CN104983671B - 重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子阴道膨胀栓及其制备方法和检测方法 - Google Patents

重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子阴道膨胀栓及其制备方法和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子(rhGM‑CSF)阴道膨胀栓及其制备方法和检测方法，所述膨胀栓包括主要由rhGM‑CSF和基质形成的含药基质和膨胀载体；含药基质中克拉替醇、海克西定和角叉菜胶能的加入可以降低降低rhGM‑CSF的有害变化，增加栓剂的稳定性；进一步所述栓剂的含药基质中还包括低芥酸菜籽油和波拉克林钾,所述低芥酸菜籽油和波拉克林钾协同作用，可以增加主要活性成分rhGM‑CSF的溶出度，且同时促进皮肤黏膜对药物的吸收，从而进一步提高栓剂的生物利用度；并且本发明所提供的rhGM‑CSF阴道膨胀栓采用了独创的六项领先技术，具有防止药液外流，稳定性高，疗效持久，防止二次感染等有益效果。

Description

重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子阴道膨胀栓及其制备方法和 检测方法
技术领域
本发明属于阴道栓剂领域，特别涉及一种重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子阴道膨胀栓及其制备方法和检测方法。
背景技术
重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子(rhGM-CSF)是由活化的T细胞、B细胞、巨噬细胞、肥大细胞、内皮细胞及成纤维细胞等细胞产生并分泌的一种酸性蛋白质。rhGM-CSF具有生白细胞的作用，是一种调节造血和白细胞功能必须的细胞生长因子，它能够全面改善慢性溃疡的病理特征，促进创伤修复，增强粒细胞和巨噬细胞的杀菌能力，在机体内广泛参与免疫及抗感染等过程。
近些年，由于基因工程技术可以大量的生产出rhGM-CSF，从而促进了对其的研究和临床应用，是已正式投放市场的细胞因子之一，且临床应用非常广泛，涉及很多领域。目前rhGM-CSF的临床应用主要包括：在肿瘤性疾病中的应用、在骨髓移植中的应用、抗感染治疗中的应用及促进伤口愈合中的应用等。
宫颈炎(cervicitis)及诱发宫颈糜烂是已婚妇女的多发病，据统计已婚妇女宫颈炎发病率高达36.9％。目前，临床上对于宫颈炎的治疗，在排出早期宫颈癌之后，多以局部治疗为主。对于糜烂面积小或炎症浸润较浅的病例可用腐蚀性药物局部敷用；糜烂面积大或炎症浸润较深的病例，可用冷冻、激光或电熨疗法；急性宫颈炎一般口服广谱抗生素治疗。上述临床治疗方法的局限性在于药物都不能深入达到炎性组织，因此患者远期效果不满意，即使近期有疗效，但是不久又会复发。
rhGM-CSF有清除坏死组织、趋化血液循环中单核细胞进入组织成为巨噬细胞、活化炎症局部聚集的巨噬细胞和中性粒细胞的功能。活化的巨噬细胞和中性粒细胞可以产生和分泌胶原酶、弹性蛋白酶、纤溶酶激活剂等；另外，内皮细胞和上皮细胞表面含有rhGM-CSF受体，rhGM-CSF可以直接促进内皮细胞迁移、增生及活化，使新的鳞状上皮覆盖创面，最终使得疾病得到彻底治疗。
迄今为止，rhGM-CSF外用制剂用于治疗宫颈炎和宫颈糜烂的研究工作及相关文献还较为少见。另外，rhGM-CSF作为一种蛋白质，本身性质不稳定，很容易发生脱氨作用、氧化作用、水解作用、二硫键的错配及变性、聚集、沉淀等现象；同时其分子较大，并具有一定的空间结构，在释放过程中更容易受到空间位阻的影响，影响其药物释放效果。专利申请CN200510085861.5中公开了粒细胞巨噬细胞刺激因子治疗宫颈炎和宫颈糜烂外用制剂的新用途，但其未对其栓剂中rhGM-CSF稳定性进行考察，没有解决栓剂的长期贮存、运输等问题。
发明内容
为了解决上述技术问题，增加rhGM-CSF的稳定性，充分发挥疗效，本发明研究了一种rhGM-CSF阴道膨胀栓及其制备方法；同时还提供了一种能够控制上述rhGM-CSF阴道膨胀栓产品质量的科学检测方法。
本发明具体技术方案如下：
一种重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子(rhGM-CSF)阴道膨胀栓，所述膨胀栓包括含药基质和可膨胀的膨胀载体；所述含药基质主要由rhGM-CSF和基质制成，含药基质涂敷在膨胀载体表面，所述膨胀载体在饱和吸水后的膨胀值大于1.1，所述膨胀栓各成分的重量份数为：
重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子 0.005-0.18
基质 166-300
膨胀载体 185-500
