ES2656896T3

ES2656896T3 - Metilglioxal como marcador de cáncer

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Publication number: ES2656896T3
Application number: ES13783073.3T
Authority: ES
Inventors: Dominique BELPOMME; Philippe IRIGARAY
Original assignee: Association Pour La Rech Therapeutique Anti Cancereuse; Association pour la Recherche Therapeutique Anti-Cancereuse
Current assignee: Association Pour La Rech Therapeutique Anti Cancereuse; Association pour la Recherche Therapeutique Anti-Cancereuse
Priority date: 2012-10-25
Filing date: 2013-10-25
Publication date: 2018-02-28
Anticipated expiration: 2033-10-25
Also published as: JP2016500821A; WO2014063743A1; RU2015119512A; JP6543193B2; DK2912465T3; CN104854458A; CN104854458B; RU2666255C2; PT2912465T; TN2015000161A1; CA2889110A1; US20150301056A1; WO2014064283A1; MA38042B2; MA38042A2; MA38042A3

Abstract

Un procedimiento in vitro para la detección y diagnóstico temprano de cáncer en muestras biológicas de fluidos extracelulares en sujetos no diabéticos, que comprende las etapas de: a) determinar el nivel de producción de metilglioxal (MG) en una muestra biológica de dichos sujetos a partir de un fluido extracelular; b) comparar dicho nivel de producción con un valor de control, es decir, con el nivel de MG en sujetos sin cáncer; en el que si el nivel de producción de MG en dichas muestras biológicas es mayor que dicho valor de control, se considera que dichos sujetos padecen cáncer.

Description

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Dado que las células cancerosas consumen mayores cantidades de glucosa y producen y liberan mayores cantidades de MG de lo normal en el ámbito de la presente invención, la actividad metabólica de las células cancerosas en el compartimento extracelular en el organismo se caracteriza por un índice MG/G, definido como la proporción del nivel de producción de MG en sangre expresada en nmoles/g sobre el nivel de glucosa (G) en sangreexpresado en mmoles/l de acuerdo con la fórmula: Índice MG/G = MG/G en el que MG/G se expresa en µmoles/g.

En pacientes diabéticos sin cáncer existe una correlación positiva entre el nivel de glucosa, el porcentaje de hemoglobina glucosilada HbA1c y el nivel de producción de MG en la sangre (Beisswenger y col., Diabetes 1999). En otras palabras, en tales pacientes, cuanto mayor es la glucemia, mayor es el porcentaje de hemoglobina glucosilada HbA1c y mayor es el nivel de MG en circulación sanguínea. Esto explica por qué en la sangre de pacientes diabéticos sin cáncer hay un aumento simultáneo en los niveles de glucosa y MG. Por el contrario, en pacientes diabéticos con cáncer, un aumento significativo en el índice MG/G se relaciona con el hecho de que, debido a su mayor consumo de glucosa (el así llamado efecto de la "bomba de glucosa") y su mayor actividad glucolítica (Hsu y Sabatini, Cell 2008; Koppenol y col., Nat Rev Cancer 2011), las células cancerosas producen y liberan cantidades significativamente mayores de MG en la sangre, tal como los inventores han demostrado en el presente documento (véase a continuación); mientras que debido a su efecto específico de la bomba de glucosa, tienden de manera simultánea a disminuir la glucosa extracelular en el organismo; explicando por qué, a diferencia de lo que ocurre en los pacientes diabéticos, la glucemia permanece normal en pacientes con cáncer, incluso en estado avanzado.

En una realización preferida, la proporción de control (en lo sucesivo, en el presente documento citado como "índice MG/G normal de control") es el índice de la proporción MG/G que se ha determinado a partir de las muestras biológicas -preferentemente, muestras de sangre de sujetos que no tienen cáncer ni diabetes, preferentemente de sujetos sanos.

En el ámbito de la invención, el índice de la proporción MG/G normal de control es de aproximadamente 0,01, lo que se corresponde con el intermedio entre el valor de la mediana del índice MG/G obtenido de la sangre de los donantes sanos y el valor de la mediana del índice MG/G obtenido de la sangre de los sujetos normoglucémicos diabéticos tratados sin cáncer (véase la Figura 4).

En el ámbito de la presente invención, el índice MG/G de un paciente diabético es "significativamente mayor" o "mayor" que el índice MG/G normal de control, cuando dicho índice MG/G es 1,5 veces mayor, preferentemente 2 veces y, de manera más fiable, 3 veces mayor que dicho índice MG/G normal de control. Se dice que el paciente diabético tiene un alto riesgo de tener un cáncer (típicamente entre el 50 % y el 80 % de riesgo) cuando su índice MG/G es 2 veces mayor que dicho índice de control, y un riesgo incluso mayor (típicamente entre el 80 y el 100 % de riesgo) cuando su índice MG/G es 3 veces mayor que dicho índice de control.

