CN105017182B - 一种从红豆杉中提取紫杉醇的方法 - Google Patents
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Abstract
一种从红豆杉中高效提取紫杉醇的方法，将红豆杉原料研磨粉碎过100‑200目筛，加入5‑10倍量的水和0.1％的冰醋酸，超声辅助酶解。静置过滤，分液，超声辅助有机溶剂萃取。柱层析除杂，碱性树脂柱连续纯化分离，重结晶获得纯度大于99.3％精品。本发明工艺步骤简单、成本低、重复性好、产品纯度高。
Description
技术领域
本发明涉及一种从红豆杉中提取紫杉醇的方法，特别是以红豆杉为原料，超声辅助酶解后，经柱层析和碱性树脂柱分离，重结晶精制，大幅提高了提取效率，降低了生产成本。
背景技术
红豆杉(俗称紫杉，yew)植物分类归于裸子植物亚门(Gymnospcrloe)，在我国医学中早有记载：《本草纲目》就记有红豆杉治疗霍乱、伤寒、排毒等疗效。1971年美国化学家Wani等从产于北美的短叶红豆杉(T.brevifolia)树皮中分离出高抗癌活性紫杉烷二萜化合物紫杉醇，发现紫杉醇具有独特的抗肿瘤作用，它能与微管蛋白质结合，形成稳定的稳管束，并使被解聚，将癌细胞停止在G2晚期或M期，抑制细胞复制，阻止癌细胞Z增殖。这一奇特的功效引起了NCI的高度重视，促进了临床试验研究。紫杉醇临床研究始于1982年，到1989年完成了I、II期的临床试验，1990年进行III期临床试验。1992年12月29日美国国家食品与药物管理局(FDA)正式批准其作为晚期卵巢癌、肺癌、子宫癌等抗癌药物上市。
紫杉醇是红豆杉中主要活性成分，是萜类环状结构的天然次生代谢衍生物，因其含量低、结构类似物较多、纯度要求高、分离过程中易转化等因素，给提取、分离和测定带来了较大的困难，如何以低成本、简单的工艺提取紫杉醇，将紫杉醇与其类似物分离(如与类似物三尖杉宁碱的分离)，获得纯度较高的紫杉醇产品，并对其进行精确的测定就成为研究的重点。
常用的提取方法有：甲醇提取-有机溶剂萃取法、乙醇提取-有机溶剂萃取法等。萃取又可分为初级萃取和次级萃取，在这两级萃取过程中，溶剂的选择具有重要影响。常用的纯化方法有：正相柱色谱法和反相色谱法主要包括常压和低压柱层析、干柱层析、制备性HPLC等法，以及一些较先进的分离手段如HSCCC(高速逆流色谱)等。
紫杉醇作为一种抗癌药品，临床应用对其纯度的要求非常高，一般要大于99.0％，这就对紫杉醇的纯化精制工艺提出了严格地要求。基于上述原因，改进或开发新工艺，寻求更为方便廉价的分离技术，越来越成为研究者们关注的热点。
紫杉醇作为一种生物大分子物质，受温度、有机溶剂、酸、碱等环境条件的影响，易降解或异构生成其它紫杉烷类物质。如紫杉醇在强酸性或弱碱性环境条件下会降解为巴卡亭III或发生表位异构生成7-表紫杉醇；温度较高时也会发生降解反应，生成相应的小分子物质。
在初级萃取过程中采用超声技术，进行超声震荡，以促进原料中物质的溶解，萃取过程所需的时间大为缩短。如果用红豆杉植物体的枝叶作为紫杉醇的来源，由于枝叶特别是叶片中含有许多色素和蜡质，无疑将大大增加紫杉醇提取分离的难度。
由于用来提取紫杉醇的天然红豆杉资源有限，且天然红豆杉属于国家珍惜保护植物，因而天然紫杉醇原料药的生产和供应受到限制，远远不能满足紫杉醇的临床应用。现在人们大规模种植红豆杉，从中提取紫杉醇等物质，以满足临床需要。但因红豆杉种植生产周期长，生产成本较高，传统提取方法效率低，资源浪费严重，因而寻找一种从红豆杉中提取紫杉醇的方法具有非常重要的意义。
