CN104854458A

CN104854458A - 作为癌症标志的甲基乙二醛

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Publication number: CN104854458A
Application number: CN201380063100.2A
Authority: CN
Inventors: D·贝尔博姆; P·伊利加雷
Original assignee: Anticancer Therapy Research Association
Current assignee: Anticancer Therapy Research Association
Priority date: 2012-10-25
Filing date: 2013-10-25
Publication date: 2015-08-19
Anticipated expiration: 2033-10-25
Also published as: JP2016500821A; WO2014063743A1; RU2015119512A; JP6543193B2; DK2912465T3; ES2656896T3; CN104854458B; RU2666255C2; PT2912465T; TN2015000161A1; CA2889110A1; US20150301056A1; WO2014064283A1; MA38042B2; MA38042A2; MA38042A3

Abstract

本发明涉及可靠、灵敏和便利的癌症操作诊断和预后试验，通过测量和分析在人或动物受试者的细胞外液、细胞生物样品和/或组织中从具有代谢活性的癌细胞中产生的甲基乙二醛(MG)来进行。本发明应用用于MG测量的任意化学或免疫学体外方法，并且提供一种试剂盒，其用于癌症的早期检测、筛查和诊断；用于对癌症分期、用于预测癌症患者的存活可能性、用于监测对抗癌程序的治疗(包括预防和预防性治疗)响应和用于预测和早期检测恶病质。

Description

作为癌症标志的甲基乙二醛

本发明公开了用于人或动物受试者中癌症的新的、可靠的、灵敏的和便利的操作诊断和预后试验。发明人在本文中首次证实，具有癌症的受试者的生物样品中甲基乙二醛(methylglyoxal)(MG)的水平增加与具有代谢活性的癌细胞发育和进展高度正相关。这一结果强调，癌细胞产生和释放显著高于肿瘤和生物体细胞外液中正常细胞的MG的量，因此，能够从独特的血样中获得癌症的可靠和灵敏的诊断和预后试验。本发明由此涉及用于早期检测和诊断癌症以及用于在具有癌症的受试者中预后评价、监测和作出治疗决定的体外方法；其通过测量MG的存在来进行。

背景技术

随着在全世界被诊断为癌症病例数量的逐步增长和因该疾病晚期发现导致的死亡数量持续增高，鉴定用于早期检测和靶向治疗干预的新生物标志(biomarker)被广泛接受为对癌症预防和经治疗的癌症患者中的更好结果是决定性的。癌症是全世界第二位死亡率最高的原因，其中肺癌、结肠癌、乳腺癌(女性)、胰腺癌和前列腺癌(男性)最常见。

目前，最常用的癌症诊断和预后指示剂基于肿瘤的形态和组织学特征，因为没有可利用的具有足够用于诊断的灵敏度和特异性的血液生物标志；且仅存在少量生物标志用于癌症的治疗监测和预后评价。

美国食品与药品监督管理局(FDA)已经将生物标志定义为分子特征，它被客观测量和评价并且指示正常生物过程、致病过程或对治疗干预的药理学响应。这样的生物标志可以由肿瘤自身或身体对正常细胞转化成癌性的恶性压力作出响应而产生。根据美国国立癌症研究所(NCI)，生物标志可以用于癌症筛查、风险度评价、疾病的早期诊断、监测、预后评价、作出治疗决定和预测对疗法的响应。

然而，限制这种肿瘤学生物标志潜力的主要挑战在于，癌症发生和加速增长和肿瘤发展是复杂的过程，其涉及各种异常遗传和外遗传的分子事件和细胞相互作用。

恶性转化导致特异性和非特异性表型细胞特征(signature)改变，由此导致生物体中癌细胞的克隆选择和进展。此外，癌症可以因暴露于多种和不同环境致癌剂，例如化学物质、辐射和/或微生物中导致；尤其是在易感宿主中(Belpomme等人,Environ Res 2007；Irigaray和Belpomme,Carcinogenesis 2010)。

作为致癌过程的如此复杂性的结果，肿瘤在病因学和发病机制中广泛改变，因此，癌症由超过200种侵害超过60种人体器官的不同的疾病组成。这种复杂性也是为什么尽管许多生物测定寻找临床肿瘤终点与生物标志之间的相关性，但是仍然几乎没有临床有用的生物标志(这些生物标志有助于肿瘤科医生作出决定和患者护理)的原因，和无关键的可利用的可以检测所有甚至许多类型癌症的单一生物标志的原因。本发明通过提供新的单一生物标志协调了许多这些局限，所述生物标志允许通过在患者/受试者的生物样品中进行简单测量来检测许多类型的癌症。这种测量非常具有再现性；以便检测癌症，甚至在早期阶段。

本发明基本上在于测量代谢副产物甲基乙二醛(MG)的产生水平，其通过检测和定量来自受试者的生物样品中这种分子的量来进行。

图1是显示真核细胞中糖酵解代谢过程和甲基乙二醛(MG)形成的示意图。

能量的完整糖酵解途径是厌氧的(不使用氧)。需氧条件中的正常细胞进入Krebs三羧酸(TCA)循环而产生腺苷三磷酸(ATP)；而仍然在需氧条件下，Warburg效应引导许多癌细胞而不是进入Krebs TCA，从而增加糖酵解(即“需氧糖酵解”)。在糖酵解过程中，MG途径绕过传统的糖酵解恩布顿-迈耶霍夫-帕纳斯途径并且是代谢盲路(cul-de-sac)；因此，这种途径导致作为废物终产物/副产物的MG和D-乳酸盐形成，而糖酵解恩布顿-迈耶霍夫-帕纳斯途径导致丙酮酸盐形成，然后在需氧条件中导致Krebs TCA或在厌氧条件中由丙酮酸盐形成L-乳酸盐。作为在许多癌细胞中的情况，Krebs TCA或呼吸链中的任何缺陷通过二羟丙酮磷酸盐形成增加来增加糖酵解以补偿ATP产生和随后的MG形成。

图1bis显示人癌细胞系(HCT16)的培养基中MG的产生取决于在培养基中存在低或高葡萄糖浓度。通过使用液相色谱法-串联质谱法(LC-MS/MS)分析对条件培养基(CM)进行MG定量。相对于在低葡萄糖条件而言，在高葡萄糖条件下，癌细胞产生10倍更高的MG，发现如下启示，癌细胞的MG合成和释放直接取决于葡萄糖消耗和代谢。

图2显示通过使用直接组织分析、用MALDI-TOF/TOF质谱法在恶性PRO细胞克隆中的MG产生。PRO细胞克隆最初得自由1,2-二甲肼施用诱导的结肠腺癌。在不染色和分别使用扫描1和2中的苏木精-曙红-Safran(HES)染色后表示肿瘤。用MALDI-TOF/TOF质谱法的MG瘤内检测表示在分别得自91Da和118Da 2MQX分子碎片分析的扫描3和4中。注意在坏死区中，在1和2中肿瘤的中部和下部中占优势，3和4中的MG显然较少被检测到，而显然主要在用HES高度着色的一些区域中检测到。

图3显示具有癌症的患者中MG血液水平与肿瘤阶段之间的显著正相关性。无论癌症阶段如何，大多数MG血液水平值均高于0.06μM的MG的正常(非癌性的)对照值(p＝0.0109)，表明血液中的MG的全身测量是诊断癌症的有效工具；关键是能够便利和早期检测和筛查。

图4显示癌症患者与对照组(正常受试者或血糖正常的(经治疗的)2型糖尿病患者)之间血液MG与血糖比率(MG/G指数)的差异(p<0.01)。注意在正常对照组与具有正常血糖的经治疗的2型糖尿病的受试者之间的MG血液水平无显著性差异。

图5公开了植入PRO致瘤的癌性结肠细胞后发育的BD-IX大鼠中MG血液水平与肿瘤体积之间的显著正相关性(p<0.001)。PRO和REG细胞克隆最初来源于BD-IX大鼠中1,2-二甲肼诱导的单一结肠腺癌。

图6显示当皮下注入同系宿主时，PRO细胞如亲代细胞诱导进行性肿瘤，而REG细胞诱导在3周后退化的肿瘤。PRO细胞的肿瘤移植物与肿瘤体积的恒定进展相关，因此，注意到MG血液水平与肿瘤体积之间的正相关性；移植后3周，存在MG血液水平恒定进展。移植后3周REG癌细胞的肿瘤移植物被排斥，而血液中的MG在整个实验期间保持在低水平。通过比较使用PRO致瘤的癌细胞克隆得到的结果(图5)，这启示活跃进展的癌症且更具体地是增殖性致瘤的癌细胞合成大量MG；而无进展的癌症、更具体地是无增殖性无致瘤的癌细胞则不能。

图7显示在癌症患者(B)中，MG血液水平与体重指数(BMI)(p＝0.0064)显著成负相关性；而MG与BMI在正常受试者中不存在相关性(A)。这表明MG由癌细胞产生。

图8显示在癌症患者中，胰岛素/葡萄糖比率(I/G)指数与MG血液水平之间存在显著的负相关性，而在正常健康受试者中的I/G指数保持恒定。因此，2种曲线的交叉点允许临界点的个体化，此时0.2μM血液MG水平称作“恶病质-相关的对照值”，高于它，胰岛素抵抗更高，而胰岛素分泌更低(相对于正常受试者而言)；使得癌症患者正在进入恶病质或严重前-恶病质。

表1显示与用作对照组的正常受试者和具有正常血糖的经治疗的2型糖尿病的患者相比，癌症患者中的MG血液水平平均值(±标准误差和置信区间)(以μM计)。

表2显示根据肿瘤类型与用作对照组的正常受试者和具有正常血糖的经治疗的2型糖尿病的患者相比，癌症患者中的MG血液水平平均值(±标准误差和置信区间)(以μM计)。

表3公开了根据临床响应在治疗的癌症患者中MG血液水平的平均值(±标准误差)(以μM计)；即，完全响应、部分响应或稳定/进行性疾病，正如通过使用成像技术的直接临床肿瘤和/或肿瘤测量值确定的。在具有如通过传统成像技术确定的显著完全临床响应的2位患者中，MG血液水平高于正常值。在这2位患者中，癌症在3和7个月后复发。

表4公开了根据其BMI在治疗的不同癌症患者中MG血液水平的平均值(±标准误差)(μM)。3种BMI类别之间的差异具有高度的统计学显著性，且前-恶病质或恶病质状态(BMI<18)与显著更高的MG血液水平相关(相对于具有超重/肥胖癌症(BMI>25)的患者而言)。

生物样品：本文所用的术语“生物样品”是指得自患者或正常个体的各种样品类型，其用于诊断性监测试验。所述生物样品包括任意的细胞外液，例如血液、血清、血浆、尿或其它液体样品，例如唾液、腹膜液或胸膜液、脑脊髓液、胃液或结肠直肠流体、淋巴液、滑液、间隙液、羊膜液、生理分泌物、泪液、粘液、汗液、乳、精液、阴道分泌物和来自溃疡和其它表面渗出的流体。它们也可以是实体组织，例如肿瘤或器官和例如得自子宫颈、骨髓、淋巴结等的细胞涂片。术语“生物样品”还包括构成生物体内胞外隔室的胞外基质和细胞外液。它不仅包括临床样品，而且包括细胞培养物和组织培养物和来源于它们的细胞及其子代。