Por el contrario, se dice que el índice MG/G de un paciente diabético es "significativamente menor" o "menor" que el índice MG/G normal de control, cuando dicho índice MG/G es 1,5 veces menor, preferentemente 2 veces, y más preferentemente 3 veces menor, que dicho índice MG/G normal de control. Se dice que el paciente tiene un bajo riesgo de tener un cáncer (típicamente entre el 20 % y el 50 % de riesgo), cuando su índice MG/G es 2 veces menor que dicho índice MG/G normal de control, y un riesgo incluso menor (típicamente un riesgo del 0-20 %) cuando su índice MG/G es 3 veces menor que dicho índice MG/G normal de control. Finalmente, se dice el índice MG/G de un paciente diabético es "similar al índice de control" si la proporción entre dicho índice MG/G y dicho índice de control está comprendida entre 0,8 y 1,2, preferentemente entre 0,9 y 1,1, más preferentemente de entre 0,95 y 1,05.

Tal como se usa en el presente documento, las expresiones "estadificación del cáncer" o "etapas del cáncer" designa la clasificación del cáncer dentro de las cuatro categorías reconocidas a nivel internacional, denominadas etapas I, II, III y IV. Estas cuatro etapas del pronóstico se determinan en el momento del diagnóstico, es decir, antes de que se administre cualquiera de los tratamientos anticancerígenos. La estadificación se ha basado principalmente en la clasificación 'TNM' del cáncer (en la que T es el tamaño y la invasión del tejido; N es la implicación de los nódulos linfáticos regionales, M es la metástasis distante). Dependiendo del tipo tumoral, la estadificación se puede determinar con otros sistemas de clasificación. De manera que, aunque por ejemplo se use frecuentemente la clasificación TNM para el cáncer de mama, para el cáncer de bronquios y para los cánceres de cabeza y cuello; se usa frecuentemente la clasificación FIGO (International Federation of Gynecologists and Obstetricians) para el carcinoma de ovario, y una clasificación de Dukes modificada para los cánceres de colon. Por lo tanto, en el ámbito de la presente invención, los inventores clasificaron los cánceres dentro de la clasificación de las cuatro etapas de pronóstico, I, II, III y IV al considerar que es la clasificación más frecuentemente usada para cada tipo de cáncer. Además, la etapa 0 se limitó a los cánceres no invasivos in situ.

Los términos "tratamiento", "tratando", "tratar" y similares usados en el presente documento, normalmente se refieren a obtener una respuesta farmacológica y/o fisiológica anticancerígena. El efecto puede ser profiláctico en el sentido de evitar la progresión del cáncer en sujetos asintomáticos, y/o puede ser terapéutico sensu stricto en pacientes sintomáticos, con el fin de obtener una estabilización parcial o completa o la cura del cáncer.

Más precisamente tal como se usa en el presente documento, la expresión "tratamiento anticancerígeno" se refiere bien a quimioterapia, a radioterapia, a cirugía o a cualquiera de las otras terapias biológicas o químicas usadas por

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demostrado ser un poderoso aceptor de electrones y, por tanto, es un compuesto extremadamente reactivo caracterizado por sus propiedades químicas y biológicas únicas.

En muchos organismos, incluyendo las bacterias, el MG se forma como un producto secundario de varias vías metabólicas. Se puede formar a partir de la 3-amino acetona, que es un intermediario del catabolismo de la treonina, así como a través de la peroxidación de lípidos. Sin embargo, la fuente más importante es la glucólisis, en la que el MG se genera a través de la eliminación no enzimática de fosfato de dihidroxiacetona fosfato (DHAP) y gliceraldehído-3-fosfato (G-3P).

Dado que el MG es altamente citotóxico, los organismos han desarrollado varios mecanismos de detoxificación. Uno de estos es el sistema de glioxalasa, que desempeña un papel importante en la protección de las células frente a la toxicidad electrófila, en particular, frente a la glucación dañina inducida por el MG. Durante este proceso, el MG activa la glioxalasa 1 (GLO-1) que usa el glutatión reducido (GSH) como un cofactor para convertir el MG en S-D-Lactoilglutatión (S-D-lactoilGSH), un intermediario metabólico que se degrada adicionalmente mediante la glioxalasa 2 (GLO-2) en D-lactato (Thornalley, Gen Pharmacol 1996). Es de destacar que se ha demostrado que la actividad de GLO-1 está aumentada en comparación con los tejidos normales en muchos cánceres humanos, que incluyen cáncer de colon, de pulmón, de mama, de ovario, de próstata, de vejiga, de riñón, de páncreas y de estómago y leucemia y melanoma y más en particular, en cánceres agresivos (Jones y col., Proteomics 2002; Zhang y col., Mol Cell Proteomics 2005). Además, la sobreexpresión de GLO-1 y de GLO-2 se ha correlacionado con la resistencia a multifármacos en tumores (Sakamoto y col., Blood 2000). Sin embargo, la actividad de GLO-2 es generalmente menor en tejidos cancerosos que en tejidos normales, lo que sugiere que, en comparación con las células normales, las células cancerosas podrían ser espontáneamente menos capaces de detoxificar el MG intracelular y de recuperar el GSH normal. Esto podría aumentar tanto el estrés carbonílico como el estrés oxidativo, por lo tanto, bien la promoción y la progresión del tumor o la apoptósis/necrosis, dependiendo de la concentración de radicales libres intracelulares (Irigaray y Belpomme, Carcinogenesis 2010).