所述基质选自合成脂肪酸酯、天然脂肪酸酯、类脂类基质、水溶性基质、凝胶基质、氢化油、甘油酯、分馏油、硬脂酸酯或胶体化合物中的一种或多种；
所述合成脂肪酸酯选自混合脂肪酸甘油酯、硬脂酸丙二醇酯、硬化油、半合成脂肪酸甘油酯、半合成椰油酯、Witepsol、半合成棕榈油酯或半合成山苍子酯中的一种或多种；
所述天然脂肪酸酯选自乌桕脂、香果脂、茴香脂、柯克姆脂或可可豆脂中的一种或多种；
所述类脂类基质选自羊毛脂或羊毛醇；
所述水溶性基质选自聚乙二醇400、聚乙二醇1500、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、甘油明胶、吐温60、吐温65、聚氧乙烯缩合物Idropostal、聚氧乙烯单硬脂酸酯或泊洛沙姆中的一种或多种；
所述凝胶基质选自羧甲基纤维素钠、羟丙甲纤维素、卡波姆、海藻酸或海藻酸钠中的一种或多种；
所述氢化油选自氢化花生油、氢化蓖麻油或氢化棉籽油中的一种或多种；
所述甘油酯选自Adeps Solidus、Massa Estarinum(饱和12-18碳脂肪酸的甘油酯)A、Massa Estarinum AS、Massa Estarinum B、Massa Estarinum C、Massa EstarinumD、Massa Estarinum E、Massa Estarinum I、Massa Estarinum T、Massa Mf13、Suppository Base W、Suppository Base AB、Suppository Base A、Suppository Base B、Suppository Base BC、Suppository Base BD、Suppository Base BBC、Suppository BaseE、Suppository Base BCF、Suppository Base C、Suppository Base D、Suppository Base299、Wecobee W、Wecobee K、Wecobee S、Wecobee M、Wecobee ES、Massuppol、Massuppol15、Suppocire OSI、Suppocire OSIx Suppocire A、Suppocire B、Suppocire C、Suppocire D、Suppocire DM、Suppocire H、Suppocire L、Tegester Triglyceride Bases-9、TegesterTriglyceride Bases-MA、Tegester Triglyceride Bases-57、甘油三棕榈酸酯、甘油三硬脂酸酯、甘油山萮酸酯或月桂酸甘油三酯中的一种或多种；
所述分馏油选自分馏棕榈油或分馏椰子油；
所述硬脂酸酯选自木糖醇酐单硬脂酸酯、硬脂酸棕榈甘油酯、聚乙二醇单硬脂酸酯、乙二醇单硬脂酸酯或单硬脂酸甘油酯中的一种或多种；
所述胶体化合物选自阿拉伯胶、明胶或果胶中的一种或多种。
本发明所述的英文名称的基质收录于《工业药剂学理论与实践》书中(L.拉赫曼,H.A.利伯曼,J.L.卡尼希.工业药剂学理论与实践,化学工业出版社,第二版：215-217)。
本发明采用了独创的“阴道内贴附式给药技术”，该技术通过在栓剂中加入膨胀载体来实现。普通栓剂由于重力的关系，无论使用者是在站立、坐式或躺式体位下，总有阴道不能或较少接触到含药基质，所述的膨胀载体膨胀后，含药基质可呈360°与阴道内壁接触，充分给药，给药面积扩大6倍，药物直接贴附到病灶部位，使原来无法接触药物的部位也能得到有效贴附治疗；并且由于药栓在阴道当中起到的隔离作用，使创面之间不再互相接触，从而避免二次感染，使其不再反复发作。此外，膨胀载体的引入应用了“防侧漏栓体”设计理念，因为膨胀载体尾端(非含药基质)的膨胀，可以与阴道壁紧贴，进而防止药物和基质的外流，减少衣物的污染和保持药物的有效浓度。并且通过“内芯膨胀系数控制技术”，可使膨胀载体在饱和吸水后的膨胀值大于1.1。
进一步，所述膨胀栓各成分的重量份数为：
重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子 0.05-0.1
基质 180-235
膨胀载体 205-423
所述基质为甘油酯、水溶性基质和胶体化合物的混合物，所述甘油酯、水溶性基质和胶体化合物的重量份数为2-4:7-10:1。rhGM-CSF与水溶性基质制成栓剂后，可以有效克服栓剂熔点低，保存困难等问题；本发明通过实验得出，加入甘油酯和胶体化合物后可以减轻对人体的刺痛性，提高了患者依从性。
甘油酯为Massa Estarinum E，所述水溶性基质为甘油明胶，所述胶体化合物为阿拉伯胶，所述膨胀栓各成分的重量份数为：
优选，本发明所述含药基质还包括重量份为0.12-1.02份的克拉替醇、0.23-1.45份的海克西定和0.51-2.15份的角叉菜胶。