甲基乙二醛：在本发明中，“甲基乙二醛”是指如下发现，癌细胞产生并且释放显著高于正常细胞所产生和释放的量的甲基乙二醛(MG)，由此可以在生物体的肿瘤和细胞外液中(特别是在MG从癌细胞中释放后的外周血液中)测量和定量MG。

通过体外测量自然存在于生物体中的游离MG部分或通过测量游离MG的总量证实样品中的MG，所测得的游离MG总量相当于自然存在于样品中的除可以从通过已使用与Chaplen类似或相同的技术处理样品后可逆配体结合的MG中回收的MG之外的游离MG(Chaplen等人,Anal Biochem 1996；Chaplen等人.,PNAS 1998)。最初研发这样的方法是为了测量胞内可逆配体-结合的MG。

因此，通过本发明方法测量其水平的MG相当于在个体肿瘤或体液中、更特别是在外周血液中测量的游离MG分子水平，其原因在于，它可以使得临床应用生物标志极为简便。然而，如上所示，本发明的方法不仅唯一依赖于自然存在于生物体肿瘤或胞外隔室中的游离MG的测量值，而且还依赖于在体外处理可逆配体-结合的MG之后回收的游离MG的测量值。然而，当术语“MG”、“MG产生”或“MG产生水平”在本文中未进一步定义使用时，MG水平相当于被视为自然存在于样品中的游离分子，而不相当于可以从样品中回收的游离MG总量，不过，其测量值也包括在本发明中。

术语“生物样品”包括其取得后以任意方式操作的样品。

可以在MG分析前“处理”所述生物样品，例如通过：由血液制备血浆；从样品中消除细胞或使得细胞群富集；稀释粘液流体等。本发明的方法可以包括过滤、蒸馏、浓缩、使干扰化合物失活、细胞裂解；例如通过超声处理、添加试剂、细胞固定或实体组织固定，然后进行MG分析。所谓MG分析前经处理的样品的实例使用用于回收胞内和/或胞外可逆配体结合的MG的技术(Chaplen等人,Anal Biochem 1996；Chaplen等人,PNAS 1998)。

受试者、个体、患者：本文所用的术语“受试者”或“个体”是指任意年龄或性别的无论是健康的还是患有疾病的人(或动物)；而术语“患者”是指具有疾病的受试者或个体，例如具有癌症或糖尿病的患者。

术语'健康受试者'和'健康个体'是指已经通过使用常规的医学检验证实无任何可检测到的疾病的无症状受试者或个体。更精确地，这些术语是指已经证实无癌症、糖尿病、慢性尿毒症、动脉高血压和阿尔茨海默病的人。

癌症或白血病：这些术语是指肿瘤，其细胞存在异常恶性表型，其特征在于在生物体中主要包括自主生长和细胞增殖调节缺失的严格公认和经验证的标志。近来更精确地综述和分析了这些标志(Hanahan和Weinberg,Cell 2011)。相反，术语“肿瘤”是指可以存在恶性或非恶性表型的细胞。术语“良性肿瘤”用于表征这样的肿瘤，其增殖能力保持受限，因为细胞不包含恶性表型。

对有关通过本发明方法鉴定的癌症类型没有特别限制；它们包括实体癌和非实体癌，包括上皮或非上皮类型。

上皮来源的癌症包括所有组织学类型，例如腺癌和鳞状细胞癌；和所有局部化癌，例如头颈癌(即口腔、舌、口咽、咽、喉等)、支气管和肺癌、乳腺癌、胃癌、结肠直肠癌、胰腺癌、肝癌(和所有其它消化道类型)、宫颈和子宫内膜癌、卵巢癌、泌尿生殖器癌(前列腺癌、膀胱癌、肾癌)等。非上皮癌主要在于任意类型的白血病、淋巴瘤、黑素瘤或肉瘤。

通过本发明也可以鉴定其它癌症。例如，睾丸癌症、无性细胞瘤、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、间皮瘤、尤因肉瘤、儿童癌症和HIV-相关肿瘤等。

所谓癌症的“早期检测”在本文中应理解为是指无症状受试者中确定的亚临床的(无明显可诊断的)显微镜可见的已经具有代谢活性的癌症的检测或鉴定。

所谓癌症的“筛查”应理解为是指在无症状个体群体中具有代谢活性的癌症或癌前期病变的全身检测。

所谓癌症的“诊断”应理解为是指在有症状患者中已经具有肉眼可见的进行性癌症的检测。本发明的检测/诊断方法由此专用于检测所谓的癌前期病变，这些病变可以在组织活检中证实，但可能不一定发展至确切的具有代谢活性的显微镜可见的癌症。而本发明易于且可靠地检测到确切增殖和进行性癌症。这可能以亚临床的显微镜可见的病变的形式发生在无症状受试者中或以更晚期的病变的形式发生在有症状受试者中，然后可以通过通常可利用的临床诊断工具所证实。由于MG水平涉及发展中的癌细胞的代谢活性，所以本发明的检测/诊断方法不仅可以用于在无症状受试者中筛查具有代谢活性的癌症，而且可以用于在有症状受试者中的增殖性癌症的发展，且由此在这样的受试者中评估癌症将临床进展的可能性；然后可以通过通常可利用的临床工具证实癌症进展。

本文所用的术语“MG正常对照值”或“MG参比值”是指已经从正常的无疾病的受试者、特别是无癌症和无糖尿病受试者(即健康供体)测定的特定值和/或数值区间。本文所用的0.6μM±0.02的正常对照值是来自健康供体的全血中的通过高效液相色谱法(HPLC)、根据下述方法测量的MG产生水平的平均值。因此，在一个优选的实施方案中，所述正常对照值是已经在来自未患癌症或糖尿病且也无其它疾病的受试者的生物样品–优选血样–中测量的MG产生水平。参比值可以是单一总计值，例如中位值或平均值；或可以是受试者特定亚群的不同值。本领域技术人员会理解，测试样品中MG的产生水平与MG对照值之间的比率取决于使用的对照值的类型。

本发明的方法能够使得医学或生物医学专业人士确定非糖尿病受试者是否存在高或低的具有癌症的风险度。评估这种癌症可能性与测试受试者中MG的产生水平成正比，其值高于正常对照值。

认为当所述生物样品中的MG产生水平高于所述正常对照值时，非糖尿病受试者存在“具有癌症的高风险度"：即尽管癌症可以或不可以通过通常可利用的诊断工具检测到，但是受试者在采集生物样品时存在具有癌症的高风险度。换句话说，当测试受试者中的MG产生水平高于MG正常对照值时，认为受试者具有高于正常群体的存在癌症的可能性。更具体地，在本发明的上下文中，当他/她具有高于50％、优选70％、更优选90％、理想地95％的存在癌症的可能性时，认为受试者存在"具有癌症的高风险度”。

相反，当测试受试者的生物样品中的MG产生水平处于正常对照值区间范围内或更不必说(fortiori)当MG产生水平低于正常对照值区间的下限时，存在癌症的风险度低。这意味着受试者在生物样品采集时具有存在癌症低概率或不发生癌症。

在本发明的上下文中，当他/她与正常群体相比具有低于10％、优选低于5％的存在癌症可能性时，受试者具有存在癌症的低风险度。换句话说，受试者具有90％、优选95％的无癌症可能性。在本发明的上下文中，认为受试者样品中的MG产生水平“显著高于”或“高于”对照值，此时所述MG水平是所述对照值1.5倍、更可靠地其2倍、最可靠地其3倍。认为受试者具有存在癌症的高风险度(典型地在50％-80％风险度)，此时其MG产生水平是所述对照值2倍。当其MG产生水平是所述对照值3倍时，癌症风险度甚至更高(典型地在80％-100％风险度)。相反，认为测试受试者的MG产生水平“显著低于”或“低于”对照值，此时所述MG水平是所述对照值三分之二、优选二分之一、更优选三分之一。相反，认为受试者具有存在癌症的低风险度(典型地在20-50％风险度)，此时其MG产生水平是所述对照值二分之一，且甚至更低风险度(典型地在0-20％风险度)，此时其MG产生水平低于所述对照值三分之一。最终，如果所述MG产生水平与所述MG对照比率在0.8-1.2，优选0.9-1.1，更优选0.95-1.05，则认为测试受试者的MG产生水平“与对照值类似”。

葡萄糖是具有式C₆H₁₂O₆或H-(C＝O)-(CHOH)₅-H的单糖，其5个羟基(OH)基团特别地排列在其6-碳骨架上，通常称作环。在其短暂的链形式中，葡萄糖分子具有6个碳原子的开放的(与环相对)和无支链骨架，C-1-C-6；其中C-1是醛基H(C＝O)-的组成部分，且另外5个碳各自带有1个羟基–OH(骨架碳的其余键被氢原子–H饱和)。

在基于水的溶液中，葡萄糖的开链形式('D-'或'L-'手)以与几种环状异构体(葡萄糖)平衡的形式存在，它们各自包含被1个氧原子封闭的碳环。在水溶液中，超过99％的葡萄糖作为吡喃糖存在。开链形式限于约0.25％且呋喃糖的量可以忽略不计。术语"葡萄糖"和"D-葡萄糖"一般也用于这些环状形式。该环通过C-1上的醛基-(C＝O)H与C-4或C-5上的羟基-OH之间的亲核加成反应来源于开链形式，得到基团-C(OH)H-O-。开放式异构体D-葡萄糖产生4种不同的环状异构体：α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-25呋喃葡萄糖和β-D-呋喃葡萄糖；它们均为手性的。

在另一种开链异构体L-葡萄糖中，类似地得到4种不同的L-葡萄糖的环状形式。

在本发明的上下文中，术语“葡萄糖”指定任意葡萄糖异构体，既可以为环状形式，也可以为开链形式。

一旦在测试的生物样品中测定MG和葡萄糖的水平，则能够计算所谓的MG/G指数，其为测试的生物样品中MG水平与葡萄糖水平比率。然后将以μmoles/g表示的该比率与正常对照比率比较，以确定患者是否患有癌症。

在本发明上下文中，因为癌细胞消耗高于正常值的更高量的葡萄糖并且产生和释放高于正常值的更高量的MG，所以生物体中胞外隔室中癌细胞的代谢活性的特征在于MG/G指数，将其定义为根据如下公式的以nmoles/g表示的血液MG产生水平与以mmoles/l表示的血液葡萄糖水平(G)比率：MG/G指数＝MG/G，其中以μmoles/g表示MG/G。