Se ha descrito un papel del MG como una molécula de señalización. Együd y Szent-Györgyi sugirieron en primer lugar que GLO-1 y su sustrato MG están implicados en la regulación de la división celular (Együd y Szent-Gyärgyi, PNAS 1966). Más recientemente se ha sugerido que el MG regula la actividad del factor de transcripción NF-kB y la expresión del gen reportero inducida por NF-kB (Ranganathan y col, Gene 1999; Laga y col.). Además, se ha demostrado que la formación de los productos finales de la glucación avanzada (AGE, del inglés Advanced Glycation Endproducts) contribuyen al envejecimiento y posiblemente al desarrollo de afecciones patológicas generales, tales como diabetes (Brownlee, Nature 2001; Brownlee, Diabetes 2005), hipertensión arterial (Wang y col., J Hypertens 2005), proliferación de adipocitos relacionada con el sobrepeso/obesidad (Jia y col., PloS One 2012), enfermedad de Alzheimer (Smith y col., PNAS 1994) y cáncer (van Heijst y col., Ann N Y Acad Sci 2005).

La formación de MG intracelular aumenta en condiciones de hiperglucemia. Los niveles anómalos de aumento de MG en sangre se han evidenciado en pacientes con diabetes de tipo 1 y 2 (Beisswenger y col., Diabetes 1999) y recientemente, se ha descrito un mecanismo mediante el cual, el MG puede inducir resistencia a la insulina en diabetes de tipo 2 (Ribouley-Chavey y col., Diabetes 2006).

Algunos datos indican claramente que debido a su poderosa capacidad como aceptor de electrones, el MG es un poderoso agente de glucación y el precursor de AGE más reactivo (Shinohara y col., J Clin Invest 1998). No solo las proteínas, sino también los lípidos y los ácidos nucleicos son susceptibles de glucación por MG (Thornalley, Drug Metabol Drug Interact 2008).

Por lo tanto, por un lado, se cree que el MG contribuye al cáncer como un mutágeno potente y podría ser responsable de la génesis y del desarrollo del cáncer. Por otro lado, debido a sus propiedades citotóxicas proapoptóticas y/o pronecróticas relacionadas con la dosis, también se cree que es un fármaco anticancerígeno y se piensa que proporciona algunos efectos carcinostáticos en animales con cáncer (Conroy, Ciba Found Symp 1978) y en individuos con cáncer (Talukdar y col., Drug Metab Drug Interact 2008). Además, sobre la base de un posible efecto antitumoral de MG, varios compuestos relacionados con el MG tales como el compuesto metilglioxal-bis ciclopentil amidino hidrazina y el compuesto Mitoguazona, es decir, metilglioxal-bis(butilaminohidrazona), comercializado con el nombre de methylGAG® (NSC-32946) se han sintetizado con el fin de tratar el cáncer. Sin embargo, ni el MG ni estos compuestos sintéticos han demostrado tener realmente efectos antitumorales beneficiosos a través de los adecuados ensayos clínicos de fase I y II. A pesar de los avances en la comprensión de los efectos sistémicos del MG, muchos permanecen desconocidos. En gran parte, esto se debe a que el MG existe principalmente aducido, dado que debido a sus propiedades de glucación extremadamente altas, se une a los ligandos intracelulares y extracelulares (Chaplen y col., PNAS 1998). Complicando además el problema está que el MG interactúa de manera reversible o de manera irreversible con estos ligandos. Sin embargo, se ha demostrado que el MG de libre circulación se puede detectar en muestras de sangre obtenidas de pacientes que padecen diabetes tipo 1 o tipo 2 (Beisswenger y col., Diabetes 1999).

En 1959, Lewis, Majane y Winhouse, usando el procedimiento de Neuberg y Strauss, sugirieron claramente que la detección del MG en células cancerosas es despreciable (Lewis y col., Cancer Res 1959).

Además, en 1978, Brandt y Siegel especularon que la determinación directa de MG en tejidos biológicos es difícil

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La presente invención, por lo tanto, se basa en un procedimiento para la detección y el diagnóstico temprano de cáncer midiendo y analizando la producción in situ de MG por células cancerosas metabólicamente activas en muestras de células y/o de tejidos, usando cualquiera de los procedimientos químicos o inmunológicos in vitro para la medición del MG. Estos procedimientos incluyen el uso de la espectrometría de masas MALDI-TOF/TOF o de técnicas similares.

En consecuencia, la presente invención abarca el MG para su uso en un procedimiento para detectar cáncer midiendo y analizando la producción y la liberación de MG en muestras de tejido y/o de células usando biopsias de tejido, tal como se hace comúnmente para cualquier tumor sólido y/o cualquier frotis de células, tal como se usa comúnmente para el diagnóstico y el control de cáncer hematológico (leucemia, linfoma) y/o para la detección sistemática de algún cáncer sólido (de cuello uterino) así como de otros tipos de cáncer. Dado que la mayor parte del MG que se produce y libera a partir de las células cancerosas proviene de su elevada actividad glucolítica, la presente invención también abarca un procedimiento para determinar la agresividad proliferativa de un tumor y por tanto, puede contribuir a distinguir el cáncer de los tumores benignos o procesos inflamatorios, dado que la actividad metabólica de las células cancerosas está potenciada de manera general en comparación con la de células de tumores benignos o células inflamatorias.

