CN104869998A - 含有非天然氨基酸的药物递送缀合物以及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

在此描述了用于靶向疗法的药物递送缀合物。具体地说，在此描述了包含含有一个或多个非天然氨基酸的多价接头的药物递送缀合物，这些缀合物适用于治疗癌症和炎性疾病。在此描述的本发明涉及用于靶向疗法的药物递送缀合物。具体地说，在此描述的本发明涉及包含含有一个或多个非天然氨基酸的多价接头的药物递送缀合物。

Description

含有非天然氨基酸的药物递送缀合物以及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2012年10月16日提交的美国临时申请序列号61/714,565、2013年3月15日提交的美国临时申请序列号61/790,234、2013年8月13日提交的美国临时申请序列号61/865,382以及2013年9月13日提交的美国临时申请序列号61/877,317的优先权。本申请根据35U.S.C.§365(c)要求2013年3月15日提交的美国专利申请序列号13/837,539的优先权。所有以上引用的申请的披露内容通过引用以其全部内容结合在此。
技术领域
在此描述的本发明涉及用于靶向疗法的药物递送缀合物。具体地说，在此描述的本发明涉及包含含有一个或多个非天然氨基酸的多价接头的药物递送缀合物。
发明背景与概述
哺乳动物免疫系统提供一种用于识别并消除病原细胞如肿瘤细胞以及其他侵入性外源性病原体的手段。虽然免疫系统通常提供强大的抵御防线，但是存在很多病原细胞如癌细胞和其他感染原逃避宿主免疫反应并增殖或者持续存在伴随宿主的致病性的情况。已开发化学治疗剂和放射性疗法消除例如复制的赘生物。然而，很多目前可用的化学治疗剂和放射性治疗方案具有不良副作用，因为它们缺乏对优选破坏病原细胞的足够选择性并且因此还可损害正常的宿主细胞如造血系统的细胞和其他非病原细胞。这些抗癌药物的不良副作用突显需要开发具有对病原细胞群的选择性并且具有减小的宿主毒性的新疗法。
在此发现包含由一个或多个非天然氨基酸形成的多价接头的药物递送缀合物可有效治疗病原细胞群并且表现出低宿主动物毒性。
在本发明的一个说明性且非限制性的实施例中，在此描述了多种具有以下化学式的化合物
B-L-Dx
其中B、L、D、以及x各自是在此所述的不同实施例和方面所定义的。
在另一个实施例中，在此还描述了含有一种或多种这些化合物的药物组合物。在一个方面，这些组合物包含用于治疗患有癌症、炎症等的患者的治疗有效量的这一种或多种化合物。应理解，这些组合物可以包含其他组分和/或成分，包括但不限于其他治疗活性的化合物和/或一种或多种载体、稀释剂、赋形剂等以及其组合。在另一个实施例中，在此还描述了用于使用这些化合物和药物组合物以用于治疗患有癌症、炎症等的患者或宿主动物的多种方法。在一个方面，这些方法包括向患有癌症、炎症等的一位患者给予在此所述的这些化合物和/或组合物中的一种或多种的步骤。在另一个方面，这些方法包括给予治疗有效量的在此所述的这一种或多种化合物和/或组合物，以用于治疗患有癌症、炎症等的患者。在另一个实施例中，在此还描述了这些化合物和组合物在制造用于治疗患有癌症、炎症等的患者的药物中的用途。在一个方面，这些药物包含用于治疗患有癌症、炎症等的患者的治疗有效量的这一种或多种化合物和/或组合物。
附图简述
图1A示出了EC1669在KB细胞中(在37℃下1h)的相对亲和力。图1B示出了EC1669在CHO-β细胞中(在37℃下1h)的相对亲和力。
图2示出EC1669对于RAW264.7细胞的抑制细胞作用，如通过在2h和72h下的XTT细胞活性所确定的。
图3A示出与以100μmol/kg联合给药EC1456和EC0923(▲)以及未治疗(PBS)对照(■)相比，在持续连续两周以1μmol/kg每周给药三次(M/W/F)(TIW)的nu/nu小鼠中EC1456针对KB肿瘤的体内活性(●)。垂直虚线表示最终剂量的那天。图3B示出EC1456不会引起任何可观察的整体动物毒性，如通过动物体重确定的。
图4A示出EC1663在具有皮下KB肿瘤的nu/nu小鼠中的活性，其中EC1663在第7天开始用0.5μmol/kg静脉内给予(▲)，持续2周的时段每周三次(M/W/F)，并且与未治疗对照(■)相比，每个群体N＝5只动物。垂直虚线＝最终给药的那天。图4A示出测试动物中的4/4PR。图4B示出EC1663不会表现出显著的宿主动物毒性。
图5A示出EC1456针对建立的皮下MDA-MB-231肿瘤的活性。具有皮下MDA-MB-231肿瘤(94-145mm3)的动物在第17天开始用2μmol/kg(图A)EC1456治疗(●)，持续2周的时段每周三次(M/W/F)，并且与未治疗动物(■)相比，如图5A所示的，每个群组N＝5只动物。垂直虚线＝最终剂量的那天。图5B示出EC1456不会引起任何可观察的整体动物总毒性，如通过重量变化％确定的。
图6A示出EC1456在具有皮下KB-CR2000(顺铂抗性)肿瘤(98-148mm3)的nu/nu小鼠中的活性，其中EC1456在第6天开始用2μmol/kg静脉内给予(●)，持续2周的时段每周三次(M/W/F)，或者用3mg/kg顺铂给予(▲)，持续2周的时段每周两次(T/Th)，并且与未治疗对照(■)相比，每个群组N＝5只动物。垂直虚线＝最终给药的那天。图6B示出EC1456不会表现出显著的宿主动物毒性。相反，顺铂治疗在给药时段过程中引起大量的宿主动物毒性。
图7示出EC1496针对佐剂诱导的关节炎的体内功效。箭头指示治疗天数，(a)健康对照，(b)未治疗对照，(c)EC1496，(d)EC1496+过量EC0923(比较剂/竞争物化合物)。
图8A示出EC1669针对关节炎的体内功效，(a)健康对照，(a)未治疗对照，(b)EC1669(375nmol/kg)，(c)EC1669+500x EC0923。图8B示出EC1669不会表现出整体动物毒性，(a)未治疗对照，(b)EC1669(375nmol/kg)，(c)EC1669+500x EC0923，(d)健康对照。
图9A示出EC1669针对关节炎的体内功效，如通过脚爪肿胀度确定的。图9B示出EC1669针对关节炎的体内功效，如通过骨放射线照相术确定的。
图10A示出在AIA大鼠中单独的EC1669和EC1669加上骁悉(CellCept)组合的联合疗法的体内功效，其中在第0天是诱导后的9天，并且箭头指示治疗天数，(a)健康对照，(b)未治疗对照，(c)EC1669(1000nmol/kg，siw，sc)，(d)骁悉TM(30mg/kg，po，qdx5)，(e)EC1669+骁悉TM。图10B示出与对照相比对于每个给予方案的整体动物毒性。
图11示出在AIA大鼠中单独的EC1669和EC1669加上骁悉组合的联合疗法的体内功效，如通过脚爪肿胀度来确定的。
图12A示出EC1669针对EAU(两只眼睛的总葡萄膜炎得分)的体内功效。动物在EAU诱导之后第8天开始每隔一天用EC1669(■)、EC1669加上EC0923(□)、以及MTX(◆)治疗或者来自未治疗的动物(●)。第0天是诱导后的8天，并且箭头指示治疗的天数。图12B示出EC1669不会引起整体动物毒性。
图13A示出EC1496针对EAU(两只眼睛的总葡萄膜炎得分)的体内功效，(a)葡萄膜炎未治疗对照，(b)EC1496(375nmol/kg)，(c)EC1496+过量EC0923。图13B示出EC1496针对EAU的体内功效，如通过组织学确定的。
图14A示出EC1669针对EAE的体内功效，(a)未治疗EAE对照，(b)EC1669(250nmol/kg)，(c)EC1669+过量EC0923。动物在EAE诱导之后第8天开始每隔一天治疗(如通过箭头指示)，并且与未治疗对照相比。图14B示出体重的变化百分比(B)，对每个组取平均值。
图15示出EC1496针对EAE的体内功效。示出来自未治疗动物和在EAE诱导之后第8天开始每隔一天用EC1496和EC1496加上EC0923治疗的动物的单个EAE得分，并且将其与未治疗对照相比。
图16A示出EC1496(500nmol/kg，s.c)的药代动力学以及氨喋呤和氨喋呤酰肼的体内产生。图16B示出EC0746(比较剂化合物，500nmol/kg，s.c)的药代动力学以及氨喋呤和氨喋呤酰肼的体内产生。
图17示出在小鼠中3H-EC1669的药代动力学生物分布，图(A)、图(C)和图(E)；以及3H-甲氨蝶呤的药代动力学生物分布，图(B)、图(D)和图(F)。以500nmol/kg向Balb/c小鼠静脉内给予测试化合物。
图18示出小鼠中3H-EC1669(■)和3H-MTX(▼)的RBC摄取的比较，如放射性随着时间的测量值。
图19示出(b)EC1496(3μmol/kg)与(c)EC0746(比较剂化合物，3μmol/kg)之间的相对整体动物毒性，并且当在叶酸缺乏的大鼠中持续2周BIW给药时与载体对照(a)相比。
图20示出与载体对照相比的EC1456的最大耐受量(MTD)。载体对照(■)、0.33μmol/kg的EC1456(●)、0.41μmol/kg的EC1456(▲)、0.51μmol/kg的EC1456(▼)、以及0.67μmol/kg的EC1456(◆)。
详细说明
本发明的若干种说明性实施例通过以下条款进行说明：
一种具有化学式B-L(D)X的化合物或其一种药学上可接受的盐，其中B是细胞表面受体结合和/或靶向配体的一个基团，D在每种情况下是一种独立地选择的药物的一个基团，x是选自1、2、3、4以及5的一个整数；并且L是包含一个或多个非天然氨基酸的一种多价可释放接头；并且其中B共价连接到L，并且L共价连接到每个D；并且
其中该化合物不是以下化学式中的任一种或其任何亚组或子组
和/或其中该化合物不具有以下化学式
和/或其中该化合物不是以下化学式中的任一种或其任何亚组或子组
和/或其中该化合物不是以下化学式中的任一种或其任何亚组或子组
和/或其中该化合物不具有以下化学式
和/或上述任何组合；
或其任何药学上可接受的盐。
如以上条款所述的化合物，其中B-L(D)X能够结合细胞表面受体。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中该配体是一种维生素受体结合配体。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中该配体是一种叶酸受体结合配体。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中该配体是一种叶酸。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中该配体是一种包含D-谷酰基的叶酸(在此也称为D-叶酸)或蝶酰基-D-谷氨酸。在此将理解的是，当B是D-叶酸的基团时，B所包含的D-谷酰基部分不是该接头L的部分。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中B是具有以下化学式的一个非天然叶酸基团。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中该配体是叶酸。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中B是具有以下化学式的基团
如以上条款中任一项所述的化合物，其中至少一个非天然氨基酸具有D-构型。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中至少一个非天然氨基酸选自D-丙氨酸、D-天冬氨酸、D-天冬酰胺、D-半胱氨酸、D-谷氨酸、D-苯丙氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-甲硫氨酸、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸、D-酪氨酸和D-鸟氨酸以及其任何氨基酸衍生物。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中至少一个非天然氨基酸选自D-天冬氨酸、D-天冬酰胺、D-半胱氨酸、D-谷氨酸、D-组氨酸、D-赖氨酸、D-甲硫氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-色氨酸、D-酪氨酸和D-鸟氨酸以及其任何氨基酸衍生物。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中至少一个非天然氨基酸选自D-天冬氨酸、D-天冬酰胺、D-半胱氨酸、D-谷氨酸、D-组氨酸、D-赖氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-色氨酸和D-鸟氨酸以及其任何氨基酸衍生物。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中至少一个非天然氨基酸选自D-天冬氨酸、D-半胱氨酸、D-谷氨酸、D-赖氨酸、D-精氨酸、D-丝氨酸和D-鸟氨酸以及其任何氨基酸衍生物。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中L包含两个或更多个非天然氨基酸。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中L包含三个或更多个非天然氨基酸。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中L包含四个或更多个非天然氨基酸。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中L还包含一个或多个二硫键。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中至少一个二硫键包含L-半胱氨酰基。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中至少一个二硫键包含D-半胱氨酰基。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中L还包含一个或多个二价亲水性基团。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中L还包含两个或更多个二价亲水性基团。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中L还包含三个或更多个二价亲水性基团。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中L还包含四个或更多个二价亲水性基团。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中L还包含一个或多个二价聚氧基团。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中L还包含两个或多个二价聚氧基团。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中L还包含三个或多个二价聚氧基团。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中L还包含四个或多个二价聚氧基团。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中L还包含一个或多个二价多羟基基团。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中L还包含两个或更多个二价多羟基基团。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中L还包含三个或更多个二价多羟基基团。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中L还包含四个或更多个二价多羟基基团。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中至少一个非天然氨基酸包含一个多羟基基团。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中至少两个非天然氨基酸包含一个多羟基基团。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中至少三个非天然氨基酸包含一个多羟基基团。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中至少四个非天然氨基酸包含一个多羟基基团。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中这些多羟基基团中的至少一个具有以下化学式
CH2-(CH(OH))n-CH2-OH
其中n是选自1、2、3、4、5、以及6。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中n是选自1、2、3、以及4。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中n是选自3和4。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中n是3。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中L包含一个二价聚谷氨酸基团，其中至少一个谷氨酸与一个氨基多羟基基团形成一个酰胺。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中L包含一个二价聚谷氨酸基团，其中至少两个谷氨酸与一个氨基多羟基基团形成一个酰胺。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中L包含一个二价聚谷氨酸基团，其中至少三个谷氨酸与一个氨基多羟基基团形成一个酰胺。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中L包含一个二价聚谷氨酸基团，其中至少四个谷氨酸与一个氨基多羟基基团形成一个酰胺。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中这些谷氨酸中的至少一个是D-谷氨酸。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中这些谷氨酸中的至少两个是D-谷氨酸。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中这些谷氨酸中的至少三个是D-谷氨酸。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中这些谷氨酸中的至少四个是D-谷氨酸。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中这些谷氨酸中的至少一个是未取代的D-谷氨酸。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中这些谷氨酸中的至少两个是未取代的D-谷氨酸。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中这些谷氨酸中的至少三个是未取代的D-谷氨酸。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中这些谷氨酸中的至少四个是未取代的D-谷氨酸。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中L包含一个二价聚(D-谷氨酸)基团，其中至少一个谷氨酸与一个氨基多羟基基团形成一个酰胺。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中L包含一个二价聚(D-谷氨酸)基团，其中至少两个谷氨酸与一个氨基多羟基基团形成一个酰胺。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中L包含一个二价聚(D-谷氨酸)基团，其中至少三个谷氨酸与一个氨基多羟基基团形成一个酰胺。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中L包含一个二价聚(D-谷氨酸)基团，其中至少四个谷氨酸与一个氨基多羟基基团形成一个酰胺。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中L包含具有化学式(K-L)d的一个二价基团，其中K是一个二价D-谷氨酸基团，L是与一个氨基多羟基基团形成一个酰胺的一个二价L-谷氨酸基团，并且d是1、2、3或4。
如以上条款所述的化合物，其中d是2、3或4。
如以上条款所述的化合物，其中d是3或4。
如以上条款所述的化合物，其中d是3。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中这些氨基多羟基基团中的至少一个具有以下化学式
NH-CH2-(CH(OH))m-CH2-OH
其中m是选自1、2、3、4、5、以及6。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中这些氨基多羟基基团中的至少一个具有以下化学式
NH-CH2-(CH(OH))m-R
其中m是选自1、2、3、4、5、以及6；并且R是H、烷基、环烷基或芳烷基。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中m是选自1、2、3、以及4。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中m是选自3和4。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中L包含具有以下化学式的一个二价基团
S-CH2CH2-O-C(O)。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中L包含具有以下化学式的一个二价基团
S-S-CH2CH2-O-C(O)。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中L-D包含具有以下化学式的一个基团
S-CH2CH2-O-C(O)-D。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中L-D包含具有以下化学式的一个基团
S-S-CH2CH2-O-C(O)-D。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中x是3。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中x是2。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中x是1。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中至少一种药物是一种细胞毒素剂。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中至少一种药物是一种癌症治疗剂。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中至少一种药物是一种长春花生物碱。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中至少一种药物是去乙酰长春碱一元酰肼。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中至少一种药物是一种微管溶素。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中至少一种药物是微管溶素A。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中至少一种药物是微管溶素B。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中至少一种药物是微管溶素A酰肼。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中至少一种药物是微管溶素B酰肼。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中至少一种药物是一种微管溶素，其中该Tuv残基包含一个醚缩醛胺。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中至少一种药物是一种微管溶素酰肼，其中该Tuv残基包含一个醚缩醛胺。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中至少一种药物是一种炎症治疗剂。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中至少一种药物是一种抗炎药。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中至少一种药物是一种二氢叶酸还原酶抑制剂。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中至少一种药物是氨喋呤或甲氨蝶呤。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中至少一种药物是一种氨蝶呤。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中至少一种药物是哺乳动物类雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的一种抑制剂。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中至少一种药物是西罗莫司(雷帕霉素)、替西罗莫司、依维莫司、或地磷莫司(ridaforolimus)。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中至少一种药物不是T-2霉菌毒素。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中至少一种药物不是一种倍癌霉素。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中至少一种药物不是一种丝裂霉素。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中至少一种药物不是去乙酰长春碱一元酰肼。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中至少一个D是具有以下化学式的一个基团
