CN105012670A - 人参林蛙油软胶囊及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人参林蛙油软胶囊及其制备方法，其特征在于，囊芯原料有：林蛙油冻干粉125份、人参提取物37.5份、麦冬提取物75份，囊芯辅料有：蜂蜡20份、玉米油542.5份，囊皮组分有：纯化水365份、可可壳色2份、二氧化钛1.25份、明胶400份、甘油160份。本发明的有益之处在于：软胶囊不仅具有较佳的增强免疫力的保健功能，而且携带、服用方便，同时能遮盖原料特殊气味；制备软胶囊的方法简单、稳定性好，有定型的生产设备及专业的生产厂家，易实现工业化、规模化生产。

Description

人参林蛙油软胶囊及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种软胶囊及其制备方法，具体涉及人参林蛙油软胶囊及其制备方法，属于医药技术领域。

背景技术

近年来人们饮食结构及生活环境的不断变化，如熬夜过多、饮酒过多、环境污染、服用药物以及情绪、心理、家庭、社会等因素，对人体免疫力的影响很大，使得免疫力低下人群数量正逐日增加，人们机体免疫能力日渐下降。

人体90％的疾病与机体免疫失调有关，病毒和细菌只能在机体免疫力低下的时候才促使其发病。世界上最好的医生就是人们自身的免疫系统。人体可生成多种不同类型的抗体，健康人遇到病毒，免疫系统在24小时产生出所需抗体去防治。

增强免疫力减少疾病发生，可避免许多生病痛苦和经济损失，甚至亡命之灾，对预防各种流行疾病也有积极的现实意义。

随着人们生活水平的提高和保健意识的日益增强，功能性保健食品在我国市场的消费量越来越大。调查数据显示，从1995年起，我国城市居民在保健方面的支出，以每年30％以上的速度递增，功能性保健食品在我国拥有巨大的市场潜力。

据上海致联市场研究有限公司对中国内地654个县级以上城市，20岁～64岁之间的成年城市居民的抽样调查显示，消费者购买保健食品所要达到的目的排名前四位的分别是：增强免疫力、改善骨骼状况、抗疲劳、改善睡眠。其中东南沿海、黄河中游和西南地区的消费者重视增强免疫力的比例相对其它地区较高。由此可见，“提倡保健，预防为主”观点已被群众广泛接受，增强免疫力、提高机体的抗病能力也已成为人们的共识。

目前，已批“增强免疫力”及“免疫调节”国产保健食品共有4113种，进口保健食品共176种，在27项功能保健食品中排名第一。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种人参林蛙油软胶囊，该人参林蛙油软胶囊不仅具有较佳的增强免疫力的保健功能，而且携带、服用方便，同时能遮盖原料特殊气味。

本发明的第二个目的在于提供一种人参林蛙油软胶囊的制备方法，该制备方法不仅操作简单，而且稳定性好，易实现工业化、规模化生产。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

一种人参林蛙油软胶囊的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

一、制备囊芯料液

(1)取林蛙油冻干粉、人参提取物、麦冬提取物，分别过80目筛，备用；

(2)取20份蜂蜡、542.5份玉米油，70℃加热熔化蜂蜡，搅拌混匀，得混合物料，备用；

(3)取125份林蛙油冻干粉、37.5份人参提取物、75份麦冬提取物，加入到蜂蜡、玉米油的混合物料中，搅拌混匀，过胶体磨研磨成质地细腻的浆状物，静置抽真空排除气泡，加压出料，备用；

二、制备囊皮胶液

将365份纯化水加热至65℃，加入2份可可壳色、1.25份二氧化钛、400份明胶、160份甘油，加盖密封，启动搅拌桨搅拌，并加热至70℃，搅拌使之成为均匀的胶液，停止搅拌，静置抽真空排除胶液中气泡，加压出胶，过80目筛，将胶液注入保温桶中60℃保温放置，备用；