在非癌性糖尿病患者中，血液中葡萄糖水平、糖化血红素HbA1c百分比和MG产生水平之间存在正相关性(Beisswenger等人,Diabetes1999)。换句话说，在这样的患者中，糖血越高，则糖化血红素HbA1c百分比越高，且循环MG血液水平越高。这解释了为何非癌性糖尿病患者血液中葡萄糖和MG水平均增加。相反，在具有癌症的糖尿病患者中，MG/G指数显著增加涉及如下事实：由于其更高的葡萄糖消耗量(所谓的“葡萄糖泵”效应)及其更高的糖酵解活性(Hsu和Sabatini,Cell 2008；Koppenol等人.,Nat Rev Cancer 2011)，所以癌细胞在血液中产生并且释放更高量的MG，正如发明人已经在本文中证实的(参见下文)；而由于其特异性葡萄糖泵效应，所以它们同时倾向于减少生物体中的胞外葡萄糖；这解释了为何在糖尿病患者发生差异时，糖血仍然在癌症患者中(甚至在晚期状态下)保持正常。

在一个优选的实施方案中，对照比率(下文称作”正常MG/G对照指数”)是从既不具有癌症、也不具有糖尿病的受试者、优选健康受试者的生物样品–优选血样中测量的MG/G比率指数。

在本发明的上下文中，正常MG/G对照比率指数约为0.01，其相当于得自健康供体血液的中位MG/G指数值与得自非癌性血糖正常的经治疗的糖尿病受试者血液的中位MG/G指数值之间的中间值(参见图4)。

在本发明的上下文中，糖尿病患者的MG/G指数“显著高于”或“高于”正常MG/G对照指数，此时所述MG/G指数是正常MG/G对照指数的1,5倍、优选2倍且更可靠地为3倍。当他/她的MG/G指数是所述对照指数2倍时，认为糖尿病患者具有存在癌症的高风险度(典型地在50％-80％风险度)，当他/她的MG/G指数是所述对照指数3倍时，风险度甚至更高(典型地在80-100％风险度)。

相反，糖尿病患者的MG/G指数“显著低于”或“低于”正常MG/G对照指数，此时所述MG/G指数是正常MG/G对照指数三分之二、优选二分之一且更优选三分之一。当其MG/G指数是所述对照指数二分之一时，认为患者具有存在癌症的低风险度(典型地在20％-50％风险度)，当其MG/G指数是所述对照指数三分之一时，风险度甚至更低(典型地在0-20％风险度)。最终，如果所述MG/G指数和所述对照指数比率包含0.8-1.2、优选0.9-1.1、更优选0.95-1.05，则认为糖尿病患者的MG/G指数“与对照指数类似”。

本文所用的术语“癌症分期”或“癌症阶段”将癌症的临床分类指定入4种国际公认的类别，称作阶段I、II、III和IV。在诊断时，即在施用任意抗癌治疗前，确定这4种预测阶段。分期主要基于癌症的‘TNM’分类(其中T＝大小和组织侵害；N＝涉及区域淋巴结；M＝远端转移)。根据肿瘤类型的不同，可以使用其它分类系统确定分期。因此，例如，尽管TNM分类常用于乳腺癌、支气管癌和头颈癌；但是FIGO分类(妇科医师和产科医师国际联盟(International Federation of Gynecologistsand Obstetricians))常用于卵巢癌且修订的Dukes常用于结肠癌分类。因此，在本发明的上下文中，发明人通过对每种癌症类型考量最常用的分类将癌症分类成4个阶段I、II、III和IV预测分类。此外，阶段0限于原位非侵害性癌症。

本文所用的术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”、“治疗 (treat)”等一般是指得到抗癌药理学和/或生理学响应。作用在无症状受试者中预防癌症进展方面是预防性性的和/或在有症状患者中严格来说(strictosensu)是治疗性的，以便得到使癌症的部分或完全稳定或治愈。

更具体地，本文所用的术语“抗癌治疗”是指化疗、放疗、手术或任意公认的医师使用的生物或化学疗法。例如，在如下US National CanerInstitute(NCI)的互联网上概述了现存的治疗：http://www.cancer.gov/cancertopics/treatment/types-of-treatment。

将肿瘤的生长倍增时间定义为肿瘤达到体积倍增(或更具体地是非间质肿瘤细胞数量倍增)必需的期限。

本文所用的术语“肿瘤响应”是指对其疾病可感觉到的癌症患者已经施用抗癌治疗后肿瘤发展的不同的国际公认的模式，即其中可以通过临床测量肿瘤直接评价和/或通过施用可利用的成像技术测量肿瘤间接评价肿瘤响应。在一些时间间隔后确定响应类型，在此过程中已经施用抗癌治疗。评价在于比较治疗后与治疗前得到的测量值。存在4种响应类型：(1)进行型肿瘤：肿瘤体积增加超过25％；(2)稳定的肿瘤：肿瘤体积增加小于25％和肿瘤皱缩小于25％；(3)部分响应：肿瘤皱缩大于25％而小于100％；和(4)完全响应：测量的肿瘤体积为空，即通过可利用的技术无法检测到肿瘤。

第一次与第二生物样品之间的时间间隔，即提供第二生物样品以评价预后和治疗响应时的时间主要取决于肿瘤的生长倍增时间；倍增时间越短，则时间间隔应越短。根据自身情况，生长倍增时间取决于肿瘤类型和治疗效能。因此，在快速生长的肿瘤的情况中，采样时间间隔可以是1个月、2个月或3个月，而在生长缓慢的肿瘤中，可以是4个月、5个月、6个月甚至更长。

本文中认为，当根据肿瘤倍增时间的不同，第一生物样品后1个月、2个月或3个月甚至6个月提供第二生物样品时，如果第二MG产生水平是第一样品中所述MG产生水平2倍且更优选3倍，则所述抗-癌治疗症对所述患者无效。相反，认为当根据肿瘤倍增时间的不同，例如第一样品后1个月、2个月或3个月甚至6个月得到第二生物样品时，如果第二MG产生水平是第一样品中MG产生水平二分之一且更优选三分之一，则所述抗-癌治疗症对所述患者有效。

存活期取决于肿瘤类型、阶段和治疗。所谓“长期存活”在本文中应理解为所述测试的受试者在进行样品采集后具有至少12个月、优选3年且更优选5年的存活期。另一方面，所谓“短期存活”在本文中应理解为所述测试的受试者在进行样品采集后生活不超过5年，可能少于3年，且更可能的是少于12个月。

在本发明的上下文中，认为当在第一样品后1个月、2个月、3个月甚至6个月得到的第二样品中测量的MG产生水平为在第一样品中所述MG产生水平2倍且更确定地是3倍时，患者被治愈甚至长期存活的可能性低。相反，当第一样品后3个月、优选6个月且更优选1年得到的第二样品中MG的产生水平是第一样品中MG产生水平的二分之一、更优选三分之一时，理想地是当在第二样品后的几次样品中测量的MG产生水平保持在正常范围时，认为患者具有更高的长期存活的机会，甚至可以确定被治愈。

恶病质是发生在慢性疾病例如癌症中的复杂的代谢综合征(Tisdale,Physiol Rev.2009)。已经在减肥患者中证实，测量胰岛素对葡萄糖耐量试验可以指示高胰岛素/葡萄糖比率(I/G指数)情况中的胰岛素抵抗或低I/G指数情况中的β胰腺细胞胰岛素分泌减少(Rofe等人,Anticancer Res1994)。

因此，发明人测量了癌症患者和正常受试者中的I/G指数。他们比较了表征癌症患者的曲线与正常受试者的曲线，并且在两条曲线的交叉点处发现存在相应的MG临界值，下文称作“恶病质-相关的MG对照值”，与正常受试者相比高于此值，存在I/G指数下降。这意味着具有高于恶病质-相关的MG对照值的MG产生水平的患者具有减少的胰岛素胰腺分泌且由此进入严重前-恶病质或恶病质。

在本发明的上下文中，癌症患者血液中恶病质-相关的MG对照值为0.2μM，是健康受试者中MG正常对照值约3倍(参见上文)，即在0.2μM MG值时，癌症患者具有的胰岛素/葡萄糖比率确切地与在健康受试者中测量的值相同，且由此具有相同水平的胰岛素抵抗和胰腺分泌。

在本发明的上下文中，认为当血液中的MG产生水平是0.2μM的恶病质-相关的MG对照值约2倍时，患者具有“发生恶病质综合征的高风险度”(典型地在50％-80％风险度)，而当MG血液水平是所述恶病质-相关的MG对照值约3倍时，发生恶病质的风险度更高(典型地在80-100％风险度)。相反，认为当MG的血液水平是0.2μM的所述恶病质-相关的MG对照值约二分之一时，患者具有“发生恶病质综合征的低风险度”(典型地在20％-50％风险度)，而当MG血液水平是所述恶病质-相关的MG对照值约三分之一时，发生恶病质的风险度甚至更低(典型地在0-20％风险度)。

本文所用的术语“相关性”、“相关”或“与…相关”等是指由数值、数据组等组成的两种变量之间的统计学相关性。正相关性(或“正相关”)是指当一个变量增加时，另一个变量也增加。相反，负相关性(或“负"或"逆相关”)是指当一个变量增加时，另一个变量减小。本发明使用USNational Cancer Institute-European Organization for Research andTreatment of Cancer(NCI-EORTC)的指导原则进行肿瘤标志研究，其适用于MG的生化表征和生物特性。NCI-EORTC指导原则包括有关研究设计的相关建议、在先推定、患者样本特征、测量方法和统计学分析。此外，为了早期检测和筛查判断，使用用于生物标志研发的NCI EarlyDetection Research Network(EDRN)的建议。

应理解本发明不限于所述具体实施方案。还必须认为本文所用的术语的目的仅在于描述具体的实施方案，而不欲以限定，因为本发明的范围仅限于待批权利要求。

发明详述

甲基乙二醛(MG)–丙酮酸的醛形式，也称作丙酮醛或2-氧代丙醛，其具有下式：(CH₃-CO-CH＝O或C₃H₄O₂)–它是唯一的，但是存在于大部分生物系统包括所有哺乳动物细胞中的遍在分子(Inoue,AdvMicrobPhysio 1995)。它具有高度活性并且是剂量依赖性细胞毒性代谢物，其主要在糖酵解即呼吸生物体的关键代谢步骤过程中产生。

主要发现是，癌细胞与正常细胞的差别在于许多癌细胞在其细胞质中主要使用糖酵解来生成腺苷三磷酸(ATP)，从而提供具有能量的细胞。这种所谓的需氧糖酵解现象涉及Warburg效应，其为癌细胞代谢的标志(Hsu和Sabatini,Cell 2008)。这种效应目前得到充分理解，因为已经清楚地确立癌细胞与线粒体功能障碍和线粒体DNA(mt DNA)中的突变相关(Copeland等人,Cabcer Invest 2002；Wallace,Cold SpringHarbSymp Quant Biol 2005)。已经证实因线粒体伴随的羰基应激导致的线粒体蛋白质、脂质和和mtDNA过度糖化促使线粒体功能障碍和mtDNA突变(Pun和Murphy,Int J Cell Biol 2012)。此外，在mtDNA附近dys-功能障碍线粒体导致的自由基过量产生和mtDNA中不存在保护性组蛋白(Baynes,Ann N Y Acad Sci 2002)可以解释为何线粒体基因组对羰基应激和氧化性应激远比核基因组更敏感，且由此发生较高比例的突变(Yakes和Van Houten,PNAS 1997)。此外，已经证实癌细胞中的外遗传和/或诱变改变可以诱导：(1)2型己糖激酶超表达(Goel等人,JBiol Chem 2003)；(2)正常胰岛素-调节的葡萄糖膜受体、尤其是GLUT1、GLUT3和GLUT5活化(Merral等人,Cell Signal 1993)，导致胞外葡萄糖易于透入癌细胞；和最终(3)在需氧和厌氧条件下所有糖酵解酶超表达，导致胞内葡萄糖被癌细胞主动代谢，而不管瘤内含氧条件如何(Hanahan和Weinberg,Cell 2011)。