如以上条款中任一项所述的化合物，其中至少一个基团具有以下化学式
如以上条款中任一项所述的化合物，其中至少一个基团具有以下化学式
其中n＝1、2、3、4、5、或6，或者可替代地，n＝1、2、或3，或者可替代地，n＝2或3。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中至少一个D是具有以下化学式的一个基团
其中n＝1、2、3、4、5、或6，或者可替代地，n＝1、2、或3，或者可替代地，n＝2或3。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中至少一种药物是能够结合一种核酸或一种DNA转录因子或者与其反应的一种化合物或其一种前药。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中B-L是具有以下化学式的一个基团
如以上条款中任一项所述的化合物，其中B-L是具有以下化学式的一个基团
如以上条款中任一项所述的化合物，其中B-L是具有以下化学式的一个基团
如以上条款中任一项所述的化合物，其中B-L是具有以下化学式的一个基团
如以上条款中任一项所述的化合物，其中该化合物具有化学式EC1456
或其一种药学上可接受的盐。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中该化合物不具有化学式EC1456
或其一种药学上可接受的盐。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中该化合物具有化学式EC1496
或其一种药学上可接受的盐。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中该化合物不具有化学式EC1496
或其一种药学上可接受的盐。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中该化合物具有化学式EC1669
或其一种药学上可接受的盐。
如以上条款中任一项所述的化合物，其中该化合物不具有化学式EC1669
或其一种药学上可接受的盐。
一种包含如以上条款中任一项所述的一种化合物连同一种或多种载体、稀释剂或赋形剂或其组合的药物组合物。
一种包含一个治疗有效量的如以上条款中任一项所述的一种或多种化合物，任选地连同一种或多种载体、稀释剂或赋形剂或其组合的单位剂量或单位剂型组合物。
一种用于治疗一个宿主动物中的癌症或炎症的组合物，该组合物包含一个治疗有效量的如以上条款中任一项所述的一种或多种化合物；或者一种包含一个治疗有效量的如以上条款中任一项所述的一种或多种化合物，任选地还包含一种或多种载体、稀释剂或赋形剂或其组合的药物组合物。
一种用于治疗一个宿主动物中的癌症或炎症的方法，该方法包括向该宿主动物给予包含一个治疗有效量的如以上条款中任一项所述的一种或多种化合物的一种组合物；或者包含一个治疗有效量的如以上条款中任一项所述的一种或多种化合物，任选地还包含一种或多种载体、稀释剂或赋形剂或其组合的一种药物组合物的步骤。
如以上条款中任一项所述的一种或多种化合物任选连同一种或多种载体、稀释剂或赋形剂或其组合在制造用于治疗一个宿主动物中的一种癌症或炎症的一种药物中的用途。
如以上条款中任一项所述的方法或组合物或单位剂量或用途，其中该癌症是抗药性癌症。
如以上条款中任一项所述的方法或组合物或单位剂量或用途，其中该癌症是一种抗铂性癌症。
如以上条款中任一项所述的方法或组合物或单位剂量或用途，其中该癌症是一种抗顺铂性癌症。
如以上条款中任一项所述的方法或组合物或单位剂量或用途，其中该癌症是一种卵巢癌。
如以上条款中任一项所述的方法或组合物或单位剂量或用途，其中该癌症是一种抗药性卵巢癌。
如以上条款中任一项所述的方法或组合物或单位剂量或用途，其中该癌症是一种抗顺铂性卵巢癌。
如以上条款中任一项所述的方法或组合物或单位剂量或用途，其中该癌症是一种抗铂性卵巢癌，如NCI/ADR-RES或NCI/ADR-RES相关的卵巢癌。
如以上条款中任一项所述的方法或组合物或单位剂量或用途，其中该癌症是一种抗铂性卵巢癌，如IGROVCDDP或IGROVCDDP相关的卵巢癌。
如以上条款中任一项所述的方法或组合物或单位剂量或用途，其中该癌症是一种乳腺癌。
如以上条款中任一项所述的方法或组合物或单位剂量或用途，其中该癌症是一种抗药性乳腺癌。
如以上条款中任一项所述的方法或组合物或单位剂量或用途，其中该癌症是一种三阴性乳腺癌，如MDA-MB-231或MDA-MB-231相关的乳腺癌。
如以上条款中任一项所述的方法或组合物或单位剂量或用途，其中该癌症是一种非小细胞肺癌。
如以上条款中任一项所述的方法或组合物或单位剂量或用途，其中该癌症是一种肝细胞癌或肝细胞癌症。
一种用于制备如以上条款中任一项所述的具有以下化学式的一种化合物
或其一种药学上可接受的盐的中间体，其中L是一个离去基团。
一种用于制备如以上条款中任一项所述的具有以下化学式的一种化合物
或其一种药学上可接受的盐的中间体，其中M是氢或一种阳离子。
一种用于制备如权利要求1所述的具有以下化学式的一种化合物
或其一种药学上可接受的盐的中间体，其中L是一个离去基团。
在另一个实施例中，在此所述的化合物可以通过结合相应细胞表面受体来内化到靶向的病原细胞中。具体地说，维生素受体如叶酸受体选择性和/或特异性地结合维生素，并且例如通过受体介导的内吞作用进行内化。一旦完成内化，在此所述的化合物中所包含的可释放接头允许将药物货物递送到靶细胞内部，因此减小针对非靶向组织的毒性，因为可释放接头基本或完全保持完整，直到在此所述的化合物递送到靶细胞为止。因此，在此所述的化合物通过将药物递送到一个细胞内生物化学过程来在细胞内起作用，从而使得暴露于宿主动物健康细胞和组织的未缀合药物的量减小。
在另一个实施例中，与不包含至少一个非天然氨基酸的相应化合物相比，包含一个叶酸受体结合配体的在此所述的化合物对叶酸受体表现出更大的特异性。在另一个实施例中，包含一个叶酸受体结合配体的在此所述的化合物显示出对于叶酸受体表达细胞的高活性。在另一个实施例中，在此所述的化合物针对病原细胞如KB细胞(包括抗顺铂KB细胞)、NC1/ADR-RES-C12细胞、IGROV1细胞、以及MDA-MB-231细胞表现出有效的体外和体内活性。在另一个实施例中，包含一个叶酸受体结合配体的在此所述的化合物并未显示显著结合叶酸受体阴性细胞。在另一个实施例中，包含一个叶酸受体结合配体的在此所述的化合物优选或排他地通过高亲和力叶酸受体如叶酸受体α(α)和/或叶酸受体β(β)进入细胞。在另一个实施例中，在此所述的化合物通常基本上并不通过被动运输如通过还原性叶酸载体(RFC)进入细胞。在另一个实施例中，在此所述的化合物与不包含至少一个非天然氨基酸的化合物相比表现出更低的宿主动物毒性。在另一个实施例中，在此所述的化合物与不包含至少一个非天然氨基酸的化合物相比表现出更大的血清稳定性。在另一个实施例中，在此所述的化合物与不包含至少一个非天然氨基酸的化合物相比被迅速地清除。在另一个实施例中，在此所述的化合物与肝脏清除相比主要通过肾清除来清除。
在此所述的化合物可以用于人临床医学和兽医应用二者。因此，具有病原细胞群并且用在此所述的化合物治疗的宿主动物可以是人，或者在兽医应用中，可以是一种实验室动物、农业动物、家养动物或野生动物。本发明可以应用于宿主动物，所述宿主动物包括但不限于，人；实验室动物，如啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠等)、兔、猴、猩猩；家养动物，如狗、猫和兔；农业动物，如牛、马、猪、羊、山羊；以及圈养的野生动物，如熊、熊猫、狮子、老虎、豹子、大象、斑马、长颈鹿、大猩猩、海豚以及鲸。
本发明可应用于在这些宿主动物中引起多种病理状况的病原细胞群。根据本发明，“病原细胞”意指癌细胞、感染原如细菌和病毒、细菌或病毒感染的细胞、能够引起疾病状态的活化巨噬细胞、引起炎症的其他病原细胞、独特地表达、优选表达或过度表达维生素受体或结合维生素的受体和/或维生素受体结合配体的任何其他类型的病原细胞、以及独特地表达、优选表达或过度表达高亲和力叶酸受体或结合叶酸的受体和/或叶酸受体结合配体的任何其他类型的病原细胞。病原细胞还可以包括引起一种疾病状态的任何细胞，该疾病状态用在此所述的化合物进行治疗引起疾病症状减少。例如，病原细胞可以是宿主细胞，这些宿主细胞在一些情况下如免疫系统的细胞是移植物抗宿主疾病的原因的情况下是致病性的，但是在其他情况下不是致病性的。
因此，病原细胞群可以是一种致瘤性癌细胞群，包括良性肿瘤和恶性肿瘤，或者它可以是非致瘤性的。癌细胞群可以自发地产生或者通过诸如存在于宿主动物的生殖细胞系中的突变或体细胞突变的此类过程产生，或者它可以是化学诱导的、病毒诱导的或者辐射诱导的。本发明可以用于治疗癌症，如癌、肉瘤、淋巴瘤、霍奇金(Hodgekin)病、黑素瘤、间皮瘤、伯基特(Burkitt)淋巴瘤、鼻咽癌、白血病以及骨髓瘤。癌细胞群可以包括但不限于，口腔癌、甲状腺癌、内分泌癌、皮肤癌、胃癌、食管癌、喉癌、胰腺癌、结肠癌、膀胱癌、骨癌、卵巢癌、宫颈癌、宫颈癌、乳腺癌、睾丸癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、肝癌、以及肺癌。
在另一个实施例中，描述了如以上实施例中任一项所述的方法或药物组合物，其中该疾病选自下组，该组由以下各项组成：关节炎，包括类风湿性关节炎和骨关节炎、肾小球肾炎、增生性视网膜病、再狭窄、溃疡性结肠炎、克罗恩氏(Crohn's)病、纤维肌痛、银屑病以及其他皮肤炎症、骨髓炎、舍格伦氏综合征、多发性硬化症、糖尿病、动脉粥样硬化、肺纤维化、红斑狼疮、结节病、系统性硬化、器官移植排斥(GVHD)以及慢性炎症。
该药物可以是能够调节或另外改变细胞功能的任何分子，包括药物活性化合物。说明性药物包括但不限于，肽、寡肽、逆反式(retro-inverso)寡肽、蛋白质、蛋白质类似物(其中至少一个非肽键置换肽键)、脱辅基蛋白、糖蛋白、酶、辅酶、酶抑制剂、氨基酸及其衍生物、受体以及其他膜蛋白；抗原及其抗体；半抗原及其抗体；激素、脂质、磷脂、脂质体；毒素；抗生素；镇痛药；支气管扩张剂；β阻断剂；抗微生物剂；抗高血压剂；心血管药物，包括抗心律失常药、强心苷、抗心绞痛药以及血管舒张药；中枢神经系统药，包括兴奋剂、精神药物、抗躁狂药、以及镇静剂；抗病毒剂；抗组胺药；抗癌药，包括化学治疗剂；镇定剂；抗抑郁剂；H-2拮抗剂；抗惊厥剂；止恶心药；前列腺素和前列腺素类似物；肌肉松弛剂；抗炎物质；免疫抑制剂、兴奋剂；解充血药；止吐药；利尿剂；解痉药；平喘药；抗帕金森病药物；祛痰药；镇咳剂；粘液溶解药；以及矿物质和营养添加剂。
另外，该药物可以是细胞毒性的、提高肿瘤通透性、抑制肿瘤细胞增殖、促进细胞凋亡、降低靶细胞中的抗凋亡活性、用于治疗由感染原引起的疾病、增强针对病原细胞的内源性免疫反应或者适用于治疗由任何类型的病原细胞所引起的一种疾病状态的一种药物。另外的说明性药物包括肾上腺类皮质激素和皮质类固醇、烷化剂、抗雄激素剂、抗雌激素剂、雄激素、阿柔比星(aclamycin)和阿柔比星衍生物、雌激素、抗代谢物(如阿糖胞苷)、嘌呤类似物、嘧啶类似物、以及甲氨喋呤、白消安、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂和其他铂化合物、他莫昔芬、紫杉酚、紫杉醇、紫杉醇衍生物、环磷酰胺、道诺霉素、根霉素、T2毒素、植物碱、泼尼松、羟基脲、替尼泊苷、丝裂霉素、圆皮海绵内酯(discodermolide)、微管抑制剂、埃博霉素、微管溶素、环丙基苯并[e]吲哚酮、断环丙基苯并[e]吲哚酮、O-Ac-断环丙基苯并[e]吲哚酮、博来霉素和任何其他抗生素、氮芥、亚硝基脲、长春花生物碱(如长春新碱、长春碱、长春地辛、长春瑞滨及其类似物和衍生物，如去乙酰基长春花碱一元酰肼(DAVLBH))、秋水仙碱、秋水仙碱衍生物、别秋水仙碱、硫代秋水仙碱、三苯甲基半胱氨酸、软海绵素B、多拉司他汀(如多拉司他汀10)、鹅膏蕈碱(如α-鹅膏菌素)、喜树碱、伊立替康及其其他喜树碱衍生物、格尔德霉素和格尔德霉素衍生物、雌莫司汀、诺考达唑、MAP4、秋水仙胺、炎症物质和促炎物质、肽和肽模拟物信号转导抑制剂以及任何其他药物或毒素。可以于在此所述的缀合物中所包含的其他药物包括雷帕霉素(如西罗莫司或依维莫司)、青霉素、头孢菌素、万古霉素、红霉素、克林霉素、利福平、氯霉素、氨基糖苷类抗生素、庆大霉素、两性霉素B、阿昔洛韦、三氟尿苷、更昔洛韦、齐多夫定、金刚烷胺、利巴韦林以及任何其他抗微生物化合物。
在另一个实施例中，该药物是选自念珠藻素、硼替佐米、硫代硼替佐米、微管溶素、氨蝶呤、雷帕霉素、紫杉醇、多西他赛、阿霉素、道诺霉素、依维莫司、a-鹅膏蕈素(amanatin)、黏液霉素(verucarin)、膜海鞘素B(didemnin B)、格尔德霉素、purvalanol A、伊斯平斯(ispinesib)、布地奈德、达沙替尼、埃博霉素、美登素以及酪氨酸激酶抑制剂，包括上述物质的类似物和衍生物。
在另一个实施例中，在此所述的化合物包括至少两种药物(D)，这些药物是说明性地选自长春花生物碱、念珠藻素、硼替佐米、硫代硼替佐米、微管溶素、氨蝶呤、雷帕霉素(如依维莫司和西罗莫司)、紫杉醇、多西他赛、阿霉素、道诺霉素、a-鹅膏蕈素、黏液霉素、膜海鞘素B、格尔德霉素、purvalanol A、伊斯平斯、布地奈德、达沙替尼、埃博霉素、美登素以及酪氨酸激酶抑制剂，包括上述物质的类似物和衍生物。在一种变型中，这些药物(D)是相同的。在另一种变型中，这些药物(D)是不同的。
在此所述的药物递送缀合物化合物可以在与任何其他已知药物的一种组合疗法中给予，无论是否靶向该另一种药物。另外的说明性药物包括但不限于，肽、寡肽、逆反式寡肽、蛋白质、蛋白质类似物(其中至少一个非肽键置换肽键)、脱辅基蛋白、糖蛋白、酶、辅酶、酶抑制剂、氨基酸及其衍生物、受体和其他膜蛋白、抗原及其抗体、半抗原及其抗体、激素、脂质、磷脂、脂质体、毒素、抗生素、止痛剂、支气管扩张剂、β-阻断剂、抗微生物药物、抗高血压药物、心血管药(包括抗心律失常药、强心苷、抗心绞痛药、血管扩张剂)、中枢神经系统药剂(包括兴奋剂、精神药物、抗躁狂药、以及镇静剂)、抗病毒剂、抗组胺剂、癌症药物(包括化疗药物)、镇定剂、抗抑郁药、H-2拮抗剂、抗惊厥剂、止恶心药、前列腺素和前列腺素类似物、肌肉松弛药、抗炎物质、兴奋剂、减充血剂、止吐药、利尿药、解痉药、止喘药、抗帕金森病药、祛痰药、镇咳剂、粘液溶解药、以及矿物质和营养添加剂。
在另一个实施例中，可以将包含一种治疗因子的至少一种另外的组合物组合给予宿主或者作为以上详述的方法的一种佐剂给予宿主，以增强病理细胞群的药物递送缀合物介导的消除，或者可以给予多于一种另外的治疗因子。治疗因子可以是选自能够刺激一种内源性免疫反应的一种化合物、一种化学治疗剂或能够补充给予的药物递送缀合物的功效的另一种治疗因子。本发明的方法可以是通过向宿主给予除以上所述缀合物之外，还给予能够刺激一种内源性免疫反应的多种化合物或组合物(例如，一种细胞因子)来进行的，这些化合物或组合物包括但不限于，细胞因子或免疫细胞生长因子，如白介素1-18、干细胞因子、碱性FGF、EGF、G-CSF、GM-CSF、FLK-2配体、HILDA、MIP-1α、TGF-α、TGF-β、M-CSF、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、可溶性CD23、LIF、及其组合。
可以使用治疗上有效的这些因子的组合。在一个实施例中，例如治疗有效量的、例如在多剂量每天的方案中剂量范围是从约0.1MIU/m2/剂量/天至约15MIU/m2/剂量/天的IL-2和例如在多剂量每天的方案中剂量范围是从约0.1MIU/m2/剂量/天至约7.5MIU/m2/剂量/天的IFN-α可以连同药物递送缀合物一起使用，以消除、减少或抵消在具有病原细胞的一种宿主动物中的病原细胞(MIU＝百万国际单位；m2＝一位普通人的近似体表面积)。在另一个实施例中，以以上所述的白介素和干扰素的治疗有效量使用IL-12和IFN-α，并且在另一个实施例中，以以上所述的白介素和干扰素的治疗有效量使用IL-15和IFN-α。在一个替代实施例中，以以上所述的治疗有效量组合使用IL-2、IFN-α或IFN-γ和GM-CSF。本发明还考虑任何其他有效细胞因子的组合的用途，包括其他白介素和干扰素与菌落刺激因子的组合。
例如本身具有细胞毒性或者可以用于增强肿瘤通透性的化学治疗剂也适用于与药物递送缀合物化合物组合地用于本发明的方法中。此类化学治疗剂包括肾上腺类皮质激素和皮质类固醇、烷化剂、抗雄激素剂、抗雌激素剂、雄激素、阿柔比星和阿柔比星衍生物、雌激素、抗代谢物(如阿糖胞苷)、嘌呤类似物、嘧啶类似物、以及甲氨喋呤、白消安、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂和其他铂化合物、他莫昔芬、紫杉酚、紫杉醇、紫杉醇衍生物、环磷酰胺、道诺霉素、根霉素、T2毒素、植物碱、泼尼松、羟基脲、替尼泊苷、丝裂霉素、圆皮海绵内酯、微管抑制剂、埃博霉素、微管溶素、环丙基苯并[e]吲哚酮、断-环丙基苯并[e]吲哚酮、O-Ac-断-环丙基苯并[e]吲哚酮、博来霉素和任何其他抗生素、氮芥、亚硝基脲、长春新碱、长春碱、长春花碱及其类似物和衍生物(如去乙酰基长春花碱一元酰肼(DAVLBH))、秋水仙碱、秋水仙碱衍生物、别秋水仙碱、硫代秋水仙碱、三苯甲基半胱氨酸、软海绵素B、多拉司他汀(如多拉司他汀10)、鹅膏蕈碱(如a-鹅膏菌素)、喜树碱、伊立替康及其其他喜树碱衍生物、格尔德霉素和格尔德霉素衍生物、雌莫司汀、诺考达唑、MAP4、秋水仙胺、炎症物质和促炎物质、肽和肽模拟物信号转导抑制剂以及任何其他本领域公认的药物或毒素。可以根据本发明使用的其他药物包括青霉素、头孢菌素、万古霉素、红霉素、克林霉素、利福平、氯霉素、氨基糖苷类抗生素、庆大霉素、两性霉素B、阿昔洛韦、三氟尿苷、更昔洛韦、齐多夫定、金刚烷胺、利巴韦林、美登素及其类似物和衍生物、吉西他滨、以及任何其他本领域公认的抗微生物化合物。
如在此所用的术语“接头”包括连接一个分子的两个或更多个官能部分以形成一种缀合物的一条原子链。说明性地，该原子链是选自C、N、O、S、Si、以及P或者C、N、O、S、以及P、C、N、O、以及S。该原子链共价连接该缀合物的不同官能部分，如结合配体、药物、诊断剂、显影剂等。该接头可以具有各种各样的长度，例如连续的主链的范围是从约2个至约100个原子。用于形成该接头的原子可以所有化学相关方式组合，例如形成亚烷基、亚烯基以及亚炔基等的碳原子链；形成醚基、聚氧化烯基团的或者与羰基组合时形成酯或碳酸酯等的碳和氧原子链；形成胺、亚胺、聚胺、肼、腙的或者与羰基组合时形成酰胺、脲、氨基脲、卡巴肼等的碳和氮原子链；形成烷氧基胺、烷氧基胺(alkoxyamines，alkoxylamines)的或者与羰基组合时形成尿烷、氨基酸、酰氧基胺、异羟肟酸等的碳、氮和氧原子链；以及很多其他原子链。此外，将理解的是，在以上每个说明性实施例中形成链的这些原子可以是饱和或不饱和的，因此形成单键、双键或三键，以使得例如烷烃、烯烃、炔烃、亚胺等可以是在该接头中所包含的基团。另外，将理解的是，形成该接头的原子还可以彼此形成环或者可以是环结构的一部分，以形成生成接头的二价环结构，包括环烷烃、环醚、环胺、以及接头中的其他杂环、亚芳基、亚杂芳基等。在此后一个安排中，将理解的是，接头长度可以通过经由一个或多个环结构的任何路径限定。说明性地，接头长度通过经由每一个环结构的最短路径限定。将理解的是，这些接头可以沿着原子链以任何一个或多个开放化合价被任选地取代，例如在任何碳、氮、硅或磷原子上的任选取代。还将理解的是，该接头可以连接一个分子的两个或更多个官能部分，以形成任何开放化合价的一种缀合物，并且形成该缀合物的一个分子的任何两个或更多个官能部分连接在任何清晰的接头末端。
在另一个实施例中，描述了一种具有以下化学式的叶酸接头基团
其中m、n、以及q是独立地选自范围0至约8的的整数；AA是一个氨基酸，R1是氢、烷基或一种氮保护基团，并且药物任选连接在(*)原子处。在一个方面，AA是具有天然或非天然构型的一种天然存在的氨基酸。在另一个方面，AA中的一个或多个是一种亲水性氨基酸。在另一个方面，AA中的一个或多个是Asp和/或Arg。在另一个方面，整数n是1或更大的整数。在另一个方面，整数n是2或更大的整数。在另一个方面，整数n是3或更大的整数。在另一个方面，整数n是4或更大的整数。在另一个方面，整数n是5或更大的整数。在另一个方面，整数q是1或更大的整数。在另一个方面，整数q是1。在另一个方面，整数m是1或更大的整数。在另一个方面，整数m是1。在另一个方面中，R1是氢。这些药物和任选另外的接头和另外的受体结合配体可以在2,ω-二氨基烷酸片段的游离NH侧链处或者在末端羧酸酯处(如由其中的自由化合价所指示的)连接到以上化学式上。将理解的是，以上方面的每种组合在此被描述为本发明的其他说明性实施例。例如，在另一个实施例中，n是1或更大的数，并且m是一或更大的数；或者n是1或更大的数，m是1，并且q是1；等等。
在另一个实施例中，描述了一种具有以下化学式的叶酸接头基团
其中m、n、q、以及p是独立地选自范围0至约8的的整数；AA是一个氨基酸，R1是氢、烷基或一种氮保护基团，并且药物任选连接在(*)原子处。在一个方面，AA是作为具有天然或非天然构型的一种天然存在的氨基酸。在另一个方面，AA中的一个或多个是一种亲水性氨基酸。在另一个方面，AA中的一个或多个是Asp和/或Arg。在另一个方面，整数n是1或更大的整数。在另一个方面，整数n是2或更大的整数。在另一个方面，整数n是3或更大的整数。在另一个方面，整数n是4或更大的整数。在另一个方面，整数n是5或更大的整数。在另一个方面，整数q和/或p是1或更大的整数。在另一个方面，整数q和/或p是1。在另一个方面，整数m是1或更大的整数。在另一个方面，整数m是1。在另一个方面中，R1是氢。这些药物和任选另外的接头和另外的受体结合配体可以在2,ω-二氨基烷酸片段的游离NH侧链处、在半胱氨酰基硫醇基团处或者在末端羧酸酯处(如由其中的自由化合价所指示的)连接到以上化学式上。将理解的是，以上方面的每种组合在此被描述为本发明的其他说明性实施例。例如，在另一个实施例中，n是1或更大的数，并且m是一或更大的数；或者n是2或更大的数，m是1，并且q是1；或者n是2或更大的数，m是1，q是1，并且p是1；等等。
在另一个实施例中，描述了一种具有以下化学式的叶酸接头基团
其中m、n、q、p、以及r是独立地选自范围0至约8的的整数；AA是一个氨基酸，R1是氢、烷基或一种氮保护基团，并且药物任选连接在(*)原子处。在一个方面，AA是作为具有天然或非天然构型的一种天然存在的氨基酸。在另一个方面，AA中的一个或多个是一种亲水性氨基酸。在另一个方面，AA中的一个或多个是Asp和/或Arg。在另一个方面，整数n是1或更大的整数。在另一个方面，整数n是2或更大的整数。在另一个方面，整数n是3或更大的整数。在另一个方面，整数n是4或更大的整数。在另一个方面，整数n是5或更大的整数。在另一个方面，整数q和/或p和/或r是1或更大的整数。在另一个方面，整数q和/或p和/或r是1。在另一个方面，整数m是1或更大的整数。在另一个方面，整数m是1。在另一个方面中，R1是氢。这些药物和任选另外的接头和另外的受体结合配体可以在2,ω-二氨基烷酸片段的游离NH侧链处、在半胱氨酰基硫醇基团处、在丝氨酰基羟基处或者在末端羧酸酯处(如由其中的自由化合价所指示的)连接到以上化学式上。将理解的是，以上方面的每种组合在此被描述为本发明的其他说明性实施例。例如，在另一个实施例中，n是1或更大的数，并且m是一或更大的数；或者n是2或更大的数，m是1，并且q是1；或者n是2或更大的数，m是1，q是1，并且p是1；或者n是2或更大的数，m是1，q是1，并且r是1；或者n是2或更大的数，m是1，q是1，p是1，并且r是1；等等。
在另一个实施例中，多价接头包含如在此所述的一个或多个二价亲水性基团，也称为接头或间隔物接头。将了解的是，不同亲水性接头的安排和/或取向可以是处于一种线性或分支形式，或者处于两种形式中。例如，亲水性接头可以形成接头的主链，从而在配体与该一种或多种药物之间形成缀合物。或者，接头的亲水性部分侧接到或连接到原子链主链上，从而连接结合配体B与一种或多种药物D。在此后一种安排中，亲水性部分可以是在原子主链的近端或远端。
在另一个实施例中，该接头或多或少是线性的，并且亲水性基团主要串联地安排，以形成缀合物中的一个链状接头。所述另一种方式，在此线性实施例中亲水性基团形成此接头的一些或所有的主链。
在另一个实施例中，该接头与亲水性基团分支。在此分支的实施例中，亲水性基团可以是在主链的近端或主链的远端。在每一种的这些安排中，接头的形状多是球形或圆柱形的。在一种变型中，该接头的形状像一个洗瓶刷。在一个方面，接头的主链是通过一系列线性酰胺形成的，并且接头的亲水性部分是通过平行安排的多个分支侧链，例如通过连接单糖、磺酸盐等及其衍生物和类似物来形成的。
应理解，该接头在某些条件下，例如在体内遇到的生理条件下可以是中性的或可电离的。对于可电离接头，在所选择的条件下，该接头可以去质子化以形成一个阴离子，或者可替代地变为质子化的以形成一个阳离子。应了解，可以发生多于一个去质子化或质子化事件。此外，应理解相同的接头可以去质子化并且质子化以形成内盐或两性离子化合物。
在另一个实施例中，亲水性间隔物接头是中性的，具体地说在生理条件下是中性的，这些接头不会显著地质子化也不会显著地去质子化。在另一个实施例中，亲水性间隔物接头可以被质子化以携带一个或多个正电荷。应理解，质子化能力是条件依赖性的。在一个方面，这些条件是生理条件，并且该接头在体内是被质子化的。在另一个实施例中，这些间隔物包括中性的区域和可以被质子化来携带一个或多个正电荷的区域二者。在另一个实施例中，这些间隔物包括可以被去质子化来携带一个或多个负电荷的区域和可以被质子化来携带一个或多个正电荷的区域二者。应理解，在此后一个实施例中可以形成两性离子或内盐。