2. MG como un biomarcador natural liberado por células cancerosas en fluidos extracelulares para la detección, el diagnóstico y la evaluación del pronóstico tempranos en sujetos no diabéticos.

En una segunda realización principal de la invención, la presente invención abarca un procedimiento para determinar la existencia de un tumor en dichos sujetos, midiendo los niveles de producción de MG en muestras biológicas del compartimento extracelular en el organismo; más preferentemente en la sangre periférica; y comparar el nivel de producción de MG medido con su valor normal de control.

La presente invención también se basa en un procedimiento in vitro para la detección y el diagnóstico temprano de cáncer en sujetos no diabéticos, que comprende las etapas de:

a) determinar el nivel de producción de MG en una muestra biológica de dichos sujetos a partir de un fluido extracelular, b) comparar dicho nivel de producción de MG con un valor de control, es decir, con el nivel de MG en sujetos sin cáncer en los que el nivel de producción de MG en dicha muestra biológica es mayor que dicho valor de control, dichos sujetos padecen cáncer o tienen un alto riesgo de tenerlo.

Por el contrario, cuando el nivel de producción de MG en dicha muestra biológica está dentro del intervalo de divo valor normal de control, dichos sujetos no padecen cáncer o tiene un bajo riesgo de tenerlo. La presente invención permite la detección y el diagnóstico de cáncer en sujetos humanos o animales que no son diabéticos, es decir, en sujetos que tienen un nivel de hemoglobina glucosilada, HbA1c por debajo del 7 %. En una realización preferida, el procedimiento de diagnóstico de la invención permite la detección de cánceres de cabeza y cuello, de bronquios y pulmón, de mama, de próstata, colorrectal, de páncreas y cánceres de otros tractos digestivos, además de los cánceres de ovario y endometrio, renal y de vejiga, leucemia y linfoma no hodgkiniano, melanoma y sarcoma. En una realización preferida, el valor de MG normal de control es el nivel de producción de dicho MG que se ha medido en una muestra biológica de individuos sanos. Preferentemente, este valor para sangre completa es 0,06 µM ± 0,02 con intervalo de confianza de 0,02 µM a 0.11 µM. Además, la presente divulgación también abarca un procedimiento para determinar la agresividad proliferativa de un tumor que comprende la etapa de medir el MG en una muestra biológica de dichos sujetos y comparar el nivel de producción de MG con su valor de control.

3. Detección y diagnóstico temprano de cáncer: pacientes diabéticos.

Existe una mayor incidencia de cáncer estadísticamente significativa en 30 pacientes de diabetes mellitus de tipo 1 y de tipo 2 no tratados. Sin embargo, se sabe que el nivel de producción de MG está aumentado en condiciones de hiperglucemia, es decir, en diabéticos no tratados o no tratados de manera correcta, (McLellan, Clin Sci 1994). Por lo tanto, el presente biomarcador de cáncer, MG, se confundiría en estos pacientes.

Un objeto de la divulgación es, por lo tanto, que el índice MG/G permite discriminar a estos pacientes que podrían tener un cáncer de aquellos que podrían no tenerlo, incluso en pacientes diabéticos. La evaluación de este índice, por lo tanto, permite la detección y diagnóstico temprano de cáncer en pacientes diabéticos y, en consecuencia, mejorará el pronóstico de cáncer en estos pacientes.

La presente divulgación, por lo tanto, se basa en un procedimiento in vitro para la detección temprana, para la detección sistemática y para diagnosticar cáncer en sujetos diabéticos, que comprende las etapas de:

a) determinar el nivel de producción de MG en una primera muestra biológica de dichos sujetos diabéticos, b) determinar el nivel de glucosa en una segunda muestra biológica de dichos sujetos, c) comparar la proporción de MG/G de estos dos niveles (índice MG/G) con la correspondiente proporción de control determinada en individuos sanos y en sujetos diabéticos normoglucémicos tratados, en los que si el índice MG/G obtenido en la etapa c) es mayor que dicha proporción correspondiente de control, se considera que dichos sujetos padecen cáncer o están en un alto riesgo de padecer cáncer; en los que si el índice MG/G

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celulares. El análisis o la detección de MG libre en muestras líquidas se puede realizar por medios convencionales conocidos en la materia, por ejemplo, usando la cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (RP-HPLC), ensayos ELISA u otros procedimientos que se han propuesto (véase Ohmori y col., J Chromatogr. 1987; McLellan y col., Anal Biochem 1992; Nemet y col., Clin Biochem 2004; Chaplen y col., Anal Biochem 1996).

En una realización preferida de la invención, dichas muestras biológicas líquidas se eligen de sangre completa, suero, plasma, orina, derrames pleurales o peritoneales, líquido cefalorraquídeo o líquidos digestivos. En una realización preferida de la invención, la detección de MG libre de origen natural se realiza añadiendo a la muestra de sangre un derivado de 1,2-diaminobenceno, preferentemente o-fenilenodiamina (o-PD). La reacción entre MG y o-PD de hecho forma quinoxalinas, que son fuertes cromóforos o fluoróforos o ambos, fácilmente cuantificados con RP-HPLC. Sin embargo, la invención también usa 1,2-diamino-4,5-dimetoxibenceno (DMB también denominado DDB) de acuerdo con el procedimiento descrito por McLellan y col. (McLellan y col., Anal Biochem 1992) que mide la quinoxalina resultante también mediante RP-HPLC.