本发明涉及如下事实：癌细胞可以特征性地产生显著高于正常细胞的更高量MG；使得MG成为癌症的潜在代谢标志。此外，由于其反应性醛和酮基团，所以证实MG为强电子受体且由此是极具反应性的化合物，其特征在于化学和生物特性。

在许多生物体包括细菌中，MG作为几种代谢途经的副产物形成。它可以由为苏氨酸分解代谢中间体3-氨基丙酮和通过脂质过氧化形成。然而，最重要的来源是糖酵解，其中MG通过从二羟丙酮磷酸(DHAP)和甘油醛-3-磷酸(G-3P)的磷酸的非酶消除生成。

由于MG具有高度细胞毒性，所以生物体发生几种解毒机制，其中之一是乙二醛酶系统，其在防止细胞发生亲电毒性方面、特别是MG-诱导的损坏糖化起决定性作用。在该过程中，MG活化乙二醛酶1(GLO-1)，该酶使用还原型谷胱甘肽(GSH)作为辅因子，它将MG转化成S-D-乳酰谷胱甘肽(S-D-乳酰GSH)，即被乙二醛酶2(GLO-2)进一步降解成D-乳酸的代谢中间体(Thornalley,Gen Pharmacol 1996)。值得注意地，已经证实GLO-1活性在与正常组织比较时在许多人癌中增加，包括结肠癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌、胰腺癌和胃癌和白血病和黑素瘤，且更具体地为侵害性癌症(Jones等人,Proteomics 2002；Zhang等人,Mol Cell Proteomics 2005)。此外，GLO-1和GLO-2超表达与肿瘤中的多药抗药性相关(Sakamoto等人,Blood2000)。然而，GLO-2活性在癌组织中一般低于在正常组织中，这启示与正常细胞相比，癌细胞能够自主地解毒胞内MG和恢复正常GSH的可能性较低。这可以增加羰基应激和氧化性应激，由此根据胞内自由基浓度的不同发生肿瘤启动和进展或细胞凋亡/坏死(Irigaray和Belpomme,Carcinogenesis 2010)。

已经描述了MG作为信号传导分子的作用。Együd和Szent-首先启示GLO-1及其底物MG涉及调节细胞分裂(Együd和Szent-PNAS 1966)。更近来，已经启示MG调节转录因子NF-kB和NF-kB-诱导的报道基因表达的活性(Ranganathan等人,Gene 1999；Laga等人)。此外，已经证实晚期糖基化终末化产物(AGEs)形成促使老化且可能发生广泛病理学情况，例如糖尿病(Brownlee,Nature 2001；Brownlee,Diabetes 2005)、动脉高血压(Wang等人,J Hypertens 2005)、超重/肥胖-相关的脂肪细胞增殖(Jia等人,PloS One 2012)、阿尔茨海默病(Smith等人,PNAS 1994)和癌症(van Heijst等人,Ann N Y AcadSci2005)。

胞内MG形成在血糖过多条件下增加。胞外MG的血液水平异常增加已经在具有1和2型糖尿病的患者中得以证实(Beisswenger等人,Diabetes 1999)，且近来，描述了MG可以诱导2型糖尿病中的胰岛素抵抗的机制(Ribouley-Chavey等人,Diabetes 2006)。

一些数据清楚地表明，由于其强力电子受体容量，所以MG是强力糖化(glycating)试剂和最具有反应性的AGE前体(Shinohara等人,JClin Invest 1998)。不仅蛋白质、而且脂质和核酸均对MG导致的糖化敏感(Thornalley,Drug Metabol Drug Interact 2008)。

因此，一方面，认为MG促成癌症作为有效的诱变剂并且可以负责癌症发生和发育。另一方面，由于其凋亡前和/或坏死前剂量-相关细胞毒性特性，所以还认为它是抗癌药并且认为可在癌动物(Conroy,CibaFound Symp 1978)和个体(Talukdar等人,Drug Metab Drug Interact2008)中提供一些制癌作用。此外，基于MG的几种可能的抗肿瘤作用，已经合成了用于治疗癌症的MG-相关化合物，例如化合物甲基乙二醛-双环戊基脒基肼；和化合物米托胍腙即在名称甲基(NSC-32946)下商品化的甲基乙二醛-双(丁基氨基腙)。然而，通过充分的I和II期临床试验证实MG和这些合成化合物均不具有实际相关的抗肿瘤作用。尽管在理解MG全身作用方面取得了进展，但是仍然远不了解。在大部分情况中，这归因于MG主要以加合形式存在，得出由于其极高的糖化特性，所以它结合胞内和胞外配体(Chaplen等人,PNAS 1998)。此外，使得该问题复杂化的原因在于MG与这些配体发生可逆或不可逆相互作用。然而，已经证实在得自患有1型或2型糖尿病的患者中的血样中可以检测到自由循环的MG(Beisswenger等人,Diabetes 1999.)。

在1959年，Lewis、Majane和Weinhouse使用Neuberg和Strauss的方法清楚地启示癌细胞中的MG检测可以忽略不计(Lewis等人,Cancer Res 1959)。

此外，在1978年，Brandt和Siegel推定生物组织中MG的直接测定因活性乙二醛酶系统而是困难的，且由此提出在血液中施用D-乳酸而不是MG(Brandt和Siegel,Ciba Found Symp 1978)。更近来，根据有有限的一系列具有确定的恶性肿瘤的研究患者推定，MG血液水平在乳腺癌和前列腺癌癌症患者中显著降低(Kumar,Biswas等人.Biomedical Res2011)；而认为MG血液水平在口腔癌前期病变中增加，即认为尚未建立为恶性癌的口腔损害。实际上，此时并不清楚患者中增加的MG血液水平是否归因于吸烟和/或酗酒成瘾，得出这些风险因素通常与这样的受试者相关，且已经证实烟草和酒精包含MG(Nagao等人,Environ HealthPerspect 1986)；且无论具有所要求确定的癌症的患者是否预先用抗癌治疗来治疗且由此这些患者在采集血样时是否与确切的临床和/或生物活性增殖性肿瘤相关。

发明人令人惊奇地发现，MG的血液水平在患有确定的进行性癌症的患者中显著升高，而在非代谢活性癌症中，即在癌前期状态甚至原位阶段0癌症时，MG血液水平并未显著升高。实际上，MG血液水平在上皮癌例如头颈癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、胰腺癌和其它消化道癌症和非上皮癌例如白血病、淋巴瘤、黑素瘤和肉瘤中显著增加。更精确地，MG血液水平与肿瘤体积和患有癌症的患者诊断治疗响应相关。MG血液水平越高，则肿瘤负荷越高。因此且关键地，MG水平显然是有助于肿瘤科医生作出决定和治疗癌症患者中的临床意义深远的生物标志。

因此，本发明涉及MG作为临床有用的生物标志的用途，其用于在具有癌症的受试者中进行癌症早期检测和诊断并且用于在癌症患(人或动物)中的预后评价、监测和作出治疗决定。由于精确和快速地测量MG血液水平，所以本发明的诊断方法以极为灵敏的方式促成疾病监测和治疗响应评价。最终，由于癌细胞的MG产生涉及这些细胞的基础和特征性代谢功能障碍，所以MG作为癌症生物标志的用途允许检测许多癌症，尽管不是所有的癌症；这与目前可利用的类型-相关的肿瘤生物标志相反。本发明的另一个目的是用于早期检测和诊断癌症的试剂盒，其用于给癌症分期、用于预测癌症患者的存活机会、用于监测抗癌治疗响应和用于预测和早期检测恶病质。

本发明的另一个目的在于MG在早期检测和诊断具有代谢活性的癌症中的用途，其通过使用任意的化学或免疫学体外MG测量方法测量和分析细胞外液、细胞和/或组织样品中MG的产生来进行；考虑到优选应用MALDI-TOF/TOF质谱法或类似技术。

1.作为癌细胞产生的天然瘤内生物标志的MG

发明人发现癌细胞可以产生和释放高于正常细胞量的MG，癌细胞在肿瘤内、然后在生物体的胞外隔室中且更具体地在外周血中直接产生和释放大量MG；而正常细胞(或炎症细胞)在生物体的组织和胞外隔室、更具体地在外周血中不产生和释放或仅产生或释放检测量较低的MG。

这些令人惊奇的结果已经在体外培养物和动物模型中、且更具体地通过使用用于原位MG肿瘤分析的MALDI-TOF/TOF质谱法和在临床上使用患者得以证实。MG可以直接在肿瘤组织和肿瘤区域中检测到，其中检测到大部分MG的区域相当于肿瘤中的活性增殖区(参见图2)。此外，癌细胞在培养物产生并且释放的MG的量取决于培养基中葡萄糖浓度，即葡萄糖浓度越高，则癌细胞产生的MG越高(参见图1bis)，从而证实癌细胞主要使用糖酵解进行ATP产生，甚至在需氧条件下。此外，发明人已经证实从肿瘤中合成和释放的MG的量与肿瘤负荷呈正相关性，即肿瘤体积越高，则外周血中MG的产生水平越高(参见癌症患的图3和动物模型的图5)；而在炎症和/或免疫感受态细胞导致的肿瘤排斥的情况中，MG水平保持极低(参见图6)。因此，本发明的一个主要的实施方案在于具有癌症的受试者的生物体中肿瘤和/或胞外隔室中检测到的MG产生水平涉及癌细胞代谢活性的水平，这相当于受试者患有的肿瘤的增殖活性水平。

本发明由此涉及用于早期检测和诊断癌症的方法，通过下列方式进行：通过使用任意化学或免疫学体外MG测量方法测量和分析细胞和/或组织样品中具有代谢活性的癌细胞导致的MG原位产生。这些方法包括应用MALDI-TOF/TOF质谱法或类似技术。

因此，本发明包括MG在通过使用组织活组织检查测量和分析组织和/或细胞样品中MG产生和释放检测癌症的方法中的用途，因为它通常对于任意实体瘤和/经或细胞涂片进行，因为它常用于血癌诊断和监测(白血病、淋巴瘤)和/或用于筛查一些实体癌(子宫颈)和其它癌症类型。由于从癌细胞中产生和释放的大部分MG来源于其增加的糖酵解活性，本发明还包括用于测定肿瘤的增殖性攻击性的方法，且由此可以促成癌症与良性肿瘤或炎症过程的区分，这归因于癌细胞的代谢活性一般比良性肿瘤或炎症细胞的代谢活性增强。