rhGM-CSF作为大分子蛋白质，稳定性较差，在水溶液或其他制品中很容易发生物理或化学变化，本发明通过实验得出，在含药基质中加入一定比例的克拉替醇、海克西定和角叉菜胶能有效降低rhGM-CSF的有害变化，所述优选比例下，所述阴道膨胀栓中rhGM-CSF的活性变化最为微小，大大提高栓剂中主要活性成分rhGM-CSF的稳定性。
进一步优选，本发明所述rhGM-CSF阴道膨胀栓的含药基质还包括重量份为1.5-3份的低芥酸菜籽油和1-2份的波拉克林钾，所述低芥酸菜籽油和波拉克林钾协同作用，可以增加主要活性成分rhGM-CSF的溶出度，且同时促进皮肤黏膜对药物的吸收，从而进一步提高栓剂的生物利用度。
本发明所述膨胀载体在饱和吸水后的膨胀值大于1.5，所述膨胀值为径向的膨胀值；所述膨胀载体包括但不限于棉条，还可包括其他能够膨胀的无菌材料，如无纺布、弹性纤维等。
本发明的含药基质呈半包围式涂敷在所述膨胀载体的前端1/5-4/5处，根据“人体工程学栓剂”形状，设计成鸭嘴形、球形、卵形、子弹形、鱼雷形、圆柱形、圆锥形或棒形等形状。
本发明所述的rhGM-CSF阴道膨胀栓的膨胀载体的后端连有拉线，膨胀后的药栓，通过牵拉膨胀载体后端拉线，吸附在膨胀载体上的被杀灭的病毒、毒素、脱落的死皮也一并拉出体外，每次换药就等于给阴道做一次彻底清洁，从根本上预防炎症再次复发，该膨胀栓即属于“治疗清洗一体化剂型”。
为了达到本发明的rhGM-CSF阴道膨胀栓遇水可迅速膨胀的效果，所述膨胀载体吸水后，每粒的最大吸水量不小于1.5毫升。适宜的吸水量，可以保证适宜的膨胀值，过低或过高的吸水量，都会造成不良的影响。吸水量过低时，将不能保证本发明rhGM-CSF遇见水即膨胀的特点而使膨胀不充分；吸水量过高时，膨胀载体会过多的吸附药物成分而限制其扩散。因此，吸水量过低或过高，都不是本发明所期望的膨胀载体。
本发明另一方面提供了rhGM-CSF阴道膨胀栓的制备方法，所述方法包括如下步骤：
1)含药基质的制备：
a.将基质置于水浴中60-70℃加热熔融，制得熔融物；
b.将克拉替醇、海克西定、角叉菜胶、低芥酸菜籽油和波拉克林钾分别加入到熔融物中，混合均匀，所得混合物降至38-45℃待用；
c.将重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子缓慢加入步骤b所得的混合物中，同时缓慢搅拌均匀，尽量避免气泡产生，制得含药基质；
2)将含药基质倒入栓模中，插入膨胀载体，冷却定型，制成栓剂。
本发明所述的rhGM-CSF阴道膨胀栓的制备方法采用了“药栓一次性灌装一体成形技术”。
本发明另一方面还提供了所述rhGM-CSF阴道膨胀栓的检测方法，所述检测方法包括膨胀值测定方法、重量差异检测方法、含量测定等。
其中所述膨胀值测定方法包括：
a.沿所述rhGM-CSF阴道膨胀栓端面的径向选取一点或若干点，测定所述膨胀载体的初始长度H；
b.所述rhGM-CSF阴道膨胀栓饱和吸水后，测定在a步中所选位置处膨胀载体膨胀后长度h；
c.计算所述膨胀值时，按照I式计算；
(I)
其中，p表示轴向的膨胀值、h表示膨胀后长度、H表示初始长度；
或，所述膨胀值测定方法如下：
a.沿所述rhGM-CSF阴道膨胀栓的轴向选取一处或若干位置，测定所述膨胀载体的初始直径R；
b.所述rhGM-CSF阴道膨胀栓饱和吸水后，测定在a步中所选位置处膨胀载体膨胀后直径r；
c.计算所述膨胀值时，按II式计算；
(II)
其中，P表示径向的膨胀值、r表示膨胀后直径、R表示初始直径；
所述重量差异测定方法包括：
a.取所述rhGM-CSF阴道膨胀栓，称取重量M；
b.取刮下含药基质的所述rhGM-CSF阴道膨胀栓中的膨胀载体，干燥，称取重量m，按照如III式计算所述含药基质的重量X：
X＝M-m
(Ⅲ)。
进一步，所述rhGM-CSF阴道膨胀栓的检测方法中，进行融变时限检测后，再进行如下至少一种检测方法：
1)膨胀值测定方法如下：
a.先沿所述rhGM-CSF阴道膨胀栓端面的径向选取一点或若干点，测定所述膨胀载体的初始长度H后，再滚动不同角度测量若干次，求平均值Hi；
b.所述rhGM-CSF阴道膨胀栓进行融变时限检测后，测定在a步中所选位置处膨胀载体膨胀后长度h；再滚动不同角度测量若干次，求膨胀后平均长度hi；
c.计算所述膨胀值时，按照I式计算；
(I)
其中，pi表示轴向的膨胀值、hi表示膨胀后平均长度、Hi表示平均初始长度；
或，所述膨胀值测定方法如下：
a.先在一个角度沿所述rhGM-CSF阴道膨胀栓的轴向选取一处或若干位置，测定所述膨胀载体的初始直径R后，再滚动不同角度测量若干次，求平均值Ri；
b.所述rhGM-CSF阴道膨胀栓进行融变时限检测后，测定在a步中所选位置处膨胀载体膨胀后直径r；再滚动不同角度测量若干次，求膨胀后平均直径ri；
c.计算所述膨胀值时，按II式计算；
(II)
其中，Pi表示径向的膨胀值、ri表示膨胀后平均直径、Ri表示平均初始直径。