目前有关紫杉醇类物质的提取方法，大多采用有机溶剂对红豆杉原料多次浸提，浸提液回收后再用有机溶剂萃取，再经层析分离后结晶得到紫杉醇。这些方法存在最大问题是提取收率低，设备昂贵，并且造成了巨大的资源浪费，提高了生产成本，存在较大环保问题。
发明内容
本发明所解决的技术问题在于提供一种从红豆杉中提取紫杉醇的方法，有效解决了提取收率低、设备昂贵的问题，且环境友好，所得产品纯度大于99.3％。
本发明的目的是提供一种从红豆杉原料中提取紫杉醇的方法。
本发明通过以下技术方案实现：
本发明提供了一种包括超声辅助酶解、有机溶剂萃取、柱层析除杂、碱性树脂柱连续纯化分离、重结晶得精品为主要步骤的分离紫杉醇的方法。红豆杉原料经研磨后，在弱酸性条件下超声酶解，有机溶剂萃取，再依次经柱层析和碱性树脂分离，重结晶精制。具体步骤为：
1)，取红豆杉原料研磨过100-200目筛，向其中加入5-10倍量的水及0.1％的冰醋酸，加纤维素酶于超声下酶解2-5小时；
2)，加入等体积的有机溶剂，超声萃取0.5-2小时；
3)，静置过滤，分液，水相用有机溶剂萃取2-3次，合并有机相；
4)，减压除去有机溶剂，所得浸膏与等质量中性氧化铝拌样，过200-300目硅胶或氧化铝层析柱，石油醚和乙酸乙酯洗脱除去脂溶性杂质，再以醇与乙酸乙酯混合液洗脱，TLC监测，收集醇与乙酸乙酯流份；
5)，减压除去醇与乙酸乙酯，所得粗品依次经弱碱性树脂柱、强碱性树脂柱，二氯甲烷与丙酮混合液洗脱，得纯品；
6)，纯品再经重结晶精制。
优选的，其中步骤1)中，酶解温度为室温-50℃，超声功率为20-80W。
优选的，所述有机溶剂为甲醇、乙醇、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、乙腈、丙酮中的一种或几种。
优选的，其中步骤2)中，超声功率为300-500W。
优选的，其中所述醇和乙酸乙酯混合液中，醇选自甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇中的一种或多种，且醇和乙酸乙酯的体积比为1∶0.1-1。
优选的，其中所述二氯甲烷与丙酮混合液中，二氯甲烷与丙酮的体积比为1∶1-10。
优选的，其中弱碱性树脂为：聚丙烯酸甲酯型树脂，强碱性树脂为：聚苯乙烯型树脂。
优选的，重结晶在有机溶剂水溶液中进行，保持温度在0-5℃，所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙酮、四氢呋喃、乙腈中的一种或几种，有机溶剂与水的体积比为0.3-0.9∶1。
优选的，超声辅助提取过程中，纤维素酶的加入量为红豆杉原料重量的0.02-0.06％。
其中，步骤1)中，加入的水、冰醋酸以及纤维素酶的量以红豆杉原料为基准，步骤2)中，有机溶剂的加入量与水等体积。
本发明通过大量的研究和探索，获得了上述紫杉醇分离纯化的方法，使得紫杉醇的提取效率和纯度都有很大的提升，提取过程环境友好，获得了显著的进步。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种操作简单、成本低、重复性好、产品纯度高的分离纯化紫杉醇的方法。本发明以超声辅助酶解为浸提手段，所用溶剂量较传统方法大大降低，且提取效率高。酶解过程在弱酸存在下进行，有效减少了对杂质的浸提量，为后续处理提供了方便。简单快速的柱层析过程能够迅速除去脂溶性杂质，减少纯化过程中有机溶剂的用量。弱碱性树脂和强碱性树脂的联合使用，可快速分离出紫杉醇及性质相近的杂质，这些杂质包括具有药用价值的紫杉烷类化合物，可留作进一步纯化的原料。分离得到的紫杉醇纯品，再经重结晶，可获得纯度高于99.3％的精品，满足临床试验对其产品纯度的要求。