2.作为癌细胞在细胞外液中释放的天然生物标志的用于在非糖尿病受试者中早期检测、诊断和预后评价的MG

在本发明的第二个主要的实施方案中，本发明包括用于测定所述受试者中存在的肿瘤的方法，通过下列步骤进行：测量生物体中胞外隔室的生物样品、更优选外周血中的MG产生水平；并且将测量的MG产生水平与其正常对照值进行比较。

本发明还涉及用于早期检测、筛查和诊断非糖尿病受试者中的癌症的体外方法，包括下述步骤：

a)测定所述受试者来自细胞外液的生物样品中的MG产生水平；

b)将所述MG产生水平与对照值，即与非-癌症受试者中的MG水平进行比较，其中如果所述生物样品中的MG产生水平高于所述对照值，则所述受试者患有癌症或具有存在癌症的高风险度。

相反，当所述生物样品中的MG产生水平处于所述正常对照值范围内时，所述受试者未患癌症或具有存在癌症的低风险度。本发明能够在属于非糖尿病的人或动物受试者即具有低于7％的糖化血红素HbA1c水平的受试者中检测和诊断癌症。在一个优选的实施方案中，本发明的诊断方法能够检测头颈癌、支气管癌和肺癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、胰腺癌和其它消化道癌症，还有卵巢癌和子宫内膜癌、肾癌和膀胱癌、白血病和非霍奇金淋巴瘤、黑素瘤和肉瘤。在一个优选的实施方案中，MG正常对照值是已经在健康个体的生物样品中测量的所述MG产生水平。优选地，这种全血值为0.06μM±0.02，其中置信区间为0.02μM-0.11μM。此外，本发明还包括用于测定肿瘤的增殖攻击性的方法，包括测定所述受试者的生物样品中的MG和将测量的MG产生水平与其对照值进行比较的步骤。

3.癌症的早期检测和诊断：糖尿病患者

在30位未治疗的1型和2型糖尿病患者中具有统计学选显著性更高的癌症发病率。然而，已知MG的产生水平在血糖过多的条件下，即在未治疗或未正确治疗的糖尿病患者中增加(McLellan,Clin Sci 1994)。因此，目前的MG癌生物标志在这些患者中可能易混淆。

本发明的目的由此在于，MG/G指数甚至能够在糖尿病患者中识别那些可能具有癌症或不可能具有癌症的患者。这种指数的评价由此能够早期检测和诊断糖尿病患者中的癌症且由此可以改善这些患者中的癌症预后。

本发明由此涉及用于早期检测、筛查和诊断糖尿病受试者中癌症的体外方法，包括下述步骤：

a)测定所述糖尿病受试者的第一生物样品中的MG产生水平；

b)测定所述受试者的第二生物样品中的葡萄糖水平；

c)将这两种水平的MG/G比率(MG/G指数)与相应的在健康个体和血糖正常的经治疗的糖尿病受试者中测量的对照比率进行比较，其中如果步骤c)中得到的MG/G指数高于所述相应的对照比率，则认为所述受试者患有癌症或处于增加的癌症风险度中；其中如果步骤c)中得到的MG/G指数与所述相应的对照比率类似，则认为所述受试者未患有癌症，也不处于增加的癌症风险度中。

重要地，该方法可以应用于任意非糖尿病动物或人受试者，优选正确地、但甚至是不正确地经治疗的糖尿病患者，即具有低于7％的糖化血红素HbA1c的受试者。

如上所述，所述第一次和所述第二生物样品(致力于分别测量同一个体的MG和葡萄糖水平)优选是生物流体样品，例如选自血液、血清、血浆、尿、腹膜或胸腔积液和脑脊髓液。在本发明的方法中，所述第一和第二样品必须具有相同性质(即血液、腹膜或胸腔积液等)。

所述第一和所述第二样品可以依次采集自所述受试者。在优选的实施方案中，同时采集所述样品。在一个更优选的实施方案中，将一种样品一分为二，以便测量同一样品中的MG和葡萄糖水平。几种方法常用于测定生物样品中的葡萄糖水平。本领域技术人员充分知晓如何根据生物样品的类型的不同测量葡萄糖水平。例如，当使用血样时，可以通过常规技术对全血、血浆或血清测量葡萄糖。然而，如果可靠地测量MG，则必须将样品保持在4℃。

而在本发明的上下文中，优选电或酶葡萄糖测量技术。两种最常用的酶是葡萄糖氧化酶和己糖激酶。在一个优选的实施方案中，通过测量在葡萄糖与葡萄糖氧化酶反应时形成的过氧化氢(H2O2)水平测量葡萄糖。

如上所述测定生物样品中的MG水平。

在一个优选的实施方案中，在健康个体或血糖正常的经治疗的糖尿病受试者的生物样品中测量和根据其测量的MG/G指数优选是约0.01μmoles/g的值，相当于MG/G指数值，其为得自健康供体的中位MG/G指数值与得自非癌的血糖正常的经治疗的糖尿病患者的中位MG/G指数值之间的中间值(图4)。

4.癌症患者中的分期、预后评价、监测和治疗评价

成像技术无法精确地检测初始的癌症状态和正确地将癌症分期成国际公认的4个(I-IV)类别。实际上，临床肿瘤科医生的关键的关注在于在亚临床的状态期间正确地评价通过生物体的癌症进展和程度。

本发明显示，在动物中，MG的产生水平与肿瘤体积相关(图5)，且在患者中，外周血中的MG产生水平与肿瘤阶段(图3)和治疗后的肿瘤响应(表3)相关。

本发明由此涉及用于在癌症患者中给疾病分期并且根据生物样品、优选得自所述患者的血样中MG的产生水平进行预后评价和用于监测癌症患者中的治疗效能的体外方法，所述癌症患者无论是人还是动物，该方法包括下述步骤：

·为了分期和预后评价：

a)测定得自所述患者的初步预处理生物样品中的MG产生水平；

b)将所述预先处理MG水平与正常MG对照值进行比较；

c)根据分期分类的4个阶段分类所述预处理MG水平；

·为了监测抗癌治疗的效能：

a)测定得自所述患者的第一生物样品中的初步预处理MG产生水平；

b)测定来自所述患者的治疗后得到的第二生物样品的第二MG产生水平，

其中所述第二样品在得到第一样品后的指定时间得到；

c)将所述初始和所述第二MG产生水平进行比较，其中如果所述第二MG产生水平高于所述初始MG产生水平，则认为所述治疗对所述患者无效；而如果所述第二MG产生水平低于所述初始MG产生水平，则认为所述治疗对所述患者有效且应优选继续进行。

这种监测方法可以适用于任意的呈现癌症的人和动物受试者。

本发明的体外方法还可以用于监测给无症状受试者施用的任意预防性抗癌治疗的治疗效能，所述受试者的亚临床的癌症已经通过使用本方法检测到。

本发明的体外方法还可以用于监测给癌症患者施用的任意预防性抗癌治疗的治疗效能，所述癌症患者已经对可感觉到的疾病进行治疗，且对其而言，需要辅助性的抗癌治疗以便优选使用本方法治疗残留的亚临床疾病。

如上所述，第一和第二生物样品(即分别是处理前和处理后的样品)优选是生物流体，例如选自全血、血清、血浆、尿、腹膜或胸腔积液和脑脊髓液，则应尽可能地相同。在本方法中，所述第一和第二样品必须以交错的方式采集，以便所述在样品采集之间进行的抗-癌治疗具有足够的时间以发挥其效能，且根据本发明测量和解释得到的结果。更精确地，如上所示，所述第二生物样品必须“在第一样品后指定的时间”得到，即根据癌症生长倍增时间的不同，至少1个月；优选2个月或3个月甚至6个月；且优选在已经完全给予或在足够长的提供可解释的结果的时间期间启动所述治疗后进行。

本发明还涉及用于通过所述患者的生物样品预测患有癌症的患者的存活机会的体外方法，包括下述步骤：

a)测定得自所述患者的第一生物样品中的初始MG产生水平；

b)测定得自所述患者的第二生物样品中的第二MG产生水平；

其中所述第二样品在得到第一样品后的指定时间得到；

c)将所述初始和第二产生水平进行比较；

其中如果所述第二MG产生水平高于所述初始MG产生水平，则预测所述患者具有短期存活机会；其中如果所述第二产生水平低于所述初始产生水平，则预测所述患者具有延长的存活机会。

该治疗效率-预测方法可以适用于呈现癌症的任意的人或动物受试者。

如上所述，第一和第二生物样品(即分别是处理前和处理后的样品)优选是生物流体，例如选自全血、血清、血浆、尿、腹膜或胸腔积液和脑脊髓液，且必须具有相同性质。此外，在本方法中，根据癌症生长倍增时间的不同，所述第一和第二样品应依次采集，即第一样品后1个月、2个月、3个月甚至6个月，生长倍增时机越短，则时间间隔应越短。

优选地，该方法对血样进行。

值得注意地，当所述第二样品中的MG产生水平与所述第一样品中的MG产生水平类似时；即如果其比值包含在0.7-1.3中且甚至更优选0.9-1.1，则例如应在1个月间隔采集所述第一和第二样品，如果患者存在生长、稳定或萎缩的癌症，则无法精确地预测。因此，必须继续进行相同治疗且随后数周或数个月重复测量以证实结果。

5.恶病质的预测和早期检测

评估恶病质在较大百分比的具有癌症的患者中发生(尤其是在具有胰腺癌、胃癌、结肠癌和肺癌的那些患者中)并且与生活质量差和存活时间减少相关，与肿瘤负荷和存在的转移无关。其临床特征在于摄食减少和体重减轻，而生物学特征在于全身炎症、脂质代谢和氧化增加、整个身体蛋白质分解和更新增加和碳水化合物代谢受损。在恶病质患者中，碳水化合物代谢改变包括葡糖耐受不良、整个身体胰岛素抵抗、宿主葡萄糖氧化减少、葡萄糖新生增加和葡萄糖更新和重复利用增加；在所有这些过程中，胰岛素起关键作用(Tayek,J Am Coll Nutr 1992)。

发明人测量MG与BMI相关，并且发现MG产生水平与癌症患者的BMI显著成负相关性，但与正常受试者的BMI不呈负相关性(参见图7)；且在具有低于18的BMI的癌症患者中，即在具有前-恶病质或恶病质综合征的患者中，MG产生水平比非恶病质癌症患者显著增加(表4)。这意味着测量癌症患者中的MG可能是预测或证实恶病质诊断的有价值的工具。此外在恶病质癌症患者中，葡萄糖耐受不良且更具体地是胰岛素抵抗是早期的生化事件，其发生在体重减轻发作很早之前(Tayek等人,J Am CollNutr 1992)和减肥患者中，测量对葡萄糖试验耐受性的胰岛素响应可以指示高胰岛素/葡萄糖(I/G)指数情况中的胰岛素抵抗或低I/G指数情况中的胰岛素分泌减少(Rofe等人,Anticancer Res 1994)。因此，发明人根据MG产生水平测量了癌症患者和正常受试者中的I/G指数，并且确立癌症患者血液中恶病质-相关的MG对照值为0.2μM，这意味着在0.2μM MG值时，癌症患者确切地具有与在健康受试者中测量的相同的I/G比率，且因此，他们具有相同水平的胰岛素抵抗和胰腺分泌(参见图8)。

