CN104994871B - 针对流感的多价融合蛋白疫苗 - Google Patents

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Abstract

待解决的问题：缺乏针对流感的安全有效的通用疫苗。方案：给出了基于融合蛋白的疫苗，所述融合蛋白由经由柔性铰链连接的A型和B型流感病毒的血细胞凝集素的抗原决定簇和起安全佐剂功能的鞭毛蛋白片段(SEQ ID NO:1)组成，其可以被用于预防由现有A型和B型流感流感毒株以及通过可能的重排列引起的流感。已经证明安全、有效、多价和预防作用。这种疫苗的使用将允许提供针对流感的通用保护。

Description

针对流感的多价融合蛋白疫苗
技术领域
本发明的实施方式涉及分子生物学、生物技术、制备生物化学、医学，并且可用于预防由现有流感毒株以及由可能的重排列引起的流感。
背景技术
术语“融合蛋白”指的是通过重组DNA分子的表达获得的蛋白质，其中数个不同基因的编码阵列结合至一个阅读框。
每年，流感病毒影响5％到15％的人口，引起急性呼吸道疾病。每一年，生产并广泛使用针对季节性流感的疫苗。然而，存在具有新的基因组合的某些流感病毒毒株的广泛传播的危险。这样的病毒可以是更具攻击性的并且引起更高水平的并发症和死亡率。在2009年，不利情况发生，其与高致病性流感病毒A(H1N1)pdm/09有关。疾病由具有新抗原决定簇的流感病毒引起。具体而言，专家担心这样的事实：新病毒是病毒的重排列，其在动物(猪)和人二者中传播。根据WHO，对于A(H1N1)pdm/09，与感染的人接触的人类的传染率为22％到33％。相比之下，季节性流感的模拟比率的范围为从5％到15％。
鉴于疫苗的开发，病毒表面蛋白血细胞凝集素(HA)是特别感兴趣的。HA负责病毒结合至细胞受体并且以这样的方式易感染疾病。HA的突变通常导致流行病学的和有时广泛流行的病毒潜能的增强。
正在针对病毒蛋白的抗原决定簇——表位开发B-细胞和T-细胞应答。针对病毒性感染即流感病毒的免疫——基于使用由病毒表位表示的氨基酸序列——显示对于针对病毒的免疫应答的开发大有希望并允许对于季节性感染发作和大流行病二者的预防创建通用疫苗。在一种构建体中使用不同病毒亚型的抗原决定簇使多价疫苗的生产更容易并允许创建针对新病毒毒株的有效疫苗。
创建通用疫苗是必要的，其将能够提供针对现有的和可能的重排列流感病毒毒株的防卫。基于重组蛋白的疫苗的使用允许避免甚至与灭活病毒的注射关联的风险。最近已经进行了许多尝试来创建这样的通用安全的疫苗。
存在这样的发明，根据该发明，编码禽流感病毒的多表位血细胞凝集素的基因在载体构建体内使用，用于在植物中生产重组多表位疫苗(RU 2008139004 A,01.10.2008)。在专利申请US 2009106864(2009)和RU 2008139004中，作者使用A型禽流感病毒血细胞凝集素的共有序列，最优化密码子用于在植物中表达。在专利申请JP2009102416(2009)中，作者在昆虫细胞中使用杆状病毒构建体，用于表达A型和B型流感病毒的血细胞凝集素。这些方法的缺点是使用来自仅一种流感病毒亚型(H5N1)的蛋白(血细胞凝集素)序列。这使疫苗活性谱变窄。而且，与在大肠杆菌中的表达相比，在植物和昆虫细胞中的表达提供更低的蛋白产率。
已知数种融合多肽，其包括与包含五种免疫显性的抗原表位的A型流感病毒的表面HA-蛋白具有高同源性百分比的序列(RU 92004487,10.12.1992)。这些多肽的建议应用中的一种是提供针对相应抗原的疫苗，用于治疗和预防(包括免疫治疗方法)以防被这类抗原感染。然而，没有规定使用哪种亚型的血细胞凝集素。在开发通用疫苗的过程中，也应当考虑B型流感病毒的血细胞凝集素的抗原决定簇，因为疫苗的免疫原性由其序列被使用的毒株限制。
已知多价流感疫苗包含多价抗流感抗原、佐剂、提供疫苗渗透的药剂和可接受的赋形剂(CN101450209,31.12.2008)。由H1-H16和N1-N9表示的抗原称为抗原组分。还已知多价流感疫苗，其由表面病毒蛋白A/H1N1、A/H3N2、B型血细胞凝集素(CN101524538,26.03.2009)、佐剂-甘油或氢氧化铝组成。融合构建体中可接受的佐剂和抗原决定簇二者的使用以及使用单一蛋白类型——血细胞凝集素将允许疫苗的生产简单化并降低生产成本，因为将不再必要调整条件和控制组分生产的质量。
已知基于灭活病毒的多价疫苗。活性组分由抗原A/H1N1、H3N2、B、H5N1和A(H1N1)pdm/09表示(CN101732711,31.12.2009)。列举的抗原从灭活病毒提取，这意味着疫苗的规模扩大的生产可以被与病毒尤其是流感病毒的使用关联的可能的问题所限制。例如，必须创建适合的工作条件以处理容易传播的高度致病的病毒毒株。而且，列举的抗原为单独的蛋白质，在上面列举了使用融合构建体的优点。