其中所述融变时限测定方法(现行中国药典二部附录)包括：取所述rhGM-CSF阴道膨胀栓3粒，在室温放置1小时后，分别放在3个金属架的下层圆板上，装入各自的套管内，并用挂钩固定。除另有规定外，将上述装置分别垂直浸入盛有不少于4L的37.0±0.5℃水的容器中，其上端位置应在水面下90mm处，容器中装一转动器，每隔10分钟在溶液中翻转该装置一次。以上数值范围不应理解为对本发明的限制，不在上述数值范围内的技术方案也在本发明的保护范围内。
2)重量差异测定方法：
a.取所述rhGM-CSF阴道膨胀栓，称取重量M；
b.刮下含药基质，将膨胀载体置于20-90℃有机溶剂中，取出，于50-150℃干燥1-10h，称取重量m,按照如Ⅲ式计算所述含药基质的重量X
X＝M-m (Ⅲ)
其中，所述有机溶剂包括乙醇、甲醇或异丙醇中的一种或多种。
更进一步，所述rhGM-CSF阴道膨胀栓的检测方法中，所述膨胀载体为棉条，所述检测方法包括如下至少一种方法：
1)膨胀值测定方法：
取所述rhGM-CSF阴道膨胀栓3粒，用游标卡尺测其尾部棉条直径，滚动90°再测一次，每粒测两次，求出每粒测定的2次平均值Ri；将上述3粒栓用于融变时限测定结束后，立即取出剩余棉条，待水断滴，均轻置于玻璃板上，用游标卡尺测定每个棉条的两端以及中间三个部位，滚动90°后再测定三个部位，每个棉条共获得六个数据，求出测定的6次平均值ri，计算每粒的膨胀值Pi，三粒栓的膨胀值均应大于1.5。
2)重量差异测定方法：
取所述重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子阴道膨胀栓10粒，分别精密称定重量，轻刮下含药基质，不得损失棉条，将棉条置于50-80℃的200-400ml乙醇中，并在80KHz频率超声清洗5min，使棉条表面残余的基质溶解脱除，取出棉条用力挤干，再用滤纸吸3遍，于105℃干燥2h，取出，室温放置1小时后，分别精密称定棉条重量，求出每粒含药基质重量与平均含药基质重量，每粒含药基质重量与平均含药基质重量比较，超出平均含药基质重量±10％的不得多于2粒，并不得有1粒超出限度1倍。
本发明所提供的rhGM-CSF阴道膨胀栓的膨胀值的测定方法采用多角度多次测量方法，提高了测量的准确度，增加了测定的可操作性，方法更易于判断；在执行国家药典附录重量差异的标准检测本发明所述rhGM-CSF阴道膨胀栓时，需将基质刮下来，由于操作人员掌握的刮取程度不同，造成每粒刮取程度差异较大，所以本发明采用溶剂溶解膨胀栓表面的基质，经过试验验证，当采用热乙醇清洗膨胀栓表面的基质时，结果更理想，重现性更高，所述的重量差异测定方法更方便稳定。
本发明所提供的rhGM-CSF阴道膨胀栓具有稳定性高、疗效好等有益效果，并且该rhGM-CSF阴道膨胀栓采用了独创的六项领先技术，所述的rhGM-CSF阴道膨胀栓中的膨胀载体的加入应用了独创的“药栓一次性灌装一体成形”技术、“内芯膨胀系数控制”技术、“人体工程学栓型”技术、“治疗清洁一体化”剂型、“阴道内贴附式给药”技术、“防侧漏栓体设计”六项技术，该膨胀载体可使rhGM-CSF阴道膨胀栓的含药基质与阴道内壁充分接触，并且防止药液外流；还具有清理阴道防止二次感染的功效；与水溶性基质制成栓剂后，可以有效克服栓剂熔点低，保存困难等问题；本发明通过实验得出，加入甘油酯和胶体化合物后可以减轻对人体的刺痛性，提高了患者依从性；所述含药基质中还包括一定重量份比的克拉替醇、海克西定和角叉菜胶，有效降低rhGM-CSF的有害变化，大大提高栓剂中主要活性成分rhGM-CSF的稳定性；所述含药基质中的低芥酸菜籽油和波拉克林钾协同作用，可以增加主要活性成分rhGM-CSF的溶出度，且同时促进皮肤黏膜对药物的吸收，从而进一步提高栓剂的生物利用度。
附图说明
图1和图2为膨胀值测定方法示意图。
具体实施方式
实施例1
制备方法：
1)含药基质的制备：
a.将Massa Estarinum E、甘油明胶和阿拉伯胶置于水浴中60℃加热熔融，制得熔融物，降至38℃备用；
b.将rhGM-CSF与a步骤的熔融物，缓慢混合均匀，制得含药基质；
2)将含药基质倒入栓模中，插入棉条，冷却定型，制成224枚圆锥形栓剂，每枚重约2.5g。
实施例2
制备方法：
1)含药基质的制备：
a.将聚乙二醇400、聚乙二醇4000、明胶和甘油三棕榈酸酯置于水浴中70℃加热熔融，制得熔融物，降至45℃；
b.取rhGM-CSF缓慢加入a步骤所得的熔融物，同时缓慢混合均匀，制得含药基质；
2)将含药基质倒入栓模中，插入棉条，冷却定型，制成110枚圆柱形栓剂，每枚重约3.5g。
实施例3
制备方法：按实施例2方法制成132枚棒形栓剂，每枚重约5g。
实施例4
制备方法：
1)含药基质的制备：
a.将泊洛沙姆、海藻酸和分馏椰子油置于水浴中65℃加热熔融，制得熔融物；
b.取克拉替醇、海克西定和角叉菜胶分别加入到步骤a的熔融物中，混合均匀，所得混合物降至40℃待用；
c.将rhGM-CSF缓慢加入b步骤所得的混合物中，同时缓慢搅拌均匀，尽量避免气泡产生，制得含药基质；
2)将含药基质倒入栓模中，插入棉条，冷却定型，制成1000枚卵形栓剂，每枚重约0.5g。