在一个方面，可以被去质子化来携带一个负电荷的这些接头区域包括羧酸(如天冬氨酸、谷氨酸)和较长链羧酸基团以及硫酸酯如硫酸烷酯。在另一个方面，可以被质子化来携带一个正电荷的这些接头区域包括氨基，如多氨基亚烷基，包括乙二胺、丙二胺、丁二胺等，和/或杂环，包括基吡咯烷、哌啶、哌嗪、以及其他氨基，它们各自被任选取代。在另一个实施例中，中性的这些接头区域包括多羟基，如食糖、碳水化合物、糖、肌醇等和/或聚醚基团，如聚氧化烯基团，包括聚氧乙烯、聚氧丙烯等。
在一个实施例中，在此所述的亲水性间隔物接头包括主要由碳、氢和氧形成的并且具有约3:1或更小的或者约2:1或更小的碳/氧比率的接头。在一个方面，在此所述的亲水性接头包含多个醚官能团。在另一个方面，在此所述的亲水性接头包含多个羟基官能团。可以用于形成此类接头的说明性片段和基团包括多羟基化合物如碳水化合物、聚醚化合物如聚乙二醇单元以及酸性基团如羧基和烷基硫酸。在一个变型中，在该接头中还可以包含低聚酰胺间隔物等。
说明性二价亲水性接头包括在此所述的碳水化合物如糖基肽(saccharopeptide)，它包含肽特征和糖特征二者；葡糖苷酸，它可以通过[2+3]胡伊斯根环化(Huisgen cyclization)来结合，这也称为点击化学；β-烷基糖苷，如2-脱氧六吡喃糖(2-脱氧葡萄糖、2-脱氧葡糖苷酸等)，以及β-烷基吡喃甘露糖苷。说明性PEG基团包括特定长度范围是从约4个至约20个PEG基团的那些基团。说明性烷基硫酸酯也可以通过点击化学直接引入到主链中。说明性低聚酰胺间隔物包括EDTA和DTPA间隔物、β-氨基酸等。
在另一个实施例中，多价接头L包含一种或多种聚醚，如具有以下化学式的接头：
其中m是在每种情况下独立地选自1至约8的一个整数；p是选自1至约10的一个整数；并且n是在每种情况下独立地选自1至约3的一个整数。在一个方面，m在每种情况下独立地是1至约3。在另一个方面，n在每种情况下是1。在另一个方面，p在每种情况下独立地是约4至约6。说明性地，在此考虑了与以上所对应的相应聚丙烯聚醚并且在这些缀合物中它们可以作为亲水性间隔物接头包含在内。此外，应了解，在这些缀合物中混合的聚乙烯和聚丙烯聚醚可以作为亲水性间隔物接头包含在内。另外，在此考虑了以上聚醚化合物的环变型，如包含四氢呋喃基、1,3-二噁烷、1,4-二噁烷等的那些环变型。
在另一个实施例中，多价接头L包含多个羟基官能团，例如结合单糖、寡糖、多糖等的接头。将理解的是，含有多羟基的间隔物接头包含多个-(CROH)-基团，其中R是氢或烷基。
在另一个实施例中，多价接头L包含以下片段中的一个或多个：
其中R是H、烷基、环烷基或芳烷基；m是从1至约3的一个整数；n是从1至约5或者从2至约5的一个整数，p是从1至约5的一个整数，并且r是选自1至约3的一个整数。在一个方面，整数n是3或4。在另一个方面，整数p是3或4。在另一个方面，整数r是1。
在另一个实施例中，多价接头L包含以下片段中的一个或多个：
其中R是H、烷基、环烷基或芳烷基；m是从1至约3的一个整数；n是从1至约5或者从2至约5的一个整数，p是从1至约5的一个整数，并且r是选自1至约3的一个整数。在一个方面，整数n是3或4。在另一个方面，整数p是3或4。在另一个方面，整数r是1。
在另一个实施例中，多价接头L包含以下环形多羟基基团中的一个或多个：
其中n是从2至约5的一个整数，p是从1至约5的一个整数，并且r是从1至约4的一个整数。在一个方面，整数n是3或4。在另一个方面，整数p是3或4。在另一个方面，整数r是2或3。应理解，在此考虑了这些接头的此类区段的所有立体化学形式。例如，在以上化学式中，该区段可以是源于核糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、或其他糖，并且保留存在于那些分子上的侧接羟基和烷基的立体化学安排。此外，应理解，在以上化学式中，还考虑了不同的脱氧化合物。说明性地，考虑了具有以下化学式的化合物：
其中n等于或小于r，例如当r是2或3时，n分别是1或2或者1、2或3。
在另一个实施例中，多价接头L包含具有以下化学式的一个或多个多羟基基团：
其中n和r各自是选自1至约3的一个整数。在一个方面中，该接头包括具有以下化学式的一种或多种多羟基化合物：
应理解，在此考虑了这些接头的此类区段的所有立体化学形式。例如，在以上化学式中，该区段可以是源于核糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、或其他糖，并且保留存在于那些分子上的侧接羟基和烷基的立体化学安排。
在另一个实施例中，多价接头L包含与接头的主链间隔开的一个或多个多羟基基团。在一个实施例中，此类碳水化合物基团或多羟基基团通过一个三唑基团连接到主链，从而形成三唑连接的亲水性间隔物接头。说明性地，该接头包含具有以下化学式的片段：
其中n、m以及r是整数并且在每种情况下各自独立地选自1至约5。在一个说明性方面，m在每种情况下独立地是2或3。在另一个方面，r在每种情况下是1。在另一个方面，n在每种情况下是1。在一个变型中，连接多羟基基团与接头的主链的基团是一个不同的杂芳基基团，包括但不限于，吡咯、吡唑、1,2,4-三唑、呋喃、噁唑、异噁唑、噻吩基、噻唑、异噻唑、噁二唑等。类似地，考虑了二价6元环杂芳基基团。以上说明性亲水性间隔物接头的其他变型包括氧化烯基团，如以下化学式：
其中n和r是整数并且在每种情况下各自独立地选自1至约5；并且p是选自1至约4的一个整数。
在另一个实施例中，多价接头L包含通过一个酰胺基连接到主链，从而形成酰胺连接的亲水性间隔物接头的一个或多个碳水化合物基团或多羟基基团。说明性地，此类接头包含具有以下化学式的片段：
其中n是选自1至约3的一个整数并且m是选自1至约22的一个整数。在一个说明性方面中，n是1或2。在另一个说明性方面，m是选自约6至约10，说明性地是8。在一个变型中，连接多羟基基团与接头的主链的基团是一个不同的官能基团，包括但不限于，酯、脲、氨基甲酸酯、酰基腙等。类似地，考虑了环形变型。以上说明性亲水性间隔物接头的其他变型包括氧化烯基团，如以下化学式：
其中n和r是整数并且在每种情况下各自独立地选自1至约5；并且p是选自1至约4的一个整数。
在另一个实施例中，多价接头L包含以下片段中的一个或多个：
其中R是H、烷基、环烷基或芳烷基；m是独立地选自1至约3的一个整数；n是从1至约6的一个整数，p是从1至约5的一个整数，并且r是选自1至约3的一个整数。在一个变型中，整数n是3或4。在另一个变型中，整数p是3或4。在另一个变型中，整数r是1。
在另一个实施例中，多价接头L包含以下片段中的一个或多个：
其中R是H、烷基、环烷基或芳烷基；m是独立地选自1至约3的一个整数；n是从2至约6的一个整数，p是从1至约5的一个整数，并且r是选自1至约3的一个整数。在一个变型中，整数n是3或4。在另一个变型中，整数p是3或4。在另一个变型中，整数r是1。
在另一个实施例中，多价接头L包含以下片段中的一个或多个：
其中m是独立地选自1至约3的一个整数；n是从1至约6的一个整数，p是从1至约5的一个整数，并且r是选自1至约3的一个整数。在一个变型中，整数n是3或4。在另一个变型中，整数p是3或4。在另一个变型中，整数r是1。
在另一个实施例中，多价接头L包含以下片段中的一个或多个：
其中m是独立地选自1至约3的一个整数；n是从2至约6的一个整数，p是从1至约5的一个整数，并且r是选自1至约3的一个整数。在变型中，整数n是3或4。在另一个变型中，整数p是3或4。在另一个变型中，整数r是1。
在另一个实施例中，多价接头L包含以下片段中的一个或多个：
其中m是独立地选自1至约3的一个整数；n是从1至约6的一个整数，p是从1至约5的一个整数，并且r是选自1至约3的一个整数。在一个变型中，整数n是3或4。在另一个变型中，整数p是3或4。在另一个变型中，整数r是1。
在另一个实施例中，多价接头L包含主链和分支的侧基序的一个组合，例如通过以下化学式所示出的
其中n是在每种情况下独立地选自0至约3的一个整数。以上化学式旨在表示4元、5元、6元以及甚至更大的环形糖。此外，应理解，以上化学式可以被修饰来表示脱氧糖，其中存在于这些化学式中的羟基中的一个或多个被氢、烷基或氨基置换。此外，应理解通过以上化学式考虑了相应的羰基化合物，其中这些羟基中的一个或多个被氧化成相应的羰基。此外，在此说明性实施例中，吡喃糖包含羧基和氨基官能团二者，并且(a)可以被插入到主链中并且(b)可以在此实施例的变型中提供分支侧链的合成手册。任何侧接的羟基可以用于连接其他化学片段，包括另外的糖，以制备相应的寡糖。还考虑了此实施例的其他变型，包括在一个单一碳处(即，螺安排)、在一对孪位碳处以及类似安排将吡喃糖或其他糖插入到主链中例如，该接头或药物D或结合配体B的一端或两端可以连接到糖，以便以1,1；1,2；1,3；1,4；2,3；或其他安排插入到主链中。
在另一个实施例中，在此所述的亲水性间隔物接头包括主要由碳、氢和氮形成的并且具有约3:1或更小的或者约2:1或更小的碳/氧比率的接头。在一个方面，在此所述的亲水性接头包含多个氨基官能团。
在另一个实施例中，多价接头L包含具有以下化学式的一个或多个氨基基团：
其中n是在每种情况下独立地选自1至约3的一个整数。在一个方面，整数n在每种情况下独立地是1或2。在另一个方面，整数n在每种情况下是1。
在另一个实施例中，多价接头L包含一种或多种硫酸酯，如硫酸烷酯。说明性地，该接头包含以下化学式(e)：
其中n是在每种情况下独立地选自1至约3的一个整数。说明性地，n在每种情况下独立地是1或2。
应理解，在包含结合杂原子的游离氢的此类多羟基、聚氨基、羧酸、硫酸等接头中，可以分别使用适当的羟基、氨基或酸保护基团保护那些游离氢原子中的一个或多个，或者可替代地可以作为相应前药封闭它们，后一种选择用于特定用途，例如在一般或特异性生理条件下释放母体药物的前药。
在另一个实施例中，多价接头包含以下二价基团中的一个或多个：
其中n是从2至约5的一个整数，p是从1至约5的一个整数，并且r是从1至约4的一个整数，如以上所述的。
还应理解，在以上实施例中，开放位置如(*)原子是用于连接有待递送的结合配体(B)或任何药物(D)的位置。此外，应理解，B和任何D之一或者二者的此类连接可以是直接的或者是通过包含在此所述的一个或多个基团的一个插入接头。此外，(*)原子可以与任何药物D或者接头L的其他部分形成可释放接头。
在另一个实施例中，亲水性间隔物接头包括一个或多个含有碳水化合物或者含有多羟基基团的接头。在另一个实施例中，亲水性间隔物接头包括至少三个含有碳水化合物或者含有多羟基基团的接头。在另一个实施例中，亲水性间隔物接头包括一个或多个含有碳水化合物或者含有多羟基基团的接头以及一个或多个天冬氨酸。在另一个实施例中，亲水性间隔物接头包括一个或多个含有碳水化合物或者含有多羟基基团的接头以及一个或多个谷氨酸。在另一个实施例中，亲水性间隔物接头包括一个或多个含有碳水化合物或者含有多羟基基团的接头、一个或多个谷氨酸、一个或多个天冬氨酸以及一个或多个β氨基丙氨酸。在一个系列的变型中，在每一个以上实施例中，亲水性间隔物接头还包含一个或多个半胱氨酸。在另一个系列的变型中，在每一个以上实施例中，亲水性间隔物接头还包含至少一个精氨酸。
在另一个实施例中，多价接头L包括含有一个或多个二价1,4-哌嗪的一种亲水性间隔物接头，它包含在原子链中，从而连接结合配体(L)中的至少一个与药物(D)中的至少一个。在一个变型中，亲水性间隔物接头包括一个或多个含有碳水化合物或者含有多羟基基团的接头。在另一个变型中，亲水性间隔物接头包括一个或多个含有碳水化合物或者含有多羟基基团的接头以及一个或多个天冬氨酸。在另一个变型中，亲水性间隔物接头包括一个或多个含有碳水化合物或者含有多羟基基团的接头以及一个或多个谷氨酸。在一个系列的变型中，在每一个以上实施例中，亲水性间隔物接头还包含一个或多个半胱氨酸。在另一个系列的变型中，在每一个以上实施例中，亲水性间隔物接头还包含至少一个精氨酸。
在另一个实施例中，亲水性间隔物接头包括一个或多个低聚酰胺亲水性间隔物，例如但不限于，氨基乙基哌嗪基乙酰胺。
在另一个实施例中，多价接头L包括一种亲水性间隔物接头，该亲水性间隔物接头包括一个或多个含有三唑连接的碳水化合物或者含有多羟基基团的接头。在另一个实施例中，亲水性间隔物接头包括一个或多个含有酰胺连接的碳水化合物或者含有多羟基基团的接头。在另一个实施例中，亲水性间隔物接头包含一个或多个PEG基团和一个或多个半胱氨酸。在另一个实施例中，亲水性间隔物接头包括一个或多个EDTE衍生物。
在另一个实施例中，多价接头L包含具有以下化学式的一个二价基团
其中*指示与一个叶酸的连接点并且**指示与一个药物的连接点；并且F和G各自独立地是1、2、3或4，如所述的。
在另一个实施例中，多价接头L包含具有以下化学式的一个三价基团
其中*、**、***各自指示与叶酸受体结合部分B和一种或多种药物D的连接点。应理解，当存在较少的药物时，*、**、***被氢或一个杂原子取代。F和G各自独立地是1、2、3或4；并且W1是NH或O，如所述的。在另一个方面中，m1是0或1。
在在此所述的任何实施例中，在多价接头L中还可以包括杂原子接头，例如–NR1R2-、氧、硫、以及化学式-(NHR1NHR2)-、-SO-、-(SO2)-、以及-N(R3)O-，其中R1、R2、以及R3是各种独立地选自氢、烷基、芳基、芳烷基、取代的芳基、取代的芳烷基、杂芳基、取代的杂芳基以及烷氧基烷基。应理解，杂原子接头可以用于共价连接在此所述的任何基团，包括连接药物基团D与多价接头、配体基团B与多价接头，或者来自多价接头L的不同二价和多价基团可以用于形成接头的一部分的其他说明性二价基团如下。
多价接头L是一种可释放接头。
如在此所用的术语“可释放接头”是指一种接头，该接头包含当在此所述的化合物被递送到靶细胞或靶细胞内部时可以在生理条件下破裂的至少一个键。因此，术语可释放接头通常并不是简单地指示在体内如在血清、血浆、胃肠道或肝中不稳定的一个键，除非那些系统是细胞表面受体结合配体的靶标。然而，在递送和/或选择性靶向之后，可释放接头可以通过任何方法裂解，包括使至少一个键在生理条件下在接头中或者在接头与B或任何D的共价连接处破裂，例如通过使一种或多种pH不稳定、酸不稳定、碱不稳定、氧化不稳定、代谢不稳定、生物化学不稳定和/或酶不稳定的键裂解。应了解，引起键破裂的此类生理条件并不一定包括一个生物或代谢过程，并且相反可以包括一个标准化学反应，如一个水解反应，例如在生理pH下，或者因此分隔到一个细胞器中，例如具有低于细胞溶质pH的一个pH的一个核内体。
应理解，一个可裂解键可以连接在可释放接头内的两个相邻的原子和/或在可释放接头的任何末端连接其他接头与在此所述的B和/或任何D。在其中一个可裂解键连接可释放接头内的两个相邻的原子的情况下，在键破裂之后，可释放接头破裂成两个或更多个片段。或者，在其中一个可裂解键是在可释放接头与另一个部分如另一个杂原子、一个间隔物接头、接头的另一个可释放部分、任何D或B之间的情况下，在键破裂之后，可释放接头与其他部分分离。
说明性基团本身包括一个可裂解键或者与B和/或任何D半缩醛及其硫变型、缩醛及其硫变型、半缩醛胺、缩醛胺等形成一个可裂解键或者可以由被至少一个杂原子取代的亚甲基片段形成，如1-烷氧基亚烷基、1-烷氧基环亚烷基、1-烷氧基亚烷基羰基、1-烷氧基环亚烷基羰基等。在此所述的说明性可释放接头包括多价接头，这些接头包括羰基芳基羰基、羰基(羧基芳基)羰基、羰基(双羧基芳基)羰基、卤代亚烷基羰基等。在此所述的说明性可释放接头包括多价接头，这些接头包括亚烷基(二烷基甲硅烷基)、亚烷基(烷芳基甲硅烷基)、亚烷基(二芳基甲硅烷基)、(二烷基甲硅烷基)芳基、(烷芳基甲硅烷基)芳基、(二芳基甲硅烷基)芳基等。在此所述的说明性可释放接头包括氧基羰基氧基、氧基羰基氧基烷基、磺酰基氧基、氧基磺酰基烷基等。在此所述的说明性可释放接头包括多价接头，这些接头包括亚氨基亚烷基、羰基亚烷基亚氨基、亚氨基环亚烷基、羰基环亚烷基亚氨基等。在此所述的说明性可释放接头包括多价接头，这些接头包括亚烷基硫基、亚烷基芳基硫基、以及羰烷基硫基等。每一个以上片段任选被在此所定义的一个取代基X2取代。
取代基X2可以是烷基、烷氧基、烷氧基烷基、羟基、羟基烷基、氨基、氨基烷基、烷基氨基烷基、二烷基氨基烷基、卤代、卤代烷基、巯基烷基、烷基硫基烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、取代的芳烷基、杂芳基、取代的杂芳基、羧基、羧基烷基、羧酸烷酯、链烷酸烷酯、胍基烷基、R4-羰基、R5-羰基烷基、R6-酰基氨基、以及R7-酰基氨烷基，其中R4和R5是各自独立地选自氨基酸、氨基酸衍生物、以及肽，并且其中R6和R7是各自独立地选自氨基酸、氨基酸衍生物、以及肽。在此实施例中，杂原子接头可以是氮，并且取代基X2和杂原子接头可以与它们所结合的可释放接头一起形成一个杂环。
这些杂环可以是吡咯烷、哌啶、噁唑烷、异噁唑烷、噻唑烷、异噻唑烷、吡咯烷酮、哌啶酮、噁唑烷酮、异噁唑烷酮、噻唑烷酮、异噻唑烷酮、以及琥珀酰亚胺。
在此所述的任何实施例中，可释放接头可以包含结合亚甲基、1-烷氧基亚烷基、1-烷氧基环亚烷基、1-烷氧基亚烷基羰基、以及1-烷氧基环亚烷基羰基以形成一个乙缩醛或缩酮的氧，其中每个片段任选被在此所定义的一个取代基X2取代。或者，亚甲基或亚烷基被一个任选取代的芳基取代。
在此所述的任何实施例中，可释放接头可以包含结合磺酰烷基以形成一种烷基磺酸酯的氧。
在此所述的任何实施例中，可释放接头可以包含结合亚氨基亚烷基、羰基亚烷基亚氨基、亚氨基环亚烷基、以及羰基环亚烷基亚氨基以形成一个腙的氮，它们各自任选被在此所定义的一个取代基X2取代。在一个替代构型中，该腙可以用一种羧酸衍生物、一种原甲酸酯衍生物、或者一种氨基甲酰衍生物酰化，以形成含有不同的酰腙的可释放接头。
在此所述的任何实施例中，可释放接头可以包含结合亚烷基(二烷基甲硅烷基)、亚烷基(烷芳基甲硅烷基)、亚烷基(二芳基甲硅烷基)、(二烷基甲硅烷基)芳基、(烷芳基甲硅烷基)芳基、以及(二芳基甲硅烷基)芳基以形成一个硅醇的氧，它们各自任选被在此所定义的一个取代基X2取代。
在此所述的任何实施例中，可释放接头可以包含结合羰基芳基羰基、羰基(羧基芳基)羰基、羰基(双羧基芳基)羰基以形成一种酰胺或者可替代地与一个药物的氮形成一种酰胺的氮。
在此所述的任何实施例中，可释放接头可以包含结合羰基芳基羰基、羰基(羧基芳基)羰基、羰基(双羧基芳基)羰基以形成一种酯或者可替代地与药物的氧形成一种酯的氧。
应理解，二价间隔物接头可以任何化学相关方式直接地或者通过一个插入的杂原子组合，以构建在此所述的可释放接头。还应理解，间隔物和杂原子接头的安排的性质限定了可释放接头将体内裂解的情况。在组合时终止于一个硫原子的两个间隔物接头形成一个二硫键，该二硫键是因此在可释放接头中形成的可裂解键。
例如，在另一个实施例中，该多价接头包含一个3-硫代琥珀酰亚胺-1-基烷氧基甲氧基部分，其中该甲基任选被烷基或取代的芳基取代。
在另一个实施例中，该多价接头包含一个3-硫代琥珀酰亚胺-1-基烷基羰基，其中该羰基与药物形成一个酰基氮丙啶。
在另一个实施例中，该多价接头包含一个1-烷氧基环亚烷基氧基部分。
在另一个实施例中，该多价接头包含一个亚烷基氨基羰基(二羧基亚烷基)羧酸酯。
在另一个实施例中，该多价接头包含一个二硫代烷羰基酰肼，其中该酰肼与药物形成一个腙。
在另一个实施例中，该多价接头包含一个3-硫代琥珀酰亚胺-1-基烷基羰基酰肼，其中该酰肼与药物形成一个腙。
在另一个实施例中，该多价接头包含一个3-硫代烷基磺酰烷基(双取代甲硅烷基)氧基，其中该双取代甲硅烷基被烷基或任选取代的芳基取代。
在另一个实施例中，该多价接头包含选自下组的多个间隔物接头，该组由天然存在的氨基酸及其立体异构体组成。
在另一个实施例中，该多价接头包含一个2-二硫代烷氧基羰基，其中该羰基与药物形成一个碳酸酯。
在另一个实施例中，该多价接头包含一个2-二硫代芳基烷氧基羰基，其中该羰基与药物形成一个碳酸酯并且该芳基是任选被取代的。
在另一个实施例中，该多价接头包含一个4-二硫代芳基烷氧基羰基，其中该羰基与药物形成一个碳酸酯，并且该芳基是任选被取代的。
在另一个实施例中，该多价接头包含一个3-硫代琥珀酰亚胺-1-基烷氧基烷氧基亚烷基，其中该亚烷基与药物形成一个腙，每个烷基是独立地选择的，并且该氧基烷氧基任选被烷基或任选取代的芳基取代。
在另一个实施例中，该多价接头包含一个2-二流动烷氧基羰基酰肼。
在另一个实施例中，该多价接头包含一个2-或3-二硫代烷基氨基，其中该氨基与药物形成一个插烯酰胺。
在另一个实施例中，该多价接头包含一个2-二硫代烷基氨基，其中该氨基与药物形成一个插烯酰胺，并且该烷基是乙基。
在另一个实施例中，该多价接头包含一个2-或3-二硫代烷基氨基羰基，其中该羰基与药物形成一个氨基甲酸酯。
在另一个实施例中，该多价接头包含一个2-二硫代烷基氨基羰基，其中该羰基与药物形成一个氨基甲酸酯。在另一个方面，该烷基是乙基。
在另一个实施例中，该多价接头包含一个2-二硫代烷氧基羰基，其中该羰基与药物形成一个氨基甲酸酯。在另一个方面，该烷基是乙基。
在另一个实施例中，该多价接头包含一个2-二硫代芳基烷氧基羰基，其中该羰基与药物形成一个氨基甲酸酯或一个氨基甲酰氮丙啶。
在另一个实施例中，该多价接头包含一个4-二硫代芳基烷氧基羰基，其中该羰基与药物形成一个氨基甲酸酯或一个氨基甲酰氮丙啶。
在另一个实施例中，在此所述的多价接头包含具有以下化学式(II)的二价基团
其中n是选自1至约4的一个整数；Ra和Rb是各自独立地选自下组，该组由氢和烷基组成，包括任选支化的低级烷基如C1-C4烷基；或者Ra和Rb与连接的碳原子一起形成一个碳环；R是一个任选取代的烷基、一个任选取代的酰基或一个适当选择的氮保护基团；并且(*)指示药物、维生素、显影剂、诊断剂、其他二价接头或缀合物的其他部分的连接点。
在另一个实施例中，在此所述的多价接头包含
具有以下化学式(III)的二价基团
其中m是选自1至约4的一个整数；R是一个任选取代的烷基、一个任选取代的酰基或一个适当选择的氮保护基团；并且(*)指示药物、维生素、显影剂、诊断剂、其他二价接头或缀合物的其他部分的连接点。
在另一个实施例中，在此所述的多价接头包含具有以下化学式(IV)的二价基团
其中m是选自1至约4的一个整数；R是一个任选取代的烷基、一个任选取代的酰基或一个适当选择的氮保护基团；并且(*)指示药物、维生素、显影剂、诊断剂、其他二价接头或缀合物的其他部分的连接点。
在另一个实施例中，在此所述的化合物包含选自以下化学式的一个或多个基团接头：
其中X是NH、O、或S。
在另一个实施例中，在此所述的多价接头包含具有以下化学式的一个基团
或者
在另一个实施例中，在此所述的多价接头包含具有以下化学式的一个基团
其中X是一个杂原子，如氮、氧、或硫，n是选自0、1、2、以及3的一个整数，R是氢或者一个取代基，包括能够诱导地或者通过芳环上的共振来使一个正电荷稳定的一个取代基，如烷氧基等，并且符号(*)指示连接点。应了解，其他取代基可以存在于芳环、苄基碳、链烷酸或亚甲基桥上，包括但不限于，羟基、烷基、烷氧基、烷基硫基、卤代等。
在另一个实施例中，在此所述的多价接头包括选自以下各项的基团：羰基、硫代羰基、亚烷基、环亚烷基、亚烷基环烷基、亚烷基羰基、环亚烷基羰基、羰基烷基羰基、1-亚烷基琥珀酰亚胺-3-基、1-(羰基烷基)琥珀酰亚胺-3-基、亚烷基次磺酰基、磺酰基烷基、亚烷基次磺酰基(sulfoxyl)烷基、亚烷基磺酰基烷基、羰基四氢-2H-吡喃基、羰基四氢呋喃基、1-(羰基四氢-2H-吡喃基)琥珀酰亚胺-3-基、以及1-(羰基四氢呋喃基)琥珀酰亚胺-3-基，其中每个所述间隔物接头任选被一个或多个取代基x1取代；
其中每个取代基X1是独立地选自下组，该组由以下各项组成：烷基、烷氧基、烷氧基烷基、羟基、羟基烷基、氨基、氨基烷基、烷基氨基烷基、二烷基氨基烷基、卤代、卤代烷基、巯基烷基、烷基硫基烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、取代的芳烷基、杂芳基、取代的杂芳基、羧基、羧基烷基、羧酸烷酯、链烷酸烷酯、胍基烷基、R4-羰基、R5-羰基烷基、R6-酰基氨基、以及R7-酰基氨烷基，其中R4和R5是各自独立地选自下组，该组由一个氨基酸、一个氨基酸衍生物、以及一个肽组成，并且其中R6和R7是各自独立地选自下组，该组由一个氨基酸、一个氨基酸衍生物、以及一个肽组成。
在此所述的化合物可以含有一个或多个手性中心，或者可以另外能够作为多种立体异构体存在。应理解，在一个实施例中，在此所述的本发明并不限于任何特定的立体化学要求，除非在特别指定的情况下，并且这些化合物和包含它们的组合物、方法、用途、以及药物可以是光学纯的，或者可以是任何多种立体异构体混合物，包括外消旋和对映体的其他混合物、非对映体的其他混合物等。还应理解，此类立体异构体的混合物可以在一个或多个手性中心包含一个单一的立体化学构型，同时在一个或多个其他手性中心处包含立体化学构型的混合物。
类似地，在此所述的化合物可以包含多个几何中心，如顺式、反式、E、以及Z双键。应理解，在另一个实施例中，在此所述的本发明并不限于任何特定的几何异构体要求，并且这些化合物和包含它们的组合物、方法、用途、以及药物可以是纯的，或者可以是任何多种几何异构体混合物。还应理解，此类几何异构体的混合物可以在一个或多个双键包含一个单一构型，同时在一个或多个其他双键处包含几何结构的混合物。
如在此所用的术语“细胞表面受体结合或靶向配体”通常是指结合和/或靶向可见于细胞表面上的受体以及具体地说可见于病原细胞的表面上、通过这些细胞过度表达和/或偏好在这些细胞表面上表达的那些受体的化合物。说明性配体包括但不限于，维生素和维生素受体结合化合物。
说明性维生素部分包括肉毒碱、肌醇、硫辛酸、吡哆醛、抗坏血酸、烟酸、泛酸、叶酸、核黄素、硫胺素、生物素、维生素B12、以及脂溶性维生素A、D、E和K。这些维生素以及其受体结合类似物和衍生物构成靶向实体，可以由该实体形成一个基团以用于与多价接头L共价连接。结合生物素受体的说明性生物素类似物包括但不限于，生物胞素、生物素亚砜、氧代生物素等)。