三、制备软胶囊

囊芯料液与囊皮胶液备好后，开动软胶囊机，压制胶丸，控制每粒囊芯料液重0.8g；

四、定型

将压制出的胶丸用输送带输送到滚笼中，温度18～25℃，相对湿度50％以下，定型时间2～4小时；

五、洗丸、干燥、拣丸。

前述的人参林蛙油软胶囊的制备方法，其特征在于，在步骤一中，静置抽真空排除气泡时，真空度为-0.06～-0.08Mpa。

前述的人参林蛙油软胶囊的制备方法，其特征在于，在步骤二中，静置抽真空排除气泡时，真空度为-0.06～-0.08Mpa。

前述的人参林蛙油软胶囊的制备方法，其特征在于，在步骤三中，压制胶丸时，控制温度在18～25℃范围内、相对湿度50％以下。

前述的人参林蛙油软胶囊的制备方法，其特征在于，在步骤五中，将定型后的胶丸用95％食用酒精进行洗涤。

前述的人参林蛙油软胶囊的制备方法，其特征在于，在步骤五中，将洗后的胶丸送入干燥室内干燥，控制干燥室的温度在20℃～30℃之间，并不停地排除室内的湿空气，控制相对湿度40％以下，待胶丸柔软度适宜时，停止干燥，干燥时间24小时。

本发明的有益之处在于：

(一)人参林蛙油软胶囊

本品主要原料为林蛙油冻干粉、人参提取物、麦冬提取物，根据文献报道以上三种原料均具有增强免疫力的保健功能，经试验验证本发明的软胶囊确实具有较佳的增强免疫力的保健功能；

因为将本品制成了软胶囊，所以本品不仅携带、服用方便，而且囊皮能有效遮盖住原料的特殊气味。

(二)人参林蛙油软胶囊的制备方法

因为制备软胶囊的条件温和、参数易控制、步骤简洁，所以本发明的制备方法不仅操作简单，而且稳定性好；

因为有定型的生产设备及专业的生产厂家，所以本发明的制备方法易实现工业化、规模化生产。

附图说明

图1是本发明制备软胶囊的工艺简图。

具体实施方式

本发明的人参林蛙油软胶囊是为免疫力低下者研发的具有增强免疫力功能的保健食品。依据《保健食品注册管理办法(试行)》，首先确定配方原料及其来源和用量，之后依据所选原料性质及适宜人群的特点确定产品剂型，组成初选的配方，再通过试验，最后制成本品。

以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。

一、通过筛选，确定组方

表1产品配方

1、林蛙油冻干粉

林蛙油，又名哈蟆油，为蛙科动物中国林蛙雌蛙的输卵管，经采制干燥而得。传统医学认为林蛙油具有补肾益精、养阴润肺的功效，常用于病后体弱、神疲乏力、心悸失眠等症。现代医学研究表明，林蛙油可调节机体免疫功能，例如增强小鼠的迟发型变态反应，增加免疫器官重量，提高单核巨噬细胞的吞噬功能和淋巴细胞增殖能力等。

郭淼等人的实验研究(林蛙油蛋白中性蛋白酶水解物促进脾细胞和巨噬细胞功能.食品工业科技.2014,35(1)：345-348.)表明，林蛙油、林蛙油蛋白对脾淋巴细胞和巨噬细胞的免疫功能均有不同程度的促进作用。

于洋通过哈蟆油对小鼠免疫功能影响及脂肪酸构成的试验研究(哈蟆油对小鼠免疫功能影响及脂肪酸构成的研究.长春中医药大学,2008,硕士论文.)发现：哈蟆油能显著提高免疫力低下小鼠脾T淋巴细胞中CD3、CD4、CD4/CD8水平及IL-2含量；提示，哈蟆油具有显著的增强免疫力作用。

2、人参提取物

人参为五加科植物人参的干燥根和根茎。性味甘、微苦，微温；归脾、肺、心、肾经。具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津养血、安神益智等功效；常用于体虚欲脱、肢冷脉微、脾虚食少、肺虚喘咳、津伤口渴、内热消渴、气血亏虚、久病虚羸、惊悸失眠、阳痿宫冷等。

周娅红通过试验研究了人参总皂苷对免疫低下小鼠免疫功能的影响(人参总皂苷对免疫低下小鼠免疫功能的影响.中国中医急症,2010,19(9):1559-1561.)，得出结论，人参总皂苷对免疫低下小鼠非特异性免疫、特异性免疫功能具有一定的促进作用。

张才军等人研究了人参皂苷Rh1对免疫功能降低小鼠的免疫调节作用(人参皂苷Rh1对免疫功能降低小鼠的免疫调节作用研究.昆明医学院学报：2009,(11):51-54,58.)，发现人参皂苷Rh1具有明显增加免疫功能低下模型小鼠免疫功能的作用。