本发明的原型是包含与人类细胞相互作用的流感病毒的至少四种蛋白表位的鞭毛的混合物，其中每一种蛋白表位在沙门氏菌的鞭毛蛋白中单独地表达(WO0032228,30.11.1998)。列举的表位涉及：(i)与B细胞相互作用的一种血细胞凝集素表位，(ii)血细胞凝集素(HA)或核蛋白(NP)的一种表位，其可以结合至MHC分子，用于表示辅助T细胞表面上的受体，和(iii)至少两种核蛋白(NP)表位或基质蛋白(M)，其受白种人显性并且结合至细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的MHC抗原限制。
在本发明中，鼠伤寒沙门氏菌的鞭毛蛋白FliC实现佐剂功能。由于其与Toll样受体-5(TLR-5)相互作用，FliC刺激巨噬细胞和树突细胞的成熟，这导致诱导免疫应答(McDermott P.F.，High-affinity interaction between Gram-negative flagellin and acell surface polypeptide results in human monocyte activation.Infect.Immun.-2000.–V.68.–p.:5525–5529；Means T.K.等，The Toll-like receptor 5 stimulusbacterial flagellin induces maturation and chemokine production in humandendritic cells.J.Immunol.-2003.–V.170.–p.:5165–5175)。
此时，鞭毛蛋白是最有希望且充分研究的新一代佐剂中的一种。研究结果显示与鞭毛蛋白一起接种的重组蛋白具有更高的免疫原性和抗原性质。在更短的时间记录对它们的应答并诱导更强的细胞和体液免疫应答(Balaram,2008)。
这种发明的缺点在于免疫混合物的复杂性。包含不同的A型和B型流感病毒亚型的B和T细胞表位的融合蛋白和鞭毛蛋白的使用将引发强烈的免疫应答并降低生产成本。因此，仅使用鞭毛蛋白组分是实际的。两个受体-活化位点在鞭毛蛋白的末端位点中被检测到(aa 79-117和aa 08-439)(Tonyia,2001)。
TLR-5在先天免疫的细胞、上皮和内皮细胞上表达(Sebastiani G.等，Cloningand characterization of the murine Toll-like receptor 5(Tlr5)gene:sequenceand mRNA expression studies in Salmonella-susceptibleMOLF/Eimice.Genomics.-2000.–V.64.–p.230–240；Zarember K.A.和Godowski P.J.，Tissue expression of humanToll-like receptors and differential regulation of Toll-like receptor mRNAsin leukocytes in response to microbes,their products,andcytokines.J.Immunol.-2002.–V.168.–p.554–561；Delneste,2007)。考虑到这一点，使用粘膜进行免疫是实际的，这将使免疫原的运输更容易。
发明内容
本发明具体化了基于高度纯化的融合蛋白(SEQ ID NO:1)的疫苗，所述蛋白包括A型流感病毒的蛋白H1(281-461aa)、H3(466-505aa)、H5(510-549aa)的片段、以及B型流感病毒血细胞凝集素的片段(554-593aa)、和作为佐剂的鞭毛蛋白组分——FliC1(1-169aa)和FliC2(182-276aa)；该组分经由柔性铰链连接。所表示的蛋白片段是血细胞凝集素H1、H3、H5和B的保守区。在自然发生感染的过程中，针对它们生产特异性抗体，其与A型和B型流感病毒的不同毒株之中的同源表位(homolog epitope)交叉反应。数种蛋白质的表位的使用将允许增加疫苗的功效，并且由于连接表位的柔性铰链，将提供蛋白质的正确的三维结构，这将促进每个表位充分发挥功能。
根据选择的氨基酸序列，通过参考大肠杆菌的蛋白编码基因中出现的密码子计算适当的核苷酸序列(SEQ ID NO:2)；同时，通过参考相应mRNA的dG的减少选择密码子。
