²⁺,Fe³⁺,Cu²⁺,Zn²⁺,Cd²⁺)，检测溶液的荧光发射光谱变化，如图5所示。从图5中可以看出，当加入Zn²⁺时，在505nm处出现一新的发射峰，而加入其它离子时，并无明显的现象，只有加入Cd²⁺时略微升起，这说明荧光探针L对Zn²⁺有很好的选择性，并且可以区分出Cd²⁺。从图5插图中可看出，荧光探针L可有效识别Zn²⁺，有很好的选择性。

荧光探针L的抗干扰检测：

10μmol/L的荧光探针L的HEPES(pH＝7.4)溶液，分别加入6倍的金属离子(Ni²⁺,Hg²⁺,Ba²⁺,Mg²⁺,K⁺,Al³⁺,Mn²⁺,Pb²⁺,Na⁺,Sr²⁺,Co²⁺,Cr³⁺,Ag⁺,Fe²⁺,Fe³⁺,Cu²⁺,Zn²⁺,Cd²⁺)，然后再分别加入6倍的Zn²⁺，检测溶液的荧光发射光谱,取最大发射波长所对应的值作图，如图6所示。由图6可知，当有其它金属离子存在时，荧光探针只对Zn²⁺有结合，说明不受其它离子的影响，只有当Ni²⁺,Co²⁺,Ag⁺,Hg²⁺存在时，荧光强度升高不明显，说明这几种金属对Zn²⁺的识别会产生干扰。

荧光探针L对Zn²⁺的滴定实验：

10μmol/L的荧光探针L的HEPES(pH＝7.4)缓冲溶液，分别加入0μmol/L～60μmol/L的Zn²⁺，检测溶液的荧光发射光谱变化如图7所示。从图7中可以看出，随着Zn²⁺不断加入，在505nm处的发射峰逐渐升高，当加入到60μmol/L的Zn²⁺时，在505nm处的发射峰不再升高，说明已经达到了饱和。

探针L与Zn²⁺的结合比实验：

我们用高分辨质谱测了L-Zn²⁺配合物的分子量，如图8所示。[L+Zn²⁺+2H₂O]配合物的质谱峰理论值为339.06，实测值为338.9077，说明L只结合了一个锌离子，这个结果与Job’s实验(如图9)得出的结果是一致的。

荧光探针L-Zn²⁺对阴离子选择性的检测：

10μmol/L的荧光探针L-Zn²⁺的HEPES(pH＝7.4)缓冲溶液，加入8倍量的阴离子后(F^-，Cl^-，Br^-，I^-，SCN^-,PO₄ ^3-,H₂PO₄ ^-,HPO₄ ^2-,NO₂ ^-，NO₃ ^-,ClO₄ ^-,SO₄ ^2-,P₂O₇ ^4-，HSO₄ ^-，CO₃ ^2-,HCO₃ ^-,S^2-)，检测溶液的荧光发射光谱变化如图10所示。从图10可看出，只有加入S^2-时，才可以使荧光回复到受体自身的状态，说明该体系对S^2-的选择性和专一性较好；当加入P₂O₇ ^4-时，荧光也有恢复，但加入大倍数时，也不能完全恢复到荧光探针L自身状态。

荧光探针L-Zn²⁺对焦磷酸根P₂O₇ ^4-的滴定实验：

10μmol/L的荧光探针1-Zn²⁺的HEPES(pH＝7.4)缓冲溶液，分别加入0μmol/L～60μmol/L的P₂O₇ ^4-，检测溶液的荧光发射光谱变化如图11所示。从图11中可以看出，随着P₂O₇ ^4-不断加入，在505nm处的发射峰逐渐降低，当加入到60μmol/L的P₂O₇ ^4-时，在505nm处的发射峰强度不再变化，说明已经达到了饱和。

荧光探针L-Zn²⁺对S^2-的滴定实验：

10μmol/L的荧光探针1-Zn²⁺的HEPES(pH＝7.4)缓冲溶液，分别加入0μmol/L～80μmol/L的S^2-，检测溶液的荧光发射光谱变化如图12所示。从图12中可以看出，随着S^2-不断加入，在505nm处的发射峰逐渐降低，当加入到80μmol/L的S^2-时，在425nm处有一新发射峰，并不再变化，恢复到了荧光探针本身状态，说明已经达到了饱和。

荧光探针L在细菌细胞中检测Zn²⁺的荧光成像实验：

在芽孢杆菌中检测Zn²⁺：

将芽孢杆菌活化，即取一些芽孢杆菌接种于LB肉汤中，在37℃，100rpm条件下，过夜振摇培育，再取出50微升接种于LB肉汤中，再过夜培养。然后放入到离心管中，在3000转下离心5分钟，再加入HEPES缓冲溶液洗涤，继续在3000转下离心5分钟，洗涤两次，然后用TopPette单道手动可调移液器吸Zn²⁺(30μM)于离心管中，并放入37℃恒温箱中培养30分钟。然后离心，并用HEPES缓冲溶液离心洗涤两次，然后加入探针L(30μM)，培养30分钟，再离心洗涤，吸取一部分置于载玻片上，用荧光倒置显微镜在紫外灯激发下观察和拍摄荧光照片。同理进行对照实验，即先加入探针L(30μM)于离心管中，然后培养30分钟，离心洗涤3次，进行荧光成像。

结果如图13所示，a)中只含有30μM的L，观察到芽孢杆菌细胞中发射微弱的荧光，b)中是加入了荧光探针L后又继续加入了Zn²⁺，照片中的芽孢杆菌细胞中发射出强烈的荧光，说明荧光探针L可以在芽孢杆菌中有效识别Zn²⁺。

在金黄色葡萄球菌中检测Zn²⁺：

金黄色葡萄球菌的活化、培养、后续处理方法均与芽孢杆菌的实验操作一样。结果如图14所示，a)中没加Zn²⁺只有荧光探针L溶液的金黄色葡萄球菌中发射出微弱的荧光，而b)中加入荧光探针L后又继续加入Zn²⁺，金黄色葡萄球菌细胞中发射出强烈的荧光，说明荧光探针L可以在金黄色葡萄球菌中有效识别Zn²⁺。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (5)

1.一种基于8-氨基喹啉衍生物荧光探针L，其特征是：结构式如下：

2.如权利要求1所述的基于8-氨基喹啉衍生物荧光探针的制备方法，其特征是：其反应式是：

所述方法按如下步骤进行：

以乙腈为溶剂，原料2-氯-N-(喹啉-8-基)乙酰胺和2-丙炔胺的摩尔比按1:1～1.5:1投料，加入一定量的碘化钾(KI)和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)，回流过夜，减压旋出乙腈，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥过夜，过滤，旋出乙酸乙酯，得到的油状物用硅胶柱色谱法进行纯化，用乙酸乙酯和石油醚＝1:1～1:5(v/v)作为洗脱剂进行分离，得到荧光探针2-(2-丙炔氨基)-N-(喹啉-8-基)-乙酰胺。

3.如权利要求2所述的基于8-氨基喹啉衍生物荧光探针的制备方法，其特征是：所述碘化钾(KI)和原料2-丙炔胺的摩尔比为1：5～1：8，N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)和原料2-丙炔胺的摩尔比为1：0.8～1：2。

4.基于8-氨基喹啉衍生物荧光探针的应用，其特征是：在pH＝7～9的HEPES缓冲溶液中对锌离子、硫离子以及焦磷酸根离子的检测。

5.基于8-氨基喹啉衍生物荧光探针的应用，其特征是：在pH＝7～9的HEPES缓冲溶液对细胞中锌离子进行检测。