实施例5
制备方法：按实施例4方法制成524枚球形栓剂，每枚重约1g。
实施例6
制备方法：按实施例4方法制成182枚子弹形栓剂，每枚重约2.5g。
实施例7
制备方法：
1)含药基质的制备：
a.将羟丙甲纤维素、分馏棕榈油置于水浴中65℃加热熔融，制得熔融物；
b.取克拉替醇、海克西定、角叉菜胶、低芥酸菜籽油和波拉克林钾分别加入到步骤a的熔融物中，混合均匀，所得混合物降至42℃待用；
c.将rhGM-CSF缓慢加入b步骤所得的混合物中，同时缓慢搅拌均匀，尽量避免气泡产生，制得含药基质；
2)将含药基质倒入栓模中，插入棉条，冷却定型，制成338枚卵形栓剂，每枚重约2g。
实施例8
制备方法：按实施例7方法制成385枚鸭嘴形栓剂，每枚重约1.5g。
实施例9
制备方法：按实施例7方法制成190枚鸭嘴形栓剂，每枚重约3g。
对照实施例1
制备方法：按实施例4方法制成524枚球形栓剂，每枚重约1g。
对照实施例2
制备方法：按实施例4方法制成524枚球形栓剂，每枚重约1g。
对照实施例3
制备方法：按实施例4方法制成524枚球形栓剂，每枚重约1g。
对照实施例4
制备方法：按实施例7方法制成385枚鸭嘴形栓剂，每枚重约1.5g。
对照实施例5
制备方法：按实施例7方法制成385枚鸭嘴形栓剂，每枚重约1.5g。
药学及临床试验
1溶出度试验
按照中国药典2010版中公开的方法测定实施例8的重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子阴道膨胀栓及对照实施例4-5的重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子阴道膨胀栓的溶出度，检测结果见表1；
表1各实施例的溶出度试验结果
从表中可以看出，本发明实施例8所提供的重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子阴道膨胀栓具有溶出快，溶出时间短的特性，所提供的膨胀栓可在20min内全部溶出；而对照实施例4-5的重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子阴道膨胀栓溶出慢，溶出时间长，在60min时，所述膨胀栓60min内还未完全溶出；由此得出，本发明在含药基质内加入波拉克林钾和低芥酸菜籽油可显著提高重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子的溶出度。
2. rhGM-CSF阴道膨胀栓体外活性稳定性试验
用TF-1细胞/MTT比色法，取实施例5和对照实施例1-3所述的rhGM-CSF阴道膨胀栓进行对比试验，分别在4℃、25℃和37℃条件下考查其rhGM-CSF体外活性，1×107IU/mg以上为合格标准，考察结果见表2-4。
表2 4℃条件下rhGM-CSF体外活性结果
表3 25℃条件下rhGM-CSF体外活性结果
表4 38℃条件下rhGM-CSF体外活性结果
由如上实验结果可知，本发明所述的rhGM-CSF阴道膨胀栓，在4℃、25℃和38℃条件下，均可以保存1年以上；而对照实施例1-3提供的rhGM-CSF阴道膨胀栓的生物活性在4℃条件下就发生了显著的变化；由此得出本发明所提供的实施例5的膨胀栓的活性优于对照实施例1-3，表明克拉替醇、海克西定和角叉菜胶共同存在才能够提高rhGM-CSF阴道膨胀栓的稳定性。
3.稳定性试验
3.1.加速试验
取实施例1、5、8所述的rhGM-CSF阴道膨胀栓和专利申请CN200510085861中公开的rhGM-CSF栓剂进行对比试验，均在恒温30℃±2℃下，相对湿度为65％±5％的恒湿条件下放置6个月，在试验期间1个月、2个月、3个月、6个月末分别取样一次，按中国药典中的规定，检测膨胀栓的性状、含rhGM-CSF的标示量(％)、融变时限，加速试验结果见表5。
表5 rhGM-CSF阴道膨胀栓的加速试验结果
从表中可看出本发明所述的rhGM-CSF阴道膨胀栓，在恒温高湿的环境下，放置6个月后，所述膨胀栓的颜色未发生变化，所述膨胀栓表面光滑，没有出现斑点、破裂的现象，所述膨胀栓中rhGM-CSF的标示量未发生明显的变化，融变时限也未发生大幅度的延长；而对照组rhGM-CSF栓剂在恒温高湿条件下放置1个月后，栓剂表面就变得粗糙，放置6个月后，栓剂发生破裂，颜色变得越来越深；并且所述rhGM-CSF的含量显著下降，融变时限显著延长；表明本发明所述的rhGM-CSF阴道膨胀栓与对照组rhGM-CSF栓剂相比稳定性显著提高。
3.2长期试验
取实施例1、5、8所述的rhGM-CSF阴道膨胀栓和专利申请CN200510085861中公开的rhGM-CSF栓剂进行对比试验，于温度25℃±2℃下，相对湿度为60％±10％的条件下放置12个月，每3个月取样一次，分别于0个月、3个月、6个月、9个月、12个月取样，检测膨胀栓的性状、含rhGM-CSF的标示量(％)和融变时限，长期试验结果见表6。