结合叶酸受体的说明性叶酸类似物包括但不限于，亚叶酸、蝶酰谷氨酸、以及叶酸受体结合蝶啶如四氢蝶呤、二氢叶酸、四氢叶酸及其脱氮和二脱氮类似物。术语“脱氮”和“二脱氮”类似物是指在天然存在的叶酸结构或其类似物或衍生物中用一个碳原子取代一个或多个氮原子的本领域公认的类似物。例如，脱氮类似物包括叶酸、亚叶酸、蝶酰谷氨酸、以及叶酸受体结合蝶啶如四氢蝶呤、二氢叶酸、以及四氢叶酸的1-脱氮、3-脱氮、5-脱氮、8-脱氮、以及10-脱氮类似物。二脱氮类似物包括例如叶酸、亚叶酸、蝶酰谷氨酸、以及叶酸受体结合蝶啶如四氢蝶呤、二氢叶酸、以及四氢叶酸的1,5-二脱氮、5,10-二脱氮、8,10-二脱氮、以及5,8-二脱氮类似物。适用作本发明的复合物形成配体的其他叶酸是叶酸受体结合类似物氨蝶呤、氨甲蝶呤(也称为甲氨蝶呤)、N10-甲基叶酸、2-脱氨基-羟基叶酸、脱氮类似物如1-脱氮甲氨蝶呤或3-脱氮甲氨蝶呤、以及3',5'-二氯-4-氨基-4-脱氧-N10-甲基蝶酰基谷氨酸(二氯甲氨蝶呤)。以上叶酸类似物和/或衍生物通常称为“叶酸类(folates)”，这反映了它们与叶酸受体结合的能力，并且此类配体在与外源性分子缀合时有效地增强跨膜转运，例如通过在此所述的叶酸介导的内吞作用。
在美国专利申请公开序列号2005/0227985和2004/0242582中描述了结合叶酸受体的其他叶酸类似物，这些专利申请的披露内容通过引用结合在此。说明性地，此类叶酸类似物具有以下一般化学式：
其中X和Y是各自独立地选自下组，该组由卤素、R2、OR2、SR3、以及NR4R5组成；
U、V、以及W代表各自独立地选自下组的二价部分，该组由-(R6a)C＝、-N＝、-(R6a)C(R7a)-、以及-N(R4a)-组成；Q是选自下组，该组由C和CH组成；T是选自下组，该组由S、O、N、以及-C＝C-组成；
A1和A2是各自独立地选自下组，该组由以下各项组成：氧、硫、-C(Z)-、-C(Z)O-、-OC(Z)-、-N(R4b)-、-C(Z)N(R4b)-、-N(R4b)C(Z)-、-OC(Z)N(R4b)-、-N(R4b)C(Z)O-、-N(R4b)C(Z)N(R5b)-、-S(O)-、-S(O)2-、-N(R4a)S(O)2-、-C(R6b)(R7b)-、-N(C≡CH)-、-N(CH2C≡CH)-、C1-C12亚烷基、以及C1-C12亚烷基氧基，其中Z是氧或硫；
R1是选自下组，该组由氢、卤素、C1-C12烷基、以及C1-C12烷氧基组成；R2、R3、R4、R4a、R4b、R5、R5b、R6b、以及R7b是各自独立地选自下组，该组由以下各项组成：氢、卤素、C1-C12烷基、C1-C12烷氧基、C1-C12烷酰基、C1-C12烷烯基、C1-C12烷炔基、(C1-C12烷氧基)羰基、以及(C1-C12烷基氨基)羰基；
R6和R7是各自独立地选自下组，该组由氢、卤素、C1-C12烷基、以及C1-C12烷氧基组成；或者，R6和R7一起形成一个羰基；R6a和R7a是各自独立地选自下组，该组由氢、卤素、C1-C12烷基、以及C1-C12烷氧基组成；或者，R6a和R7a一起形成一个羰基；
L是在此所述的一个二价接头；并且
n、p、r、s以及t各自独立地是0或1。
如在此所用的术语“氨基酸”通常是指β、γ以及更长的氨基酸，如具有以下化学式的氨基酸：
-N(R)-(CR’R”)q-C(O)-
其中R是氢、烷基、酰基或一个适合的氮保护基团，R’和R”是氢或一个取代基，它们在每种情况下是各自独立地选择的，并且q是一个整数如1、2、3、4、或5。说明性地，R'和/或R”独立地对应于但不限于存在于天然存在的氨基酸上的氢或侧链，如甲基、苄基、羟甲基、硫代甲基、羧基、羧甲基、胍基丙基等以及其衍生物和保护性衍生物。以上所述的化学式包括所有立体异构体变型。例如，氨基酸可以是选自天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、鸟氨酸、苏氨酸等。
如在此所用的术语“氨基酸衍生物”通常是指如在此所定义的一种氨基酸，其中氨基和/或侧链之一或二者被取代。说明性氨基酸衍生物包括氨基和/或侧链的前药和保护基团，如胺、酰胺、羟基、羧酸、以及硫基前药和保护基团。另外的说明性氨基酸衍生物包括在此所述的氨基酸的取代的变型，例如但不限于，羟基的醚和酯、酰胺、氨基甲酸酯、以及氨基脲、羧酸基团的酯、酰胺和氰基衍生物等。
如在此所述的术语“微管溶素”和“多种微管溶素”通常是指具有以下化学式的四肽化合物
及其药用盐，其中
n是1-3；
V是H、OR2、或卤素，并且W是H、OR2、或烷基，其中R2在每种情况下是独立地选自H、烷基、以及C(O)R3，其中R3是烷基、环烷基、烷烯基、芳基、或芳烷基，它们各自被任选取代；条件是当V和W二者均是OR2时，R2不是H；或者V和W与连接的碳一起形成一个羰基；
X＝H、C1-4烷基、烷烯基(它们各自被任选取代)、或CH2QR9；其中Q是-N-、-O-、或-S-；R9＝H、C1-4烷基、烷烯基、芳基、或C(O)R10；以及R10＝C1-6烷基、烷烯基、芳基、或杂芳基，它们各自被任选取代；
Z是烷基并且Y是O；或者Z是烷基或C(O)R4，并且Y不存在，其中R4是烷基、CF3、或芳基；
R1是H，或者R1表示选自卤素、硝基、羧酸酯或其衍生物、氰基、羟基、烷基、卤代烷基、烷氧基、以及OR6的1至3个取代基，其中R6是氢或者任选取代的芳基、一个苯酚保护基团、一个前药部分、烷基、芳烷基、C(O)R7、P(O)(OR8)2、或SO3R8，其中R7和R8在每种情况下独立地选自H、烷基、烯基、环烷基、杂环基、芳基、以及芳烷基，它们各自被任选取代，或者R8是一个金属阳离子；并且
R是OH或一个离去基团，或R形成一个羧酸衍生物，如一个酰基酰肼。
在此描述了每种以上微管溶素的缀合物。在一个变型中，Z是甲基。在另一个变型中，R1是H。在另一个变型中，R1是C(4)处的OR6，其中R6是H、烷基、或COR7。在另一个变型中，V是H，并且W是OC(O)R3。在另一个变型中，X＝CH2QR9。在另一个变型中，X＝CH2OR9。在另一个变型中，R9是烷基或烷烯基。在另一个变型中，R9是C(O)R10。在另一个变型中，R10＝任选取代的C1-6烷基。在另一个变型中，R10＝C1-6烷基。在另一个变型中，R形成一个酰基酰肼。应理解，以上说明是对于一般微管溶素结构的每种化学上可能的变型组合的一个清楚的说明。例如，应理解以上说明是对变型的一个说明，在该变型中Z是甲基并且R1是H；其中R1是C(4)处的OR6，并且R6是H；其中Z是甲基，R1是C(4)处的OR6，R6是H，并且X＝CH2OR9；等等。
天然的微管溶素通常是由以下各项组成的线性四肽：N-甲基哌啶酸(Mep)、异亮氨酸(Ile)、称为微管缬氨酸的一种非天然氨基酸(Tuv)、以及称为微管酪氨酸的一种非天然氨基酸(Tut，一种酪氨酸类似物)或称为微管苯丙氨酸的一种非天然氨基酸(Tup，一种苯丙氨酸的类似物)。在另一个实施例中，描述了具有以下一般化学式的天然存在的微管溶素及其类似物和衍生物
及其药用盐，其中R、R1、以及R10是如在此的不同实施例所述的。在此描述了每种以上微管溶素的缀合物。
在另一个实施例中，描述了具有以下一般化学式的天然存在的微管溶素的缀合物
系数 R10 R1
A (CH3)2CHCH2 OH
B CH3(CH2)2 OH
C CH3CH2 OH
D (CH3)2CHCH2 H
E CH3(CH2)2 H
F CH2CH3 H
G (CH3)2C＝CH OH
H CH3 H
I CH3 OH
及其药用盐。
在另一个实施例中，在此描述了多种化合物，其中该缀合物在末端羧酸基团或末端酰基酰肼基团处由每种在此描述的微管溶素形成。
如在此所用的术语“雷帕霉素”被理解为包括西罗莫司(雷帕霉素)、替西罗莫司、依维莫司和地磷莫司、以及相关化合物、以及具有以下化学式的化合物
及其药学上可接受的盐，其中
YA是ORc或OCH2CH2ORc；
RA、RB、或RC中之一是连接到L的一个键；并且
RA、RB、以及RC中的其余两个在每种情况下独立地选自下组，该组由氢、任选取代杂烷基、前药形成基团、以及C(O)RD组成，其中RD在每种情况下独立地选自下组，该组由氢和烷基、烷烯基、杂烷基、环烷基、环杂烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、以及杂芳基烷基组成，它们各自是被任选取代的，如所述的。
如在此所用的术语“烷基”包含任选支化的一条碳原子链。如在此所用的术语“烷烯基”和“烷炔基”包含任选支化的一条碳原子链，并且分别包含至少一个双键或三键。应理解，烷炔基还可以包含一个或多个双键。还应理解，在某些实施例中，烷基有利地具有有限的长度，包括C1-C24、C1-C12、C1-C8、C1-C6、以及C1-C4。说明性地，此类具有特别有限的长度的烷基(包括C1-C8、C1-C6、以及C1-C4)可以被称为低级烷基。还应理解，在某些实施例中，烷烯基和/或烷炔基各自可以有利地具有有限的长度，包括C2-C24、C2-C12、C2-C8、C2-C6、以及C2-C4。说明性地，此类具有特别有限的长度的亚烯基和/或亚炔基(包括C2-C8、C2-C6、以及C2-C4)可以被称为低级烷烯基和/或烷炔基。在此应了解，较短的烷基、烷烯基和/或烷炔基可以使该化合物增加较少的亲脂性，并且因此将具有不同的药代动力学行为。在此所述的本发明的实施例中，应理解在每种情况下，所述的烷基是指在此定义的烷基以及任选的低级烷基。在此所述的本发明的实施例中，应理解在每种情况下，所述的烷烯基是指在此定义的烷烯基以及任选的低级烷烯基。在此所述的本发明的实施例中，应理解在每种情况下，所述的烷炔基是指在此定义的烷炔基以及任选的低级烷炔基。说明性烷基、烷烯基、以及烷炔基是(但不限于)甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、2-戊基、3-戊基、新戊基、己基、庚基、辛基等，以及含有一个或多个双键和/或三键的相应基团，或其一个组合。
如在此所用的术语“亚烷基”包含任选支化的一条二价碳原子链。如在此所用的术语“亚烯基”和“亚炔基”包含任选支化的一条二价碳原子链，并且分别包含至少一个双键或三键。应理解，亚炔基还可以包含一个或多个双键。还应理解，在某些实施例中，亚烷基有利地具有有限的长度，包括C1-C24、C1-C12、C1-C8、C1-C6、以及C1-C4。说明性地，此类具有特别有限的长度的亚烷基(包括C1-C8、C1-C6、以及C1-C4)可以被称为低级亚烷基。还应理解，在某些实施例中，亚烯基和/或亚炔基各自可以有利地具有有限的长度，包括C2-C24、C2-C12、C2-C8、C2-C6、以及C2-C4。说明性地，此类具有特别有限的长度的亚烯基和/或亚炔基(包括C2-C8、C2-C6、以及C2-C4)可以被称为低级亚烯基和/或亚炔基。在此应了解，较短的烷基、亚烯基和/或亚炔基可以使该化合物增加较少的亲脂性，并且因此将具有不同的药代动力学行为。在此所述的本发明的实施例中，应理解在每种情况下，所述的亚烷基、亚烯基、以及亚炔基是指在此定义的亚烷基、亚烯基、以及亚炔基以及任选的低级亚烷基、亚烯基、以及亚炔基。说明性烷基是(但不限于)亚甲基、亚乙基、亚正丙基、亚异丙基、亚正丁基、亚异丁基、亚仲丁基、亚戊基、1,2-亚戊基、1,3-亚戊基、亚己基、亚庚基、亚辛基等。
如在此所用的术语“环烷基”包含任选支化的一条碳原子链，其中该链的至少一部分为环状。应理解，环烷基烷基是环烷基的一个子组。应理解，环烷基可以是多元环。说明性环烷基包括但不限于，环丙基、环戊基、环己基、2-甲基环丙基、环戊基乙烷-2-基、金刚烷基等。如在此所用的术语“环烷烯基”包含任选支化的一条碳原子链，并且包含至少一个双键，其中该链的至少一部分为环状。应理解，一个或多个双键可以是处于环烷烯基的环部分和/或环烷烯基的非环部分中。应理解，环烷烯基烷基和环烷基烷烯基各自是环烷烯基的子组。应理解，环烷基可以是多元环。说明性环烷烯基包括但不限于，环戊烯基、环己基乙烯-2-基、环庚烯基丙烯基等。还应理解，链形成的环烷基和/或环烷烯基有利地具有有限的长度，包括C3-C24、C3-C12、C3-C8、C3-C6、以及C5-C6。在此应了解，分别形成环烷基和/或环烷烯基的较短烷基和/或烷烯基链可以使该化合物增加较少的亲脂性，并且因此将具有不同的药代动力学行为。
如在此所用的术语“杂烷基”包含含有碳和至少一个杂原子二者并且任选支化的一条原子链。说明性杂原子包括氮、氧、以及硫。在某些变型中，说明性杂原子还包括磷和硒。如在此所用的术语“环杂烷基”(包括杂环基和杂环)包含含有碳和至少一个杂原子二者(如杂烷基)并且任选支化的一条原子链，其中该链的至少一部分是环形。说明性杂原子包括氮、氧、以及硫。在某些变型中，说明性杂原子还包括磷和硒。说明性环杂烷基包括但不限于，四氢呋喃基、吡咯烷基、四氢吡喃基、哌啶基、吗啉基、哌嗪基、高哌嗪基、奎宁环基等。
如在此所用的术语“芳基”包含单环和多元环芳族碳环基团，它们各自可以是被任选取代的。在此所述的说明性芳族碳环包括但不限于，苯基、萘基等。如在此所用的术语“杂芳基”包含芳族杂环基团，它们各自可以是被任选取代的。说明性芳族杂环基团包括但不限于，吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、四嗪基、喹啉基、喹唑啉基、喹喔啉基、噻吩基、吡唑基、咪唑基、噁唑基、噻唑基、异噁唑基、异噻唑基、噁二唑基、噻二唑基、三唑基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、苯并异噁唑基、苯并异噻唑基等。
如在此所用的术语“氨基”包含基团NH2、烷基氨基、以及二烷基氨基，其中二烷基氨基中的两个烷基可以是相同或不同的，即烷基烷基氨基。说明性地，氨基包括甲基氨基、乙基氨基、二甲基氨基、甲基乙基氨基等。此外，应理解，当氨基修饰或者通过另一个术语(如氨基烷基或酰基氨基)修饰时，术语氨基的以上变型被包含在内。说明性地，氨基烷基包括H2N-烷基、甲基氨基烷基、乙基氨基烷基、二甲基氨基烷基、甲基乙基氨基烷基等。说明性地，酰基氨基包括酰基甲基氨基、酰基乙基氨基等。
如在此所用的术语“氨基及其衍生物”包括在此所述的氨基，以及烷基氨基、烷烯基氨基、烷炔基氨基、杂烷基氨基、杂烷烯基氨基、杂烷炔基氨基、环烷基氨基、环烷烯基氨基、环杂烷基氨基、环杂烷烯基氨基、芳基氨基、芳烷基氨基、芳基烷烯基氨基、芳基烷炔基氨基、杂芳基氨基、杂芳烷基氨基、杂芳基烷烯基氨基、杂芳基烷炔基氨基、酰基氨基等，它们各自是被任选取代的。术语“氨基衍生物”还包括脲、氨基甲酸酯等。
如在此所用的术语“羟基及其衍生物”包括OH以及烷氧基、烷烯基氧基、烷炔基氧基、杂烷基氧基、杂烷烯基氧基、杂烷炔基氧基、环烷基氧基、环烷烯基氧基、环杂烷基氧基、环杂烷烯基氧基、芳基氧基、芳基烷氧基、芳基烷烯基氧基、芳基烷炔基氧基、杂芳基氧基、杂芳基烷氧基、杂芳基烷烯基氧基、杂芳基烷炔基氧基、酰氧基等，它们各自是被任选取代的。术语“羟基衍生物”还包括氨基甲酸酯等。
如在此所用的术语“硫基及其衍生物”包括SH以及烷基硫基、烷烯基硫基、烷炔基硫基、杂烷基硫基、杂烷烯基硫基、杂烷炔基硫基、环烷基硫基、环烷烯基硫基、环杂烷基硫基、环杂烷烯基硫基、芳基硫基、芳烷基硫基、芳烷烯基硫基、芳烷炔基硫基、杂芳基硫基、杂芳烷基硫基、杂芳基烷烯基硫基、杂芳基烷炔基硫基、酰基硫基等，它们各自是被任选取代的。术语“硫基衍生物”还包括硫代氨基甲酸酯等。
如在此所用的术语“酰基”包括甲酰基、以及烷基羰基、烷烯基羰基、烷炔基羰基、杂烷基羰基、杂烷烯基羰基、杂烷炔基羰基、环烷基羰基、环烷烯基羰基、环杂烷基羰基、环杂烷烯基羰基、芳基羰基、芳烷基羰基、芳基烷烯基羰基、芳基烷炔基羰基、杂芳基羰基、杂芳烷基羰基、杂芳基烷烯基羰基、杂芳基烷炔基羰基、酰基羰基等，它们各自是被任选取代的。
如在此所用的术语“羰基及其衍生物”包括基团C(O)、C(S)、C(NH)以及其取代的氨基衍生物。
如在此所用的术语“羧酸及其衍生物”包括基团CO2H及其盐、以及其酯和酰胺、以及CN。
如在此所用的术语“任选取代的”包括在任选取代的基团上用其他官能团置换氢原子。此类其他官能团说明性地包括但不限于，氨基、羟基、卤素、巯基、烷基、卤代烷基、杂烷基、芳基、芳烷基、芳基杂烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂芳基杂烷基、硝基、磺酸及其衍生物、羧酸及其衍生物等。说明性地，任何氨基、羟基、巯基、烷基、卤代烷基、杂烷基、芳基、芳烷基、芳基杂烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂芳基杂烷基和/或磺酸是被任选取代的。
如在此所用的术语“任选取代的芳基”和“任选取代的杂芳基”包括在任选取代的芳基或杂芳基上用其他官能团置换氢原子。此类其他官能团说明性地包括但不限于，氨基、羟基、卤素、巯基、烷基、卤代烷基、杂烷基、芳基、芳烷基、芳基杂烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂芳基杂烷基、硝基、磺酸及其衍生物、羧酸及其衍生物等。说明性地，任何氨基、羟基、巯基、烷基、卤代烷基、杂烷基、芳基、芳烷基、芳基杂烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂芳基杂烷基和/或磺酸是被任选取代的。
说明性的取代基包括但不限于，一个基团-(CH2)XZX，其中x是选自0-6的一个整数并且ZX是选自卤素、羟基、烷酰基氧基(包括C1-C6烷酰基氧基)、任选取代的芳酰氧基、烷基(包括C1-C6烷基)、烷氧基(包括C1-C6烷氧基)、环烷基(包括C3-C8环烷基)、环烷氧基(包括C3-C8环烷氧基)、烷烯基(包括C2-C6烷烯基)、烷炔基(包括C2-C6烷炔基)、卤代烷基(包括C1-C6卤代烷基)、卤代烷氧基(包括C1-C6卤代烷氧基)、卤代环烷基(包括C3-C8卤代环烷基)、卤代环烷氧基(包括C3-C8卤代环烷氧基)、氨基、C1-C6烷基氨基、(C1-C6烷基)(C1-C6烷基)氨基、烷羰基氨基、N-(C1-C6烷基)烷羰基氨基、氨基烷基、C1-C6烷基氨基烷基、(C1-C6烷基)(C1-C6烷基)氨基烷基、烷羰基氨基烷基、N-(C1-C6烷基)烷羰基氨基烷基、氰基、以及硝基；或者Zx是选自-CO2R4和-CONR5R6，其中R4、R5、以及R6在每种情况下是各自独立地选自氢、C1-C6烷基、芳基-C1-C6烷基、以及杂芳基-C1-C6烷基。
如本文所用的关于例如细胞表面受体结合和/或靶向配体和/或独立地选择的药物的术语“基团(radical)”是指如在此所述的一个细胞表面受体结合和/或靶向配体和/或独立地选择的药物，其中一个或多个原子或基团如氢原子或在一个杂原子上的一个烷基等被去除，以提供用于与多价接头L缀合的一个基团。此类配体基团和药物基团也可以分别被称为配体类似物和药物类似物。
如在此所用的术语“离去基团”是指在它所连接的原子上生成一个亲电子位点以使得亲核试剂可以添加到该原子的亲电子位点上的一个反应性官能团。说明性离去基团包括但不限于卤素、任选取代的苯酚、酰氧基、磺酰氧基等。应理解，此类离去基团可以是处于烷基、酰基等上。此类离去基团在此也称为活化基团，例如当离去基团存在于酰基上时。此外，常见的肽、酰胺、以及酯偶合剂(例如但不限于，PyBop、BOP-C1、BOP、五氟苯酚、异丁基氯甲酸酯等)形成在一个羰基上包含在此所定义的一个离去基团的不同中间体。
应理解，在此所披露的每种情况下，所述的任何可变量的整数范围描述了所述范围、范围内的每个单个成员、以及该可变量的每个可能的子范围。例如，n是从0至8的一个整数的叙述描述了该范围，单个以及可选择的值是0、1、2、3、4、5、6、7、以及8，例如n是0、或n是1、或n是2等。此外，n是从0至8的一个整数的叙述也描述了各个和每个子范围，每个子范围可以是另一个实施例的基础，例如n是从1至8、从1至7、从1至6、从2至8、从2至7、从1至3、从2至4等的一个整数。
如在此所用的术语“组合物”通常是指含有指定量的指定成分的任何产品以及由指定量的指定组分的组合直接或间接得到的任何产品。应理解，在此所述的组合物可以是由在此所述的分离的化合物或者由在此所述的化合物的盐、溶液、水合物、溶剂合物以及其他形式制备的。应了解，某些官能团如羟基、氨基等基团与水和/或不同溶剂形成复合物和/或配位化合物，这些化合物是不同的物理形式。还应理解，这些组合物可以是由不同的无定形、非无定形、部分结晶、结晶和/或其他形态的在此所述的化合物制备的。还应理解，这些组合物可以是由在此所述的化合物的不同水合物和/或溶剂合物制备的。因此，述及在此所述的化合物的此类药物组合物被理解为包含在此所述的化合物的不同形态和/或溶剂合物或水合物形式中的每一种或其任何组合。此外，应理解，这些组合物可以是由在此所述的化合物的不同共晶制备的。
说明性地，组合物可以包含一种或多种载体、稀释剂和/或赋形剂。在此所述的化合物或者包含它们的组合物可以一个治疗有效量配制成用于在此所述的方法中的任何常见剂型。在此所述的化合物或包含它们的组合物(包括此类制剂)可以通过用于在此所述的方法的多种常规路径给予并且利用已知的程序以多种剂型给予(通常参见，雷明顿：药剂学科学与实践(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)(第21版，2005))。
如在此所用的术语“治疗有效量”是指研究员、兽医、医师或其他临床医生寻找的在组织系统、动物或人类中引出生物学或医学反应的活性化合物或药物试剂的量，该反应包括减轻正在被治疗的疾病或病症的症状。在一个方面，有效量是可以在适用于任何医学治疗的一个合理效益/风险比率下治疗或减轻疾病或疾病症状的量。然而，应理解，在此所述的化合物和组合物的总日用量可以由主治医师在合理的医学判断范围内决定。对于任何特定患者的特定治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括正在治疗的病症和病症的严重程度；所使用的特定化合物的活性；所使用的特定组合物；患者的年龄、体重、总体健康、性别以及饮食：给予的时间、给予的路径、以及所使用的特定化合物的排泄率；治疗的持续时间；与所使用的特定化合物组合或同时使用的药物；以及研究人员、兽医、内科医生或具有普通技艺的其他临床医生已熟知的类似因素。
如在此所用的术语“给予”包括向患者引入在此所述的化合物和组合物的所有方式，包括但不限于，口服(po)、静脉内(iv)、肌内(im)、皮下(sc)、透皮、吸入、口腔、眼、舌下、阴道、直肠等。在此所述的化合物和组合物可以含有常见无毒的药学上可接受的载体、佐剂以及媒剂(vehicle)单位剂型和/或制剂给予。
用于口服给予的说明性剂型包括片剂、胶囊、酏剂、糖浆等。
用于胃肠外给予的说明性路径包括静脉内、动脉内、腹膜内、硬膜上、尿道内、胸骨内、肌内和皮下注射，以及任何其他本领域公知的肠胃外给予路径。
根据在此所述的疾病、给予路径和/或是否局部或全身给予这些化合物和/或组合物，在此考虑了大范围的允许剂量，包括属于从约1μg/kg至约1g/kg的范围的剂量。这些剂量可以是单次的或分次的，并且可以根据各种各样的方案给予，包括每天四次(q.d.)、每天两次(b.i.d.)、每天三次(t.i.d.)、或甚至每隔一天一次、一周一次、一月一次、一季一次等。在这些情况的每一种中，应理解，在此所述的治疗有效量对应于给予的情况或者可替代地对应于总每日、每周、每月或每季的剂量，如通过给药方案所确定的。
如在此所用的术语“前药”通常是指当向一个生物系统给予时由于一个或多个自发性化学反应、一种或多种酶催化的化学反应和/或一种或多种代谢性化学反应或起组合而生成一种生物活性化合物的任何化合物。在体内，该前药典型地受到酶(如酯酶、酰胺酶、磷酸酶等)、简单的生物化学或其他体内过程作用，以释放或再生更多药理学活性药物。通过在给予前药之前、之后或过程中向宿主给予的一种内源性宿主酶或一种非内源性酶作用可以进行活化。前药的其他详情描述于美国专利号5,627,165；以及帕特克(Pathalk)等人，有机合成的酶保护基团技术(Enzymic protectinggroup techniques in organic synthesis)，立体选择性生物催化(Stereosel.Biocatal.)775-797(2000)。应了解，一旦实现目标如靶向递送、安全性、稳定性等，该前药就被有利地转化为初始药物，然后随后快速消除所释放的形成前药的其余基团。
前药可以是由在此所述的化合物通过将最终体内裂解的基团连接到存在于该化合物上的一个或多个官能团如-OH-、-SH、-CO2H、-NR2来制备的。说明性前药包括但不限于，羧酸酯(其中该基团是烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、酰氧基烷基、烷氧基羰基氧基烷基)以及羟基、硫基和胺的酯(其中所连接的基团是酰基、烷氧基羰基、氨基羰基、磷酸酯或硫酸酯)。说明性酯也称为活性酯，它包括但不限于1-茚满基、N-氧基琥珀酰亚胺；酰氧基烷基，如乙酰氧基甲基、新戊酰氧基甲基、β-乙酰氧基乙基、β-新戊酰氧基乙基、1-(环己基羰基氧基)丙-1-基、(1-氨基乙基)羰基氧基甲基等；烷氧基羰基，如乙氧羰基氧基甲基、α-乙氧基羰基氧基乙基、β-乙氧基羰基氧基乙基等；二烷基氨基烷基，包括二-低级烷基氨基烷基，如二甲基氨基甲基、二甲基氨基乙基、二乙基氨基甲基、二乙基氨基乙基等；2-(烷氧基羰基)-2-链烯基，如2-(异丁氧基羰基)戊-2-烯基、2-(乙氧羰基)丁-2-烯基等；以及内酯基，如酞基、二甲氧基酞基等。
其他说明性前药包含用于增加在此所述的化合物的溶解度和/或稳定性的一个化学部分，如一个酰胺或磷基团。氨基的其他说明性前药包括但不限于，(C3-C20)烷酰基；卤代-(C3-C20)烷酰基；(C3-C20)烯酰基；(C4-C7)环烷烯基；(C3-C6)-环烷基(C2-C16)烷酰基；任选取代的芳酰基，如未取代的芳酰基或通过选自下组的1至3个取代基取代的芳酰基，该组由卤素、氰基、三氟甲烷磺酰氧基、(C1-C3)烷基以及(C1-C3)烷氧基组成，它们各自另外任选被1至3个卤素原子中的一个或多个取代；任选取代的芳基(C2-C16)烷酰基和任选取代的杂芳基(C2-C16)烷酰基，如未取代或者被选自下组的1至3个取代基取代的芳基或杂芳基，该组由卤素、(C1-C3)烷基以及(C1-C3)烷氧基组成，它们各自任选另外被1至3个卤素原子取代；以及具有在杂芳基部分中具有一个至三个选自O、S和N的杂原子并且在烷酰基部分中具有2个至10个碳原子的任选取代的杂芳基烷酰基，如未取代或者被选自下组的1至3个取代基取代的杂芳基基团，该组由卤素、氰基、三氟甲烷磺酰氧基、(C1-C3)烷基以及(C1-C3)烷氧基组成，它们各自任选另外被1至3个卤素原子取代。所示出的基团是示例性的，而不是详尽的，并且可以通过常规方法制备。