张玉梅、王家晓通过试验探讨了人参皂苷Rg3对Lewis肺癌细胞体外增殖及荷瘤小鼠免疫功能的影响(人参皂甙Rg3对Lewis肺癌细胞体外增殖及荷瘤小鼠免疫功能的影响.实用临床医药杂志，2014,18(1):5-8.)，发现，人参皂苷Rg3可明显抑制Lewis增殖,诱导其凋亡,还可增强荷瘤小鼠的免疫功能。

3、麦冬提取物

麦冬，又名麦门冬，为百合科植物麦冬的干燥块根。性味甘、微苦，微寒；归心、肺、胃经。具有养阴生津、润肺清心的功效；常用于肺燥干咳、阴虚劳嗽、喉痹咽痛、津伤口渴、内热消渴、心烦失眠、肠燥便秘等症。

汤军通过试验观察麦冬多糖对正常小鼠免疫功能的影响(麦冬多糖的免疫活性研究.中国中医基础医学杂志，1998,4(9):44-46.)，发现麦冬多糖可显著增加幼鼠的胸腺和脾脏重量,增强小鼠网状内皮系统的吞噬功能，提高血清溶血素水平；得出结论，麦冬多糖具有免疫活性。

徐慧宇等人研究了麦门冬水煎剂对D-半乳糖衰老模型大鼠红细胞超氧化物歧化酶活性、血清总抗氧化能力、血清丙二醛含量及红细胞免疫功能的影响(中药麦门冬对大鼠红细胞免疫功能及抗衰老作用的研究.中医药学报，2001,29(1):46-47.)，发现麦门冬水煎剂能显著提高模型大鼠的红细胞活性、血清总抗氧化能力及红细胞免疫功能。

本品主要原料为林蛙油冻干粉、人参提取物、麦冬提取物，根据文献报道，以上三种原料均具有增强免疫力的保健功能。

二、制备方法

本品工艺路线设计为：配料→溶胶→制丸→定型→洗丸→干燥→拣丸→包装→检验→入库。

参照图1，本品具体的制备过程为：

1、制备囊芯料液

(1)取林蛙油冻干粉、人参提取物、麦冬提取物，分别过80目筛，备用。

(2)按配方比例取蜂蜡、玉米油，70℃加热熔化蜂蜡，搅拌混匀，得混合物料，备用。

(3)按配方比例取林蛙油冻干粉、人参提取物、麦冬提取物，加入到蜂蜡、玉米油的混合物料中，搅拌混匀，过胶体磨研磨成质地细腻的浆状物，静置抽真空(真空度：-0.06～-0.08Mpa)排除气泡，加压出料，备用。

2、制备囊皮胶液

按配方比例称取制备囊皮胶液所用物料。将纯化水加热至65℃，加入可可壳色、二氧化钛、明胶、甘油，加盖密封，启动搅拌桨搅拌，并加热至70℃，搅拌使之成为均匀的胶液，停止搅拌，静置抽真空(真空度：-0.06～-0.08Mpa)，排除胶液中气泡，加压出胶，过80目筛，将胶液注入保温桶中60℃保温放置，备用。

3、制备软胶囊

将制备好的囊芯料液用输液管输送到软胶囊机的储料槽中，将制备好的囊皮胶液用输液管输送到软胶囊机的储胶槽中并注意保温(60℃)。囊芯料液与囊皮胶液备好后，开动软胶囊机，压制胶丸，控制每粒囊芯料液重0.8g，温度18～25℃，相对湿度50％以下。

4、定型

因压制出的胶丸有一定的温度，形体较软，所以需冷却定型。

方法是：将压制出的胶丸用输送带输送到滚笼中，使其降温及散去表面的水分，温度18～25℃，相对湿度50％以下，定型时间约2～4小时。

5、洗丸

将定型后的胶丸用95％食用酒精洗涤。

95％食用酒精：应符合GB10343《食用酒精》项下的规定。

6、干燥

洗后的胶丸送入干燥室内干燥，控制干燥室的温度在20℃～30℃之间，并不停地排除室内的湿空气，控制相对湿度40％以下，待胶丸柔软度适宜时，停止干燥，干燥时间约24小时。