本发明的应用的主要技术结果是流感疫苗的效价增加：在引入本发明要求保护的疫苗之后，形成针对A型和B型流感病毒二者的不同亚型——针对现有的和甚至针对可以由于任何其它流感病毒毒株的重排列出现的那些亚型——的免疫。在疫苗引入之后，针对来自不同的流感病毒毒株的血细胞凝集素的表位的抗体正在体内产生。因此，响应于流感病毒感染而产生抗体的能力正在形成。其后，一旦被任何流感病毒感染则免疫应答将更快形成，这将引起避免感染或者疾病将更温和。这种方法将允许消除目前疾病。
核苷酸序列的密码子最优化的技术结果是蛋白质产率增加。
因此，使用鞭毛蛋白组分作为无毒佐剂将增加免疫应答，发展为疫苗。
该技术结果也降低价格并加速疫苗生产，这是由于单组分(融合蛋白)生产代替了一组疫苗混合物(原型)组分。
为了生产本发明的融合蛋白，可以使用分子生物学和微生物学的标准方法，其对于本领域普通技术人员而言是熟悉的。这类方法在科学文献中描述。
附图描述
图1.用1LD/50的病毒A/PR/8/34(H1N1)感染后小鼠存活率的动力学。感染后的天数在横轴上展现，并且纵轴显示小鼠存活率的百分比。
图2.用1LD/50的A/California/07/09(H1N1)感染后小鼠存活率的动力学。感染后的天数在横轴上展现，小鼠存活率的百分比在纵轴上。
图3.针对В/Florida/04/06流感病毒的血清IgG。针对融合蛋白的血清IgG。血清稀释度(倒数值)在横轴上展现，并且450nm下的光密度在纵轴上。
图4.针对融合蛋白的血清IgG。血清稀释度(倒数值)在横轴上展现，并且450nm下的光密度在纵轴上。重组蛋白以3μg/ml的浓度截留。
实施例1.融合蛋白的建模
计划的融合多肽是复杂的多结构域蛋白质(6个结构域：FliC1、FliC2、H1、H3、H5、B)。为了多结构域蛋白的建模，进行以下步骤：估计结构域边界(boarder)；构建全蛋白的模型，用于估计结构域的取向；为每个结构域构建模型(使用3D结构的例子和基于从头开始的建模)；使用全蛋白的模型对接模型。
在计划的融合多肽中，两个结构域具有原型并且其四个需要基于从头开始的建模；而且在基于从头开始的建模期间，结构域之间的柔性铰链必须形成。
为了在自动模式中生成现实的结果，使用I-Tasser算法，其在最后三种蛋白-建模竞争-CASP(蛋白质结构预测的关键评估)中被认为是最佳的。该分析进行五天。然而，即使通过这种强算法，为包括基于从头开始建模的结构域和其边界的多结构域蛋白生成现实的数据不是充分有效的(70％)。
为了生成更准确数据的目的，将蛋白质分裂成使用的结构域，然后使用I-Tasser，在它们的对接之后，进行它们的建模。
在上面所提及的所有步骤之后，构建结果显示在图1、2中。
建模的融合蛋白由593个氨基酸残基构成；给出了其氨基酸序列——SEQ ID NO:1。经由ProtParam程序(http://au.expasy.org/tools/protparam.html)分析该蛋白质的氨基酸序列已经显示融合蛋白的分子量为63.6kDa，pI 6.2。
实施例2.编码融合蛋白的核苷酸序列的产生。
将包括FliC1、FliC2、H1、H3、H5、B片段的融合蛋白的氨基酸序列翻译成核苷酸序列(1785bp)，其然后被优化用于在大肠杆菌细胞中表达(SEQ ID NO:2)。
根据所描述的方法(Majumder,1992)，当前核苷酸序列的合成经由延伸重叠的寡核苷酸进行。寡核苷酸表示70个核苷酸长度的融合基因的片段，其包含20个核苷酸的重叠区。主要引物要求如下：它们的长度应当不超过60个核苷酸，同时融合(fusionization)位点应当不短于20个核苷酸。而且，不应当存在长末端G/C重复。在某些情况下，最佳引物的选择经由引物-模板运动或3-6核苷酸的引物长度变化按经验进行。总之，为了合成1785bp长度的融合基因，使用65种引物。合成的片段(每个300bp)经由凝胶电泳提取并被克隆入质粒载体pGEM-T Easy。根据具体情况，使用限制性位点KpnI、SacII、EcoRV、BamHI或经平末端进行克隆。测序之后，片段被扩增，并且然后经由聚合酶链反应(PCR)连接入融合蛋白的核苷酸序列。在经由DNA片段连接的融合基因合成的最后阶段之后，经由KрnI和SacI限制性位点将人工基因克隆入pGEM-T载体。产生的基因的两侧是额外的限制性位点：5'端的EcoRI和3'端的XhoI。然后，经由EcoRI和XhoI限制性位点将人工基因再克隆入表达载体pET24a。
实施例3.编码融合蛋白的质粒DNA的产生。
为了产生流感疫苗的目的，根据实施例2中描述的方法，获得核苷酸序列。
为了在大肠杆菌细胞中随后表达的目的，将得到的基因克隆入pET24a质粒。因此，经由适当的缓冲液和连接酶进行基因和pET24a载体的连接。反应在+20℃下进行2小时。
将混合物在+95℃下升温10min。然后，经由透析通过具有0.025μm孔径的硝酸纤维素滤膜(Millipore,USA)去除盐。透析针对在10％的甘油中包含0.5mM EDTA的溶液进行10min。