应理解，这些前药本身可能不具有显著的生物活性，反而在体内给予之后经受一个或多个自发化学反应、一个或多个酶催化的化学反应和/或一个或多个代谢化学反应或其组合，以产生具有生物活性的或者为生物活性化合物的一个前体的在此所述的化合物。然而，应了解，在一些情况下，该前药是具有生物活性的。还应了解，前药通常可以用于通过改进的口服生物利用度、药代动力学半衰期等来提高药物功效或安全性。前药还是指在此所述的化合物的衍生物，它包含简单掩饰不希望的药物特性或者提高药物递送的基团。例如，在此所述的一种或多种化合物可以表现出有利地阻断或最小化的一种不希望的特征，该特征在临床药物应用中可以变成药理学、药物或药代动力学障碍，如低口服药物吸收、位点特异性缺乏、化学不稳定、毒性、以及不良患者接受度(不良味道、气味、在注射部位的疼痛等)以及其他特征。在此应了解，一种前药或使用不可逆的衍生物的其他策略可以适用于优化一种药物的临床应用。
在此所述的这些化合物、接头、中间体、以及缀合物可以使用常规方法制备，这些方法包括在国际专利申请公开号WO 2009/002993、WO2004/069159、WO 2007/022494、以及WO 2006/012527、以及美国专利申请号13/837539(2013年3月15日提交)中描述的那些方法。以上美国专利申请的披露内容通过引用以其全部内容结合在此。
在此引用的每个公开文件均通过引用结合在此。
以下实例还阐明本发明的特定实施例；然而，以下说明性实例并不以任选方式解释为限制本发明。
实例
化合物实例
在此所述的化合物可以是使用在此所述的过程和合成法以及使用常见有机合成方法制备的。具体地说，用于制备这些化合物的方法描述于美国专利申请公开2005/0002942中，该专利申请公开的披露内容通过引用结合在此。
实例.叶酸-肽的一般化学式。含叶酸的肽基片段Pte-Glu-(AA)n-NH(CHR2)CO2H(3)是通过聚合物支持的顺序排列使用标准方法制备的，如对酸敏感型Fmoc-AA-Wang树脂(1)的Fmoc-策略，如在以下方案中示出的：
方案
(a)20％哌啶/DMF；(b)Fmoc-AA-OH、PyBop、DIPEA、DMF；(c)Fmoc-Glu(O-t-Bu)-OH、PyBop、DIPEA、DMF；(d)1.N10(TFA)-Pte-OH；PyBop、DIPEA、DMSO；(e)TFAA、(CH2SH)2、i-Pr3SiH；(f)NH4OH，pH10.3。
应理解，非天然氨基酸可以使用适当的起始物质被包括在以上方法中。
在此所述的方法的此说明性实施例中，R1是Fmoc，R2是希望的适当保护的氨基酸侧链，并且DIPEA是二异丙基乙胺。使用标准偶合程序如PyBOP和在此所述或本领域已知的其他程序，其中该偶合剂说明性地作为活化试剂使用，以确保有效的偶合。在标准条件下进行每个偶合步骤之后，例如在用哌啶、四丁基氯化铵(TBAF)等处理时去除Fmoc保护基团。使用适当保护的氨基酸结构单元(building block)，如Fmoc-Glu-OtBu、Fmoc-D-Glu-OtBu、N10-TFA-Pte-OH等，如在该方案中所述的，并且在步骤(b)中由Fmoc-AA-OH表示。因此，AA是指适当保护的任何氨基酸起始物质。应理解，如在此所用的术语氨基酸意图是指具有由一个或多个碳分开的一个胺和一个羧酸官能团的任何试剂，并且包括天然存在的α和β氨基酸、以及氨基酸衍生物和这些氨基酸的类似物。具体地说，具有受到保护的侧链的氨基酸如受保护的丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸酯等也可以用于在此所述的叶酸-肽合成。另外，γ、δ或更长的同源氨基酸也可以作为起始物质包含在在此所述的叶酸-肽合成中。另外，具有同源侧链或替代的分支结构的氨基酸类似物如正亮氨酸、异缬氨酸、β-甲基苏氨酸、β-甲基半胱氨酸、β,β-二甲基半胱氨酸等也可以作为起始物质包含在在此所述的叶酸-肽合成中。
将涉及Fmoc-AA-OH的偶合顺序(步骤(a)&步骤(b))进行“n”次，以制备固体支撑肽(2)，其中n是一个整数并且可以等于0至约100。在最后的偶合步骤之后，去除其余的Fmoc基团(步骤(a))，并且依次将该肽偶合到一个谷氨酸酯衍生物(步骤(c))、去保护并且偶合到TFA-保护的蝶酸(步骤(d))。然后，在用三氟乙酸、乙烷二硫醇和三异丙基硅烷处理时肽从聚合物支撑中裂解(步骤(e))。反应条件引起t-Bu、t-Boc、以及Trt保护基团的去除，这些保护基团可以形成适当保护的氨基酸侧链的一部分。TFA保护基团在用碱处理(步骤(f))处理时去除，以提供含有叶酸的肽基片段(3)。
LCMS[ESI[M+H]+:1046；部分1H NMR(D2O,300MHz):δ8.68(s,1H,FA H-7),7.57(d,2H,J＝8.4Hz,FA H-12&16),6.67(d,2H,J＝9Hz,FAH-13&15),4.40-4.75(一系列m,5H),4.35(m,2H),4.16(m,1H),3.02(m,2H),2.55-2.95(一系列m,8H),2.42(m,2H),2.00-2.30(m,2H),1.55-1.90(m,2H),1.48(m,2H)ppm。
实例.还可以制备含有一个或多个D-氨基酸的对应化合物，例如以下各项：
LCMS[ESI,[M+H]+1)1046。部分1H-NMR(DMSO)δ(ppm):8.6(s),7.5(d),6.6(d),3.8-4.6(m),2.8-3.2(-2.8(m),1-2.2(m)
MS(ESI,[M+H]+1)＝1046.5。部分1H-NMR(DMSO)δ(ppm):8.6(s),7.5(d),6.6(d),3.8-4.6(m),2.8-3.2(-2.8(m),1-2.2(m)
MS(ESI,[M+H]+1)＝1046.4。部分1H-NMR(DMSO)δ(ppm):8.6(s),7.6(d),6.6(d),4-4.6(m),3.4-3-3.15(m),1-2.8(m)
[M+H]+＝1047.52。部分1H NMR(D2O):8.6(s,1H),7.5(d,2H),6.65(d,2H),4.4(dd,2H),4.18(m,4H),2.9(t,2H),2.75(t,2H),2.6-2.15(m,10H),2.1-1.8(m,3H),1.7-1.4(m,3H),1.3(m,3H)。
MS(ESI[M+H]+):1046。部分1H NMR数据(D2O,300MHz):δ(ppm)8.68(s,1H,FA H-7),7.57(d,2H,J＝8.4Hz,FA H-12&16),6.67(d,2H,J＝9Hz,FA H-13&15)。
MS(ESI,[M+H]+)＝1046.7。部分1H-NMR(D2O)δ(ppm):8.6(s),7.5(d),6.6(d),4.4-4.8(m),4-4.2(m)-3(m),1.8-2.2(m),1.3-1.7(m)
以及
实例.微管溶素酰肼的制备。通过制备EC0347(TubB-H)进行说明。
在-15℃下通过注射器将N,N-二异丙基乙胺(DIPEA，6.1μL)和氯甲酸异丁酯(3.0μL)依次添加到微管溶素B(0.15mg)的无水EtOAc(2.0mL)溶液中。在-15℃下在氩气下搅拌45分钟之后，将反应混合物冷却至-20℃并且向其中添加无水肼(5.0μL)。在氩气下在-20℃下将反应混合物搅拌3个小时，用1.0mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0，1.0mL)淬火，并且将其注射到一个制备型HPLC中，以用于纯化。柱：Waters XTerra Prep MSC1810μm，19×250mm；流动相A：1.0mM磷酸钠缓冲液，pH 7.0；流动相B：乙腈；方法：10％B至80％B，持续20分钟，流速＝25mL/min。收集来自15.14-15.54分钟的级分并且将其冻干，以产生作为一种白色固体的EC0347(2.7mg)。以上方法同样适用于通过适当选择微管溶素起始化合物来制备其他微管溶素酰肼。
实例.偶合剂EC0311的制备。
在0℃下将DIPEA(0.60mL)添加到HOBt-OCO2-(CH2)2-SS-2-吡啶HCl(685mg，91％)的无水DCM(5.0mL)悬浮液中，在氩气下将其搅拌2分钟，并且向其中添加无水酰肼(0.10mL)。将反应混合物在氩气下在0℃下搅拌10分钟并且在室温下搅拌另外30分钟，将其过滤，并且通过快速色谱法(硅胶，DCM中的2％MeOH)纯化滤液，以获得作为一种澄清的稠油的EC0311(371mg)，该油在放置后固化。
实例.二硫化微管溶素的制备(逐步过程)。
对EC0312进行说明。在-15℃下通过注射器将DIPEA(36μL)和氯甲酸异丁酯(13μL)依次添加到微管溶素B(82mg)的无水EtOAc(2.0mL)溶液中。在-15℃下在氩气下搅拌45分钟之后，向反应混合物中添加EC0311的无水EtOAc(1.0mL)溶液。将所得的溶液在氩气下在-15℃下搅拌15分钟并且在室温下搅拌另外45分钟，将其浓缩，并且通过快速色谱法(硅胶，DCM中的2％至8％MeOH)纯化残余物，以获得作为一种白色固体的EC0312(98mg)。以上方法同样适用于通过适当选择微管溶素起始化合物来制备其他微管溶素衍生物。
实例.
向阿霉素(100mg，0.184mmol)和2-[苯并三唑-1-基-(氧基羰基氧基)-乙基二磺酰基]-吡啶(77.8mg，0.184mmol)的DCM(4ml)溶液中添加DIPEA(0.064ml，0.368mmol)。将该反应搅拌2小时。TLC(DCM中的10％MeOH)指示反应完成。在减压下去除DCM并且在SiO2柱(DCM中的10％MeOH)上进行纯化，以产生纯化合物(90mg，65％)。LCMS(ESI):(M+H)+，对于C35H36N2O13S2所计算的，757.17；实测值757.30，1H NMR(300MHz,CDC13/CD3OD):δ8.44(br s,1H),8.00(d,1H),7.65-7.82(m,3H),7.38(d,1H),7.18(br s,1H),5.45(s,1H),5.25(s,3H),4.70(m,2H),4.3(m,1H),4.22-3.90(m,2H),3.75(s,1H),3.62(s,1H),3.35-2.90(m,2H),2.45-2.10(m,2H),1.85(m,5H),1.32(d,3H)。
实例.微管溶素B吡啶二硫化物。
类似地，如在此所述地制备微管溶素B吡啶二硫化物。
实例.D-EC0488。
此化合物通过在此所述的一般肽合成程序由H-Cys(4-甲氧基三苯甲基)-2-氯三苯甲基-树脂和以下SPPS试剂开始来制备：
偶合步骤。在一个肽合成容器中添加树脂、添加氨基酸溶液、DIPEA和PyBOP。鼓泡氩气1h并且用DMF和IPA洗涤3X。在每次氨基酸偶合之前，使用DMF中的20％哌啶进行Fmoc脱保护，3X(10min)。继续完成所有9个偶合步骤。最后，用DMF中的2％肼处理树脂3X(5min)，以裂解蝶酸上的TFA保护基团，用DMF(3X)、IPA(3X)、MeOH(3X)洗涤树脂，并且用氩气鼓泡树脂30min。
裂解步骤.试剂：92.5％TFA、2.5％H2O、2.5％三异丙基硅烷、2.5％乙二硫醇。在氩气鼓泡的情况下用裂解试剂处理树脂3X(10min，5min，5min)，排出，用裂解试剂洗涤一次树脂，并且将溶液合并。旋转蒸发直到剩余5ml为止并且在乙醚(35mL)中沉淀。离心，用乙醚洗涤，并且干燥。通过HPLC纯化约一半粗固体(约100mg)。
HPLC纯化步骤。柱：Waters Xterra Prep MS C1810μm 19x 250mm；溶剂A：10mM乙酸铵，pH 5；溶剂B：ACN；方法：5min 0％B至25min20％B，26mL/min。收集含有产物的级分并且将其冷冻干燥，以获得43mgEC0488(51％产率)。1H NMR和LC/MS(准确质量1678.62)与产物一致。
实例.
MS(ESI,[M+H]+)＝1681。部分1H NMR(D2O):8.96(s),7.65(d),6.81(d),4.66(s),4.40-4.15(m),3.90-3.54(m),3.50-3.18(m),2.97-2.90(m),2.51-1.80(m)。
实例.含有二硫化物的微管溶素缀合物的一般合成。
用某些天然存在的微管溶素的吡啶基二硫化物衍生物进行说明，其R1是H或OH，并且R10是烷基或烯基。将含有一个硫基的一种结合配体接头中间体置于去离子水(约20mg/mL，在使用之前用氩气鼓泡10分钟)中，并且悬浮液的pH通过饱和NaHCO3(在使用之前用氩气鼓泡10分钟)调节至约6.9(当pH增加时悬浮液可能变成一种溶液)。在需要时向溶液中添加另外的去离子水(约20％-25％)，并且立即向水溶液添加EC0312的THF溶液(约20mg/mL)。反应混合物迅速变得均匀。在氩气下搅拌例如45分钟之后，用2.0mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0，约150体积百分比)稀释反应混合物并且通过抽空去除THF。将所得的悬浮液过滤并且可以通过制备型HPLC(如在此所述的)纯化滤液。将级分冻干，以分离这些缀合物。以上方法同样适用于通过适当选择微管溶素起始化合物来制备其他微管溶素缀合物。
实例.用于制备缀合物的一般方法2(一锅法)。
用EC1456的制备进行说明。在-15℃下在注射器的帮助下将DIPEA(7.8μL)和氯甲酸异丁酯(3.1μL)依次添加到微管溶素A(18mg)的无水EtOAc(0.50mL)溶液中。在-15℃下在氩气下搅拌35分钟之后，向反应混合物中添加EC0311(5.8mg)的无水EtOAc(0.50mL)溶液。去除冷却并且在氩气下将反应混合物搅拌另外45分钟，将其浓缩，抽真空，并且将残余物溶解于THF(2.0mL)中。同时，将D-EC0488(40mg)溶解于去离子水(在使用之前用氩气鼓泡10分钟)并且通过饱和NaHCO3将水溶液的pH调节至6.9。将另外的去离子水添加到D-EC0488溶液中，以使得总体积为2.0mL并且向其中立即添加含有活性微管溶素的THF溶液。在氩气下将迅速变均匀的反应混合物搅拌50分钟并且用2.0mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0，15mL)淬火。将所得云状溶液过滤并且将滤液注射到一个制备型HPLC中，以用于纯化。柱：Waters XTerra Prep MS C1810μm，19×250mm；流动相A：2.0mM磷酸钠缓冲液，pH 7.0；流动相B：乙腈；方法：1％B持续5分钟，然后1％B至60％B持续另外30分钟，流速＝26L/min。收集来自20.75-24.50分钟的级分并且将其冻干，以获得作为一种淡黄色蓬松固体的EC1456(26mg)。以上方法同样适用于通过适当选择微管溶素或其他药物起始化合物来制备其他微管溶素和其他缀合物。
实例.EC1663和EC1664，使用在此所述的方法和过程可制备以下的其他化合物：
实例.EC1426是根据以下过程制备的。
实例.EC1456是根据以下过程制备的。
实例.N10-TFA保护的EC1454是根据以下过程制备的。
实例.EC1454是根据以下过程制备的。
EC1454：MS(ESI,[M+2H]2+)＝840.90,[M+H]+＝1681.3。部分1H-NMR(DMSO)δ(ppm):8.6(s),7.6(d),6.6(d),4.45(s),4.35(t),4.15-4.3(m),3.3-3.6(m),3.25(m),3.0(m),2.7-2.9(m),2-2.3(m),1.6-2(m)。
EC1415：[M+H]+＝1709.69,[M+2H]2+＝855.22。部分1H NMR(D2O,300MHz)δ(ppm):8.6(s,1H),7.45(d,2H),6.5(d,2H),4.5(s,2H),4.3-4.1(m,6H),3.95(t,1H),3.8-3.4(m,19H),3.4-2.95(m,7H),2.4-1.7(m,26H),1.6(m,1H),1.25(s,2H),1.05(s,3H)。
实例.EC1004是根据以下过程制备的。
向装备有磁力搅拌棒和温度探针的一个圆底烧瓶中添加二肽EC1458、咪唑以及亚甲基氯。一旦所有的固体都溶解，则使用冰浴冷却该溶液。逐滴添加氯三乙基硅烷(TESC1)并且去除冰浴。监控反应的完成度。如果需要，则添加第二部分氯三乙基硅烷和/或咪唑。通过过滤去除咪唑HCl盐并且添加亚甲基氯。用一种氯化钠饱和溶液(盐水)洗涤这些有机物，用亚甲基氯反提取一次水层，并且用盐水洗涤合并的有机层。将有机层用硫酸钠干燥，并且在一个旋转蒸发器上将其浓缩。将残余物溶解于四氢呋喃(THF)中并且将其冷却至大约-45℃。逐滴添加双(三甲基甲硅烷基)酰胺钾(KHMDS)的甲苯溶液。在搅拌的情况下，添加丁酸氯甲酯并且监控反应。用甲醇淬火反应并且然后添加乙酸乙酯和盐水。丢弃水层并且将这些有机物用盐水洗涤一次。在一个旋转蒸发器上浓缩有机层并且使油质残余物经过一个短的硅胶塞。用20％乙酸乙酯的石油醚溶液洗涤该塞。在一个旋转蒸发器上浓缩合并的有机物，直到蒸馏停止为止。通过LC和NMR分析粗EC1004油并且在使用之前保存在一个冷冻箱中。
实例.EC1005是根据以下过程制备的。
向一个适当大小的氢化烧瓶中放置哌啶酸(pipecolinate)R-N-甲酯基(MEP)、五氟苯酚、N-甲基吡咯烷(NMP)以及乙基二甲基氨基丙基碳化二亚胺(EDC)。将混合物搅拌至少16h。添加溶解于N-甲基吡咯烷(NMP)和10wt％Pd/C中的EC1004。将反应混合物在氢气压力下搅拌/振摇，直到通过LC分析完成该反应为止。通过经由硅藻土的过滤去除Pd/C。用乙酸乙酯洗涤硅藻土并且用1％碳酸氢钠/10％氯化钠溶液洗涤合并的有机物三次。将有机层用硫酸钠干燥，并且在一个旋转蒸发器上将其浓缩。将残余物溶解于DCM中并且通过硅胶色谱法使用乙酸乙酯和石油醚作为洗脱液进行纯化。收集级分，检查纯度，将其合并并且在一个旋转蒸发器上干燥。通过LC测定粗EC1005油并且在使用之前保存在一个冷冻箱中。
实例.EC1008是根据以下过程制备的。
将EC1005溶解于1,2-二氯乙烷(DCE)中并且添加三甲基氢氧化锡。将反应混合物加热并且通过LC监控反应。在完成时，用冰浴冷却混合物并且过滤。然后用DCE洗涤这些固体。用水洗涤一次有机层，并且用硫酸钠干燥。将溶液在一个旋转蒸发器上浓缩并且将残余物溶解于四氢呋喃(THF)中。添加三乙胺三氢氟酸盐并且搅拌混合物同时使用LC监控。添加吡啶、二甲氨基吡啶(DMAP)以及乙酸酐。将反应搅拌并且通过LC监控。将反应混合物浓缩成一种残余物并且通过使用乙腈和水作为洗脱液的C18柱色谱法纯化该产物。收集产物级分，将其浓缩并且冻干，以获得一种白色至米白色粉末。
实例.EC1426是根据以下过程制备的。
将EC1422溶解于四氢呋喃(THF)中并且添加(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷子基磷六氟磷酸脂(PyBop)和二异丙基乙胺(DIPEA)。一旦所有固体都溶解，则添加肼并且搅拌该反应并且监控完成度。添加EC0607并且搅拌混合物并通过LC监控完成度。添加乙酸乙酯并且将这些有机物用饱和氯化铵洗涤一次、用饱和碳酸氢钠洗涤两次并且用饱和氯化钠洗涤一次。将有机物用硫酸钠干燥，并且在一个旋转蒸发器上将其浓缩。通过使用二氯甲烷和甲醇作为洗脱液的二氧化硅柱色谱法纯化粗EC1426。收集级分并且在一个旋转蒸发器上浓缩合并的产物级分，以获得一种黄色固体。
实例.EC1428是根据以下过程制备的。
将EC1008溶解于二氯甲烷中并且添加溶解于DCM中的五氟苯酚连同N-环己基碳化二亚胺、N'-甲基聚苯乙烯(DCC-树脂)。将混合物搅拌并且通过LC监控反应完成度。将混合物过滤，以去除树脂，并且在一个旋转蒸发器上浓缩有机层，以获得活化的EC1008。在一个单独的烧瓶直接，将EC1426溶解于二氯甲烷中并且添加三氟乙酸。将反应混合物搅拌并且通过LC监控完成度。在以旋转蒸发器上浓缩反应混合物，以获得脱保护的EC1426。将活化的EC1008溶解于DMF中并且添加二异丙基乙胺(DIPEA)。将脱保护的EC1426溶解于DMF中并且将其添加到反应混合物中。将反应搅拌并且通过LC监控完成度。添加乙酸乙酯并且用饱和氯化钠水溶液洗涤有机物三次。将有机层用硫酸钠干燥，并且通过旋转蒸发器去除挥发物。通过使用二氯甲烷和甲醇作为洗脱液的二氧化硅柱色谱法纯化粗EC1428。收集级分，检查纯度，并且通过旋转蒸发器浓缩合并的产物级分，以获得一种黄色固体。该EC1428保存在一个冷冻箱中。
实例.其他微管溶素和微管溶素中间体可以根据WO 2012/019123、WO2009/055562、PCT国际申请序列号US 2013/034672、以及美国临时申请序列号61/793082中所述的方法制备，每份专利的披露内容通过引起以其全部内容结合在此。
实例.说明性微管溶素是如下的：
实例.EC1454是根据以下过程制备的。
使用树脂结合的三苯甲基保护的D-半胱氨酸开始N10-TFA保护的EC1454的固相合成。将该树脂悬浮于二甲基甲酰胺(DMF)中并且用DMF洗涤两次。将EC0475(葡糖胺修饰的L-谷氨酸)、(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷子基磷五氟磷酸酯(PyBOP)、以及二异丙基乙胺(DIPEA)添加到反应混合物中。在至少1个小时之后，进行凯撒测试(Kaiser test)，以确保偶合完成。将树脂用DMF洗涤三次、用IPA洗涤三次并且用DMF洗涤三次。将树脂用DMF中的哌啶缓慢洗涤三次、用DMF洗涤三次并且用IPA洗涤三次。进行凯撒测试，以证实脱保护。将树脂用DMF洗涤三次并且按相同的方法偶合顺序中的另一个氨基酸。以以下顺序偶合单体：1)EC0475、2)Fmoc-D-Glu(OtBu)-OH、3)EC0475、4)Fmoc-D-Glu(OtBu)-OH、5)EC0475、6)Fmoc-D-Glu-OtBu、以及7)N10-TFA-Pte-OH。
一旦最终偶合完成，就将该树脂用甲醇洗涤三次并且通过在室温下使氩气经过该树脂来干燥。将干燥的树脂悬浮于TFA、水、乙二硫醇、以及三异丙基硅烷的混合物中。在1小时之后，通过过滤去除树脂并且用TFA洗涤树脂。通过添加到冷乙醚中来沉淀产物，将其过滤，并且用醚洗涤。在真空下在室温中干燥这些固体并且将其保存在一个冷冻箱中。
将Ν10-TFA EC1454溶解于氩气吹扫的水中。添加碳酸钠(1M，在水中，氩气吹扫)，以实现pH 9.4-10.1。将反应混合物搅拌至少20分钟。一旦反应完成(如通过LC确定的)，通过用2M HC1将pH调节至1.9-2.3来淬火。通过使用乙腈和pH 5乙酸铵缓冲液作为洗脱液的C18柱色谱法纯化该产物。收集级分并且通过HPLC检查纯度。将合并的产物级分在一个旋转蒸发器上浓缩并且然后冻干，以获得作为一种黄色固体的EC1454。MS(ESI,[M+2H]2+)＝840.90,[M+H1]+＝1681.3。选择的1H-NMR(DMSO,300MHz)δ(ppm):8.6(s),7.6(d),6.6(d),4.45(s),4.35(t),4.15-4.3(m),3.3-3.6(m),3.25(m),3.0(m),2.7-2.9(m),2-2.3(m),1.6-2(m)。将产物保存在-20℃下。
实例.EC1456是根据以下过程制备的。
将EC1428溶解于乙腈中并且添加EC1454在pH 7.4磷酸钠缓冲液中的溶液。在添加之前和之后用氩气吹扫这些溶液。将反应混合物搅拌至少15分钟并且然后检查完成度。通过使用乙腈和pH 7.4磷酸盐缓冲液作为洗脱液的C18柱色谱法纯化所希望的产物。收集产物级分，检查其纯度，将其合并并且通过超滤进行浓缩，以产生10-20mg/mL EC1456的水溶液。对最终产物溶液进行取样，以用于测定并且然后保存在一个冷冻箱中。
在高分辨Waters Acquity UPLC Xevo Gs-S QTOF质谱仪上获得EC1456的正电喷射质谱。在UPLC入口系统上分离主要的组分之后获得光谱，分辨力是大约35,000。M+H单同位素峰的精确质量测量值是2625.0598，它与化学式C110H166N23O45S3的离子的理论值2625.0570具有1.1ppm误差差值。同位素分布也与该化学式一致。
EC1456的ES+光谱的质谱特征
将约30mg EC1456样品溶解于665μL 9:1重氢二甲亚砜和重氢水的混合物中。在26℃下在装配有包含宽带和质子观察线圈二者的一个2通道探针的安捷伦模型DD2光谱仪上以500MHz获得1H NMR光谱。在相同条件下在相同仪器上以125MHz获得13C NMR光谱。所有光谱均参考2.5ppm(1H)和39.50ppm(13C)的DMSO溶剂残余物信号。
使用下图中的原子编号为下表中的两种NMR光谱(1H和13C)分配所有光谱特征，其中*符号指示二硫键的连接。
基于1D和2D NMR实验做出分配，包括通过使用COSY和TCSY 2D实验的键H-H连接性、通过使用2D NOESY的空间H-H接近性、使用1DDEPT实验的碳多重性测量以及通过使用质子检测的2D实验HSQC和HMBC的键C-H连接性。在1D光谱中的大部分重叠情况下(不同质子或碳以相同化学位移共振)可以在2D光谱中分辨，在这些情况下，这些表格反映了由2D光谱测量的化学位移，但也反映了共振物质基团的求和积分。在一些1D重叠的情况下(如几乎相同的谷氨酸和葡糖胺亚基)，在2D相关光谱中也存在重叠，该重叠排除了多个原子数目之间的单个或多个共振态的明确分配，在这些情况下在一个单表行中存在化学位移和/或原子数目分配的多个词目。
NH和OH质子通过D2O重氢原子交换并且大部分缺席于光谱中，除了5-10ppm区域中的弱宽峰。在表中未列出的光谱中的1H峰包括3.75ppm的宽HOD峰和2.50ppm的DMSO峰。该HOD峰不会遮掩任何共振，但是由于宽基线上升而提高了在4.2和3.4-3.7ppm附近的共振的积分。该DMSO峰遮掩了H129的共振，它出于这个原因而未取积分。在表中未列出的光谱中的13C峰包括在39.50ppm处的非常大的DMSO溶剂。该DMSO峰遮掩了来自C91和C93的两个信号。由于因附近的酰胺基团周围的构象变化而延伸加宽使该C116峰在13C光谱中是不可观察的。所有三个化学位移(C91、C93、C116)在质子检测的2D相关光谱中是可见的并且是在该光谱中测量的。
EC1456的质子NMR分配
EC1456的碳NMR分配