具体实施方式
实施例1
取红豆杉原料0.5kg，研磨过100目筛，向其中加入5倍量的水及0.1％的冰醋酸，室温环境下，加入质量分数0.02％的纤维素酶，置于超声(功率50W)下酶解5小时。酶解结束后，加入等体积的乙酸乙酯，超声(功率400W)萃取1小时。静置过滤，分液，水相用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相。减压除去乙酸乙酯，所得浸膏与等质量中性氧化铝拌样，过200目氧化铝层析柱，先以石油醚和乙酸乙酯洗脱除去脂溶性杂质，再以甲醇与乙酸乙酯体积比为1∶0.3混合液洗脱，TLC监测，收集甲醇与乙酸乙酯流份。减压除去甲醇与乙酸乙酯，所得粗品依次经弱碱性树脂柱、强碱性树脂柱，二氯甲烷与丙酮体积比为1∶6混合液洗脱，得纯品。纯品以70％乙醇水溶液，0℃下重结晶，得精品1.12g，HPLC测定紫杉醇含量99.5％。
实施例2
取红豆杉原料0.5kg，研磨过100目筛，向其中加入7倍量的水及0.1％的冰醋酸，40℃环境下，加入质量分数0.02％的纤维素酶，置于超声(功率20W)下酶解3小时。酶解结束后，加入等体积的氯仿，超声(功率500W)萃取2小时。静置过滤，分液，水相用氯仿萃取3次，合并有机相。减压除去氯仿，所得浸膏与等质量中性氧化铝拌样，过200目硅胶层析柱，先以石油醚和乙酸乙酯洗脱除去脂溶性杂质，再以乙醇与乙酸乙酯体积比为1∶0.4混合液洗脱，TLC监测，收集乙醇与乙酸乙酯流份。减压除去乙醇与乙酸乙酯，所得粗品依次经弱碱性树脂柱、强碱性树脂柱，二氯甲烷与丙酮体积比为1∶7混合液洗脱，得纯品。纯品以75％甲醇水溶液，0℃下重结晶，得精品1.09g，HPLC测定紫杉醇含量99.7％。
实施例3
取红豆杉原料1.0kg，研磨过200目筛，向其中加入5倍量的水及0.1％的冰醋酸，室温环境下，加入质量分数0.02％的纤维素酶，置于超声(功率20W)下酶解2小时。酶解结束后，加入等体积的乙酸乙酯，超声(功率300W)萃取0.5小时。静置过滤，分液，水相用乙酸乙酯萃取2次，合并有机相。减压除去乙酸乙酯，所得浸膏与等质量中性氧化铝拌样，过200目氧化铝层析柱，先以石油醚和乙酸乙酯洗脱除去脂溶性杂质，再以甲醇与乙酸乙酯体积比为1∶0.4混合液洗脱，TLC监测，收集甲醇与乙酸乙酯流份。减压除去甲醇与乙酸乙酯，所得粗品依次经弱碱性树脂柱、强碱性树脂柱，二氯甲烷与丙酮体积比为1∶4混合液洗脱，得纯品。纯品以50％四氢呋喃水混合溶液，5℃下重结晶，得精品2.30g，HPLC测定紫杉醇含量99.3％。
实施例4
取红豆杉原料1.0kg，研磨过100目筛，向其中加入10倍量的水及0.1％的冰醋酸，30℃环境下，加入质量分数0.06％的纤维素酶，置于超声(功率80W)下酶解5小时。酶解结束后，加入等体积的二氯甲烷，超声(功率500W)萃取1小时。静置过滤，分液，水相用二氯甲烷萃取3次，合并有机相。减压除去二氯甲烷，所得浸膏与等质量中性氧化铝拌样，过200目氧化铝层析柱，先以石油醚和乙酸乙酯洗脱除去脂溶性杂质，再以甲醇与乙酸乙酯体积比为1∶0.2混合液洗脱，TLC监测，收集甲醇与乙酸乙酯流份。减压除去甲醇与乙酸乙酯，所得粗品依次经弱碱性树脂柱、强碱性树脂柱，二氯甲烷与丙酮体积比为1∶3混合液洗脱，得纯品。纯品以80％丙酮水溶液，0℃下重结晶，得精品2.11g，HPLC测定紫杉醇含量99.5％。
实施例5