实施例4.产生用于扩增包含融合基因的质粒DNA的大肠杆菌菌株。
为了创建流感疫苗的目的，根据实施例3中描述的方法，产生基因的核苷酸序列，并且然后将其克隆入pET24a载体。利用所得质粒经由电穿孔转化具有以下基因型的DH10B/R菌株的大肠杆菌细胞(Gibko BRL,USA)：F-mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)15ΔlacX74 deoR recA1 endA1 araD139Δ(ara,leu)769 galU galKλ-rpsL nupG。
转化之后，细胞在SOC培养基(2％细菌用胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl2、10mM MgSO4、20mM葡萄糖)中在+37℃下温育40min。
在包含LB-琼脂和100μg/ml卡那霉素的选择性培养基中筛选具有该质粒的大肠杆菌细胞后，大肠杆菌细胞的适当的菌落被取样以获得大肠杆菌菌株，用于随后扩增包含融合基因的质粒DNA。
经由Wizard Minipreps DNA纯化系统试剂盒(Promega,USA)从生长的克隆中提取质粒DNA。
纯化的质粒DNA经由限制性酶切试验(restriction assay)和测序进行分析。在研究过程中，取样在其质粒中包含需要大小的DNA片段的克隆。然后，提取这样的质粒，用于随后的基因表达的诱导。
实施例5.获得产生融合蛋白的大肠杆菌菌株。
为了产生流感疫苗的目的，根据实施例4中描述的方法，获得蛋白质的核苷酸序列，并且然后将其克隆入pET24a质粒；所得质粒在DH10B/R菌株的大肠杆菌细胞中扩增，然后提取。
为了表达蛋白质，使用具有如下基因型的BL21 Star菌株的大肠杆菌细胞(DE3)(Invitrogen,USA)：在基因组中包含λDe3溶源体和rne131突变的F-ompT hsdSB(rB-mB-)gal dcm rne131(DE3)。突变体rne-基因(rne131)编码短译本的RNase E，使得细胞内mRNA降解降低并且其发酵稳定性增加。蛋白酶基因中lon-和оmpТ-突变允许获得高产率的未蛋白水解的(non-proteolyzed)重组蛋白。
具有基因型F-ompT hsdSB(rB-mB-)gal dcm rne131的BL21菌株的大肠杆菌细胞(DE3)如下制备。细胞在+37℃下在包含1％胰蛋白胨、1％酵母提取物和1％氯化钠的5ml溶菌肉汤(L-broth)中温育过夜。将培养物在新鲜的溶菌肉汤中稀释50-100倍并且在+37℃下的振荡培养箱中培养，直到在590nm下检测到0.2-0.3的光密度。达到0.3OD之后，在新鲜的溶菌肉汤中稀释培养物直到0.1OD，并培养30min。将100ml体积的培养物转移到无菌离心管中，细胞在+4℃、5000g下进行10min沉淀。丢弃上清液，并将细胞在随后离心下重悬在去离子水中至初始体积。重复洗涤步骤三次。洗涤之后，将细胞沉淀重悬在小体积的去离子水中并且将悬浮液在5000rpm下在微型离心机中离心30秒。
感受态细胞的转化经由电穿孔进行。因此，将1μl的质粒DNA加入到12μl的感受态细胞中，并且混合悬浮液。随后的电穿孔经由脉冲发生器GVI-1(St.Petersburg StatePolytechnical University,St.Petersburg)在无菌室中在10kV/cm下进行4毫秒。
转化之后，细胞在SOC培养基(2％细菌用胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl2、10mM MgSO4、20mM葡萄糖)中在+37℃下温育40min。将10-100μl细胞悬浮液转移到包含卡那霉素(100μg/ml)的选择性LB培养基(Gibco BRL,USA)，用于选择具有该质粒的克隆(生产菌株)。
大肠杆菌感受态细胞的转化之后获得的质粒提供编码的重组蛋白的高水平表达。
实施例6.根据Studier方法经由通过0.2％乳糖诱导蛋白质合成在大肠杆菌细胞中产生用于创建流感疫苗的融合蛋白。
根据实施例5中描述的方法，获得用于创建流感疫苗的融合蛋白的核苷酸序列并将其克隆入pET24a质粒；获得的质粒在DH10B/R菌株的大肠杆菌细胞中扩增、提取，和从而为了诱导靶基因表达的目的，转化BL21菌株的大肠杆菌细胞。
为了培养获得的生产菌株的目的，使用用于阻断非特异性表达的包含卡那霉素(100μg/ml)和1％葡萄糖的标准琼脂化(agarized)LB培养基。
在细胞培养物在600nm下已经达到0.6-0.8的光密度之后，诱导表达。使用0.2％乳糖作为诱导物(Studier,2005)。