在装备有Ever-Glo中/远IR源、延长范围的溴化钾(KBr)分束器、以及重氢硫酸三甘钛(DTGS)检测器的Nexus傅里叶变换红外线(FT-IR)分光光度计(热电尼高力公司(Thermo Nicolet))上获取EC1456的IR光谱。将具有锗(Ge)结晶的衰减全反射比(ATR)配件(ThunderdomeTM，热电光谱技术公司(Thermo Spectra-Tech))用于数据获取。光谱表示在4cm-1光谱分辨率下收集的256次共加入扫描。使用干净的Ge结晶获取背景数据集。通过获得这两个数据集针对彼此的比率来获取Log 1/R(R＝反射比)光谱。使用聚苯乙烯进行波长校准。
EC1456参考物质的红外谱带分配
在珀金-埃尔默埃尔默(Perkin-Elmer Lambda)25UV/Vis分光仪上获取紫外光谱EC1456。在25℃下在40.7uM的0.1M NaOH溶剂中在1cm光程样品池上记录光谱。在366nm、288nm以及243nm处的局部最大值主要是分别由于蝶酸、苯甲酰胺/苯酚和噻唑-酰胺亚结构，尽管该分子包含在UV区域中具有重叠吸收的几十个生色团。
实例.N10-TFA保护的EC1579是根据以下过程制备的。
实例.EC1579是根据以下过程制备的。
EC1579MS(ESI,[M+2H]2+)＝840.89(M+1H)1+＝1681.0。部分1H-NMR(D2O)δ(ppm):8.6(s),7.5(d),6.65(d),4.4-4.8(m),4-4.2(m),3.4-3.8(m)3-3.3(m)2.75(s),1.6-2.4(m)。
实例.EC0948是通过在此所述的过程制备的。
EC0848:MS(ESI,[M+2H]2+)＝840.8。[M+H]+＝1681.1。所选择的1H-NMR(DMSO)δ(ppm):s,8.6；d,7.6；d,6.6；s,4.45；m,4-4.2；m,3.3-3.8；m,3.1-3.3；m,3-3.1；m,2.7-2.9；m,1.7-2.3；s,1.15
实例.EC1669是根据在此所述的方法由EC1579和如下的EC0469制备的：
将EC1579(200mg，1.0当量)溶解于去养(鼓泡氩气)20mM PO4(pH＝7)缓冲液(4.0mL)，并且在室温下在氩气鼓泡的情况下将其逐滴添加到EC0469(80mg，1.0当量)在干燥二甲亚砜(4.0mL)中的搅拌溶液中。在30min之后，通过用0-30％乙腈/50mM NH4HC03pH 7缓冲液的制备型HPLC纯化EC1669(132mg)并且将其冻干(49％产率)。化学式：C87H122N26O40S2；准确质量：2234.78；MW 2236.18。MS(ESI,[M+2H]2+)预测值1118.39，实测值1119.52。部分1H NMR(DMSO w/10％D2O)δ(ppm)8.67(s),8.59(2),7.61(d),7.56(d),6.71(d),6.61(d),3.34-3.39(m)’
实例.描述以下其他化合物并且根据在此所述的一般过程制备这些化合物。
EC1739(C113H173N23O44S3；MW 2653.91)
将EC1454(8.5mg，1.5当量)溶解于脱气(Ar鼓泡)的20mM磷酸酯pH 7缓冲液(2.0mL)并且在室温下在Ar鼓泡的情况下将其逐滴添加到EC1717(3.8mg，1.0当量)在干燥二甲亚砜(2.0mL，德里奇公司(Aldrich))中的搅拌溶液中。在30min之后，通过用10％-100％乙腈/50mMNH4HCO3pH 7缓冲液的制备型HPLC纯化EC1739(5.3mg，59％)并且将其冻干。MS(ESI,[M+2H]2+)＝1327.06，实测值1327.73
EC1664(C111H169N23O44S3；分子量2625.85)
将EC1454(5.5mg，1.0当量)溶解于脱气(Ar鼓泡)的20mM磷酸酯pH 7缓冲液(2.0mL)中并且在室温下在Ar鼓泡的情况下将其逐滴添加到EC1662(3.6mg，1.0当量)在干燥二甲亚砜(2.0mL，德里奇公司)中的搅拌溶液中。在30min之后，通过用10％-100％乙腈/50mM NH4HCO3pH 7缓冲液的制备型HPLC纯化EC1664(4.6mg，54％)并且将其冻干。MS(ESI,[M+2H]2+)预测值1313.05，实测值1313.37。部分1H NMR(DMSOw/10％D2O,300MHz)□(ppm)8.61(s),8.15(s),7.58(d),6.94(d),6.60(m),5.78(d),5.22(d),4.47(m),4.09-4.33(m),0.99(d),0.93(d),0.76(t),0.71(t),0.61(d)。
EC1663(化学式：C110H167N23O44S3；MW 2611.83)
将EC1454(16.1mg，1.2当量)溶解于脱气(Ar鼓泡)的20mM磷酸酯pH 7缓冲液(2.0mL)中并且在室温下在Ar鼓泡的情况下将其逐滴添加到EC1661(8.7mg，1.0当量)在干燥二甲亚砜(2.0mL，德里奇公司)中的搅拌溶液中。在30min之后，通过用10％-100％乙腈/50mMNH4HCO3pH 7缓冲液的制备型HPLC纯化EC1663(15.8mg，76％)并且将其冻干。MS(ESI,[M+2H]2+)预测值1306.04，实测值1306.82。
EC1416(C112H169N23O45S3；MW 2653.87)
将EC1415(20mg)溶解于pH 7磷酸酯(pH 7.75，用氩气吹扫)中。向此溶液中添加EC0312(14mg)在等体积的MeOH中的悬浮液。在环境温度下在氩气下将反应混合物搅拌45min，并且然后将其装载到制备型HPLC上(流动相A＝50mM NH4HCO3缓冲液，pH＝7.0，B＝CAN，方法：5％-80％B，在20min内)，以进行纯化。收集含有所希望的产物的级分，将其组合，并且冷冻干燥，以获得作为一种淡黄色固体的产物(18mg)。MS(ESI,[M+2H]2+)1328,1H NMR(DMSO-d6,D2O,300MHz):8.6(s,1H),8.15(s,1H),7.85(bd,1H),7.55(d,2H),6.95(d,2H),6.6(m,4H),6.2(d,1H),5.68(d,1H),5.2(d,1H),4.5(bs,3H),4.5-4.3(m,4H),4.3-4.0(m,10H),3.5-3.3(m,13H),3.2(bd,5H),3.1-2.8(m,8H),2.75(bs,5H),2.6-1.6(m,50H),1.4(m,9H),1.2(m,9H),1.0(dd,9H),0.7(m,11H),0.6(d,3H)。
EC1299(C85H118N22O28S3；MW 1992.18)
将EC0259(35mg)在20mM pH 7磷酸盐缓冲液(3.0mL)中的溶液和饱和NaHCO3溶液(1.5mL)依次添加到EC0312(39mg)在MeOH(5.5mL)中的溶液中。在环境温度下在氩气下将所得的均匀溶液搅拌20min，并且然后将其直接装载到制备型HPLC上(流动相A＝50mM NH4HCO3缓冲液，pH＝7.0，B＝ACN，方案：5％-80％B，在20min内)，以进行纯化。收集含有所希望的产物的级分，将其组合，并且冷冻干燥，以获得作为淡黄色固体的产物(25mg)。MS(ESI,[M+H]+)1993。
EC1549(C85H118N22O28S3；MW 1992.17)
将EC0259(35mg)在20mM pH 7磷酸盐缓冲液(3.0mL)中的溶液和饱和NaHCO3溶液(1.5mL)依次添加到EC0312(39mg)在MeOH(5.5mL)中的溶液中。在环境温度下在氩气下将所得的均匀溶液搅拌20min，并且然后将其直接装载到制备型HPLC上(流动相A＝50mM NH4HCO3缓冲液，pH＝7.0，B＝ACN，方案：5％-80％B，在20min内)，以进行纯化。收集含有所希望的产物的级分，将其组合，并且冷冻干燥，以获得作为淡黄色固体的产物(25mg)。MS(ESI,[M+H]+)1993。
EC1548(C85H118N22O28S3；MW 1992.17)
将EC1544(55.1mg)在20mM pH7磷酸盐缓冲液(1.95mL)中的溶液和饱和NaHCO3溶液(0.30mL)依次添加到EC1248(58.0mg)在MeOH(2.30mL)中的溶液中。在环境温度下在氩气下将所得的均匀溶液搅拌20min，并且然后将其直接装载到制备型HPLC上(流动相A＝50mMNH4HCO3缓冲液，pH＝7.0，B＝ACN，方法：5％-80％B，在20min内)，以进行纯化。收集含有所希望的产物的级分，将其组合，并且冷冻干燥，以获得作为淡黄色固体的产物(61.5mg)。MS(ESI,[M+H]+)1993。
EC1393(C87H122N22O28S3；MW 2020.23)
用饱和NaHCO3溶液将EC1392(20mg)在40mM pH7磷酸酯缓冲液中的溶液的pH调节至8。向该溶液中添加EC0312(20mg)在等体积的MeOH中的悬浮液。在环境温度下在氩气下将反应混合物搅拌30min，并且然后将其装载到制备型HPLC上(流动相A＝50mM NH4HCO3缓冲液，pH＝7.0，B＝CAN，方法：5％-80％B，在20min内)，以进行纯化。收集含有所希望的产物的级分，将其组合，并且冷冻干燥，以获得作为淡黄色固体的产物(15mg)。MS(ESI,[M+2H]2+)1011.39。1H NMR(DMSO-d6,D2O,300MHz):8.6(s,1H),8.15(s,1H),7.85(bd,1H),7.55(d,2H),6.95(d,2H),6.6(m,4H),6.2(d,1H),5.68(d,1H),5.2(d,1H),4.6(t,1H),4.5(m,3H),4.5-4.0(m,11H),3.2-2.8(m,6H),2.8-2.5(m,8H),2.4(m,5H),2.2-2.0(m,14H),2.0-1.7(m,7H),1.6-1.3(m,13H),1.25(d,8H),1.1-0.95(dd,8H),0.75(m,10H),0.6(d,2H)。
实例.在此所述的化合物还可以通过以下两种方法制备：
方法A：在氩气吹扫的情况下通过用NaHCO3溶液将该溶液的pH调节至pH＝7来将叶酸间隔物溶解于水中。然后添加有机溶剂(MeOH、ACN、THF或DMSO)中的嗜硫剂。在室温下在氩气吹扫的情况下搅拌该反应混合物。通过分析型HPLC监控反应过程(流动相A＝50mM NH4HCO3缓冲液，pH＝7.0；B＝ACN)。在反应完成之后，将有机溶剂蒸发并且然后通过使用C18柱的制备型HPLC纯化所得的溶液(流动相A＝50mMNH4HCO3缓冲液或者2mM磷酸缓冲液，pH＝7.0；B＝ACN)。
方法B：将叶酸间隔物溶解于水中并且用酸(AcOH或稀释的HC1)将该pH调节至2。将所得的pH调节的间隔物冻干，并且然后将其再次溶解于DMSO中。用氩气吹扫反应混合物，并且添加10摩尔当量的Et3N(或DIPEA)。向此溶液中添加有机溶剂(DMSO、THF、ACN等)中的嗜硫剂。通过HPLC监控反应过程(流动相A＝50mM NH4HCO3缓冲液或2mM磷酸盐缓冲液，pH＝7.0；B＝ACN)。在反应完成之后，通过使用C18柱的制备型HPLC纯化反应混合物(流动相A＝50mM NH4HCO3缓冲液或者2mM磷酸缓冲液，pH＝7.0；B＝ACN)。
实例.在此描述了另外的说明性接头中间体(也称为叶酸受体)：
EC0014:1H NMR(D2O,500MHz)δ(ppm)8.73(s,1H,FA H-7),7.56(d,2H,FA H-12&H16),6.73(d,2H,FA H-13&H15),4.45(m,2H),4.1(m,2H),3.61(d,2H),2.82(m,3H),2.74(dd,1H),2.37(m,2H),2.18(m,1H),2.09(m,3H),1.74(m,1H)
实例.
EC0020:MS(ESI,[M+H]+)746。1H NMR(D2O,500MHz)δ(ppm)8.76(s,1H,FA H-7),7.68(d,2H,FA H-12&H16),6.8(d,2H,FA H-13&H15),4.71(dd,1H,Asp H-2),4.64(s,2H FA H-9),4.41(dd,1H,D-Glu H-2),4.3(dd,1H,Cys H-2),4.1(dd,Dpr H-2),3.72(dd,1H,Dpr H-3A),3.52(dd,1H,DprH-3B),2.89(dd,1H,Cys H-3A),2.85(dd,1H,Cys H-3B),2.81(dd,1H,AspH-3A),2.62(dd,1H,Asp H-3B),2.44(dd,2H,D-Glu H-4),2.27(m,1H,D-GluH-3A),2.08(m,1H,D-Glu H-3B)。13C NMR(DMSO-d6+D2O,75MHz):□174.78,174.42,172.68(2C),170.45,168.25,167.08,162.24,156.24,154.38,151.24,149.41(2C),129.52,128.14,121.74,111.98,55.76,53.02(2C),52.77,50.89,46.16,36.61,32.26,27.32,26.60
实例.
EC0149:[M+H]+＝631。1H NMR(D2O):8.55(s,1H),7.5(d,2H),6.61(d,2H),4.42(s,2H),4.35(dd,1H),4.25(m,2H),4.1(s,1H),3.68(m,1H),3.5(m,1H),3.35-3.2(m,3H),3.1(dd,1H),2.4-2.1(m,3H),2.1-1.9(m,4H)。
EC0150:MS(ESI,[M+H]+)631。所选择的1H NMR(D2O)δ(ppm)8.42(s,1H,FA H-7),7.50(d,2H,FA H-12&16),6.65(d,2H,FA H-13&15),4.42(s,2H),4.3-4.1(m,2H),4.0-3.85(m,1H),3.35-3.30(m,1H),3.30-3.10(m,2H),3.10-2.90(m,2H),2.80-2.70(m,1H),2.65-2.50(m,2H),2.30-2.10(m,3H),2.10-1.85(m,2H),1.95-1.80(m,2H)。
ECO 151:MS(ESI,[M+H]+)630。所选择的1H NMR(D2O)δ(ppm)8.42(s,1H,FA H-7),7.50(d,2H,FA H-12&16),6.65(d,2H,FA H-13&15),4.42(s,2H),4.3-4.1(m,2H),4.0-3.85(m,1H),3.35-3.30(m,1H),3.30-3.10(m,2H),3.10-2.90(m,2H),2.80-2.70(m,1H),2.65-2.50(m,2H),2.30-2.10(m,3H),2.10-1.85(m,2H),1.95-1.80(m,2H)。
EC0232:MS(ESI,[M+H]+)774。1H NMR(D2O):8.56(s),7.50(d),6.65(d),4.48-4.41(m),4.21(dd),4.08(dd),3.48-3.42(m),3.28-3.09(m),2.61-2.35(m),2.28-2.18(m),2.16-2.02(m),1.97-1.62(m)。
EC0252:[M+H]+＝1046.83。1H NMR(D2O):8.58(s,1H),7.5(d,2H),6.6(d,2H),3.05-2.6(m,5H),2.3-1.9(m,4H),1.8-1.2(m,7H)。
EC0259:[M+H]+＝1047.52。1H NMR(D2O):8.6(s,1H),7.5(d,2H),6.65(d,2H),4.4(dd,2H),4.18(m,4H),2.9(t,2H),2.75(t,2H),2.6-2.15(m,10H),2.1-1.8(m,3H),1.7-1.4(m,3H),1.3(m,3H)。
EC1213(EC119-D-Glu(2)-非对映体)
EC1213:LCMS(ESI[M+H]+):1046。所选择的1H NMR数据(D2O,300MHz):δ8.68(s,1H,FA H-7),7.57(d,2H,J＝8.4Hz,FA H-12&16),6.67(d,2H,J＝9Hz,FA H-13&15)。
EC1214(EC119-D-Arg(4)-非对映体)
EC1214:LCMS(ESI[M+H]+):1046。所选择的1H NMR数据(D2O,300MHz):δ8.68(s,1H,FA H-7),7.57(d,2H,J＝8.4Hz,FA H-12&16),6.67(d,2H,J＝9Hz,FA H-13&15)。
EC1215(EC119-D-Asp(5)-非对映体)
EC1215:LCMS(ESI[M+H]+):1046。所选择的1H NMR数据(D2O,300MHz):δ8.68(s,1H,FA H-7),7.57(d,2H,J＝8.4Hz,FA H-12&16),6.67(d,2H,J＝9Hz,FA H-13&15)。
EC1216(EC119-D-Asp(6)-非对映体)
EC1216:LCMS(ESI[M+H]+):1046
所选择的1H NMR数据(D2O,300MHz):δ8.68(s,1H,FA H-7),7.57(d,2H,J＝8.4Hz,FA H-12&16),6.67(d,2H,J＝9Hz,FA H-13&15)。
EC1217(EC119-D-Cys-非对映体)
EC1217:LCMS(ESI[M+H]+):1046。所选择的1H NMR数据(D2O,300MHz):δ8.68(s,1H,FA H-7),7.57(d,2H,J＝8.4Hz,FA H-12&16),6.67(d,2H,J＝9Hz,FA H-13&15)。
EC1392:[M+H]+＝1074.85。1H NMR(D2O,300MHz)δ(ppm):8.55(s,1H),7.45(d,2H),6.5(d,2H),4.6(m,2H),4.45(t,1H),4.35(bs,2H),4.2(m,1H),4.1(s,1H),4.05(m,1H),2.9(t,2H),2.75-2.4(m,6H),2.3(m,2H),2.2-1.9(m,2H),1.8-1.4(m,2H),1.2(m,2H),1.3(s,3H),1.2(s,3H)。
EC1347:MS(ESI,[M+H]+)＝701.57。所选择的1H-NMR(DMSO,300MHz)δ(ppm):8.65(s),7.6(d),6.6(d),4.2-4.6(m),2.6-3.2(m),1.8-2.6(m),1.1-1.7(m)
EC0589(EC20的a-异构体)
EC0589:MS(ESI,[M+H]+)746。所选择的1H NMR(DMSO-d6+D2O,300MHz):□8.46(s,1H),7.45(d,J＝8.4Hz,2H),6.47(d,J＝8.4Hz,2H),4.39(t,J＝6.6Hz,1H)。
EC0819:MS(ESI,[M+H]+)＝1046.4。所选择的1H-NMR(DMSO)δ(ppm):8.6(s),7.6(d),6.6(d),4-4.6(m),3.4-3.8(m),3-3.15(m),1-2.8(m)。
EC0823:MS(ESI,[M+H]+)＝672.3。所选择的1H-NMR(DMSO)δ(ppm):8.8(s),7.6(d),6.6(d),4.4-4.6(m),4.2-4.4(m),3.4-3.8(m),1.8-2.8(m),1.15(s)
EC0835:MS(ESI,[M+H]+)＝1046.5。所选择的1H-NMR(DMSO)δ(ppm):8.6(s),7.5(d),6.6(d),3.8-4.6(m),2.8-3.2(m),2.2-2.8(m),1-2.2(m)
EC0923:MS(ESI,[M+H]+)＝672.3。所选择的1H-NMR(D2O)δ(ppm):8.8(s),7.75(d),6.85(d),4.4-5(m),2.6-2.9(m),2.4-2.6(m),2-2.6(m)
D-叶酸
EC0879:MS(ESI,[M+H]+)＝442.3。所选择的1H-NMR(DMSO)δ(ppm):8.7(s),7.6(d),6.6(d),4.55(s),4.3(m),2.2-2.6(m),1.8-2.2(m),1-1.2(m)
EC0306:[M+H]+＝1100.51。1H NMR(D2O):δ8.75(s,1H),7.6(d,2H),6.75(d,2H),4.7-4.5(m,5H),4.38(m,2H),4.2(m,2H),4.1(d,1H),3.85-3.5(m,10H),2.95-2.6(m,4H),2.45(m,2H),2.3-2.0(m,2H)。
EC0368:[M+H]+＝2175.5。1H NMR(D2O):8.6(s,1H),7.5(d,2H),6.6(d,2H),4.45(bs,3H),4.35-4.2(m,4H),4.05(t,1H),3.6-3.35(bs,114H),3.2(s,6H),2.77(t,2H),2.65(dd,1H),2.55-2.45(m,3H),2.4-2.2(m,6H),2.1-1.8(m,2H)。
EC0373:[M+H]+＝1346.0。1H NMR(D2O):8.55(s,1H),7.5(d,2H),6.6(d,2H),4.4(s,2H),4.25(m,2H),4.05(t,1H),3.7(dd,1H),3.6-3.3(m,50H),3.25(dd,3H),3.05(dd,3H),2.8(t,2H),2.7(dd,2H),2.6(dd,1H),2.4(t,2H),2.2-1.9(m,4H)。
EC0536:[M+2H]2+＝941.2。1H NMR(D2O):8.55(s,1H),7.5(d,2H),6.6(d,2H),4.4(s,2H),4.25(m,2H),4.1(m,5H),3.85(t,1H),3.8-3.4(m,21H),3.4-2.95(m,7H),2.8(s,2H),2.7-2.4(ddd,2H),2.4-1.7(m,22H),1.55(m,1H)。
实例.在此描述了另外的说明性化合物和用于制备这些化合物的方法：
EC1579的缀合物
将EC1579(酸化，13.0mg，0.0077mmol)在DMSO(0.4mL)中溶液和12μL DIPEA(0.070mmol，13.5当量)依次添加到EC1822(5.6mg，0.0052mmol)在DMSO(0.2mL)中的溶液中。在环境温度下在氩气下将所得的均匀溶液搅拌20min，并且然后将其直接装载到制备型HPLC上(流动相A＝50mM NH4HCO3缓冲液，pH＝7.0，B＝CAN，方法：5％-80％B，在20min内)，以进行纯化。收集含有所希望的产物的级分，将其组合，并且冷冻干燥，以获得作为淡黄色固体的产物(12.4mg)。所选择的1H NMR(DMSO-d6)δ(ppm)8.62(s,1H),8.20(s,1H),7.60(d,2H),7.56(d),6.93(d,2H),6.61(m,3H),5.25(d,1H),4.51(d,1H),4.50-4.40(m,3H),4.32-4.10(m,10H),3.65-3.50(m,10H),3.40-3.30(m,10H),3.30-3.10(m,7H),3.10-2.95(m,3H),2.95-2.80(m,3H),2.75-2.60(br,3H),2.40-2.00(m,14H),2.0-1.3(m,24H),1.30-1.05(m,6H),0.99(d,3H),0.88(d,3H),0.86(d,3H),0.79(t,6H),0.73(t,3H),0.64(br,3H)
实例.EC1746的合成
将EC1579(30.9mg)在20mM pH 7磷酸盐缓冲液(4.2mL)中的溶液和饱和NaHCO3溶液(0.30mL)依次添加到EC1662(16.9mg)在MeOH(4.8mL)中的溶液中。在环境温度下在氩气下将所得的均匀溶液搅拌20min，并且然后将其直接装载到制备型HPLC上(流动相A＝50mMNH4HCO3缓冲液，pH＝7.0，B＝CAN，方法：5％-80％B，在20min内)，以进行纯化。收集含有所希望的产物的级分，将其组合，并且冷冻干燥，以获得作为一种蓬松的黄色固体的产物(33.1mg)。MS(ESI,M+H)＝2627。EC17461H NMR(D2O):8.66(s),8.10(s),7.62(b),6.99(b),6.69(b),5.81(b),5.18(b),4.60-4.18(m),3.91-0.57(m)。
实例.EC1669的合成
将EC1579(200g，1.0当量)溶解于脱气(Ar鼓泡)的20mM PO4pH7缓冲液(4.0mL)中并且在室温下在Ar鼓泡的情况下将其逐滴添加到粗EC0469(80mg，1.0当量)在干燥二甲亚砜(4.0mL，德里奇公司)中的搅拌溶液中。在30min之后，通过用0％-30％乙腈/50Mm NH4HCO3pH 7缓冲液的制备型HPLC纯化EC1669(132mg，49％)并且将其冻干。MS(ESI,[M+2H]2+)预测值1118.39，实测值1119.52。部分1H NMR(DMSO w/10％D2O)d(ppm)8.67(s),8.59(2),7.61(d),7.56(d),6.71(d),6.61(d),3.34-3.39(m)。
实例.EC1665的合成
将EC1579(15mg，1.0当量)溶解于脱气(Ar鼓泡)的20mM PO4pH7缓冲液(2.0mL)中并且在室温下在Ar鼓泡的情况下将其逐滴添加到EC0564(10.5mg，1.0当量)在干燥二甲亚砜(4.0mL，德里奇公司)中的搅拌溶液中。在30min之后，通过用10％-100％乙腈/10mM NH4OAc pH5缓冲液的制备型HPLC纯化EC1665(13.4mg，55％)并且将其冻干。MS(ESI,[M+2H]2+)预测值1368.09，实测值1368.30
EC1454的缀合物
实例.EC1751的合成
将EC1454(21.1mg，1.3当量)溶解于脱气(Ar鼓泡)的20mM PO4pH 7缓冲液(2.0mL)中并且在室温下在Ar鼓泡的情况下将其逐滴添加到EC1716(10.8mg，1.0当量)在干燥二甲亚砜(2.0mL，德里奇公司)中的搅拌溶液中。在30min之后，通过用10％-100％乙腈/50mM NH4HCO3pH 7缓冲液的制备型HPLC纯化EC1751(8.5mg，33％)并且将其冻干。MS(ESI,[M+2H]2+)预测值1320.05，实测值1320.72。所选择的1H NMR(DMSO w/10％D2O)d(ppm)8.61(s),8.15(s),7.58(d),6.94(d),6.60(m),5.79(d),5.22(d),4.47(m),4.09-4.33(m),0.98(d),0.93(d),0.75(m),0.61(d)