因此，本发明还涉及用于预测、检测和诊断癌症受试者或患者中的恶病质或前-恶病质的体外方法，包括下述步骤：

a)测定得自所述患者的生物样品中的MG产生水平；

b)将所述MG产生水平与恶病质MG-相关的对照值进行比较；

其中如果所述生物样品中的MG产生水平高于所述恶病质MG-相关的对照值，则所述患者正在进入恶病质或严重前恶病质，因此，预测在无有效的特异性抗恶病质治疗的存在下，具有短存活期；

而如果所述生物样品中的MG产生水平低于所述对照值，则所述患者未进入恶病质或严重前恶病质，且由此预测具有更延长的存活期。

在该方法中，根据癌症患者中的胰岛素/葡萄糖比率(I/G指数)的发展与正常受试者中I/G指数的发展之间的比较确定所述MG对照值，从而能够表征称作“恶病质-相关的对照值”的MG产生水平的临界点，经评估在血液中约为0.2μM MG，且高于该值，通过β胰腺细胞的胰岛素分泌水平不足，这意味着癌症患者进入恶病质或严重前恶病质。

即，在健康受试者中的MG正常对照值约3倍。

此外，这种预测方法可以适用于存在癌症的任意的人或动物受试者。

甲基乙二醛测量方法

可以通过使用MALDI-TOF/TOF质谱法对实体组织且更具体地是肿瘤的样品中的MG进行直接原位分析/检测，所述MALDI-TOF/TOF质谱法结合了基质辅助激光解吸/电离(matrix assisted laserdesorption/ionization)(MALDI)与飞行时间质谱法(TOF)。

为通过MALDI-TOF/TOF质谱法直接原位测量和分析实体组织活组织检查和细胞涂片中的MG进行的该方法描述在下文中的“实施例”中。简言之，就涉及的实体组织而言，在切成12μm厚度切片之前，首先将实体组织冷冻在-80℃下并且在低温恒温操作过程中用超纯水固定。然后将切片置于专用MALDI平板上，并且用乙醇处理，然后用α-邻苯二胺(o-PD)处理。此后，将制品在加湿室内在室温下在黑暗中温育过夜，然后干燥(使用干燥器)并且涂敷α-氰基-4-羟基肉桂酸(HCCA)基质溶液。通过分析MALDI-TOF/TOF质谱法对2MQX提供的作用，发明人发现，2个2MQX分子碎片(一个为91Da，而另一个为118Da)是最佳选择的MG的标志，其在使用MS/MS成像分析后可以用于检测和定量实体组织中的MG。已经设定了类似的方法并且实施用于检测和测量细胞涂片中的胞内MG。液体样品中游离MG的分析/检测可以通过本领域公知的常规方式进行，例如通过使用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)、ELISA试验或其它已经提出的方法(参见Ohmori等人,JChromatogr.1987；McLellan等人,Anal Biochem 1992；Nemet等人,Clin Biochem 2004；Chaplen等人,Anal Biochem 1996)进行。

在本发明的一个优选的实施方案中，所述流体生物样品选自全血、血清、血浆、尿、腹膜或胸腔积液、脑脊髓液或消化液。在本发明的一个优选的实施方案中，通过向血样中添加1,2-二氨基苯衍生物、优选邻-苯二胺(o-PD)对天然存在的游离MG进行检测。MG与o-PD的反应实际上形成喹喔啉类，它们是强发色团或荧光团或它们两者，易于用RP-HPLC定量。然而，根据McLellan等人(McLellan等人,Anal Biochem1992)所述的也通过RP-HPLC测量得到的喹喔啉的方法，本发明还使用1,2-二氨基-4,5-二甲氧基苯(DMB，也称作DDB)。

在如下的实验部分提供了定量全血样中MG水平的简便方法。在该具体的实施方案中，通过常规方式从受试者采集全血样品，即刻保持在冰上，然后冷冻在-80℃下，直到测量MG为止。解冻后，达到衍生操作的温度，将样品保持在4℃，因为MG极具反应性且不稳定。在第一步中，将三氟乙酸(TFA)加入到解冻的全血样品中，用于即时地蛋白质沉淀。此后，在4℃离心样品，回收上清液。在第二步中，通过将o-PD或DMB添加到上清液中进行衍生，将所述混合物保持在室温(23℃)在黑暗中4-6小时。进行最终离心，回收上清液，以便使用RP-HPLC或偶联检测系统的气相色谱法分析，两种方法均可以精确地定量MG水平。

作为该方法的可替代选择，发明人提出了用于简化样品采集和处理和MG测量的改进方法。在这种可选的方法中，已经包含TFA的小瓶用于样品采集，即刻通过翻转混合样品，保持在4℃下，然后冷冻在-80℃下。因此，在解冻后，即刻在4℃离心样品，得到上清液，如上所述衍生用于MG定量。还可以通过使用定量“夹心式”酶联免疫吸附测量(“夹心式”ELISA)，基于对MG的特异性抗体制备物进行MG测量。对游离MG具有特异性的抗体制备对于本试验的有效性而言是关键。几种人MG ELISA试剂盒是商品化的。

在本发明的一个优选的实施方案中，将对MG特异性的抗体预包被在微量培养板上。然后，将校准的样品引入预包被的微量培养板，使得在样品中出现的游离MG结合预包被的抗体。在除去任意未结合的物质后，将辣根过氧化物酶(HRP)-缀合的抗-MG抗体直接加入到各孔中。洗涤后，将3,3’,5,5’四甲基-联苯胺(TMB)底物溶液(所用酶缀合物的特异性底物)添加到每个孔中。仅包含MG的孔证实颜色改变，可以通过分光光度法测量。最终，通过与标准品比较，测量样品中的MG水平。这种定量“夹心式”酶免疫测量是可利用的商品化ELISA试验的简化形式，其使用例如偶联抗生物素蛋白-缀合的HRP的生物素-缀合的抗体的系统。由于“夹心式”ELISA试验的有效性取决于抗-MG抗体的特异性和质量，所以这样的试验应包括对每种新储备的试剂进行定期RP-HPLC控制检验。

减少假阴性和假阳性结果

从本文提供的数据(参见图3和“实施例”)中，当通过RP-HPLC测量癌症患者全血中的MG时，发明人评价假阴性结果的概率为10-15％的时间。在这样的情况中，必须使用其它方法例如直接测量组织或细胞中MG的本发明那些方法。假阳性错误发生在慢性尿毒症(Nakayama等人,Am J Nephrol 2008)和1&2型糖尿病患者中，但慢性尿毒症和糖尿病易于识别和诊断，且发明人已经提出了MG/G指数在检测糖尿病患者中的癌症中的用途。如上所述，除糖尿病外，AGEs与衰老和几种非癌的与年龄相关的疾病例如动脉高血压、超重/肥胖和阿尔茨海默病相关。在高血压大鼠的动脉壁上和血液中检测到MG水平增加(Wu和JuurlinkHypertension 2002)，但尚未证实具有普通动脉高血压的患者在其血液中存在MG产生水平增加。已经报道，具有阿尔茨海默病的患者的脑脊髓液中的蛋白质糖化和MG水平增加，而在该患者的外周血中未观察到MG增加。此外，发现具有阿尔茨海默病的患者的外周血中检测到的晚期糖基化终末化产物-相关参数与非痴呆的对照组相比具有较低的值(Thorne J等人,Life Science 1996)，即发现未启示MG血液水平可以在这样的患者中增加。实际上，除外慢性尿毒症和1&2型糖尿病，没有数据支持在具有与年龄相关的疾病例如动脉高血压或阿尔茨海默病的人中存在游离MG的高血液水平。此外，在正常健康受试者中，并不认为衰老影响血液MG产生水平，且与年龄相关的MG血液水平包括在正常范围值内，因此，衰老自身可能不构成假阳性。此外，在具有慢性炎症疾病的若干患者血液中未观察到任何MG产生水平增加。

在另一个方面，本发明涉及试剂盒，其用于早期检测和诊断癌症、用于给癌症分期、用于预测癌症患者的存活机会、用于监测抗癌治疗响应和用于预测和早期检测恶病质，包含：

-用于采集生物样品的工具(means)；

-用于测量MG产生水平的工具；

-所述试剂盒的使用说明书；

-任选的对照(参比)样品。

在本发明的一个优选的实施方案中，所述试剂盒包含说明书和工具，其用于通过MALDI-TOF/TOF质谱法或类似技术原位检测和测量细胞涂片或组织中的MG并且通过如下可利用的方法之一定量MG：

·化学试验，包括用于细胞外液中RP-HPLC分析的o-PD或DMB、2MQX或DMQ、MQX或DDQ。

为了进行化学试验，所述试剂盒包含如下试剂：

-用于蛋白质沉淀的三氟乙酸(TFA)；

-用于衍生的邻苯二胺(o-PD)或1,2-二氨基-4,5-二甲氧基苯(DMB，也称作DDB)；

-相当于所用衍生试剂的具体喹喔啉产物：用于校准曲线的2-甲基喹喔啉(2-MQX)或6,7-二甲氧基-2-甲基喹喔啉(DMQ)。

-由喹喔啉衍生物5-甲基喹喔啉(5-MQX)或6,7-二甲氧基-2,3-二甲基-喹喔啉(DDQ)组成用于内标的标准品。

·任选地，使用用于实体组织或细胞涂片中MG测量的MALDI-TOF/TOF质谱法分析的化学试剂的化学试验。

·任选地，定量“夹心式”酶免疫学试验，其基于特异性识别游离MG的单克隆或多克隆抗体，其用于细胞外液中的MG测量。

在另一个优选的实施方案中，本发明的试剂盒还包含用于检测葡萄糖产生水平的工具和基于用于葡糖氧化酶或己糖激酶的酶试验测定MG/G指数的说明书。

实施例1：固体组织样品制备和肿瘤中的MG测量

在给90只雄性和雌性BD-IX大鼠(Charles River,France)植入PRO致瘤癌结肠细胞后6周得到肿瘤样本(45只雌性和45只雄性由CharlesRiver提供)。在切成12μm厚度切片之前，将肿瘤冷冻在-80℃下并且在-20℃在低温恒温操作过程中用超纯水固定。然后将切片置于专用MALDI平板上(由Bruker提供)，并且用乙醇、然后用o-PD(0.01％)(Sigma Aldrich,France)处理制备物，此后，将其在加湿室内在室温下在黑暗中温育过夜。温育后，切片干燥(使用干燥器)并且涂敷α-氰基-4-羟基肉桂酸(HCCA)基质溶液(由Sigma Aldrich提供)。通过分析MALDI TOF/TOF质谱法(Bruker UltraFlex III)对2MQX(2-甲基喹喔啉)(由Sigma Aldrich提供)的作用，选择2个2MQX分子碎片(一个为91Da，而另一个为118Da)，其能够检测MS/MS成像分析后肿瘤中的MG。