为了根据Studier的方法(Studier,2005)自身诱导表达，使用PYP-5052培养基，其包含1％蛋白胨(Gibco,USA)、0.5％酵母提取物(Gibco,USA)、50mM Na2HPO4、50mM K2HPO4、25mM(NH4)2SO4、2mM MgSO4、0.5％甘油、0.05％葡萄糖和0.2％乳糖。
将单个生产菌株菌落接种至包含卡那霉素(100μg/ml)的PYP-5052培养基内。发酵在+37℃下在250rpm下的恒温摇床中进行20小时，直到每小时测量的OD600没有显著改变。为了表达分析编码疫苗蛋白的基因的目的，采取细胞的等分试样。表达分析经由聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)进行。剩余的生物质在离心机中在9000g下沉淀。
蛋白质经由细胞裂解从大肠杆菌细胞提取。以1g细胞/5-7ml缓冲液将细胞重悬在裂解缓冲液中，所述缓冲液包含20mM tris-HCl pН 7.5、5mM EDTA和1mM苯氧基甲基磺酰氟(PMSF)。将细胞悬浮液暴露于超声7次，每次持续30秒，间隔为30秒(22kHz)。裂解物在+4℃、5000g下离心10min。丢弃上清液，并以10ml/1g细胞将沉淀通过强烈混合重悬在1M尿素溶液中。重复离心步骤。丢弃上清液，并将沉淀重悬在相同体积的2M尿素溶液中。重复离心步骤。丢弃上清液。
根据SDS-Page(利用十二烷基硫酸钠的聚丙烯酰胺凝胶电泳)数据，获得的产物包含大约98％的1mg/ml浓度的融合蛋白。
提取和纯化条件根据实验调整并且可以以本领域普通技术人员熟悉的一些程度变化。
实施例7.获得纯化的融合蛋白制剂
将MgCl2加入到融合蛋白溶液以达到6mM的浓度。融合蛋白经由固定化金属亲和层析(IMAC)使用Ni-NTA琼脂糖凝胶纯化。由于在获得的重组蛋白的N-末端上的6个组氨酸残基，通过该吸附剂进行捕获。经由具有0.22μm孔径的PVDF过滤器进行蛋白质溶液过滤。向如此获得的滤液中提供吸附剂——Ni-NTA琼脂糖凝胶，其利用重折叠(refolding)缓冲液平衡，使得允许这样的事实：1ml吸附剂可以结合不超过40mg的蛋白质。捕获进行2小时。经由离心使吸附剂沉淀并转移到包含2ml吸附剂的重力层析柱中。
分级梯度洗脱利用20-300mM咪唑通过在每步中递增50％的前浓度，使用柱体积的5-20倍体积的洗脱液进行。蛋白质的产率和纯度经由圆盘电泳和Bradford蛋白质测定控制。
为了测定内毒素含量，制备具有4000EU限定效价的标准内毒素原液。当在+4℃下保藏时，产生的溶液稳定至少两周。使用无内毒素的水在无菌聚苯乙烯管中制备2倍连续稀释液。利用无内毒素石蜡膜密封管。样品的5倍连续稀释液和预备内毒素含量评估后的2倍连续稀释液被制备。将样品、水、100μl内毒素和最后100μl反应性LAL放置在每个微量离心管的底部。混合物在水浴中37℃下温育1小时。通过在倒置的管底部上存在或不存在坚实凝块估计结果。
显示在分析的样品中不存在抑制凝块形成的因素。凝胶凝块在1/8样品稀释下形成，这意味着，考虑到0.03EU/ml的方法灵敏度，具有50μg/ml浓度的样品包含少于100EU。
在诱导表达之后，在大肠杆菌中重组融合蛋白的生物合成期间其构象经由通过声波处理破裂的大肠杆菌细胞的聚丙烯酰胺不连续电泳进行测定。此外，分析在细胞裂解物的沉降之后形成的沉淀和上清液二者。光密度测定分析表明，在大肠杆菌生产菌株中合成的100％的重组蛋白在上清液即可溶部分中集聚。
不同温度：20℃、30℃和37℃下细菌的培养不影响蛋白质溶解度。
在利用0.2％乳糖在大肠杆菌中自身诱导表达和随后的细胞裂解物的聚丙烯酰胺圆盘电泳之后，在大肠杆菌中进行靶蛋白表达的光密度测定分析。光密度测定分析表明，融合蛋白集聚并且总计43％的总细胞蛋白质含量。
获得的表达水平在6次传代的生产菌株中不改变，这表明了所分析基因的稳定表达。
实施例8.经由具有连续营养物供应的大肠杆菌细胞的培养产生重组融合蛋白(优选的营养物：葡萄糖和酵母提取物)。
为了产生融合蛋白的目的，使用大肠杆菌菌株的补料分批培养。当必须避免基质限制和其负面结果时，优选该方法。因此，基质或任何其它必需组分连续地被供应，或者响应于传感器信号供应。为了优化在培养基中分泌的产物的产率的目的，增加细菌细胞的生物合成能力是重要的，同时培养模式将延长第二生长期并增加细胞外代谢物的产率。可以在潜在地有毒基质(重组蛋白对于大肠杆菌细胞是有毒的)的情况下使用该方法，因为其在培养基中的浓度将保持在低水平。
由于克服产物合成的分解代谢产物阻遏，基质摄取的速度可以被其运输速度限制。
补料分批培养好像是实现高细胞密度和高生产力的最有效的方式。