Un procedimiento sencillo para cuantificar el nivel de MG en la muestra de sangre completa se proporciona en la parte experimental a continuación. En esta realización particular, la muestra de sangre completa se toma del sujeto por medios convencionales, y se mantiene inmediatamente sobre hielo antes de congelarla a -80 °C hasta que se mide el MG. Tras la descongelación, hasta la temperatura del procedimiento de derivatización, la muestra se mantiene a 4 °C, ya que el MG es muy reactivo e inestable. En una primera etapa, se añade ácido trifluoroacético (TFA) a la muestra de sangre completa descongelada para la precipitación instantánea de proteínas. La muestra se centrifuga a continuación a 4 °C y se recupera el sobrenadante. En una segunda etapa, la derivatización se realiza añadiendo o-PD o DMB al sobrenadante, y dicha mezcla se mantiene durante 4-6 horas a temperatura ambiente (23 °C) en la oscuridad. Se realiza una centrifugación final y se recupera el sobrenadante, para analizarlo usando RP-HPLC o cromatografía de gas, acoplada a un sistema de detección, que cuantifican ambos los niveles de MG de manera precisa.

Como alternativa a este procedimiento, los inventores proponen un procedimiento mejorado para simplificar la toma y el tratamiento de la muestra y la medición del MG. En este procedimiento alternativo, para la toma de la muestra, se usan los frascos que ya contienen TFA, las muestras se mezclan inmediatamente mediante inversión y se mantienen a 4 °C antes de congelarlas a -80 °C. De manera que después de la descongelación, la muestra se pueda centrifugar inmediatamente a 4 °C y obtener el sobrenadante, y derivatizarlo para la cuantificación del MG como anteriormente. La medición de MG también se puede hacer usando un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas cuantitativo de tipo sándwich (ELISA de tipo "sándwich") basado en la preparación de anticuerpos específicos frente a MG. La preparación de anticuerpos específicos contra el MG libre es crucial para la validez de este ensayo. Se comercializan varios kits de ELISA para MG humano.

En una realización preferida de la invención, los anticuerpos específicos para MG se recubren previamente sobre microplacas. Las muestras calibradas se introducen después en los pocillos de la microplaca recubiertos previamente, de manera que el MG libre que está presente en la muestra se une a los anticuerpos previamente recubiertos. Tras retirar cualquiera de las sustancias no unidas se añaden después directamente a los pocillos los anticuerpos anti-MG conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP, del inglés HorseRadish Peroxidase). Tras el lavado, a esto le sigue la adición de la solución del sustrato 3,3',5,5' tetrametil-bencidina (TMB) (un sustrato específico para el conjugado enzimático usado) a cada pocillo. Solo los pocillos que contengan MG evidenciarán un cambio en el color que se puede medir mediante espectrofotometría. Finalmente, los niveles de MG en las muestras se determinar mediante comparación con un patrón. Este inmunoensayo enzimático cuantitativo de tipo "sándwich" es una simplificación de los ensayos de ELISA comercialmente disponibles, que usan por ejemplo un sistema de anticuerpos conjugados con biotina acoplados a HRP conjugada con avidina. Dado que la validez de los ensayos ELISA de tipo "sándwich" dependerá de la especificidad y de la calidad de los anticuerpos anti-MG, tales ensayos deberían implicar controles regulares de RP-HPLC para cada nuevo reservorio de reactivos.

REDUCCIÓN DE RESULTADOS DE FALSOS NEGATIVOS Y DE FALSOS POSITIVOS

A partir de los datos presentados en el presente documento (véase la Fig 3 y los "Ejemplos") al medir el MG en la sangre completa de un paciente de cáncer mediante RP-HPLC, los inventores evaluaron la posibilidad de resultados de falsos negativos del 10 al 15 % del tiempo. En tales casos, se tuvieron que emplear otros procedimientos tales como aquellos de la invención que miden directamente el MG en tejidos o células. El error de falso positivo puede tener lugar en pacientes con insuficiencia renal crónica (Nakayama y col., Am J Nephrol 2008) y en pacientes con diabetes mellitus de tipo 1 y 2, pero la insuficiencia renal crónica y la diabetes se pueden reconocer y diagnosticar con facilidad, y los inventores han propuesto el uso de un índice MG/G para detectar cáncer en pacientes diabéticos. Tal como se indica anteriormente, además de la diabetes, Los AGE se han asociado con el envejecimiento y con varias enfermedades no cancerosas relacionadas con la edad, tales como hipertensión arterial, sobrepeso/obesidad y la enfermedad de Alzheimer. Se ha detectado un aumento en los niveles de MG en la pared de la pared arterial y en la sangre de ratas hipertensas (Wu y Juurlink Hypertension 2002) pero nunca se ha demostrado que los pacientes con hipertensión arterial común tengan unos niveles de producción de MG aumentados en su sangre. Se ha documentado un aumento en la glucación de proteínas y en los niveles de MG en el líquido cefalorraquídeo de los pacientes con enfermedad de Alzheimer, pero no se ha observado que el MG haya aumentado en la sangre