如下制备对照品范围：内标5MQX(5-甲基喹喔啉)(由Sigma Aldrich提供)以0.4μM使用并且在这种终浓度下与根据0-1.6μM浓度范围制备的每一2MQX等分部分混合。使用超纯水进行稀释。使用MALDI-TOF/TOF质谱法进行分析。

实施例2：细胞外液样品制备和血液中的MG测量:

由于MG可以存在于一些食物和饮料中，所以在采样前必须使受试者禁食8-12小时。在4℃采集血样，对全血进行分析，因为MG在红细胞中处于恒定浓度。这种可能性来源于如下事实：在红细胞中，MG以非酶的恒定速率从产生磷酸甘油酮和甘油醛3-磷酸酯产生(Thornalley,Biochem 1989)。

已经使用基于简便衍生方法的方法、随后使用气相色谱法/质谱法(GC/MS)分析。使用包括用o-PD或DMB衍生的偶联质谱分析的反相高效液相色谱(RP-HPLC)法进行MG的制备和定量。简言之，在4℃全血离心后，加工要求使用三氟乙酸(TFA)进行蛋白质沉淀、将上清液与衍生试剂o-PD或DMB一起在23℃在黑暗中温育4-6小时和在将其转化成2MQX(对于o-PD而言)或6,7-二甲氧基-2-甲基喹喔啉(DMQ)(对于DMB而言)后的MG定量分析。

如下制备标准溶液：通过终点测定以酶方式测量MG的储备水溶液浓度。MG定量包括在还原型谷胱甘肽(GSH)的存在下通过乙二醛酶I转化成S-D-乳酰谷胱甘肽。制备包含在1ml水中的0.0625–1.6nmol MG的校准标准品。通过上述方法进行衍生。通过将2MQX和5MQX(内标)的采集区比率对衍生试剂o-PD的MG浓度绘图或通过将DMQ和6,7-二甲氧基-2,3-二甲基-喹喔啉(DDQ)(内标)的采集区比率对衍生试剂DMB的MG浓度绘图建立校正曲线。

为了鉴定和测量血液中MG的浓度，通过RP-HPLC解析o-PD的喹喔啉衍生物2MQX和5MQX和DMB的DMQ和DDQ并且通过电喷雾电离/选择的离子监测(ESI/SIM)分析。最终，通过以选择的离子监测模式(SIM)计算质子化分子离子峰强度(m/z 145，2MQX；和m/z 205，DMQ)与质子化分子内标离子峰强度(m/z 145，5MQX；和m/z 218，DDQ)对MG进行定量。

实施例3：体外实验

已经通过使用体外组织培养物测量了癌细胞与正常细胞对比的MG产生。在一个使用细胞培养物的典型实验中，使用LC-MS/MS在调湿培养基(CM)中HCT116人结肠癌细胞系进行通过癌细胞的MG产生。在低葡萄糖条件(5.6mM)或高葡萄糖条件(25mM)下培养细胞，48小时后采集。

发现CM中的MG产生在高葡萄糖条件下(MG浓度为0.05917μM)是在低葡萄糖条件下(MG浓度为0.00515μM)10倍更高，表明癌细胞由葡萄糖合成MG，且由此主要使用糖酵解进行ATP生产。

另外的实验证实，这种剂量依赖性涉及各种类型的癌细胞；而由于更低的葡萄糖消耗和糖酵解，所以正常细胞合成并且释放更少的MG。

实施例4：体内实验

分析一系列101位连续的具有各种癌症类型并且限于其疾病的不同阶段的患者的血液中存在的MG，并且将癌症患者中得到的水平与一系列36位正常对照者，以及12位具有正常血糖的经治疗的2型糖尿病的患者中得到的水平对比(还有6位未治疗的2型糖尿病用作本试验的阳性对照)。癌症患者的选择标准是病理上诊断为癌症，无预先治疗，存在临床和/或生物学可感觉到的疾病，无糖尿病、肾功能不全和其它慢性病。

正常对照组的选择标准是无癌症、糖尿病、动脉高血压、阿尔茨海默病和肾功能不全；对于具有非胰岛素依赖性2型糖尿病的患者，无糖尿病相关并发症，而对于经治疗的糖尿病患者，糖化血红素HbA1c<＝7％且血糖正常。对于所有包括的受试者，选择标准是不吸烟、不饮酒和在采样前24小时未消耗咖啡，且将所有具有吸烟量大和/或酗酒成瘾的患者排除在本研究外。根据前66位包括的患者和全部患者中的标准操作顺序测定BMI和血液葡萄糖和胰岛素测量值。

实施例5：体内动物模型

使用实验室动物、特别是在同基因BDIX大鼠中1-2二甲基肼-诱导的可移植结肠癌模型进行一组实验，对于在同基因BDIX大鼠中1-2二甲基肼-诱导的可移植结肠癌模型，其中在植入大鼠时，已经预先在体外筛选了两种癌细胞克隆(DHD-K12/SRb和DH-K12/JSb)以分别形成进行性(PROb)肿瘤和退化性(REGb)肿瘤。在这些实验中，在第2、3、4、6和9周时采集用于MG和其它分子例如葡萄糖和胰岛素测量的血样。同时，测量肿瘤块用于肿瘤评价。使用JMP 7(SAS Software,NC,USA)进行统计学分析。通过使用Fisher精确检验和双尾学生t-检验测量统计学显著性。

结肠肿瘤是得自植入PRO致瘤癌结肠细胞后6周的BD-IX大鼠的腺癌(参见上文)。在图2的1和2中，肿瘤在其中部和下部中占优势的大坏死区显著相关。这特别地在图2的2中充分证实，相当于苏木精-曙红-Safran染色的肿瘤。

在通过MALDI-TOF/TOF进行MS/MS成像分析后，通过检测2MQX的2个分子碎片发现，MG已经局限于肿瘤，一个是91Da，而另一个是118Da。这能够得到分别如图2的3和4所示的肿瘤扫描。

3和4中的扫描是实例，证实恶性肿瘤能够产生大量MG，而通过使用本方法的正常对照组中揭示出无或低可检测的MG。正如图2的扫描3和4中报道的，并不清楚MG是胞内可检测的，胞外可检测的，还是它们两者。然而，在图2的扫描3中(相当于91Da 2MQX碎片)，MG的量显然在肿瘤坏死区中丰度较低，而显然大部分在肿瘤活跃增殖部分中检测到。

实施例6：癌症患者

表1的结果表明癌症患者中MG血液水平的平均值和极端值显著高于正常对照组中的平均值和极端值(对于男性和女性)和高于具有正常血糖的经治疗的2型糖尿病的患者中的平均值和极端值。发现用作对照组的正常受试者与具有正常血糖的经治疗的2型糖尿病的患者之间无显著性差异。

除MG血液测定外，在抗癌治疗前，预期和连续地研究具有病理学证实的癌症的患者的血糖和胰岛素。在正常受试者中进行类似研究。在癌症患者中，发现MG血液水平与血糖过多之间无显著相关性，而MG血液水平倾向于与胰岛素血症(数据未显示)具有负相关性，即在癌症患者中，MG血液水平是相对独立的参数。在正常对照组中发现非显著性结果。因此，这样的数据是指在正确治疗的糖尿病患者中、即在具有正常血糖和标准化HbA1c的患者中检测到MG血液水平增加可以归因于癌症结果(就健康非糖尿病受试者而言)。

将正常血糖的经治疗的糖尿病患者中MG的全身测量对下述作出解释：作为包括结肠-直肠癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌和膀胱癌的一些类型的癌症的高发病率，其已经证实这与1或2型糖尿病显著相关。

表2的结果公开了根据肿瘤类型癌症患者中MG血液水平的比较：

实际上，与正常对照组(和血糖正常的经治疗的2型糖尿病患者)相比，MG血液水平在患有头颈癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、胰腺癌和/或其它消化道癌症的患者中MG血液水平显著增加，且证实在这些患者中，不同的MG值是正常对照值1,5-2倍更高，视肿瘤类型而定。值得注意的是MG水平与对于最常见的癌症乳腺癌和前列腺癌得到的正常对照值具有统计学显著性差异；且与对于目前无可利用的早期检测生物标志的肺癌、结肠-直肠癌、胰腺癌和头颈癌具有高度统计学显著性差异。

实施例7：癌症患者血液中的MG水平与疾病阶段之间的统计学显著性相关性

由于充分证实肿瘤体积具有预后价值，所以可以将MG血液水平视为预后指数。此外，由于发明人已经证实MG血液水平清楚地反映出肿瘤体积，所以MG血液水平也是随后疾病进展过程中的预后指数。

对于原位癌症(阶段0)，与正常对照值(0.06μM)相比MG血液水平无显著性增加，这一发现证实一些阶段0的癌症可能不具有代谢活性，而对于阶段I-IV癌症，存在显著性的正相关性(p＝0.0109)。这意味着癌症患者血液中的全身测量值是用于诊断癌症并且对其分期和用于预后评价的有效工具。

实施例8：动物实验中的MG血液水平和肿瘤体积

图5公开了植入PROb致瘤癌结肠细胞后BD-IX大鼠中MG血液水平的进展，而图6公开了植入REGb非致瘤癌结肠细胞后BD-IX大鼠中MG血液水平的进展。正如从这些数据中显示的，在植入PROb肿瘤细胞的大鼠中MG血液水平与肿瘤体积之间存在显著的统计学显著性的正相关性。相反，在植入REGb肿瘤细胞且不能取得该移植物的大鼠中，无法进一步检测到植入后第4周时瞬间升高后的MG血液水平，即在无法取得致瘤移植物的动物中，没有证据证明循环MG的量显著增加。本实验显示生长中的肿瘤与MG血液水平的相关性高于非生长中的肿瘤，即增殖的癌细胞产生并且释放高于非增殖性癌或正常细胞量的循环MG。这解释了为何增加的MG血液水平在癌症患者中可检测到，而在没有癌症的、更具体地是没有增殖性活跃癌症的受试者中检测到显著更低的MG血液水平甚至无MG血液水平。

实施例9：根据在治疗的癌症患者中得到的临床响应的MG血液水平的平均值和极端值(以μM计)

正如表3中所示，对治疗癌症的几位患者的纵向研究表明，抗癌治疗后临床评价为完全响应的患者与正常MG血液水平相关，而对治疗无应答或具有部分响应或治疗后疾病稳定的患者具有持续高的MG血液水平。因此，在癌症患者中，MG是疾病发展和治疗响应的标志。然而，几位被视为对通过使用目前可利用的用于评价响应的生物标志和成像技术治疗具有完全响应的患者在其血液中仍然具有可检测到的MG水平增加，其水平进一步与早期肿瘤复发相关。这一发现强烈地启示治疗的癌症患者中的MG检测可以成为用于评价肿瘤治疗响应的工具，其优于目前可利用的基于传统生物标志和/或成像技术的临床方法。

实施例10：癌症患者、正常受试者和治疗的2型糖尿病患者的血液中的MG/G指数.