大肠杆菌菌株在无菌条件下在倾斜的(angular)包含EDTA的琼脂上传代并在恒温箱中温育5天。为了获得接种物，培养物从琼脂中洗出，传代至液体的包含EDTA的培养基中，并培养3-4天。然后，将10ml接种物在包含200ml无菌液体培养基的750-ml烧瓶内传代，并在150-200rpm下，在28℃-30℃下在恒温摇床中培养10天。
凝胶生长培养基用于获得新鲜的菌株培养物。
液体生长培养基用于获得种子材料和用于定期培养。
液体生长培养基的制备
1)MgSO4*7H2O 10ml/l
2)CaCl2*2H2O 20ml/l
3)KH2PO4+NaH2PO4*12H2O 10ml/l
4)EDTA 10ml/l
5)微量元素1ml/l
(рН调节至4.2)+5.6g/l EDTA：
FeCl2*4H2O 1.5g/l
H3BO30.06g/l
MnCl2*6H2O 0.1g/l
CaCl2*6H2O 0.12g/l
ZnCl20.07g/l
NiCl2*6H2O 0.025g/l
CuCl2*2H2O 0.015g/l
Na2MoCl40.025g/l
6)维生素
吡哆醇 20mg
硫胺素 10mg
核黄素 10mg
烟酸 10mg
4-氨基苯甲酸 10mg
α硫辛酸 10mg
烟酰胺 10mg
维生素 В12 10mg
生物素 4mg
叶酸 4mg
将所有的组分溶于200ml水中，在0.5atm下灭菌30min，并在1ml/l的速度下加入到液体营养肉汤培养基中。
生长培养基的复合物在技术和分析天平上称重并溶于蒸馏水。根据先前的经验，我们用预灭菌的浓缩溶液制备了生长培养基。
生产作为液体和具有3％琼脂二者的凝胶生长培养基。
大肠杆菌细胞培养物的光密度(OD600)为9。细胞经由在13000g下、在10℃下离心6min而沉淀。称重细胞沉淀；其重量为2.1g。
将细胞重悬在30ml缓冲液(50mM TrisHCl、50mM EDTA、20mM L-半胱氨酸，pH 8.6)中并通过超声(声波处理时间-10min，脉冲时间-30秒，脉冲之间的间歇-30秒，振幅-70％)破裂。细胞破碎之后，包涵体在30000g、10℃下离心20min沉淀；包涵体的湿重为1.45g。沉淀的包涵体利用数种缓冲液根据以下方案洗涤：
1.将含有包涵体的沉淀重悬在10ml(最后一次洗涤-15ml)洗涤缓冲液中
2.重悬的包涵体在水平摇床上在室温下混合1小时
3.包涵体经由在30000g下在10℃下离心20min而沉淀
五次洗涤步骤之后，包涵体的湿重为0.7g。
为了将蛋白质溶解出包涵体的目的，使用18ml溶液(9M尿素，2mM EDTA，50mM TrisНCl，pH 8.6)。溶解的包涵体在30000g下在10℃下离心20min。将形成的上清液转移到新的falcon离心管中并用于重折叠。
重折叠步骤如下进行：溶解的包涵体在重折叠缓冲液中在+4℃下逐滴10倍稀释。将MgCl2加入到重折叠的蛋白质中直到6mM。蛋白纯化经由固定化金属亲和层析(IMAC)使用Ni-NTA琼脂糖凝胶进行。蛋白溶液经由具有0.22μm孔径的PVDF过滤器过滤。向如此获得的滤液中提供吸附剂——Ni-NTA琼脂糖凝胶，其利用重折叠缓冲液平衡，考虑到这样的事实：1ml吸附剂可结合不超过40mg的蛋白质。捕获进行2小时。吸附剂经由离心沉淀并在包含2ml吸附剂的重力层析柱上以最小体积提供。
分级梯度洗脱利用20-300mM咪唑(20、40、100、150、200、300mM)进行，然而在每步中洗脱液的体积是柱体积的10倍。
以这种方式，获得41mg具有97％纯度的融合蛋白。
实施例9.在稀释之前产生被纯化的融合蛋白，和经由利用包含盐酸胍(guanidinehydrochloride)洗涤剂的缓冲液洗涤去除包括DNA、RNA、蛋白质、脂多糖的可溶性细胞组分。
发酵、细胞破碎和洗涤包涵体之后(参见实施例8)，将蛋白质溶解在包含盐酸胍(guanidinium chloride)的18ml溶液(8M GuHCl，2mM EDTA，50mM TrisHCl，pH 8.6)中。溶解的包涵体在30000g下在10℃下离心20min而沉淀。将获得的上清液转移到新的falcon离心管中并用于重折叠。
然后，进行重组蛋白的重折叠和纯化(参见实施例8)。作为纯化的结果，获得41mg具有98％纯度比率的融合蛋白。
实施例10.测定获得蛋白的免疫原性。
进行获得蛋白的免疫原性测试。免疫原性是抗原开始产生通过免疫系统中和抗原异质成分(foreignness)的效应物的能力。为了诱导免疫应答，抗原应当是免疫原性的。要强调的一点是免疫原性是复杂的特征，其取决于抗原本身的特性、其渗透方式和免疫方式。
利用20μg融合蛋白腹内免疫小鼠。免疫进行两次，间隔开两周。将动物分开成实验组和对照组，在每组中具有5-6只小鼠。