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periférica de los pacientes. Además, se descubrió que los parámetros asociados al producto final de la glucación avanzada detectados en la sangre periférica de los pacientes con enfermedad de Alzheimer eran valores más bajos en comparación con los controles sin demencia (Thorne J y col., Life Science 1996), un hallazgo que no sugiere que los niveles de MG en sangre puedan aumentar en tales pacientes. De hecho, a excepción de la insuficiencia renal crónica y la diabetes mellitus de tipo 1 y 2, no hay datos que apoyen la presencia de altos niveles de MG libre en sangre en seres humanos con enfermedades relacionadas con la edad tales como hipertensión arterial o la enfermedad de Alzheimer. Además, en sujetos normales sanos, no se consideró que el envejecimiento influyen en los niveles de producción de MG en sangre y los niveles de MG en sangre relacionados con la edad se incluyeron dentro de los valores del intervalo normal, de manera que el envejecimiento de por sí no podría suponer falsos positivos. Además, no se ha observado ningún aumento en los niveles de producción de MG en la sangre de varios pacientes con enfermedad inflamatoria crónica.

En otro aspecto, la presente divulgación se basa en un kit para la detección y el detección y diagnóstico temprano de cáncer, para la estadificación del cáncer, para la predicción de las probabilidades de supervivencia de los pacientes de cáncer, para el control de la respuesta terapéutica anticancerígena y para la predicción y la detección temprana de caquexia, que comprende:

-los medios para tomar muestras biológicas, -los medios para medir los niveles de producción de MG, -las instrucciones para usar dicho kit, -de manera óptima, una muestra de control (referencia).

En una realización preferida de la divulgación, dicho kit comprende las instrucciones y los medios para la detección in situ y la medición de MG en frotis celulares o tejidos mediante espectrometría de masas MALDI-TIF/TOF o técnicas similares y la cuantificación de MG, usando uno de los procedimientos disponibles:

• Un ensayo químico, que incluye o-PD o DMB, 2MQX o DMQ, MQX o DDQ para el análisis de RP-HPLC en fluidos extracelulares

Para el ensayo químico, dicho kit comprende los siguientes reactivos:

-Ácido trifluoroacético (TFA) para la precipitación de proteínas -o-fenilendiamina (o-PD) o 1,2-diamino-4,5-dimetoxibenceno (DMB también denominado DDB) para la

derivatización -El producto específico de quinoxalina que se corresponde con los agentes de derivatización usados: 2

metilquinoxalina (2-MQX) o 6,7-dimetoxi-2-metilquinoxalina (DMQ) para la curva de calibración. -Patrones que consisten en los derivados de quinoxalina 5-metilquinoxalina (5-MQX) o 6,7-dimetoxi-2,3-dimetil

quinoxalina (DDQ) para el patrón interno.

•: Opcionalmente, un ensayo químico que usa reactivos químicos para el análisis de espectrometría de masas MALDI-TOF/TOF para la medición del MG en tejidos sólidos o en frotis celulares.

•: Opcionalmente, un ensayo inmunológico enzimático cuantitativo de tipo "sándwich" basado en los anticuerpos monoclonales o policlonales que reconocen de manera específica el MG libre, para la medición de MG en fluidos extracelulares.

En otra realización preferida, el kit de la divulgación comprende adicionalmente los medios para detectar el nivel de producción de glucosa y las instrucciones para determinar el índice MG/G basado en los ensayos enzimáticos de la glucosa oxidasa o de la hexocinasa.

Ejemplo 1: Preparación de muestras de tejidos sólidos y medida de MG en tumores

Las muestras de tumores se obtuvieron 6 semanas después de que 90 ratas BD-IX macho y hembra (Charles River, Francia) se injertasen con células de cáncer de colon tumorigénicas PRO (45 hembras y 45 machos proporcionados por Charles River). Antes de cortarlos en secciones de 12 µm de espesor, los tumores se congelaron a -80 °C y se fijaron mediante agua ultrapura durante el procedimiento de criostato a -20 °C. Las secciones se pusieron después sobre placas MALDI específicas (proporcionadas por Bruker) y las preparaciones se trataron con etanol, después con o-PD (al 0,01 %) (Signa Aldrich, Francia) antes de incubarlas en una cámara humidificada durante toda la noche a una temperatura ambiente en la oscuridad. Tras esta incubación, las secciones se secaron (usando un desecador) y se recubrieron con una solución de matriz de ácido α-ciano-4-hidroxicinámico. (HCCA) (proporcionado por Sigma Aldrich). Analizando el efecto sobre 2MQX (2-metilquinoxalina) (proporcionado por Sigma Aldrich) con espectrometría de masas MALDI-TOF/TOF(Bruker UltraFlex III), se seleccionaron dos fragmentos moleculares de 2MQX, uno de 91 Da y el otro de 118 Da, que permitieron la detección de MG en el tumor tras el análisis de imágenes MS/MS.