表6 rhGM-CSF阴道膨胀栓的长期试验结果
从表中可看出本发明所述的rhGM-CSF阴道膨胀栓，在12个月的长期试验中，所述膨胀栓的颜色未发生变化，所述栓剂表面光滑，没有出现斑点、破裂的现象，所述膨胀栓中rhGM-CSF的标示量未发生明显的变化，融变时限也未发生大幅度的延长；而对照组的rhGM-CSF栓剂放置3个月后，栓剂表面就变得粗糙，放置12个月后，栓剂发生破裂，颜色变得越来越深；并且所述rhGM-CSF的含量显著下降，融变时限显著延长；表明本发明所述的rhGM-CSF阴道膨胀栓与对照组的rhGM-CSF栓剂相比稳定性显著提高，同时，对本发明所述的rhGM-CSF阴道膨胀栓的PH值、失水和均匀性等做长期观察，均无明显变化，说明其具有良好的稳定性。
4.膨胀值测定试验
方法一
取所述rhGM-CSF阴道膨胀栓3粒，用游标卡尺测其尾部棉条直径，滚动约90°再测一次，每粒测两次，求出每粒测定的2次平均值Ri；将上述3粒栓用于融变时限测定结束后，立即取出剩余棉条，待水断滴，均轻置于玻璃板上，用游标卡尺测定每个棉条的两端以及中间三个部位，滚动约90°后再测定三个部位，每个棉条共获得六个数据，求出测定的6次平均值ri，计算每粒的膨胀值Pi，三粒栓的膨胀值均大于1.5。
根据上述膨胀值测定方法测定实施例1、5、8所述rhGM-CSF阴道膨胀栓的膨胀值如表7所示
表7 rhGM-CSF阴道膨胀栓的膨胀值
方法二
如图1和图2所示，阴道膨胀栓的检测方法：
1)膨胀值测定方法：
a.先沿所述阴道膨胀栓端面的径向选取C1、C2、C3三个点，用游标卡尺测定所述膨胀载体的初始长度H1、H2、H3后，再滚动90°测量，沿所述阴道膨胀栓端面的径向选取C1、C4、C5三个点用游标卡尺测定所述膨胀载体的初始长度H4、H5、H6后，求H1、H2、H3、H4、H5和H6的平均值Hi；
b.所述阴道膨胀栓进行融变时限检测后，用游标卡尺测定在a步中所选的C1、C2、C3三个位置处膨胀载体膨胀后长度h1、h2、h3；再滚动90°，用游标卡尺测定在a步中所选的C1、C4、C5三个位置处膨胀载体膨胀后长度h4、h5、h6，求h1、h2、h3、h4、h5和h6的平均长度，即为膨胀后平均长度hi；
c.计算所述膨胀值时，按照I式计算；
(I)
其中，pi表示轴向的膨胀值、hi表示膨胀后平均长度、Hi表示平均初始长度；
或，膨胀值测定方法：
d.先在一个角度沿所述阴道膨胀栓的轴向选取A1、A2和A3三个点，用游标卡尺测定所述膨胀载体的初始直径R1、R2和R3后，再滚动90°，沿所述阴道膨胀栓的轴向选取B1、B2和B3三个点，用游标卡尺测定所述膨胀载体的初始直径R4、R5和R6后，求R1、R2、R3、R4、R5和R6六个初始直径的平均值Ri；
e.所述阴道膨胀栓进行融变时限检测后，测定在d步中所选的A1、A2和A3位置处膨胀载体膨胀后直径分别为r1、r2和r3，；再滚动90°测量d步中所选的B1、B2和B3位置处膨胀载体膨胀后直径分别为r4、r5和r6，求r1、r2、r3、r4、r5和r6的平均值，得膨胀后平均直径ri；
f.计算所述膨胀值时，按II式计算；
(II)
其中，Pi表示径向的膨胀值、ri表示膨胀后平均直径、Ri表示平均初始直径，三粒栓的膨胀值均大于1.5。
5.重量差异测定试验
取实施例1所述rhGM-CSF阴道膨胀栓10粒，分别精密称定重量，轻刮下含药基质(不得损失棉条)，将棉条置于60-70℃的300ml乙醇中，并在80khz频率超声清洗5分钟，使棉条表面残余的基质溶解脱除，取出棉条用力挤干，再用滤纸吸3遍，于105℃干燥2小时，取出，室温放置1小时后，分别精密称定棉条重量，求出每粒含药基质重量与平均含药基质重量，每粒含药基质重量与平均含药基质重量比较，超出平均含药基质重量±10％的不得多于2粒，并不得有1粒超出限度1倍。
重复上述操作，检测实施例5和实施例8所述的rhGM-CSF阴道膨胀栓，其重量差异均符合标准。
6.临床试验
一、研究方法
(一)研究方案参照中华人民共和国卫生部新药临床指导原则有关“妇产科生殖道炎症局部用药的临床验证”内容而制定。
(二)诊断标准
1、宫颈炎症状：白带增多，呈脓性或乳白色，呈黏液状或白带中夹有血丝，或性交出血，伴下腹不适，外阴瘙痒，腰骶部疼痛，经期加重伴腰痛；
2、妇科检查：宫颈充血水肿，或有不同程度的糜烂，有脓性分泌物白宫颈管排出，触动宫颈时可有疼痛感；宫颈有肥大、息肉、腺体囊肿、外翻等表现，或见宫颈口有脓性分泌物，触诊宫颈较硬，或有接触性出血；
3、实验室检查：宫颈刮片示巴氏Ⅱ级。
(三)试验病例标准
纳入病历标准：21-50岁，符合细菌诊断的已婚妇女。
(四)治疗方法
1、治疗组：使用本发明实施例8所述的rhGM-CSF阴道膨胀栓进行治疗，每日一粒，7天为一疗程。
2、对照组：使用专利申请CN200510085861中公开的rhGM-CSF栓剂治疗，每日一粒，7天为一疗程。
(五)观察项目
治疗性观察
(1)症状：分泌物的量、颜色、状态；