7、拣丸

对干燥好的胶丸，人工拣出不合格胶丸，合格胶丸待包装。

8、包装

内包装：将胶丸装入口服固体药用高密度聚乙烯瓶，每瓶装60粒。

外包装：贴签、装箱。

9、检验入库

成品检验，入库。

本品为软胶囊剂，规格为0.8g/粒，每日服用2次，每次2粒，所选原料均为可用于保健食品的原料。

软胶囊剂具有以下优点：①携带、服用方便；②能遮盖原料特殊气味；③制备简单，有定型的生产设备及专业的生产厂家，易实现工业化、规模化生产。

药典(2010版)规定哈蟆油日用量为5～15g，本品林蛙油冻干粉日用量为0.5g。

药典(2010版)规定人参日用量为3～9g，本品人参提取物日用量为0.15g(提取率18％)，折合人参药材日用量为0.83g。

药典(2010版)规定麦冬日用量为6～12g，本品麦冬提取物日用量为0.3g(提取率16％)，折合麦冬药材日用量为1.875g。

经吉林省疾病预防控制中心安全性评价试验证明，本品为无毒级，是安全的，用量符合规定，可以长期服用。

我们根据实验室研究的生产工艺，对确定的配方、工艺进行了三批中试生产，中试数据见下表：

表2中试数据

注：*取出2.5kg内容物供动物实验用；**囊皮胶液的投料量放大为配方的120倍。

中试结果显示，本品工艺稳定可行，可进行生产。

三、产品达到的技术指标

1、感官检验

在自然光线下，观察色泽、形态，并嗅其气味。结果见表3。

表3感官评价

项目	评价
		色泽	囊皮呈棕色，内容物为黄棕色
滋味、气味	本品特有的滋味、气味，无异味
		性状	软胶囊，外观完整光洁，内容物为油性膏状物
杂质	无肉眼可见外来杂质

2、功能

经动物功能试验证明，本品具有增强免疫力的保健功能。

2.1材料和方法

(1)样品：

样品性状为软胶囊，规格为0.8g/粒，人体推荐剂量为2粒/次，2次/日。保存条件为密封、置干燥处。

(2)实验动物：

长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供的SPF级ICR雄性小鼠240只，体重18g～22g，生产许可证号：SCXK-(吉)2011-0004。

饲料由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供，生产许可证号：SCXK-(吉)2010-0001。

本实验动物环境设施合格证，吉动设字10-1005，实验动物使用许可证号：SYXK-(吉)2010-0011。

(3)剂量选择与受试物给予方式：

选健康雄性小鼠48只，体重18g～22g，分为4组，每组12只，作为免疫一组，进行脏器/体重比值测定、半数溶血值(HC₅₀)的测定和抗体生成细胞检测；

选健康雄性小鼠48只，体重18g～22g，分为4组，每组12只，作为免疫二组，进行碳廓清实验；

选健康雄性小鼠48只，体重18g～22g，分为4组，每组12只，作为免疫三组，进行ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验和NK细胞活性测定；

选健康雄性小鼠48只，体重18g～22g，分为4组，每组12只，作为免疫四组，进行迟发型变态反应实验；

选健康雄性小鼠48只，体重18g～22g，分为4组，每组12只，作为免疫五组，进行小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验。

推荐成人每日摄入量为2次/日，2粒/次，0.8g/粒，即3.2g/60kgBW，相当于0.053g/kg BW，以日推荐摄入量的1倍、10倍和30倍设置灌胃剂量，即0.053g/kg BW、0.533g/kg BW、1.600g/kg BW，各剂量组以植物油稀释。以植物油作阴性对照组，各组小鼠灌胃量均为0.2mL/10g BW，连续灌胃30天后测各项免疫指标。

(4)主要仪器与试剂：

电子天平(0.1g)、分析天平、洁净工作台、二氧化碳培养箱、离心机、722分光光度计、恒温水浴、酶标仪、显微镜等；无菌手术器械、游标卡尺(精密度0.02mm)、微量注射器(25μL)、细胞计数器、24孔和96孔平底细胞培养板、96孔U型细胞培养板、玻璃平皿、纱布、试管、玻片架、200目筛网、计时器、血色素吸管、载玻片等；绵羊红细胞(SRBC)、生理盐水、Hank’s液(pH7.2～7.4)、RPMI1640培养液、小牛血清、青链霉素、刀豆蛋白A(ConA)、l％冰醋酸、1mol/L的HCl溶液、酸性异丙醇(96mL异丙醇加4mL盐酸)、MTT、PBS缓冲液(pH7.2～7.4)、补体(豚鼠血清)、SA缓冲液、琼脂糖、都氏试剂(碳酸氢钠1.0g，高铁氰化钾0.2g，氰化钾0.05g，加蒸馏水至1000mL)、YAC–1细胞、乳酸钠、硝基氯化四氮唑、吩嗪二甲酯硫酸盐、氧化型辅酶I、0.2mol/L的Tris–HCl缓冲液(pH8.2)、l％NP40、印度墨汁、Na₂CO₃、鸡红细胞、甲醇、Giemsa染液。