取红豆杉原料0.5kg，研磨过100目筛，向其中加入5倍量的水及0.1％的冰醋酸，50℃环境下，加入质量分数0.02％的纤维素酶，置于超声(功率50W)下酶解5小时。酶解结束后，加入等体积的乙酸乙酯，超声(功率400W)萃取1小时。静置过滤，分液，水相用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相。减压除去乙酸乙酯，所得浸膏与等质量中性氧化铝拌样，过300目硅胶层析柱，先以石油醚和乙酸乙酯洗脱除去脂溶性杂质，再以甲醇与乙酸乙酯体积比为1∶0.3混合液洗脱，TLC监测，收集甲醇与乙酸乙酯流份。减压除去甲醇与乙酸乙酯，所得粗品依次经弱碱性树脂柱、强碱性树脂柱，二氯甲烷与丙酮体积比为1∶10混合液洗脱，得纯品。纯品以90％乙腈水混合溶液，5℃下重结晶，得精品1.03g，HPLC测定紫杉醇含量99.4％。
实施例6
取红豆杉原料0.5kg，研磨过100目筛，向其中加入8倍量的水及0.1％的冰醋酸，室温环境下，加入质量分数0.06％的纤维素酶，置于超声(功率80W)下酶解4小时。酶解结束后，加入等体积的氯仿，超声(功率500W)萃取1小时。静置过滤，分液，水相用氯仿萃取3次，合并有机相。减压除去氯仿，所得浸膏与等质量中性氧化铝拌样，过300目氧化铝层析柱，先以石油醚和乙酸乙酯洗脱除去脂溶性杂质，再以甲醇与乙酸乙酯体积比为1∶0.7混合液洗脱，TLC监测，收集甲醇与乙酸乙酯流份。减压除去甲醇与乙酸乙酯，所得粗品依次经弱碱性树脂柱、强碱性树脂柱，二氯甲烷与丙酮体积比为1∶1混合液洗脱，得纯品。纯品以30％甲醇水溶液，0℃下重结晶，得精品1.08g，HPLC测定紫杉醇含量99.5％。
Claims (5)
1.一种从红豆杉中提取紫杉醇的方法，其包括以下步骤：1)，取红豆杉原料研磨过100-200目筛，向其中加入5-10倍量的水及0.1％的冰醋酸，加纤维素酶于超声下酶解2-5小时，其中，酶解温度为室温-50℃，超声功率为20-80W，纤维素酶的加入量为红豆杉原料重量的0.02-0.06％；2)，静置过滤，分液，加入等体积的有机溶剂，超声萃取0.5-2小时；3)，分液后，水相用有机溶剂萃取2-3次，合并有机相；4)，减压除去有机溶剂，所得浸膏与等质量中性氧化铝拌样，过200-300目硅胶或氧化铝层析柱，石油醚和乙酸乙酯洗脱除去脂溶性杂质，再以醇与乙酸乙酯混合液洗脱，TLC监测，收集醇与乙酸乙酯流份；5)，减压除去醇与乙酸乙酯，所得粗品依次经弱碱性聚丙烯酸甲酯型树脂柱、强碱性聚苯乙烯型树脂柱，二氯甲烷与丙酮混合液洗脱，得纯品；6)，纯品再经重结晶精制，所述重结晶在有机溶剂水溶液中进行，保持温度在0-5℃，所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙酮、四氢呋喃、乙腈中的一种或几种，有机溶剂与水的体积比为0.3-0.9∶1。
2.如权利要求1所述方法，步骤2)所述有机溶剂为甲醇、乙醇、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、乙腈、丙酮中的一种或几种。
3.如权利要求1所述方法，其中步骤2)中，超声功率为300-500W。
4.如权利要求1所述方法，其中所述醇和乙酸乙酯混合液中，醇选自甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇中的一种或多种，且醇和乙酸乙酯的体积比为1∶0.1-1。
5.如权利要求1所述方法，其中所述二氯甲烷与丙酮混合液中，二氯甲烷与丙酮的体积比为1∶1-10。
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