正如图4上所示的，血液中测量的MG/G指数与健康受试者和血糖正常的经治疗的2型糖尿病患者中的MG/G指数相比显著增加了几乎2倍。这一结果强烈地启示能够识别具有癌症(具有高MG/G指数)与没有癌症癌症(具有低MG/G指数)的糖尿病患者；不过，糖尿病患者可能是掺杂MG的葡萄糖失调。

实施例11：癌症患者和健康受试者中MG血液水平与BMI之间的相关性

正如可以证实的，具有超重/肥胖的患者与癌症发病率显著增加相关，在癌症患者于正常对照组之间进行MG血液水平与BMI之间关系的探索。

a.具有超重-肥胖的癌症患者中的MG血液水平

正如表4中展示出的，与具有正常体重(18<BMI<25)的癌症患者相比，具有超重/肥胖(BMI>25)的癌症患者与更低–但仍然高的-MG血液水平相关。然而，不同于在正常受试者中，在癌症患者中存在BMI与MG血液水平之间具有统计学显著性的负相关性(图7)，即检测的MG血液水平高于具有超重-肥胖的患者中的0.1μM可能归因于癌症。因此，为下述提供了解释：具有超重/肥胖的患者中的MG测量值。

b.前恶病质或恶病质癌症患者中的MG血液水平

正如表4中所示，具有低于18的BMI(即体重过轻或恶病质)的癌症患者具有显著高于具有正常BMI(18<BMI<25)的患者的MG血液水平。还发现MG血液水平与白蛋白血液水平具有显著的负关性(数据未显示)。由于已经证实低白蛋白血症与恶病质相关，所以这间接地证实在癌症患者中，高MG血液水平与恶病质相关。这一结果展示在图7中，其中，如上所示，显示癌症患者中的MG血液水平与BMI显著呈负相关性(图7B)，而在正常受试者中，MG血液水平和BMI不相关(图7A)。

由于体重过轻-恶病质与存活时间减少相关，而与肿瘤体积或存在的转移灶无关，所以这些数据强烈地启示在癌症患者中重复测量MG构成了用于预测和早期检测恶病质和由此用于客观评价患者预后的新工具。

实施例12：与恶病质相关的MG血液对照值的测定

在恶病质中，I/G指数增加或相应地在25％的病例中正常并且在50％的病例中减小；这取决于恶病质的晚期状态，指数越低，则恶病质的严重性越低。实际上，众所周知增加的I/G指数涉及胰岛素抵抗，而减小的I/G指数涉及β胰腺细胞的缺陷性胰岛素分泌。正如展示在图8中的，在正常受试者中，I/G指数是恒定值，无论MG血液水平的值如何，而在癌症患者中，显然与MG血液水平呈负相关性。基于上述考量(参见上文)，两条曲线的交叉点定义了癌症患者中I/G指数变得低于正常受试者中的极限值。这种交叉点由此是指MG临界值–所谓的“恶病质-相关的MG对照值”-高于它，在癌症患者中胰岛素分泌少于在正常患者中的分泌，这一发现显然与恶病质相关。这意味着在示意图上测量的0.2μM MG血液对照值相当于MG极限值，高于它，癌症患者进入恶病质或严重前-恶病质(图8)。

与测量胰岛素胰腺分泌相比，测量癌症患者血液中的MG显然确保可以测定胰岛素抵抗水平，并且客观地识别这些患者中是否进入恶病质或严重前-恶病质状态。

Claims

1.通过测量和分析经过细胞和/或组织样品中代谢活性的癌细胞原位产生的甲基乙二醛(MG)早期检测和诊断癌症的方法，所述方法通过使用任意化学或免疫学的体外MG测量方法来进行。

2.权利要求1的方法，包括应用MALDI-TOF/TOF质谱法或类似技术。

3.用于早期检测和诊断非糖尿病受试者的细胞外液的生物样品中的癌症的体外方法，包括下述步骤：

a)测定从所述受试者的细胞外液生物样品中的甲基乙二醛(MG)的产生水平；

b)将所述产生水平与对照值，即非-癌症受试者中的MG水平进行比较；其中如果所述生物样品中的MG产生水平高于所述对照值，则认为所述受试者患有癌症。

4.权利要求3的体外方法，其中所述对照值是已经在健康个体生物样品中测量的所述MG的产生水平，且优选在血液中的数值约为0.06μM。

5.用于早期检测和诊断糖尿病受试者中癌症的体外方法，包括下述步骤：

a)测定所述受试者的第一生物样品中MG的产生水平；

b)测定所述受试者的第二生物样品中的葡萄糖水平；

c)将这两种水平的[甲基乙二醛/葡萄糖]比率(MG/G指数)与在健康个体和血糖正常的经治疗的糖尿病受试者中测定的相应对照比率进行比较，

其中如果步骤c)中得到的MG/G指数高于所述相应的对照比率，则认为所述受试者患有癌症或处于增加的癌症风险中；其中如果步骤c)中得到的MG/G指数与所述相应的对照比率类似，则认为所述受试者未患有癌症，也未处于增加的癌症风险中。

6.权利要求5的体外方法，其中同时收集所述第一和所述第二样品，且它们优选得自单一样品。

7.权利要求5和6的体外方法，其中所述对照比率是在健康个体或血糖正常的经治疗的糖尿病受试者的生物样品中测量且从该生物样品中测定的[甲基乙二醛/葡萄糖]比率(MG/G指数)；且优选数值约为0.01μmoles/g。

8.权利要求3-7任一项的体外方法，其中所述生物样品是血样。

9.权利要求1-8任一项的体外方法，其中所述肿瘤是头颈癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠-直肠癌、胰腺癌或其它消化道肿瘤。

10.权利要求1-8任一项的体外方法，其中所述癌症是白血病、淋巴瘤、黑素瘤、肉瘤、儿童癌症或脑癌、泌尿生殖器癌、子宫癌或卵巢癌；或其它癌症。

11.权利要求1-8任一项的体外方法，其中将该方法应用于任意肿瘤或炎症过程，由此能够区分良性肿瘤与恶性肿瘤以及炎症过程与癌症。

12.权利要求1-11任一项的体外方法，其中将该方法应用于无症状受试者中的癌症筛查。

13.权利要求1-12任一项的体外方法，其中所述受试者是人或动物。

14.用于在人类或动物的癌症患者中疾病分期和预后评价的体外方法，所述方法通过测定生物样品中MG的产生水平来进行，所述生物样品优选为得自所述患者的血样。

15.用于监测对具有癌症的患者施用的任意抗癌治疗的治疗效能的体外方法，包括下述步骤：

a)测定得自所述患者的第一生物样品中的初始预处理MG产生水平；

b)测定从治疗后的所述患者中得到的第二生物样品中的第二MG产生水平；

其中所述第二样品在得到所述第一样品后的指定时间时得到；

c)将所述初始MG产生水平和所述第二MG产生水平进行比较，其中如果所述第二MG产生水平高于所述初始MG产生水平，则认为所述治疗对所述患者无效；而如果所述第二MG产生水平低于所述初始MG产生水平，则认为所述治疗对所述患者有效。

16.用于监测对无症状受试者施用的任意预防性抗癌治疗的治疗效能的体外方法，所述受试者的亚临床的癌症已经被检测到，所述方法通过使用权利要求15中所述的操作来进行。

17.用于监测任意预防性抗癌治疗的治疗效能的体外方法，所述任意预防性抗癌治疗对已经可感觉到的疾病治疗的癌症患者施用，并且对所述患者需要辅助性抗癌治疗来治疗残留的亚临床疾病，所述方法通过使用权利要求15中所述的操作来进行。

18.用于预测、检测和诊断癌症受试者或患者中的恶病质或前-恶病质的体外方法，包括下述步骤：

a)测定得自所述患者的生物样品中的MG产生水平；

b)将所述MG产生水平与恶病质MG-相关的对照值进行比较；

其中如果所述生物样品中的MG产生水平高于所述恶病质MG-相关的对照值，则所述患者正在进入恶病质或严重性前恶病质，而如果所述生物样品中的MG产生水平低于所述对照值，则所述患者未进入恶病质或严重性前恶病质。

19.体外方法，其中已经从在癌症患者中[胰岛素/葡萄糖]比率(I/G指数)的发展与正常受试者中I/G指数的发展之间的比较中测定所述MG对照值，从而允许表征称作“恶病质-相关的对照值”的MG产生水平的临界点，所述恶病质-相关的对照值在血液中估计约为0.2μM MG，且高于它，则通过β胰腺细胞的胰岛素分泌水平是缺陷型的，这意味着癌症患者进入恶病质或严重性前恶病质。

20.用于经由所述患者或受试者的生物样品预测患有癌症的患者或受试者的存活机会的体外方法，包括下述步骤：

a)测定得自所述患者的第一生物样品中的初始MG产生水平；

b)测定得自所述患者的第二生物样品中的第二MG产生水平测，

其中所述第二样品在得到第一样品后指定的时间得到；

c)将所述初始产生水平和第二产生水平进行比较；

其中如果所述第二MG产生水平高于所述初始MG产生水平，则预测所述患者具有短期存活机会；

其中如果所述第二产生水平低于所述初始产生水平，则预测所述患者具有延长的存活机会。

21.权利要求12-20的体外方法，其中所述生物样品是血样。

22.试剂盒，所述试剂盒用于早期检测和诊断癌症、用于对癌症分期、用于预测癌症患者的存活机会、用于监测抗癌治疗响应和用于预测和早期检测恶病质，所述试剂盒包含：

-用于采集生物样品的工具；

-用于测量MG产生水平的工具；

-所述试剂盒的使用说明书；

-任选的对照样品。

23.用于癌症筛查的试剂盒，包含权利要求22的工具和说明书。

24.权利要求22和23的试剂盒，其中提供所述工具用于通过MALDI-TOF/TOF质谱法或类似技术原位检测和测量细胞涂片或组织中的MG，且其中所述工具用于测量细胞外液中的MG，所述工具选自如下化学和免疫-酶学试验的试剂盒的组：用于RP-HPLC分析(化学试验)的化学试剂，包括o-PD或DMB、2MQX或DMQ、MQX或DDQ；和任选的“夹心式”ELISA试验中特异性识别MG的单克隆或多克隆抗体。

25.权利要求22-24任一项的试剂盒，还包含用于检测葡萄糖产生水平的工具和用于测定MG/G指数的说明书。

26.甲基乙二醛(MG)在代谢活性的癌症的早期检测和诊断中的用途，其通过使用任意化学或免疫学体外MG测量方法测量和分析细胞外液、细胞和/或组织样品中MG的产生来进行。

27.权利要求26中的甲基乙二醛(MG)的用途，包括使用MALDI-TOF/TOF质谱法或类似技术。