(5)试验方法：

a、脏器/体重比值测定

小鼠称重后脱臼处死，取脾脏和胸腺，去尽筋膜，用滤纸吸干脏器表面血污，称重，计算脾脏/体重比值和胸腺/体重比值。

b、迟发型变态反应(足跖增厚法DTH)

取羊血，生理盐水洗涤，小鼠用2％(V/V)SRBC腹腔免疫，每只鼠注射0.2mL/只。免疫后4天，测量左后足跖部厚度，测量部位皮下注射20％(V/V)SRBC，20μL/只，注射后24h测量左后足跖部厚度三次，计算平均值。

c、ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验(MTT法)

无菌取脾，Hank’s液中将脾磨碎制成单细胞悬液，Hank’s液洗2次，每次离心10min(1000r/min)。将细胞悬浮于1mL的完全培养液，台酚兰染色计数活细胞数(应在95％以上)，调整细胞浓度至3×10⁶个/mL。将每份细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1mL，一孔加75μLConA液(相当于7.5μg/mL)，另一孔作为对照，置5％CO₂37℃CO₂培养箱中培养72h。培养结束前4h，每孔吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT(5mg/mL)50μL/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入lmL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解，后测定OD_570nm。

d、抗体生成细胞检测(Jerne改良玻片法)

将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中，朝一个方向摇动，以脱纤维，4℃冰箱保存备用(可保存2周)。压积SRBC以生理盐水配成2％(V/V)细胞悬液，鼠腹腔注射0.2mL/只。将SRBC免疫4～5天后的小鼠脱臼处死，取脾，放入Hank’s液，将脾磨碎制成细胞悬液，纱布过滤，Hank’s液洗2次，每次离心(1000r/min)10min，后将脾细胞悬液加入RPMI1640培养液中，计数细胞，细胞浓度调至5×10⁶个/mL。琼脂糖加热溶解后，45～50℃水浴保温，与等量PH7.2～7.42倍浓度的Hank’s液混合，分装小试管，每管0.5mL,再向管内加10％(V/V，用SA液配制)压积SRBC 50μL、脾细胞悬液20μL，混匀后倾倒于已刷有琼脂糖薄层的玻片上，做平行片，待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，CO₂培养箱中温育1.5h，后用SA缓冲液稀释的补体(1：8)加入到玻片架凹槽内，继续温育1.5h后，计数溶血空斑数。

e、半数溶血值(HC₅₀)的测定

取羊血，生理盐水洗涤3次，每次离心(2000r/min)10min，腹腔注射2％(V/V，生理盐水配制)压积SRBC 0.2mL/只进行免疫。4天后，取血于离心管，放置约1h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，2000r/min离心10min，收集血清。用SA缓冲液将血清稀释(400倍)，稀释后的血清1mL置试管内，依次加入10％(V/V)SRBC 0.5mL，补体1mL(用SA缓冲液按1:8稀释)。另设不加血清的对照管(以SA缓冲液代替)。37℃恒温水浴中保温15～30min，冰浴终止反应。2000r/min离心10min，取上清1mL，加都氏试剂3mL。同时取10％(V/V)SRBC 0.25mL，加都氏试剂至4mL，充分混匀，放置10min后，以对照作空白，分别测定各管OD_540nm，溶血素的量以半数溶血值(HC₅₀)表示，计算：

HC₅₀＝样品光密度值/SRBC半数溶血时的光密度值×稀释倍数

f、小鼠碳廓清实验

小鼠尾静脉注射1：4倍稀释的印度墨汁，立即计时，注入墨汁后2min、10min，分别从内眦静脉丛取血20μL，并立刻将其加到2mL0.1％Na₂CO₃溶液中，以Na₂CO₃为对照，测定OD_600nm。处死小鼠，取肝脏和脾脏，称重。计算吞噬指数a：

k＝(lgOD1-lgOD2)/(t2-t1)

g、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验

小鼠腹腔注射20％(V/V用生理盐水配制)压积鸡红细胞(2000r/min，10min)悬液1mL，间隔30min，脱臼处死，取腹腔巨噬细胞洗液1mL，滴于载玻片上，37℃孵箱温育20min，生理盐水中漂洗，以除去未贴片细胞。晾干，甲醇固定，4％(V/V)Giemsa–磷酸缓冲液染色，蒸馏水漂洗晾干。油镜下计数，每片计数100个巨噬细胞，计算吞噬率和吞噬指数：