Los intervalos de control se prepararon tal como sigue: el patrón interno 5MQX (5-metilquinoxalina) (proporcionado por Sigma Aldrich) se usó a 0,4 µM y se mezcló a su concentración final con cada alícuota de 2MQX, preparada de acuerdo con un intervalo de concentraciones, desde 0 hasta 1,6 µM. Las diluciones se hicieron con agua ultrapura. El análisis se hizo usando la espectrometría de masas MALDI-TOF/TOF.

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Ejemplo 2: Preparación de muestras de fluidos extracelulares y medida de MG en sangre:

Los sujetos tuvieron que estar en ayunas durante 8-12 horas antes del muestreo, dado que el MG puede estar presente en algunos alimentos y bebidas. Las muestras de sangre se recolectaron a 4 °C y el análisis se pudo hacer sobre sangre completa dado que el MG está a concentración constante en glóbulos rojos. Esta posibilidad proviene del hecho de que en los glóbulos rojos, el MG se produce de manera no enzimática a una tasa constante a partir de glicerona fosfato y gliceraldehído-3-fosfato (Thornalley, Biochem 1989).

Se ha usado un procedimiento basado en un proceso de derivatización seguido por cromatografía de gas/espectrometría de masas (GC/MS). La preparación y cuantificación del MG se hace usando un procedimiento de cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (RP-HPLC) que implica la derivatización bien con o-PD o DMB acoplado con un análisis de espectrometría de masas. En resumen, tras la centrifugación de la sangre completa a 4 °C, el procesamiento requiere la precipitación de proteínas con ácido trifluoroacético (TFA), la incubación del sobrenadante con el agente de derivatización o-PD o DMB durante 4-6 horas a 23 °C en la oscuridad, y el análisis cuantitativo del MG tras su conversión en 2MQX para o-PD, o 6,7-dimetoxi-2-metilquinoxalina (DMQ) para DMB.

Las soluciones patrón se prepararon tal como sigue: La concentración de la solución madre acuosa de MG se determinó de manera enzimática mediante ensayo de criterios de valoración. La cuantificación del MG implica la conversión a S-D-lactoilglutatión mediante glioxalasa I en presencia de glutatión reducido (GSH). Se prepararon patrones de calibración que contienen 0,0625-1,6 nmol de MG en 1 ml de agua. La derivatización se llevó a cabo mediante el procedimiento descrito anteriormente. Las curvas de calibración se construyen representando gráficamente las proporciones del área de los picos de 2MQX y 5MQX (patrón interno) frente a las concentraciones de MG para el agente de derivatización o-PD o representando gráficamente las proporciones del área de los picos de DMQ y 6,7-dimetoxi-2,3-dimetil-quinoxalina (DDQ) (patrón interno) frente a las concentraciones de MG para el agente de derivatización DMB.

Con el fin de identificar y determinar la concentración de MG en la sangre, los derivados de quinoxalina 2MQX y 5MQX, para o-PD, y DMQ y DDQ para DMB se resuelven mediante RP-HPLC y se analizan mediante ionización de electronebulización/monitorización de iones seleccionados (ESI/SIM). Finalmente, la cuantificación del MG se realiza calculando la proporción del área del pico de la intensidad del pico del ion molecular protonado (m/z de 145 para 2MQX y m/z de 205 para DMQ) para una intensidad de pico de iones de patrón interno molecular (m/z de 145 para 5MQX y m/z de 218 para DDQ) en el modo de monitorización de iones seleccionados (SIM).

Ejemplo 3: Experimentos in vitro

La medida de la producción de MG por las células cancerosas en comparación con las células normales se ha hecho usando cultivos tisulares in vitro. En un experimento típico que usa cultivos celulares, la producción de MG por las células cancerosas en el medio acondicionado (MA) de la línea celular HCT116 de carcinoma colorrectal humano se hizo usando LC-MS/MS. Las células se cultivaron bien en condiciones de baja glucosa (5,6 mM) o en condiciones de elevada glucosa (25 mM) y se recogieron tras 48 horas.

Se descubrió que la producción de MG en el MA es 10 veces superior en condiciones de elevada glucosa (concentración de MG de 0,05917 µM) que en condiciones de baja glucosa (concentración de MG de 0,00515 µM), demostrando que las células cancerosas sintetizan MG a partir de glucosa y, por lo tanto, usan principalmente la glucólisis para la producción de ATP.

Los experimentos adicionales demostraron que esta dependencia de la dosis implica a diversos tipos de células cancerosas; mientras que debido al bajo consumo de glucosa y a la glucólisis, las células normales sintetizan y liberan menos MG.

Ejemplo 4: Experimentos in vivo

En una serie de 101 pacientes consecutivos con una variedad de tipos y localizaciones de cánceres en diferentes etapas de su enfermedad se examinó la presencia de MG en la sangre y los niveles obtenidos en los pacientes de cáncer se compararon con los obtenidos en una serie de 36 individuos normales de control ajustados a la edad y el sexo y con los de 12 pacientes normoglucémicos tratados por diabetes mellitus de tipo 2 (además de 6 pacientes de diabetes mellitus de tipo 2 usados como un control positivo para el ensayo). Los criterios de inclusión para los pacientes de cáncer fueron un diagnóstico patológico de cáncer, la ausencia de tratamiento previo, la presencia de un enfermedad clínicamente y/o biológicamente perceptible, la ausencia de diabetes mellitus, la insuficiencia renal y otras enfermedades crónicas.