第二次免疫之后两周，从来自每组的5-6只小鼠的尾静脉采集血样。为了获得血清，血液在37℃下温育30分钟。凝块形成之后，将样品转移到冰上，冷却1小时，并且然后在400g下离心15分钟。合并来自每组的小鼠血清并在-20℃下冷冻。
免疫的小鼠的血清中的抗体滴度经由酶联免疫吸附试验(ELISA)测定。ELISA根据常规技术进行。使用96孔板(Greiner,Germany)，在其上融合蛋白被吸附(在碳酸盐缓冲液中，pH 9.5-9.6)并在4℃下温育过夜。
融合蛋白如下被变性。向蛋白样品中加入洗涤剂吐温20，直到达到1％(w/v)的终浓度。接着，样品在37℃下的水浴中温育1小时。温育步骤之后，样品在200℃和2000g下离心1小时，并采集包含融合蛋白的上清液。经由Detergent-OUTtmMicro试剂盒(Millipore)消除(liquidate)洗涤剂；无洗涤剂的样品在SpeedVac上浓缩直到初始体积。在随后的针对碳酸盐缓冲液(рН＝8.5)的透析过夜之后，利用8M尿素和二硫苏糖醇(0.02M)进行产物的额外处理。
微量滴定板通过封闭缓冲液(0.01M PBS，pH＝7.2-7.4，具有5％FCS)在室温下处理1小时，然后用包含吐温20的PBS洗涤三次。将在封闭缓冲液的100μl两倍血清稀释液(开始于1∶200)给予到板孔中并在室温下温育1小时。将血清一式二份进行分析。作为缀合物，使用1∶8000稀释的多克隆兔抗小鼠辣根(radish)过氧化物酶-缀合的IgG抗体(Abcam,UK)。TMB用作底物。检测在450nm下进行。端点滴度是最高稀释液，其给出高于阴性对照——相同稀释下非免疫小鼠的血清——2个标准差的光密度。
结果显示获得蛋白的高免疫原性。利用融合蛋白免疫之后，检测到对抗原的抗体，滴度是51200。
因此，表明利用融合蛋白免疫的小鼠中强免疫应答的形成。
实施例11.基于针对不同流感病毒毒株的融合蛋白的疫苗的保护作用。
在本研究中，使用30只7-8周龄(16-18g重)的Balb/c母小鼠，其接收自Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry,RAS(IBCh RAS)的分部——AnimalsBreeding Center“Pushchino”。实验室动物是健康的并且无寄生虫(2012年11月27日的兽医证书250№0187942)。根据现有卫生条例，将动物保存在Ministry of Healthcare ofthe Russian Federation Research Institute of Influenza的动物设施中。
利用20μg的重组融合蛋白腹内免疫小鼠。免疫进行两次，间隔两周。
为了分析融合蛋白对致命流感感染的模型的保护作用，使用小鼠适应流感病毒毒株A/California/07/2009(H1N1)和A/PR/8/34(H1N1)。对Balb/c小鼠系(母小鼠，6-7周龄)进行引起50％动物死亡的剂量的病毒滴定法的测定。使冷冻的病毒解冻，经由引入10倍病毒稀释液(4只小鼠预稀释)估计小鼠致死剂量(引起50％死亡)。引入后监测小鼠14天。使用Reed和Muench数学技术估计病毒滴度。利用1LD/50(引起小鼠50％死亡率的剂量)和5LD/50(引起小鼠90％死亡率的剂量)的剂量以50μl/小鼠的比率在轻微乙醚麻醉下给小鼠鼻腔接种。引入之后，监测动物14天。
在引入后的第六天小鼠开始死亡。对照组的存活率为43％。在实验组中，观察到100％的存活率(图1)。
在引入后的第六天小鼠开始死亡。对照组的存活率估计42％。在实验组中，观察到100％的存活率(图2)。
实施例12.经由利用融合蛋白的小鼠免疫对不同A型和B型流感病毒株形成多价免疫应答。
在本研究中，使用30只7-8周龄(16-18g重)的Balb/c母小鼠，其接收自Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry,RAS(IBCh RAS)的分部–AnimalsBreeding Center“Pushchino”。实验室动物是健康的并且无寄生虫(2012年11月27日的兽医证书250№0187942)。根据现有卫生条例，将动物保存在Ministry of Healthcare ofthe Russian Federation Research Institute of Influenza的动物设施中。
利用20μg/200μl的融合蛋白腹内免疫小鼠。免疫进行两次，间隔两周。将动物分开成实验组和对照组，在每组中具有5-6只小鼠。
第二次免疫之后两周，从来自每组的5-6只小鼠的尾静脉采集血样。为了获得血清，将血液在37℃下温育30分钟。凝块形成之后，将样品转移到冰上，冷却1小时，然后在400g下离心15分钟。合并来自每组的小鼠血清并在-20℃下冷冻。