(2)妇科检查：包括阴道分泌物检查及宫颈检查；
(3)实验室检查：包括宫颈刮片检查。
(六)疗效判定标准
1、痊愈：症状消失，妇科检查和实验室检查正常；
2、显效：症状明显减轻，妇科检查和实验室检查明显好转；
3、有效：症状有所减轻，妇科检查和实验室检查好转；
4、无效：治疗前后无变化。
二、治疗结果
表8两组对宫颈炎的治疗效果比较
两组疗效比较治疗组优于对照组。
三、结论
rhGM-CSF阴道膨胀栓对宫颈炎的有效率达到97.37％，疗效优于对照组；在验证其疗效过程中，未发现毒副作用，安全可靠，疗效显著。

Claims (8)

1.一种重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子阴道膨胀栓，其特征在于，所述膨胀栓包括含药基质和可膨胀的膨胀载体，所述含药基质主要由重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子和基质制成，含药基质涂敷在膨胀载体表面，所述膨胀载体在饱和吸水后的膨胀值大于1.1，所述膨胀栓各成分的重量份数为：
重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子 0.05-0.1
基质 180-235
膨胀载体 205-423
所述基质为甘油酯、水溶性基质和胶体化合物的混合物，所述甘油酯、水溶性基质和胶体化合物的重量份数为2-4:7-10:1；
所述水溶性基质选自聚乙二醇400、聚乙二醇1500、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、甘油明胶、吐温60、吐温65、聚氧乙烯单硬脂酸酯或泊洛沙姆中的一种或多种；
所述甘油酯选自Massa Estarinum A、Massa Estarinum B、Massa Estarinum E、甘油三棕榈酸酯、甘油三硬脂酸酯、甘油山萮酸酯或月桂酸甘油三酯中的一种或多种；
所述胶体化合物选自阿拉伯胶、明胶或果胶中的一种或多种；
所述含药基质还包括如下重量份数的辅料：
克拉替醇 0.12-1.02
海克西定 0.23-1.45
角叉菜胶 0.51-2.15。
2.如权利要求1所述的重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子阴道膨胀栓，其特征在于，所述甘油酯为Massa Estarinum E，所述水溶性基质为甘油明胶，所述胶体化合物为阿拉伯胶，所述膨胀栓各成分的重量份数为：
3.如权利要求1所述的重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子阴道膨胀栓，其特征在于，所述含药基质还包括重量份数为1.5-3份的低芥酸菜籽油和1-2份的波拉克林钾。
4.如权利要求1-3任一所述的重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子阴道膨胀栓，其特征在于，所述膨胀载体在饱和吸水后的膨胀值大于1.5，所述膨胀值为径向的膨胀值；所述膨胀载体为棉条；所述含药基质呈半包围式涂敷在所述膨胀载体的前端1/5-4/5处，所述膨胀载体的后端连有拉线；所述膨胀载体吸水后，每粒的最大吸水量不小于1.5毫升。
5.如权利要求3所述的重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子阴道膨胀栓的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1)含药基质的制备：
a.将基质置于水浴中60-70℃加热熔融，制得熔融物；
b.将克拉替醇、海克西定、角叉菜胶、低芥酸菜籽油和波拉克林钾分别加入到熔融物中，混合均匀，所得混合物降至38-45℃待用；
c.将重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子缓慢加入步骤b所得混合物中，同时缓慢搅拌均匀，尽量避免气泡产生，制得含药基质；
2)将含药基质倒入栓模中，插入膨胀载体，冷却定型，制成栓剂。
6.如权利要求1-3任一所述的重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子阴道膨胀栓的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下至少一种方法：
1)膨胀值测定方法如下：
a.沿所述重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子阴道膨胀栓端面的径向选取一点或若干点，测定所述膨胀载体的初始长度H；
b.所述重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子阴道膨胀栓饱和吸水后，测定在a步中所选位置处膨胀载体膨胀后长度h；
c.计算所述膨胀值时，按照I式计算；