吞噬率％＝吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/计数的巨噬细胞数×100

吞噬指数＝被吞噬的鸡红细胞总数/计数的巨噬细胞数

h、NK细胞活性测定(乳酸脱氢酶LDH测定法)

实验前24h传代培养靶细胞YAC–l，应用前以Hank’s液洗3次，含10％小牛血清的RPMI1640完全培养液调整细胞浓度至4×10⁵个/mL。受试小鼠脱臼处死，取脾脏，制成脾细胞悬液，Hank’s液洗3次，每次1500r/min离心10min，用2mL含10％小牛血清的RPMI1640完全培养液重悬，台酚兰染色计数(活细胞数应在95％以上)，调整细胞浓度至2×10⁷个/mL，使效靶比为50：1。取靶细胞和效应细胞各100μL，加入U形96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μL，靶细胞最大释放孔加靶细胞和l％NP40各100μL；上述各项均设三个平行孔，37℃，5％CO₂培养箱中培养4h，将96孔板以1500r/min离心5min，每孔吸取上清100μL置酶标板中，加入LDH基质液100μL，反应10min，然后每孔加入lmol的HCl溶液30μL终止反应，测定OD_490nm，计算NK活性：NK细胞活性％＝(反应孔OD－自然释放孔OD)/(最大释放孔OD－自然释放孔OD)×100％

LDH基质液的配制：乳酸钠5×10^-2mol/L

硝基氯化四氮唑6.6×10^-4mol/L

吩嗪二甲酯硫酸盐2.8×l0^-4mol/L

氧化型辅酶I 1.3×10^-3mol/L

将上述试剂溶于0.2mol/L的Tris–HCl缓冲液中(pH8.2)。

(6)试验数据统计：

采用SPSS11.5统计软件中单因素方差分析进行均值比较，方差齐时，各组间两两比较用LSD法；方差不齐时，各组间两两比较采用Tamhane法。

(7)结果判定：

增强免疫力功能判定标准：在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能、NK细胞活性四项中任意两项结果阳性，可判定该受试样品具有增强免疫力功能作用。

其中，细胞免疫功能、体液免疫功能和单核-巨噬细胞功能测定项目中的两个实验结果均为阳性，或任一实验的两个剂量组结果阳性，可判定细胞免疫功能测定结果阳性；NK细胞活性测定实验的一个以上剂量组结果阳性，可判定NK细胞活性结果阳性。

2.2结果

(1)受试物对小鼠体重的影响

表4受试物对免疫一组小鼠体重影响

P值：各实验组与阴性对照组比较

由表4可知，经统计学处理，经口给予受试物30天，各剂量组小鼠体重与阴性对照组比较差异无显著性(P>0.05)，即受试物对小鼠体重无明显影响。

表5受试物对免疫二组小鼠体重影响

P值：各实验组与阴性对照组比较

由表5可知，经统计学处理，经口给予受试物30天，各剂量组小鼠体重与阴性对照组比较差异无显著性(P>0.05)，即受试物对小鼠体重无明显影响。

表6受试物对免疫三组小鼠体重影响

P值：各实验组与阴性对照组比较

由表6可知，经统计学处理，经口给予受试物30天，各剂量组小鼠体重与阴性对照组比较差异无显著性(P>0.05)，即受试物对小鼠体重无明显影响。

表7受试物对免疫四组小鼠体重影响

P值：各实验组与阴性对照组比较

由表7可知，经统计学处理，经口给予受试物30天，各剂量组小鼠体重与阴性对照组比较差异无显著性(P>0.05)，即受试物对小鼠体重无明显影响。

表8受试物对免疫五组小鼠体重影响

P值：各实验组与阴性对照组比较

由表8可知，经统计学处理，经口给予受试物30天，各剂量组小鼠体重与阴性对照组比较差异无显著性(P>0.05)，即受试物对小鼠体重无明显影响。

(2)受试物对小鼠脏器/体重比值的影响

表9受试物对小鼠脏器/体重比值的影响

脾脏/体重比值P1值：各实验组与阴性对照组比较

胸腺/体重比值P2值：各实验组与阴性对照组比较

由表9可知，经口给予小鼠不同剂量的受试物30天，各剂量组脾脏/体重比值和胸腺/体重比值与阴性对照组间比较差异无显著性(P＞0.05)，即受试物对小鼠的脏器/体重比值无明显影响。