免疫的小鼠血清中的抗体滴度经由酶联免疫吸附试验(ELISA)测定。ELISA根据常规技术进行。使用96孔板(Greiner,Germany)，在其上来自毒株A/California/07/09(H1N1)、A/PR/8/34(H1N1)、A/Perth/16/09(H3N2)、A/Chicken/Kurgan/05/2005(H5N1)的抗原以2μg/ml的浓度(在碳酸盐缓冲液中，pH 9.5-9.6)被吸附并在4℃下温育过夜。
融合蛋白如下被变性。向蛋白样品中加入洗涤剂吐温20，直到达到1％(w/v)的终浓度。接着，样品在水浴中在37℃下温育1小时。温育步骤之后，样品在200℃和2000g下离心1小时，并采集包含融合蛋白的上清液。经Detergent-OUTtmMicro试剂盒(Millipore)消除洗涤剂；无洗涤剂的样品在SpeedVac上浓缩直到初始体积。在随后的针对碳酸盐缓冲液(рН＝8.5)的透析过夜之后，利用8M尿素和二硫苏糖醇(0.02M)进行产物的额外处理。
微量滴定板通过封闭缓冲液(0.01M PBS，pH＝7.2-7.4，具有5％FCS)在室温下处理1小时，然后用包含吐温20的PBS洗涤三次。将在封闭缓冲液中的100μl两倍血清稀释液(开始于1∶200)给予到板孔中并在室温下温育1小时。将血清一式二份进行分析。使用1∶8000稀释的多克隆兔抗小鼠辣根过氧化物酶-缀合的IgG抗体(Abcam,UK)作为缀合物。TMB用作底物。检测在450nm下进行。端点滴度是最高稀释液，其给出高于阴性对照——相同稀释下非免疫小鼠的血清——2倍标准差的光密度。
表1.利用融合蛋白双倍免疫小鼠之后的血清抗体(IgG)的滴度。
在利用融合蛋白免疫的过程中，在鼠科动物血液中发现针对所有检查的A型流感病毒毒株的抗体，在H3N2 A/Perth/16/09的情况下比率1∶3200，在H1N1 A/California/07/09的情况下比率上至1∶51200。
因此，证明了在利用融合蛋白免疫的小鼠中针对A型和B型流感病毒的不同毒株形成了多价免疫应答。
实施例13.利用灭活的B型流感病毒免疫动物之后形成的抗体结合融合蛋白的能力。
在本研究中，使用2-2.5kg重的来自毛丝鼠属的兔子。兔子取自Russian Academyof Medical Sciences,village Rappolovo,Leningrad oblast的实验室动物银行。根据现有卫生条例，动物保存在North-West Branch of the Russian Academy of MedicalScience的动物设施中。
利用灭活的B型流感病毒免疫动物之后形成的抗体结合融合蛋白的能力对兔子进行研究。利用灭活的流感病毒В/Florida/04/以及109PFU剂量的弗氏佐剂皮下免疫动物两次，间隔一个月。第二次免疫后1.5个月，从耳静脉采集血样。针对流感病毒В/Florida/04/06和融合蛋白的血清抗体(IgG)滴度经由ELISA估计(抗兔Ig-HRP缀合物，Sigma-Aldrich，A6154，1∶5000稀释)。来自非免疫兔的血清用作阴性对照。进行的研究的结果表明针对流感病毒В/Florida/04/06的表面蛋白的抗体能够结合融合蛋白；针对融合蛋白的抗体的滴度为1∶204000。
针对流感病毒毒株В/Florida/04/06和融合蛋白的血清抗体(IgG)滴度经由ELISA估计(抗兔Ig-HRP缀合物，Sigma-Aldrich，A 6154，1∶5000稀释)。结果在图3和图4中显示。ELISA中针对流感病毒毒株В/Florida/04/06和融合蛋白的抗体的滴度相应地为409’600和204’800。
因此，针对A型和B型流感病毒的免疫多价融合蛋白已经被证明。

Claims (3)

1.多价流感疫苗，其包括陈述为SEQ ID NO:1的融合蛋白，所述融合蛋白包含A型流感病毒的蛋白H1、H3、H5的片段，B型流感病毒的血细胞凝集素的片段，鞭毛蛋白组分，其经由柔性铰链连接，其中所述鞭毛蛋白组分起佐剂的功能。
2.根据权利要求1所述的多价流感疫苗，其特征在于以下事实：所述融合蛋白以陈述为SEQ ID NO:2的核苷酸序列编码。
3.根据权利要求1或2所述的多价流感疫苗，其特征在于由于下述步骤而生产：创建编码根据权利要求1所述的融合蛋白的重组DNA，将该DNA插入至载体构建体中用于在大肠杆菌的细胞中表达，将该载体构建体转移到大肠杆菌的细胞中，在大肠杆菌细胞中产生所述融合蛋白，提取、纯化所述融合蛋白，和与生理上可接受的赋形剂混合。
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