其中，p表示轴向的膨胀值、h表示膨胀后长度、H表示初始长度；
或，膨胀值测定方法如下：
a.沿所述重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子阴道膨胀栓的轴向选取一处或若干位置，测定所述膨胀载体的初始直径R；
b.所述重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子阴道膨胀栓饱和吸水后，测定在a步中所选位置处膨胀载体膨胀后直径r；
c.计算所述膨胀值时，按II式计算；
其中，P表示径向的膨胀值、r表示膨胀后直径、R表示初始直径；
2)重量差异测定方法：
a.取所述重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子阴道膨胀栓，称取重量M；
b.取刮下含药基质的所述重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子阴道膨胀栓中的膨胀载体，干燥，称取重量m，按照如III式计算所述含药基质的重量X：
X＝M-m
(Ⅲ)。
7.如权利要求6所述的重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子阴道膨胀栓的检测方法，其特征在于，进行融变时限检测后，再进行如下至少一种检测方法：
1)膨胀值测定方法如下：
a.先沿所述重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子阴道膨胀栓端面的径向选取一点或若干点，测定所述膨胀载体的初始长度H后，再滚动不同角度测量若干次，求平均值Hi；
b.所述重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子阴道膨胀栓进行融变时限检测后，测定在a步中所选位置处膨胀载体膨胀后长度h；再滚动不同角度测量若干次，求膨胀后平均长度hi；
c.计算所述膨胀值时，按照I式计算；
其中，pi表示轴向的膨胀值、hi表示膨胀后平均长度、Hi表示平均初始长度；
或，膨胀值测定方法如下：
a.先在一个角度沿所述重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子阴道膨胀栓的轴向选取一处或若干位置，测定所述膨胀载体的初始直径R后，再滚动不同角度测量若干次，求平均值Ri；
b.所述重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子阴道膨胀栓进行融变时限检测后，测定在a步中所选位置处膨胀载体膨胀后直径r；再滚动不同角度测量若干次，求膨胀后平均直径ri；
c.计算所述膨胀值时，按II式计算；
其中，Pi表示径向的膨胀值、ri表示膨胀后平均直径、Ri表示平均初始直径；
2)重量差异测定方法：
a.取所述重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子阴道膨胀栓，称取重量M；
b.刮下含药基质，将膨胀载体置于20-90℃有机溶剂中，取出，于50-150℃干燥1-10h，称取重量m,按照如Ⅲ式计算所述含药基质的重量X
X＝M-m (Ⅲ)
其中，所述有机溶剂选自乙醇、甲醇或异丙醇中的一种或多种。
8.如权利要求7所述的重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子阴道膨胀栓的检测方法，其特征在于，所述膨胀载体为棉条，所述检测方法包括如下至少一种方法：
1)膨胀值测定方法：
取所述重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子阴道膨胀栓3粒，用游标卡尺测其尾部棉条直径，滚动90°再测一次，每粒测两次，求出每粒测定的2次平均值Ri；将上述3粒栓用于融变时限测定结束后，立即取出剩余棉条，待水断滴，均轻置于玻璃板上，用游标卡尺测定每个棉条的两端以及中间三个部位，滚动90°后再测定三个部位，每个棉条共获得六个数据，求出测定的6次平均值ri，计算每粒的膨胀值Pi，三粒栓的膨胀值均应大于1.5；
2)重量差异测定方法：
取所述重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子阴道膨胀栓10粒，分别精密称定重量，轻刮下含药基质，不得损失棉条，将棉条置于50-80℃的200-400ml乙醇中，并在80KHz频率超声清洗5min，使棉条表面残余的基质溶解脱除，取出棉条用力挤干，再用滤纸吸3遍，于105℃干燥2h，取出，室温放置1小时后，分别精密称定棉条重量，求出每粒含药基质重量与平均含药基质重量，每粒含药基质重量与平均含药基质重量比较，超出平均含药基质重量±10％的不得多于2粒，并不得有1粒超出限度1倍。
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