(3)受试物对小鼠细胞免疫功能的影响

a、受试物对小鼠迟发型变态反应(DTH)的影响

表10受试物对小鼠迟发型变态反应(DTH)的影响

P值：各实验组与阴性对照组比较，*P＜0.05

由表10可知，经统计学处理，经口给予受试物30天，低剂量组足跖肿胀度与阴性对照组比较差异无显著性(P＞0.05)，中、高剂量组与阴性对照组间比较差异有显著性(P＜0.05)，即中、高剂量的受试物能增强小鼠的迟发型变态反应。

b、受试物对ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验的影响

表11受试物对ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验的影响

P值：各实验组与阴性对照组比较

由表11可知，经口给予小鼠不同剂量的受试物30天，经统计学处理，各剂量组淋巴细胞的增殖能力与阴性对照组间比较差异无显著性(P＞0.05)，即受试物对ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化能力无明显影响。

(4)受试物对体液免疫的影响

a、受试物对抗体生成细胞数的影响

表12受试物对小鼠抗体生成细胞数的影响

P值：各实验组与阴性对照组比较

由表12可知，经口给予小鼠不同剂量的受试物30天，经统计学处理，各剂量组抗体生成细胞数与阴性对照组比较差异无显著性(P＞0.05)，即受试物对小鼠的抗体生成细胞数无明显影响。

b、受试物对小鼠半数溶血值(HC50)的影响

表13受试物对小鼠半数溶血值HC50的影响

P值：各实验组与阴性对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

由表13可知，经统计学处理，经口给予受试物30天，低剂量组足跖肿胀度与阴性对照组比较差异无显著性(P＞0.05)，中、高剂量组与阴性对照组间比较差异有显著性(P＜0.05)，即中、高剂量的受试物能提高小鼠半数溶血值。

(5)受试物对小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能的影响

a、受试物对小鼠单核-巨噬细胞碳廓清功能的影响

表14受试物对小鼠单核-巨噬细胞碳廓清功能的影响

P值：各实验组与阴性对照组比较，*P＜0.05

由表14可知，经口给予小鼠不同剂量的受试物30天，经统计学处理，低、中、高剂量组与阴性对照组比较差异有显著性(P＜0.05)，即低、中、高剂量组受试物能提高小鼠单核-巨噬细胞的碳廓清能力。

b、受试物对小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力的影响

表15受试物对小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力的影响

吞噬率(％)P1值：各实验组与阴性对照组比较

吞噬指数P2值：各实验组与阴性对照组比较

由表15可知，经统计学处理，经口给予受试物30天，各剂量组吞噬率与阴性对照组比较差异无显著性(P＞0.05)，各剂量组吞噬指数与阴性对照组比较差异无显著性(P＞0.05)，即受试物对小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力无明显影响。

(6)受试物对小鼠NK细胞活性的影响

表16受试物对小鼠NK细胞活性的影响

P值：各实验组与阴性对照组比较

由表16可知，经口给予小鼠不同剂量的受试物30天，经统计学处理，各剂量组NK细胞活性与阴性对照组间比较差异无显著性(P＞0.05)，即受试物对小鼠的NK细胞活性无明显影响。

2.3小结

经口给予小鼠不同剂量的受试物30天，能增强小鼠迟发型变态反应，即能增强细胞免疫功能；能提高小鼠半数溶血值，即能增强体液免疫功能；能提高小鼠单核–巨噬细胞的碳廓清能力，即能增强单核—巨噬细胞功能；对小鼠抗体生成细胞数、小鼠的体重增长、脏器/体重比值、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力、ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化能力、NK细胞活性无影响。由此判定，本发明的人参林蛙油软胶囊具有增强免疫力功能作用。

3、标志性成分

选择蛋白质、总皂苷为本品标志性成分。

蛋白质按GB 5009.5规定的方法测定。

总皂苷按《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)“二十三、保健食品中总皂甙的测定”规定的方法测定。