实例.EC1750的合成
将EC1454(31.1mg，1.3当量)溶解于脱气(Ar鼓泡)的20mM PO4pH 7缓冲液(2.0mL)中并且在室温下在Ar鼓泡的情况下将其逐滴添加到EC1715(15.3mg，1.0当量)在干燥二甲亚砜(2.0mL，德里奇公司)中的搅拌溶液中。在30min之后，通过用10％-100％乙腈/50mM NH4HCO3pH7缓冲液的制备型HPLC纯化EC1750(18.0mg，97％)并且将其冻干。MS(ESI,[M+2H]2+)预测值1299.03，实测值1299.19。部分1H NMR(DMSOw/10％D2O)d(ppm)8.61(s),8.14(s),7.57(d),6.93(d),6.60(m),5.77(d),5.23(d),4.47(m),0.98(d),0.92(d),0.76(m),0.71(t),0.61(d)
实例.EC1739的合成
将EC1454(8.5mg，1.5当量)溶解于脱气(Ar鼓泡)的20mM PO4pH 7缓冲液(2.0mL)中并且在室温下在Ar鼓泡的情况下将其逐滴添加到EC1717(3.8mg，1.0当量)在干燥二甲亚砜(2.0mL，德里奇公司)中的搅拌溶液中。在30min之后，通过用10％-100％乙腈/50Mm NH4HCO3pH7缓冲液的制备型HPLC纯化EC1739(5.3mg，59％)并且将其冻干。MS(ESI,[M+2H]2+)预测值1327.06，实测值1327.73
MS(ESI,[M+2H]2+)预测值1313.05，实测值1313.37。所选择的1H NMR(DMSO w/10％D2O)d(ppm)8.61(s),8.15(s),7.58(d),6.94(d),6.60(m),5.78(d),5.22(d),4.47(m),4.09-4.33(m),0.99(d),0.93(d),0.76(t),0.71(t),0.61(d)
实例.EC1664的合成
将EC1454(5.5mg，1.0当量)溶解于脱气(Ar鼓泡)的20mM PO4pH 7缓冲液(2.0mL)中并且在室温下在Ar鼓泡的情况下将其逐滴添加到EC1662(3.6mg，1.0当量)在干燥二甲亚砜(2.0mL，德里奇公司)中的搅拌溶液中。在30min之后，通过用10％-100％乙腈/50mM NH4HCO3pH 7缓冲液的制备型HPLC纯化EC1664(4.6mg，54％)并且将其冻干。
实例.EC1663的合成
将EC1454(16.1mg，1.2当量)溶解于脱气(Ar鼓泡)的20mM PO4pH 7缓冲液(2.0mL)中并且在室温下在Ar鼓泡的情况下将其逐滴添加到EC1661(8.7mg，1.0当量)在干燥二甲亚砜(2.0mL，德里奇公司)中的搅拌溶液中。在30min之后，通过用10％-100％乙腈/50mM NH4HCO3pH 7缓冲液的制备型HPLC纯化EC1663(15.8mg，76％)并且将其冻干。MS(ESI,[M+2H]2+)预测值1306.04，实测值1306.82
实例.EC1653的合成
将EC1454(8.3mg，1.0当量)溶解于脱气(Ar鼓泡)的20mM PO4pH 7缓冲液(2.0mL)中并且在室温下在Ar鼓泡的情况下将其逐滴添加到EC0564(5.8mg，1.0当量)在干燥二甲亚砜(4.0mL，德里奇公司)中的搅拌溶液中。在30min之后，通过用10％-100％乙腈/10mM NH4OAcpH 5缓冲液的制备型HPLC纯化EC1653(6.3mg，46％)并且将其冻干。MS(ESI,((M-2)/2))预测值1368.09，实测值1368.74
实例.EC1496的合成
将EC1454(324mg，1.0当量)溶解于脱气(Ar鼓泡)的20mM PO4pH 7缓冲液(4.0mL)中并且在室温下在Ar鼓泡的情况下将其逐滴添加到粗EC0469(142mg，1.0当量)在干燥二甲亚砜(4.0mL，德里奇公司)中的搅拌溶液中。在30min之后，通过用0％-30％乙腈/50mM NH4HCO3pH7缓冲液的制备型HPLC纯化EC1496(221mg，51％)并且将其冻干。MS(ESI,((M+2)/2))预测值1118.39，实测值1119.02
实例.EC1415的缀合物
实例.EC1416的合成
将EC1415(20mg)溶解于pH 7磷酸酯(pH 7.75，用氩气吹扫)中。向此溶液中添加EC0312(14mg)在等体积的MeOH中的悬浮液。在环境温度下在氩气下将反应混合物搅拌45min，并且然后将其装载到制备型HPLC上(流动相A＝50mM NH4HCO3缓冲液，pH＝7.0，B＝CAN，方法：5％-80％B，在20min内)，以进行纯化。收集含有所希望的产物的级分，将其组合，并且冷冻干燥，以获得作为一种淡黄色固体的产物(18mg)。MS(ESI,[M+2H]2+)1328。1H NMR(DMSO-d6,D2O,300MHz):8.6(s,1H),8.15(s,1H),7.85(bd,1H),7.55(d,2H),6.95(d,2H),6.6(m,4H),6.2(d,1H),5.68(d,1H),5.2(d,1H),4.5(bs,3H),4.5-4.3(m,4H),4.3-4.0(m,10H),3.5-3.3(m,13H),3.2(bd,5H),3.1-2.8(m,8H),2.75(bs,5H),2.6-1.6(m,50H),1.4(m,9H),1.2(m,9H),1.0(dd,9H),0.7(m,11H),0.6(d,3H)。
实例.EC1392的缀合物
MS(ESI,[M+2H]/+)1011.39
实例.EC59的缀合物
将EC59(13.2mg)在20mM pH 7.1磷酸缓冲液(2.4mL)中的溶液添加到EC0312(14.2mg)在MeOH(2.4mL)中的溶液中。在环境温度下在氩气下将所得的均匀溶液搅拌20min，并且然后将其直接装载到制备型HPLC上(流动相A＝50mM NH4HCO3缓冲液，pH＝7.0，B＝CAN，方法：5％-80％B，在20min内)，以进行纯化。收集含有所希望的产物的级分，将其组合，并且冷冻干燥，以获得作为一种蓬松的黄色固体的产物(15.3mg)。
实例.EC1347的缀合物
EC1208:LCMS[ESI(M+H)+:1918]。1所选择的EC145的1H NMR数据(D2O,300MHz):δ8.67(s,1H,FA H-7),7.50(br s,1H,VLB H-11’),7.30-7.40(br s,1H,VLB H-14’),7.35(d,2H,J＝7.8Hz,FA H-12&16),7.25(m,1H,VLB H-13’),7.05(br s,1H,VLB H-12'),6.51(d,2H,J＝8.7Hz,FAH-13&15),6.4(s,2H,VLB H-14&17),5.65(m,1H,VLB H-7),5.5(m,1H,VLB H-6),4.15(m,1H,VLB H-8’),3.82(s,3H,VLB C18’-CO2CH3),3.69(s,3H,VLB Cl6-OCH3),2.8(s,3H,VLB N-CH3),1.35(br s,1H,VLB H-3’),1.15(m,1H,VLB H-2’),0.9(t,＝7Hz,VLB H-21’),0.55(t,3H,J＝6.9Hz,VLBH-21)ppm。
EC1209:LCMS[ESI(M+H)+:1918]。1所选择的EC145的1H NMR数据(D2O,300MHz):δ8.67(s,1H,FA H-7),7.50(br s,1H,VLB H-11’),7.30-7.40(br s,1H,VLB H-14’),7.35(d,2H,J＝7.8Hz,FA H-12&16),7.25(m,1H,VLB H-13'),7.05(br s,1H,VLB H-12’),6.51(d,2H,J＝8.7Hz,FAH-13&15),6.4(s,2H,VLB H-14&17),5.65(m,1H,VLB H-7),5.5(m,1H,VLB H-6),4.15(m,1H,VLB H-8’),3.82(s,3H,VLB C18’-CO2CH3),3.69(s,3H,VLB C16-OCH3),2.8(s,3H,VLB N-CH3),1.35(br s,1H,VLB H-3'),1.15(m,1H,VLB H-2’),0.9(t,3H,J＝7Hz,VLB H-21’),0.55(t,3H,J＝6.9Hz,VLB H-21)ppm。
EC1575：将EC1577(9.5mg)在20mM pH 7磷酸盐缓冲液(2.0mL)中的溶液和饱和NaHCO3溶液(0.50mL)依次添加到EC0312(10.1mg)在MeOH(2.0mL)中的溶液中。在环境温度下在氩气下将所得的均匀溶液搅拌20min，并且然后将其直接装载到制备型HPLC上(流动相A＝50mM NH4HCO3缓冲液，pH＝7.0，B＝CAN，方法：5％-80％B，在20min内)，以进行纯化。收集含有所希望的产物的级分，将其组合，并且冷冻干燥，以获得作为一种淡黄色固体的产物(9.5mg)。LCMS[ESI(M+H)+:2627]。1H NMR(D2O,300MHz):8.70(s),8.11(s),7.62(d),7.00(d),6.71(dd),6.11(d),5.80(d),5.33(d),4.60-4.50(m),4.40-4.15(m),3.88-3.51(m),3.50-3.20(m),3.19-2.80(m),2.76(s),2.60-1.43(m),1.40-1.27(m),1.18(d),1.02(d),0.97-0.82(m),0.76-0.63(m)。
EC1548：将EC1544(55.1mg)在20mM pH7磷酸盐缓冲液(1.95mL)中的溶液和饱和NaHCO3溶液(0.30mL)依次添加到EC 1248(58.0mg)在MeOH(2.30mL)中的溶液中。在环境温度下在氩气下将所得的均匀溶液搅拌20min，并且然后将其直接装载到制备型HPLC上(流动相A＝50mM NH4HCO3缓冲液，pH＝7.0，B＝CAN，方法：5％-80％B，在20min内)，以进行纯化。收集含有所希望的产物的级分，将其组合，并且冷冻干燥，以获得作为一种淡黄色固体的产物(61.5mg)。MS(ESI,M+1)1993
EC1549：将EC1547(23.5mg)在20mM pH 7磷酸盐缓冲液(2.0mL)中的溶液和饱和NaHCO3溶液(0.30mL)依次添加到EC1248(24.7mg)在MeOH(2.3mL)中的溶液中。在环境温度下在氩气下将所得的均匀溶液搅拌20min，并且然后将其直接装载到制备型HPLC上(流动相A＝50mM NH4HCO3缓冲液，pH＝7.0，B＝CAN，方法：5％-80％B，在20min内)，以进行纯化。收集含有所希望的产物的级分，将其组合，并且冷冻干燥，以获得作为一种淡黄色固体的产物(29.2mg)。MS(ESI,M+1)1993
实例.
EC1349
实例.EC1299
将EC0259(35mg)在20mM pH 7磷酸盐缓冲液(3.0mL)中的溶液和饱和NaHCO3溶液(1.5mL)依次添加到EC0312(39mg)在ACN(5.5mL)中的溶液中。在环境温度下在氩气下将所得的均匀溶液搅拌20min，并且然后将其直接装载到制备型HPLC上(流动相A＝50mM NH4HCO3缓冲液，pH＝7.0，B＝ACN，方法：5％-80％B，在20min内)，以进行纯化。收集含有所希望的产物的级分，将其组合，并且冷冻干燥，以获得作为一种淡黄色固体的产物(25mg)。MS(ESI,M+1)1993
实例.
实例.
实例.
EC153:MS(ESI,[M+H]+)1023；(ESI,[M-H]-)1021；1H NMR(DMSO-d6,300MHz):8.84(s,1H),7.70(d,2H),6.80(d,2H),4.60(m,1H),4.56(s,2H),4.34(m,2H),4.10(m,2H),3.85(m,2H),3.60-3.30(m,5H),3.20(s,2H),318-3.05(m,1H),3.0(br,2H),2.90-2.70(m,2H),2.40-2.00(m,4H),1.95(m,3H)，
实例.以下化合物根据在此所述的过程由EC0059开始制备：
实例.EC1391
实例.EC1390
实例.
EC74:MS(ESI,[M+H]+)1438.3；(ESI,[M-H]-)1436.4比较例.披露了以下比较性化合物：
比较例.
EC0746(C87H122N26O40S2；MW 2236.18)
比较例.
EC0531(C110H165N23O45S3；MW 2625.81)
比较例.EC0923.
EC0923(C27H29N9O12；MW 671.57)
方法和实例
总述.在此使用以下缩写：部分响应(PR)；全响应(CR)、每周三次(M/W/F)(TIW)。
方法.相对亲和力测定。叶酸受体(FR)相对于叶酸的亲和力根据具有微小修改的一种以上所述的方法进行测定(韦斯特霍夫G.R.(Westerhof,G.R.)，J.H.Schornagel等人，(1995)分子药理学(Mol.Pharm.)48:459-471)。简而言之，将FR-阳性KB细胞大量接种到24-孔细胞培养板上并且将其粘接到塑料上，持续18h。在浓度增加的测试物体或叶酸不存在和存在下，在指定孔中用补充有100nM 3H-叶酸的无叶酸型RPMI(FFRPMI)替换废的培养基。在37℃下将细胞孵育60min并且然后用pH 7.4PBS冲洗3次。每孔添加五百微升PBS中的1％SDS(pH 7.4)。然后收集细胞裂解物并且将其添加到含有5mL闪烁混合液的单个小瓶中，并且然后进行放射活性计数。阴性对照管仅包含FFRPMI中的3H-叶酸(无竞争物)。阳性对照管包含最终浓度1mM的叶酸，并且从所有样品中减去在这些样品中测量的CPM(表示标签的非特异性结合)。相对亲和力被定义为置换50％结合KB细胞上的FR的3H-叶酸所需要的化合物反摩尔比，其中叶酸对于FR的相对亲和力被设为1。
实例.EC1669显示针对叶酸受体的高结合亲和力，如通过体内竞争性结合测定所确定的，该测定测量了配体与3H-叶酸竞争以结合细胞表面叶酸受体(FR)的能力。EC1669()。EC1669的相对亲和力值(标准化地针对叶酸，它被设为(1))测定为在KB和CHO-FRβ细胞上分别是0.53和0.13(参见图1A和图1B)。在比较时，甲氨蝶呤(MTX)显示与细胞表面FR的不良结合。在不希望受到理论约束的情况下，在此认为EC1669的高结合亲和力允许通过FR-介导的内吞作用进行有效细胞摄取。
方法.细胞DNA合成的抑制。使用体外细胞毒性测定评价在此所述的化合物，该测定预测了药物抑制叶酸受体阳性细胞如KB细胞、RAW264.7、巨噬细胞等生长的能力。应理解，可以基于那些选择的细胞对于形成缀合物的药物的敏感性来选择细胞类型。这些测试细胞包含连接到一种对应化学治疗剂的叶酸，如根据在此所述的方法制备的。使这些测试细胞暴露于不同浓度的叶酸-药物缀合物，并且也在至少100倍过量叶酸不存在或存在下评定对叶酸受体介导特异的活性。
实例.在此所述的细胞毒性药物的缀合物具有针对KB细胞的活性。该活性使通过叶酸受体介导的，如通过实验联合给予的叶酸的竞争性实验所指示的。在至少100倍过量叶酸不存在或存在下，在37℃下持续多至7h将KB细胞暴露于指定浓度的叶酸-药物缀合物。然后将这些细胞用新鲜培养基冲洗一次，并且在37℃下在新鲜培养基中孵育72小时。使用一种3H-胸苷结合测定评定细胞生存力。对于在此所述的化合物，剂量依赖的细胞毒性通常是可测量的，并且在大部分情况下，IC50值(将结合新合成的DNA的3H-胸苷减少50％所需要的药物缀合物浓度)是处于低纳摩尔范围内。尽管并未受到理论约束，当在过量叶酸存在下减少这些缀合物的细胞毒性时，在此认为此类结果指示所观察到的细胞死亡时通过结合叶酸受体来介导的。
实例.EC1669显示针对鼠RAW264.7巨噬细胞的一个有效细胞抑制作用。在2-h暴露和总计72h孵育之后在对RAW264.7细胞进行的XTT细胞生存力测定(图2)中测量EC1669的抗增殖活性。RAW264.7巨噬细胞对形成EC1669缀合物的药物氨喋呤敏感。根据制造商说明通过添加XTT(2,3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺酸基-苯基)-2H-四唑-5-酰苯胺)来测定细胞生存力。EC1669显示相对IC50值是约1.2nM的剂量依赖性细胞增殖抑制。在100倍过量叶酸(FA)存在下所观察到抗增殖作用是100％可竞争的，这指示EC1669的FR特异性作用模式。
方法.针对不同癌细胞系的体外活性。生成不同细胞系的IC50值。将细胞大量接种在24-孔福尔肯(Falcon)板并且允许整夜形成接近融合的单层。在添加测试化合物之前三十分钟，从所有的孔中吸出废培养基并且用新鲜叶酸缺乏型RPMI培养基(FFRPMI)替换。一个子组的孔被指定为接收含有100μΜ叶酸的培养基。在指定的孔中的这些孔用于测定靶向特异性。在不受理论约束的情况下，在此认为在过量叶酸存在下通过测试化合物产生的细胞毒素活性(即，其中存在对于FR结合的竞争性)与和FR特异性递送不相关的总活性的一部分相对应。在用1mL含有10％加热失活的胎牛血清的新鲜FFRPMI冲洗一次之后，在所指示的100μΜ游离叶酸存在或不存在下每个孔接收1mL含有增加的浓度测试化合物(每种样品4个孔)的培养基。在37℃下使处理的细胞脉冲2h，将其用0.5mL培养基冲洗4次，并且然后在1mL新鲜培养基中追踪(chased)多至70h。从所有孔中吸出废培养基并且用含有5μCi/mL 3H-胸苷的新鲜培养基替换。在另外进行2h 37℃孵育之后，将细胞用0.5mL PBS洗涤3次并且然后用每孔0.5mL冰冷却的5％三氯乙酸进行处理。在15min之后，吸出三氯乙酸并且通过添加0.5mL 0.25N氢氧化钠来溶解所有细胞物质，持续15min。将450μL等份的每种溶解的样品转移到含有3mL Ecolume闪烁混合液的一个闪烁管中并且然后以液体闪烁计数器进行计数。最终结果被表示为3H-胸苷结合相对于未处理对照的百分比。
实例.在此所述的化合物表现出针对病原细胞如KB细胞的有效体外活性。在此所述的化合物与不包含至少一个非天然氨基酸的化合物相比表现出对于叶酸受体的更大特异性。例如，EC1456表现出对于叶酸受体的约1000-倍特异性，如通过叶酸竞争所确定的(特异性＝竞争组与非竞争组之间的IC50差值)以及与比较性化合物EC0531相比4倍的特异性提高，该比较性化合物EC0531不包含具有非天然氨基酸的一个接头L。
实例.对于表达叶酸受体的细胞的选择性。在此所述的化合物显示出对于表达叶酸受体的细胞的高活性。在此所述的化合物并不显示显著结合叶酸受体阴性细胞。EC1456显示与表达低和高FR的细胞(FR+)的高竞争性结合，并且并不显示与不表达FR的细胞(FR-)的结合。
EC1456在(FR+)和(FR-)细胞系中的活性
(a)由0.1-100nM评价针对这些特异性选择(FR-)的细胞系(A549、H23、HepG2、AN3CA、LNCaP)的活性；NA＝不适用。
方法.在小鼠中的肿瘤生长的抑制。四周至七周大的小鼠(Balb/c或nu/nu品系)是从哈伦斯普拉格道利公司(Harlan Sprague Dawley,Inc.)(印第安纳波利(Indianapolis)，印第安纳州(IN))购买的。正常的啮齿动物食物包含高浓度的叶酸(6mg/kg食物)；因此，在肿瘤种植之前持续约1周用一种无叶酸膳食(哈伦膳食#TD00434)喂养测试动物，以实现接近于正常人血清范围的血清叶酸浓缩，并且在该方法的过程中也如此喂养。对于肿瘤细胞接种，将Balb/c品系的1×106M109细胞(同源肺癌)或者nu/nu品系的1×106KB细胞以100μL注入到背内侧区域(右腋下)的皮下组织。每2-3天使用卡尺在两个垂直方向上测量肿瘤，并且它们的体积被计算为0.5×L×W2，其中L＝以mm计的最长轴的测量值并且W＝以mm计算的垂直于L的轴的测量值。然后根据公开的程序计算细胞杀伤对数(LCK)值和治疗相对于对照(treated over control)(T/C)值(参见，例如李(Lee)等人，“BMS-247550：具有类似于紫杉醇的作用模式并具有优越抗肿瘤功效的新的埃博霉素类似物(BMS-247550:a novel epothilone analog with amode of action similar to paclitaxel but possessing superior antitumorefficacy)”临床癌症研究(Clin Cancer Res)7:1429-1437(2001)；罗斯(Rose)，“基于紫杉酚的组合化学疗法和体内临床前抗肿瘤研究(Taxol-based combination chemotherapy and other in vivo preclinicalantitumor studies)”美国癌症研究所杂志(J Natl Cancer Inst Monogr)47-53(1993))。
在皮下肿瘤具有50-100mm3之间的平均体积(t0)时开始给药，典型地对于KB肿瘤在肿瘤接种之后(PTI)8天，并且对于M109肿瘤是PTI 11天。用不同剂量(如1μmol/kg至5μmol/kg)的药物递送缀合物或等效剂量体积的PBS(对照)静脉内注射测试动物(5只/组)，通常每周三次(TIW)，持续3周，除非另外指示。给药溶液以PBS每日新鲜制备并且通过小鼠的侧尾静脉给予。
方法.一般4T-1肿瘤测定。从印第安纳州印第安纳波利斯哈伦公司(Harlan,Inc.,Indianapolis,IN)获得六周至七周大的小鼠(雌性Balb/c品系)在该方法开始之前和该方法的过程中持续总计三周用哈伦氏无叶酸食物喂养小鼠。在右腋下的皮下组织接种叶酸受体阴性4T-1肿瘤细胞(每只动物1×106个细胞)。肿瘤接种后约5天，当该4T-1肿瘤平均体积是约100mm3(t0)时，用不同剂量如3μmol/kg的药物递送缀合物或者用等效剂量体积的PBS(对照)静脉内注射小鼠(5只/组)，每周三次(ΤIW)，持续3周，除非在此另外指示。在每个治疗组，以2天或3天间隔使用卡尺测量肿瘤生长。使用等式V＝a×b2/2计算肿瘤体积，其中“a”是肿瘤的长度并且“b”是以毫米表示的宽度。
方法.药物毒性。通过经由心脏穿刺收集血液并且提交血清用于独立分析血尿素氮(BUN)、肌酸酐、总蛋白质、AST-SGOT、ALT-SGPT加上Ani-Lytics公司(盖瑟斯堡(Gaithersburg)，MD)的标准血液血细胞板评定持续的药物毒性。此外，通过委员会认证的病理学家在动物参考病理学实验室(Animal Reference Pathology Laboratories)(奥雅纳公司(ARUP)；盐湖市(Salt Lake City)，犹他州(Utah))进行福尔马林固定的心脏、肺、肝、脾、肾、小肠、骨骼肌和以及骨(胫骨/腓骨)的组织病理学评价。
方法.通过重量减轻所测量的毒性。在肿瘤接种后(PTI)所选择的几天和给药过程中测定测试动物的重量变化百分比。对这些结果进行绘图。
实例.针对肿瘤的体内活性。在此所述的化合物显示针对nu/nu小鼠的KB肿瘤的高效力和功效。在此所述的化合物显示针对表达叶酸受体的肿瘤的特异性活性，同时具有低宿主动物毒性。例如，EC1456当以1μmol/kgΤIW静脉内给予2周时在4/4只测试动物中显示全响应。EC1456也显示通过叶酸受体介导的特异性活性，如通过与过量可比较化合物EC0923(50或100μmol/kg)竞争所证明的，如图3A所示的。EC1456并未显示整体动物毒性的任何证据，如图3B所示的。
实例.评价EC1663针对人KB肿瘤的治疗性能。在图4A中的数据显示4/4部分响应，其中肿瘤体积与对照细胞显著减小，但是并未减小至零，并且该肿瘤在给药结束后开始再生。在此认为较高的剂量可以引起全响应和/或治愈。在图4B中的数据显示在给予的有效剂量下，并未观察到整体动物毒性。
方法.TNBC肿瘤测定。三阴型乳腺癌(TNBC)的一个亚型特征在于缺乏雌激素、黄体酮和Her2/neu的基因表达。TNBC难以治疗并且据报道所得的患者死亡率不成比例高于任何其他亚型的乳腺癌。以与在此所述的KB和M109模型类似的方式通过在nu/nu小鼠中植入MDA-MB-231乳腺癌来生成TNBC异种移植模型。当皮下肿瘤具有110-150(通常130)mm3的平均体积(t0)时，通常是在肿瘤接种后(PTI)17天，开始给药。用不同剂量(如1μmol/kg至5μmol/kg)的药物递送缀合物或等效剂量体积的PBS(对照)静脉内注射测试动物(5只/组)，通常每周三次(TIW)，持续2-3周，除非另外指示。给药溶液以PBS每日新鲜制备并且通过小鼠的侧尾静脉给予。
实例.当真的建立的三阴性FR-阳性皮下MDA-MB-231乳腺癌异种移植进行测试时，发现EC1456在每周三次(2个连续周的方案)给予的2μmol/kg静脉内剂量下具有高活性。该治疗产生4/5全响应，其中肿瘤体积减小至零，并且在近135天的观察窗过程中没有出现再生。在不受理论约束的情况下，在此认为测试动物的三阴性乳腺癌获得治愈。EC1456的结果显示在图5A中。在测试动物中抗肿瘤活性并未伴随显著的肿瘤减轻，如图5B所示的。
方法.人抗顺铂细胞系。通过在增加的顺铂浓度(100→2000nM；持续12个月的时段)存在下培养FR-阳性KB细胞来形成人抗顺铂细胞系。发现抗顺铂细胞(标记为KB-CR2000细胞)是致瘤性的，并且发现它们保持体内FR表达状态。证实KB-CR2000肿瘤对顺铂疗法具有抗性。用高的毒性剂量的顺铂(平均重量减轻10.3％，如图6B所示的)的治疗不会产生甚至单一部分响应(PR)，如图6A所示的。相反，发现EC1456具有针对KB-CR肿瘤的非常大的活性，其中观察到5/5CR。此外，仅在1/5只测试动物中观察到肿瘤的再生。在不受理论约束的情况下，在此认为4/5只测试动物的抗顺铂癌症获得治愈，其中在几乎70天的观察时段过程中没有出现再生。此外，与顺铂不同，EC1456在小鼠的此群组中并未引起任何重量减轻，并且因此在给药时段过程中不会表现出任何总动物毒性的证据。
实例.缀合药物和未缀合药物的比较。评价未缀合微管溶素B和未缀合TubB-H(EC0347)药物针对小鼠中的人KB肿瘤的治疗性能。将每种未缀合药物通过体重变化确定的抗肿瘤功效和总毒性与EC1456缀合物相比较。EC1456在此模型中产生剂量响应性抗肿瘤活性。在几乎没有至没有产生重量减轻的治疗条件下观察到全响应。相反，两种基于未缀合微管溶素的药物没有产生任何抗肿瘤响应，甚至在想小鼠给予非常大毒性的剂量时。这些结果示出在下表中。
*未治疗对照组具有2.4％的平均重量减轻
1组由于毒性而仅接受2个剂量。
这些结果证实尽管微管溶素B和TubBH对培养基中的细胞具有高细胞毒性(典型地IC50约1nM)，两种药剂在不会产生可测量的抗肿瘤作用的水平下在小鼠中产生剂量限制性毒性。因此，未缀合化合物不会表现出一个治疗窗。相反，药物的缀合形式如缀合的TubBH(EC1456)产生抗肿瘤响应而对具有良好建立的人肿瘤异种移植的小鼠不具有显著的毒性。在此所述的缀合为高毒性药物提供了一个治疗窗。
实例.在此所述的化合物表现出在10％血清/FDRPMI中与叶酸相比(相对亲和力＝1)相比的高叶酸受体亲和力、有效体外活性、有效体内活性、对叶酸受体的特异性、以及与未缀合药物相比的足够高的治疗指数。
(a)与叶酸相比；(b)通过胸苷掺入确定的；(c)测试化合物当与过量叶酸竞争时的IC50；该IC50越高，越多特异性是叶酸介导的；(d)体外特异性＝竞争组与非竞争组之间的IC50差值；(e)如在nu/nu小鼠的皮下KB肿瘤中测定的；CR＝全响应，其中如在此所定义的在观察时段过程中的肿瘤体积对于该组中的所有测试动物均是零；(f)母体微管溶素；NT＝未测试到。
方法.佐剂诱导性关节炎(AIA)模型。在关节炎诱导之前持续9-10天向雌性路易斯大鼠喂食叶酸缺乏型膳食(Harlan Teklad，印第安纳波利斯，印第安纳州)。通过真皮内接种(在尾根部)100μL轻矿物油(西格玛公司)中的0.4-0.5mg加热灭活的乳酪分枝杆菌(Mycobacteria butyricum)(BD诊断系统公司，斯帕克斯(Sparks)，马里兰州(MD))来诱导佐剂诱导型关节炎(AIA)。在关节炎诱导之后十天，使用修改的关节炎评分系统评定大鼠中的脚爪肿胀(关节炎程度)：0＝无关节炎；1＝在一种类型的关节中的肿胀；2＝在两种类型的关节中的肿胀；3＝在三种类型的关节中的肿胀；4＝整个脚爪的肿胀。每只大鼠的总分是通过汇总四只脚爪中每一只的得分来计算的，每只大鼠获得最大得分是16。在关节炎诱导后第10天，将具有≥2的总关节炎得分的大鼠从研究中去除并且其余大鼠均匀地分布于对照组合和治疗组中(对于所有组n＝5，除了健康对照组n＝2-3)。所有治疗均在第10天开始，除非另外指示。还放射线照相地评价大鼠脚爪，以评定并确定骨损害。
实例.在此所述的化合物是有效地治疗炎性疾病，如炎症和骨损害伴随的关节炎。EC1496是高效且有效地减少佐剂诱导型关节炎的大鼠模型的脚爪炎症，如图7所示的。图7显示EC1496是有效地基于脚爪肿胀的评价预防关节炎的发展。EC1496(迹线(d))显著不同于未治疗对照(迹线(b))。此外，该数据指示该作用是叶酸受体介导的，因为EC1496(迹线(d))也显著不同于竞争性对照组，在该竞争性对照组中EC1496与过量叶酸(迹线(d))组合给予。
实例.在此所述的化合物是有效地治疗炎性疾病，如炎症和骨损害伴随的关节炎。说明性地，EC1496是高效且有效地减少和/或预防佐剂诱导关节炎的大鼠模型中的骨损害，如通过放射线照相分析确定的。放射性照相显示治疗的动物并不表现出在未治疗对照动物中可见(基于视觉评分)的骨损害。反而，治疗动物和健康动物显示类似的骨结构。
实例.EC1669表现出针对佐剂型关节炎的叶酸受体特异性活性。在诱导之后9天开始，根据关节炎得分，患有发展的AIA的大鼠被分配为三组(n＝5)：(1)未治疗AIA对照、(2)EC1669治疗组、以及(3)EC1669加上EC0923竞争组。所有治疗均持续2个连续周。使AIA对照组中的这些动物保持未治疗。在EC1669治疗组中的这些动物以375nmol/kg的剂量每周给予两次皮下剂量的EC1669。在EC1669加上EC0923组中的这些动物以375nmol/kg剂量每周给予两次皮下剂量的EC1669连同以187.5μmol/kg剂量给予EC0923。研究端点示出在图8A、图8B、图9A、以及图9B，它们是：(a)关节炎得分；(b)体重变化；以及(c)脚爪肿胀度，通过脚爪重量增加百分比评定(在最后给药之后4天收集)；以及(d)骨放射线照相。发现EC1669高度有效地缓解脚爪肿胀(与对照相比缓解了约80％)和骨损害(与对照相比缓解了约80％)。EC1669的抗关节炎活性可与叶酸竞争物(EC0923)竞争(用其阻断)。
实例.在后一个给药研究中，评价不同的EC1669给药方案，包括1000nml/kg每周一次、250nmol/kg每周两次、以及500nmol/kg每周两次。意外的是，250nmol/kg每周两次给药优于1000nml/kg每周一次给药，总剂量减小两倍。发现EC1669在两周给药一次而不是每周给药一次时更有效地减少脚爪肿胀，与在1000nmol/kg siw下减少44％相比，在500nmol/kgbiw下减少81％，在250nmol/kg biw下减少64％。
实例.EC1669加上骁悉针对佐剂诱导型关节炎比单独的药剂更有效。骁悉是霉酚酸的一种前药，该霉酚酸是用于预防移植时的器官排斥的一种免疫抑制药物。骁悉在体内活化并且释放其活性产物，该活性产物可以抑制T细胞增殖并且干扰白血球粘附内皮细胞。为了测试EC1669和骁悉的组合作用，根据关节炎得分将患有发展的AIA的大鼠分配成四组(n＝5)：(1)未治疗的AIA对照、(2)EC1669对照组、(3)骁悉对照组、以及(4)EC1669和骁悉组合组。所有治疗均在AIA诱导之后第9天开始并且持续2个连续周。在AIA对照组中的这些动物是未治疗的。在EC1669治疗组中的这些动物以1000nmol/kg的剂量每周给予一次皮下剂量的EC1669。在骁悉治疗组中的这些动物以30mg/kg的剂量给予每日口服剂量的骁悉，每周5天。在EC1669和骁悉组合治疗组中的这些动物以1000nmol/kg的剂量每周给予皮下剂量的EC1669并且以30mg/kg剂量给予每日口服剂量的骁悉，每周5天。如图10A和图11所示的，EC1669和骁悉组合疗法比单独的药剂更有效地减小关节炎得分、脚爪肿胀度、以及由于疾病进展的重量减轻。图10B显示EC1669和骁悉组合疗法引起比单独给予的药物更低的毒性。
方法.胶原诱导型关节炎(CIA)模型。在用叶酸缺乏型膳食(HarlanTeklad，印第安纳波利斯，印第安纳州)喂养的雌性路易斯大鼠中诱导胶原诱导型关节炎(CIA)。在第0天，用500μg以弗氏完全佐剂配制的II型牛胶原蛋白(Chondrex，雷德蒙德(Redmond)，华盛顿州(WA))免疫大鼠。在第7天用250μg以弗氏不完全佐剂配制的牛胶原蛋白给予一个加强的免疫。通过制造商(Chondrex，雷德蒙德，华盛顿州)描述的一种定性临床评分系统评定关节炎疾病：0＝正常，1＝轻度但明显的红肿和踝关节或腕关节的肿胀或者明显的红肿和仅限于单个足趾的肿胀，不管受影响的足趾数目是多少，2＝中度红肿和踝关节或腕关节的肿胀，3＝重度红肿和整个脚爪(包括脚趾)的肿胀，并且4＝涉及多个关节的最严重红肿的肢。在第一次免疫之后第10天，大鼠均匀地分布于(根据关节炎得分)对照组和治疗组。在10-19天向CIA大鼠给予十个连续皮下剂量的测试化合物。对于每种药物，在第10天和第15天给予一个诱导剂量(例如，500nmol/kg)并且在第11-14天和第16-19天给予一个维持剂量(例如，100nmol/kg)。使关节炎对照组中的这些动物保持未治疗。关节炎得分和动物体重每周记录五次。
方法.动物实验性自身免疫葡萄膜炎模型。在用叶酸缺乏型膳食(HarlanTeklad，印第安纳波利斯，印第安纳州)喂养的雌性路易斯大鼠中诱导实验性自身免疫葡萄膜炎(EAU)。在第0天，用25μg以含有0.5mg接地结核分枝杆菌H37Ra的弗氏不完全佐剂配制的牛S-Ag PDSAg肽皮下免疫这些动物。在同一天通过腹腔内注射以每只动物1μg剂量给予纯化的百日咳毒素(PT)。在每只眼睛中的葡萄膜炎严重性是通过一种定性的视觉评分系统评定的：0＝无疾病，眼睛是半透明的并且反射光(红光反射)；0.5(微量)＝在虹膜中的血管扩张，1＝在虹膜中血管充盈，瞳孔收缩异常；2＝前房模糊，红光反射减小；3＝前房适度不透明，但瞳孔仍可见，红光反射迟钝；并且4＝前房不透明并且瞳孔模糊，红光反射缺乏，眼睛突出。此测定每只动物产生最大葡萄膜炎得分8。
实例.在此所述的化合物高效地治疗自身免疫葡萄膜炎。EC1669表现出针对自身免疫葡萄膜炎的叶酸受体特异性活性。将患有EAU的动物随机化并且分配成三组：(1)未治疗EAU对照(n＝11)、(2)测试化合物治疗组(n＝7)如EC1669、(3)测试化合物和竞争物化合物治疗组(n＝7)如EC1669加上EC0923、以及(4)阳性对照治疗组(n＝7)如甲氨蝶呤(MTX)。所有治疗均在EAU诱导之后第8天开始。在EAU对照组中的这些动物是未治疗的。在EC1669治疗组中的这些动物每隔一天(q2d)以250nmol/kg的剂量给予五次皮下剂量的EC1669。在EC1669加上EC0923治疗组中的这些动物每隔一天以250nmol/kg的剂量给予五次皮下剂量的EC1669加上以125μmol/kg的剂量给予作为叶酸竞争物的500倍过量的EC0923。在MTX治疗组中的这些动物每隔一天以250nmol/kg的剂量给予五次皮下剂量的MTX。以预定频率记录每只动物的葡萄膜炎得分和动物体重。在每日基础上使用眼底镜监控EAU的临床严重性并且每只眼睛以0至4的标准分等级，其中每只动物可能的最大得分是8。在第16天，使这些动物安乐死并且在福尔马林中固定大鼠眼球，以用组织学分析。如图12A所示，在疾病开始时的EC1669治疗以一种FR依赖的方式有效地减少EAU的症状并且其活性与皮下MTX竞争。对于包含含有至少一个非天然氨基酸的一个接头的在此所述的缀合物化合物没有观察到治疗相关的重量减轻，如图12B所示的。
实例.EC1496针对叶酸受体特异性自身免疫葡萄膜炎是高效且有效的，如图13A所示的。通过组织学评价组织，如图13B所示的。
方法.自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型。在大鼠中通过针对25μg以含有1mg接地结核分支杆菌H37Ra的CFA配制的豚鼠髓脂质碱性蛋白(MBP)进行免疫来诱导EAE。腹腔内给予百日咳毒素(1μg/大鼠)，以增强器官特异性自身免疫。在诱导之后8天开始，将大鼠分成4组：(1)未治疗对照(n＝8)、(2)测试化合物(n＝7)、以及(3)测试化合物加上竞争物化合物(n＝7)如EC0923竞争。所有治疗均在EAE诱导之后第8天开始。使EAE对照组中的这些动物保持未治疗。在测试化合物治疗组中的这些动物每隔一天(q2d)以250nmol/kg的剂量给予四次皮下剂量的测试化合物。在测试化合物加上竞争物化合物治疗组中的这些动物每隔一天以250nmol/kg的剂量给予四次皮下剂量的测试化合物加上以125μmol/kg的剂量给予作为说明性叶酸受体竞争物的500倍过量的竞争物化合物如EC0923。在每日基础上监控EAE的临床严重性并且每只动物以0至5的标准分等级。将EAE大鼠的上行性麻痹临床体征分成0-5个标准：0＝无疾病、0.5＝尾末端无力、1＝尾无力、2＝轻度下肢轻瘫；共济失调变弱的后肢；3＝中度下肢轻瘫；后肢轻瘫；4＝完全后肢瘫痪；5＝完全后肢瘫痪和失禁(安乐死)。在第16天，使这些动物安乐死并且在福尔马林中固定大脑和脊髓，以用组织学分析。
实例.在此所述的化合物高效地治疗实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)。EC1669表现出针对EAE的叶酸受体特异性活性。如图14A所示，在疾病开始时的EC1669治疗在EAE急性期有效地抑制神经症状。对于EC1669在单独给药时并未观察到治疗相关的重量减轻，如图14B所示的。通过叶酸受体竞争物EC0923阻断EC1669的治疗作用。
实例.EC1496针对EAE是高效且有效的，如图15所示的。对于EC1496在单独给药时并未观察到治疗相关的重量减轻。
方法.人血清稳定性。使用常规方案和方法测试在此所述的化合物在人血清中的稳定性。简言之，向测试动物给予测试化合物，例如通过皮下注射。随着时间监控缀合物以及任选一种或多种代谢物的血浆浓度。将这些结果绘制图表，以确定这些测试化合物和代谢物的Cmax、Tmax、半衰期、以及AUC。
实例.包含含有至少一个非天然氨基酸的一个接头的在此所述的缀合物化合物与不具有含有至少一个非天然氨基酸的一个接头的比较性缀合物化合物相比，在血浆中是更稳定的。通过皮下注射以500nmol/kg各自给予EC1495和EC0746(比较性化合物)。随着时间监控该缀合物和这些代谢物(氨蝶呤和氨蝶呤酰肼)的血浆浓度。EC1496显示比EC0746跟高的Cmax，分别如图16A和图16B所示的。此外，图16A和图16B显示在血浆中EC1496释放基本上小于EC0746所释放的药物。也如下表中所示的，游离药物作为母体氨蝶呤和酰肼衍生物(EC0470)释放。
在不受理论约束的情况下，在此认为该数据指示包含含有至少一个非天然氨基酸的一个接头的在此所述的化合物如EC1496表现出更大的血浆稳定性。此外，不包含含有至少一个非天然氨基酸的一个接头的比较例EC0746在大鼠中皮下给药之后释放比EC1496多2倍以上的药物。EC1496还显示比EC0746更高的Cmax，这引起更高的有效治疗剂量。最后，EC1496显示更短的半衰期。在不受理论约束的情况下，在此认为快速清除还可能引起较低的毒性，因为暴露于从在此所述的缀合物中过早释放的药物的持续时间与不包含含有至少一个非天然氨基酸的一个接头的化合物相比也将有所减小。
方法.血浆清除率。体内研究包括每个时间点最少3只测试动物，如大鼠。说明性地，向具有颈静脉导管的雌性路易斯大鼠(哈伦，常规啮齿动物膳食)给予一个单一皮下注射的测试化合物，例如500nmol/kg的EC1669。在以下时间点收集全血样品(300μL)：在注射之后1min、10min、30min、1h、2h、3h、4h、8h、以及12h。将血液样品置于含有在0.15％乙酸溶液中的1.7mg/mL K3-EDTA和0.35mg/mL N-马来酰基-β-丙氨酸(0.35mg/mL)的抗凝血剂管。血浆样品是通过以约2,000g离心作用3min并且保存在-80℃下来获得的。通过LC-MS/MS定量在血浆中的测试化合物和任何代谢物如分别为EC1669及其两种活性代谢物氨蝶呤(AMT)和AMT酰肼(EC0470)的量。
实例.EC1669在大鼠中皮下给予之后显示快速血浆清除。EC1669在血流中在数分钟内是可检测的，其中Cmax约472nM出现在给药后约30min，并且它维持一个平稳段直到注射之后60min为止。EC1669-衍生的AMT和EC0470以分别为27nM和21nM的类似Cmax值检测到，但是与EC1669Cmax相比有一个30-min的延迟。当EC1669本身从血液中快速清除时(其中清除半衰期是约37min)，两种代谢物的清除半衰期是其约2-3倍长，分别是66min(AMT)和112min(EC0470)。EC1669、AMT和EC0470的相应曲线下面积(AUC)值分别是52、5.9以及3.9nmol*min/mL。基于它们的AUC响应，评估在12h收集时段内在血浆中约15.8％活性药物暴露/释放(AMT加上EC0470)，如下表所示的。
在不受理论约束的情况下，在此认为对于在此所述的化合物如EC1669所观察到的快速血浆清除可能引起更低的宿主动物毒性，因为暴露于从在此所述的缀合物中过早释放的药物的持续时间与不包含含有至少一个非天然氨基酸的一个接头的化合物相比也将有所减小。
方法.药代动力学生物分布。在此部分中的研究包括每个时间点最少3只测试动物(小鼠)。在用叶酸缺乏型膳食喂养的雌性Balb/c小鼠中观察到测试化合物如3H-EC1669(在药物上标记)与阳性对照如3H-甲氨蝶呤(3H-MTX)相比的药代动力学生物分布。将化合物作为单一皮下(SC)注射以500nmol/kg给予。在不同时间点(如10min、30min、1h、2h、4h、8h、12h、24h、以及72h)收集全血(>300μL)连同各自约100mg的感兴趣的不同组织。将这些血液样品置于BD微量试管(肝素)并且将其离心(4,000g×3min，4℃)以分离血浆(>100μL)。用磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)洗涤2x其余红血细胞(RBC)质量，以获得RBC。将所收集的组织称重并处理以测定3H-EC1669和3H-MTX分布：血浆、RBC、心脏、肺、肝(最小的叶)、脾、肾(1)、肠(盲肠以上)、粪便物质(来自结肠)、肌肉、以及脑。
实例.在皮下给予之后3H-EC1669和3H-甲氨蝶呤的药代动力学生物分布的比较。在图17中示出比较性药代动力学生物分布(每克所注射剂量的百分比(％ID/g))。在给药后10min，通过肝捕获31％ID/g 3H-MTX。在血浆中发现3H-EC1669比3H-MTX多两倍(12％对比5.2％ID/g)。在整个取样时段过程中，在RBC、脾、肝、肠、以及粪便中的3H-MTX保留也一直高于3H-EC1669。在图18中对RBC数据绘图，显示3H-MTX保留高于EC1669。在不受理论约束的情况下，在此认为这些数据表明EC1669的肝脏清除显著不同于MTX，其中MTX优选通过肝清除。在不受理论约束的情况下，在此还认为这些数据表明EC1669的RBC摄取显著不同于MTX，这表明进入细胞的不同方法。据报道MTX非特异性地、典型地通过普遍存在表达的还原性叶酸载体(RFC)进入细胞。在此所述的化合物显示通过官能性叶酸受体特异性地进入细胞。在不受理论约束的情况下，在此认为RBC数据还支持在此所述的缀合物的叶酸受体介导的活性。
在后一个肾/肝分泌研究中，在皮下给予3H-EC1669或3H-MTX之前在6-h禁食的情况下在代谢笼中圈养小鼠。在给药后24h，在3H-EC1669给药动物的合并的尿中发现比3H-MTX给药的动物多约14％的放射性。相反，在3H-MTX给药的动物的合并的粪便中发现比EC1669给药的动物多两倍放射性。在不受理论约束的情况下，在此认为这些数据表明EC1669的肾肝清除率比率显著不同于MTX，其中EC1669优选通过肾而不是肝清除。据报道MTX引起作为主要副作用的肝中毒，特别是在长期使用之后。在不受理论约束的情况下，在此认为在此所述的化合物的优选肾清除将引起较少副作用如肝中毒。
实例.在此所述的化合物具有比不具有包含至少一个非天然氨基酸的一个接头的化合物更小的毒性。向叶酸缺乏型大鼠静脉内给予等效剂量的测试化合物。如图19所示的，包含含有至少一个非天然氨基酸的一个接头的在此所述的缀合物如EC1496具有比不包含该接头的相应缀合物如比较例EC0746更小的毒性。
实例.最大耐受剂量(MTD)。包含含有至少一个非天然氨基酸的一个接头的在此所述的缀合物化合物显示高MTD，这与不具有含有一个或多个非天然氨基酸的接头的化合物相比有所提高。通过在雌性斯普拉格-杜勒(Sprague-Dawley)大鼠中持续2周每周两次静脉内(i.v.,BIW,2wks)给予测试化合物。比较性化合物EC0531具有0.33μmol/kg的MTD，而EC1456具有至少0.51μmol/kg的MTD，提高65％，如图20所示的。在以MTD或低于MTD的EC1456给药的情况下没有观察到组织病理学变化。

Claims (46)

1.一种具有化学式B-L(D)X的化合物或其一种药学上可接受的盐，其中B是细胞表面受体结合和/或靶向配体的一个基团，D在每种情况下是一种独立地选择的药物的一个基团，x是选自1、2、3、4以及5的一个整数；并且L是包含一个或多个非天然氨基酸的一种多价可释放接头；并且其中B共价连接到L，并且L共价连接到每个D；并且
其中该化合物不是以下化学式中的任一种或其任何亚组或子组
和/或其中该化合物不具有以下化学式
和/或其中该化合物不是以下化学式中的任一种或其任何亚组或子组
和/或其中该化合物不是以下化学式中的任一种或其任何亚组或子组
和/或其中该化合物不具有以下化学式
和/或上述任何组合；
或其任何药学上可接受的盐。
2.如权利要求1所述的化合物，其中至少一个非天然氨基酸具有D-构型。
3.如权利要求1所述的化合物，其中至少一个非天然氨基酸选自D-丙氨酸、D-天冬氨酸、D-天冬酰胺、D-半胱氨酸、D-谷氨酸、D-苯丙氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-甲硫氨酸、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸、D-酪氨酸和D-鸟氨酸以及其任何氨基酸衍生物。
4.如权利要求1中任一项所述的化合物，其中L包含两个或更多个非天然氨基酸。
5.如权利要求1所述的化合物，其中L包含三个或更多个非天然氨基酸。
6.如权利要求1所述的化合物，其中L包含四个或更多个非天然氨基酸。
7.如权利要求1至6中任一项所述的化合物，其中该配体是一种叶酸受体结合配体。
8.如权利要求1至6中任一项所述的化合物，其中该配体是包含D-谷酰基的一种叶酸。
9.如权利要求1至6中任一项所述的化合物，其中L还包含一个或多个二硫键。
10.如权利要求1至6中任一项所述的化合物，其中L还包含一个或多个二价亲水性基团。
11.如权利要求1至6中任一项所述的化合物，其中L还包含一个或多个二价聚氧基团。
12.如权利要求1至6中任一项所述的化合物，其中L还包含一个或多个二价多羟基基团。
13.如权利要求12所述的化合物，其中这些多羟基基团中的至少一个具有以下化学式
CH2-(CH(OH))n-CH2-OH
其中n是选自1、2、3、4、5、以及6。
14.如权利要求1至6中任一项所述的化合物，其中L包含一个二价聚谷氨酸基团，其中至少一个谷氨酸与一个氨基多羟基基团形成一个酰胺。
15.如权利要求14所述的化合物，其中这些谷氨酸中的至少一个是D-谷氨酸。
16.如权利要求15所述的化合物，其中这些谷氨酸中的至少一个是未取代的D-谷氨酸。
17.如权利要求1至6中任一项所述的化合物，其中L包含一个二价聚(D-谷氨酸)基团，其中至少一个谷氨酸与一个氨基多羟基基团形成一个酰胺。
18.如权利要求1至6中任一项所述的化合物，其中L包含具有化学式(K-L)d的一个二价基团，其中K是一个二价D-谷氨酸基团，L是与一个氨基多羟基基团形成一个酰胺的一个二价L-谷氨酸基团，并且d是1、2、3或4。
19.如权利要求14所述的化合物，其中这些氨基多羟基基团中的至少一个具有以下化学式
NH-CH2-(CH(OH))m-CH2-OH
其中m是选自1、2、3、4、5、以及6。
20.如权利要求17所述的化合物，其中这些氨基多羟基基团中的至少一个具有以下化学式
NH-CH2-(CH(OH))m-CH2-OH
其中m是选自1、2、3、4、5、以及6。
21.如权利要求14所述的化合物，其中这些氨基多羟基基团中的至少一个具有以下化学式
NH-CH2-(CH(OH))m-R
其中m是选自1、2、3、4、5、以及6；并且R是H、烷基、环烷基或芳烷基。
22.如权利要求17所述的化合物，其中这些氨基多羟基基团中的至少一个具有以下化学式
NH-CH2-(CH(OH))m-R
其中m是选自1、2、3、4、5、以及6；并且R是H、烷基、环烷基或芳烷基。
23.如权利要求1至6中任一项所述的化合物，其中L包含具有以下化学式的一个二价基团
S-CH2CH2-O-C(O)。
24.如权利要求1至6中任一项所述的化合物，其中L包含具有以下化学式的一个二价基团
S-S-CH2CH2-O-C(O)。
25.如权利要求1至6中任一项所述的化合物，其中x是1。
26.如权利要求1至6中任一项所述的化合物，其中至少一种药物是一种细胞毒素剂。
27.如权利要求1至6中任一项所述的化合物，其中至少一种药物是一种癌症治疗剂。
28.如权利要求1至6中任一项所述的化合物，其中至少一种药物是一种微管溶素。
29.如权利要求1至6中任一项所述的化合物，其中至少一种药物是一种炎症治疗剂。
30.如权利要求1至6中任一项所述的化合物，其中至少一种药物是一种二氢叶酸还原酶抑制剂。
31.如权利要求1至6中任一项所述的化合物，其中至少一种药物是哺乳动物类雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的一种抑制剂。
32.如权利要求1至5中任一项所述的化合物，其中B-L是具有以下化学式的一个基团
33.如权利要求1至5中任一项所述的化合物，其中B-L是具有以下化学式的一个基团
34.如权利要求1至5中任一项所述的化合物，其中B-L是具有以下化学式的一个基团
35.如权利要求1至5中任一项所述的化合物，其中B-L是具有以下化学式的一个基团
36.如权利要求1至5中任一项所述的化合物，其中该化合物具有化学式EC1456
或其一种药学上可接受的盐。
37.如权利要求1至5中任一项所述的化合物，其中该化合物具有化学式EC1669
或其一种药学上可接受的盐。
38.一种包含如权利要求1至6中任一项所述的一种化合物连同一种或多种载体、稀释剂或赋形剂或其组合的药物组合物。
39.一种包含一个治疗有效量的如权利要求1至6中任一项所述的一种或多种化合物，任选地连同一种或多种载体、稀释剂或赋形剂或其组合的单位剂量或单位剂型组合物。
40.一种用于治疗一个宿主动物中的癌症或炎症的组合物，该组合物包含一个治疗有效量的如权利要求1至6中任一项所述的一种或多种化合物；或者一种包含一个治疗有效量的如权利要求1至6中任一项所述的一种或多种化合物，任选地还包含一种或多种载体、稀释剂或赋形剂或其组合的药物组合物。
41.如权利要求1至6中任一项所述的一种或多种化合物任选连同一种或多种载体、稀释剂或赋形剂或其组合在制造用于治疗一个宿主动物中的一种癌症或炎症的一种药物中的用途。
42.权利要求41的用途，其中该癌症是抗药性癌症。
43.如权利要求41所述的用途，其中该癌症是一种卵巢癌。
44.权利要求41的用途，其中该癌症是一种乳腺癌。
45.权利要求41的用途，其中该癌症是一种小细胞肺癌。
46.如权利要求41所述的用途，其中该癌症是一种肝细胞癌或肝细胞癌症。
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