经测定，本品的蛋白质和总皂苷达到的指标见表17。

表17标志性成分

项目	指标
		蛋白质，g/100g	≥5
总皂苷(以人参皂苷Re计)，g/100g	≥0.4

4、理化指标

(1)崩解时限按《中华人民共和国药典》一部规定的方法测定。

(2)灰分按GB 5009.4规定的方法测定。

(3)酸价和过氧化值按GB/T 5009.37规定的方法测定。

(4)黄曲霉毒素B1按GB/T 5009.22规定的方法测定。

(5)铅按GB 5009.12规定的方法测定。

(6)砷按GB/T 5009.11规定的方法测定。

(7)汞按GB/T 5009.17规定的方法测定。

(8)镉按GB/T 5009.15规定的方法测定。

(9)六六六、滴滴涕按GB/T 5009.19规定的方法测定。

经测定，本品所达到的理化指标见表18。

表18理化指标

项目	指标
		崩解时限，min	≤60
灰分，％	≤5
		酸价，(KOH)mg/g	≤4
过氧化值，g/100g	≤0.25
		黄曲霉毒素B1，μg/kg	≤10
铅(以Pb计)，mg/kg	≤1.5
		砷(以As计)，mg/kg	≤1.0
汞(以Hg计)，mg/kg	≤0.3
		镉(以Cd计)，mg/kg	≤0.1
六六六，mg/kg	≤0.2
		滴滴涕，mg/kg	≤0.2

5、微生物指标

(1)菌落总数按GB 4789.2规定的方法检验。

(2)大肠菌群按GB/T 4789.3-2003规定的方法检验。

(3)致病菌按GB 4789.4、GB 4789.5、GB 4789.10、GB/T 4789.11规定的方法检验。

(4)霉菌、酵母按GB 4789.15规定的方法检验。

表19微生物指标

6、净含量及允许负偏差

净含量为每瓶48g；允许的负偏差为9％。

综上所述，本发明的人参林蛙油软胶囊不仅具有较佳的增强免疫力的保健功能，而且携带、服用方便，同时囊皮能有效遮盖住原料的特殊气味；制备本发明的软胶囊的方法不仅操作简单，而且稳定性好，易实现工业化、规模化生产。

需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.一种人参林蛙油软胶囊的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

一、制备囊芯料液

(1)取林蛙油冻干粉、人参提取物、麦冬提取物，分别过80目筛，备用；

(2)取20份蜂蜡、542.5份玉米油，70℃加热熔化蜂蜡，搅拌混匀，得混合物料，备用；

(3)取125份林蛙油冻干粉、37.5份人参提取物、75份麦冬提取物，加入到蜂蜡、玉米油的混合物料中，搅拌混匀，过胶体磨研磨成质地细腻的浆状物，静置抽真空排除气泡，加压出料，备用；

二、制备囊皮胶液

将365份纯化水加热至65℃，加入2份可可壳色、1.25份二氧化钛、400份明胶、160份甘油，加盖密封，启动搅拌桨搅拌，并加热至70℃，搅拌使之成为均匀的胶液，停止搅拌，静置抽真空排除胶液中气泡，加压出胶，过80目筛，将胶液注入保温桶中60℃保温放置，备用；

三、制备软胶囊

囊芯料液与囊皮胶液备好后，开动软胶囊机，压制胶丸，控制每粒囊芯料液重0.8g；

四、定型

将压制出的胶丸用输送带输送到滚笼中，温度18～25℃，相对湿度50％以下，定型时间2-4小时；

五、洗丸、干燥、拣丸。

2.根据权利要求1所述的人参林蛙油软胶囊的制备方法，其特征在于，在步骤一中，静置抽真空排除气泡时，真空度为-0.06～-0.08Mpa。

3.根据权利要求1所述的人参林蛙油软胶囊的制备方法，其特征在于，在步骤二中，静置抽真空排除气泡时，真空度为-0.06～-0.08Mpa。

4.根据权利要求1所述的人参林蛙油软胶囊的制备方法，其特征在于，在步骤三中，压制胶丸时，控制温度在18～25℃范围内、相对湿度50％以下。

5.根据权利要求1所述的人参林蛙油软胶囊的制备方法，其特征在于，在步骤五中，将定型后的胶丸用95％食用酒精进行洗涤。

6.根据权利要求5所述的人参林蛙油软胶囊的制备方法，其特征在于，在步骤五中，将洗后的胶丸送入干燥室内干燥，控制干燥室的温度在20℃～30℃之间，并不停地排除室内的湿空气，控制相对湿度40％以下，待胶丸柔软度适宜时，停止干燥，干燥时间24小时。

7.一种由权利要求1至6任意一项所述的方法制备而来的人参林蛙油软胶囊。