Los criterios de inclusión para los controles normales fueron la ausencia de cáncer, diabetes mellitus, hipertensión arterial, enfermedad de Alzheimer e insuficiencia renal; para los pacientes con diabetes de tipo 2 no insulinodependientes, que no tuviesen complicaciones asociadas a la diabetes y para los pacientes diabéticos tratados, una hemoglobina glucosilada, HbA1c <= al 7 % y una glucemia normal. Para todos los sujetos incluidos, los criterios de inclusión fueron no fumar, no consumir alcohol ni café 24 horas antes del momento de la recogida de la muestra, y todos los pacientes con elevado consumo de tabaco y/o adicción al alcohol se excluyeron del estudio. El

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IMC así como la medida de la glucosa e insulina en sangre se determinaron de manera seriada de acuerdo a los procedimientos convencionales en los primeros 66 pacientes incluidos y en todos los controles.

Ejemplo 5: modelos animales in vivo

Se llevó a cabo un conjunto de experimentos usando animales de laboratorio, en particular, el modelo de cáncer de colon trasplantado inducido por 1-2 dimetilhidrazina en ratas singénicas BDIX, para lo cual, dos clones de células de carcinoma, (DHD-K12/SRb y DH-K12/JSb) se seleccionaron previamente in vitro para formar tumores progresivos (PROb) y tumores regresivos (REGb), respectivamente, cuando se injertaron a las ratas. En estos experimentos, las muestras de sangre para la medición del MG y de otras moléculas tales como glucosa e insulina se recolectaron en las semanas 2, 3, 4, 6 y 9. Al mismo tiempo, se midieron las masas tumorales para la evaluación tumoral. El análisis estadístico se realizó usando JMP 7 (SAS Software, NC, EE.UU.). La significación estadística se determinó usando el test exacto de Fisher y la prueba de la t de Student de dos colas.

El tumor de colon es un adenocarcinoma que se obtuvo de ratas BD-IX 6 semanas después del trasplante de células de cáncer de colon tumorigénicas PRO (véase anteriormente). En 1 y 2 de la Fig 2, el tumor se asocia claramente con una gran zona necrótica que predomina en su parte media e inferior. Esto se evidencia particularmente bien en 2 de la Fig 2, lo que se corresponde con la tinción tumoral mediante hematoxilina-eosina-safrán.

El MG se ha localizado en el tumor detectando los dos fragmentos moleculares de 2MQX, uno de 91 Da y el otro de 118 Da tras el análisis de imágenes de MS/MS mediante MALDI-TOF/TOF. Esto permitió obtener los escaneos tumorales que se muestran en 3 y 4 de la Fig 2, respectivamente.

Los escaneos en 3 y 4 son ejemplos que demuestran que los tumores malignos son capaces de producir altas cantidades de MG, mientras que el análisis del tejido normal de control usando el presente procedimiento no reveló MG detectable o lo hizo en baja cantidad. Tal como se documenta en los escaneos 3 y 4 de la Fig 2, no estaba claro si se detectó el MG intracelular, extracelular o ambos. Sin embargo, en el escaneo 3 de la Fig 2 (que se corresponde con el fragmento de 2MQX de 91 Da), la cantidad de MG parece ser menos abundante en la zona necrótica del tumor, aunque parece que se detecta principalmente en la parte proliferativa activa del tumor.

Ejemplo 6: Pacientes de cáncer

Los resultados de la Tabla 1 demuestran que el valor medio y los valores extremos de los niveles de MG en sangre en pacientes de cáncer son significativamente superiores que los de los normales de control, tanto en hombres como en mujeres, y en pacientes normoglucémicos tratados de diabetes mellitus de tipo 2. No se descubrió una diferencia significativa entre los sujetos normales y los pacientes normoglucémicos tratados de diabetes mellitus de tipo 2 usados como control.

Además de la determinación del MG en sangre, a los pacientes con cáncer demostrado de manera patológica se les investigó de manera prospectiva y seriada la glucosa y la insulina en sangre antes del tratamiento anticancerígeno. Se realizó una investigación similar en sujetos normales. En pacientes de cáncer, no se halló una correlación significativa entre los niveles de MG en sangre y la glucemia, aunque los niveles de MG en sangre tendían a correlacionarse de manera inversa con la insulinemia (datos no mostrados), lo que significa que en pacientes de cáncer, el nivel de MG en sangre es un parámetro relativamente independiente. Se halló un resultado no significativo en los controles normales. Tales datos, por lo tanto, significan que la detección de un aumento en el nivel de MG en sangre en pacientes diabéticos tratados de manera correcta, es decir, en pacientes con glucemia normal y con HbA1c normalizada, se podría deber a, como en los sujetos sanos no diabéticos, una consecuencia del cáncer.

Las medidas sistemáticas del MG en pacientes normoglucémicos tratados de diabetes se justifican, por lo tanto, como una alta incidencia de determinados tipos de cáncer que incluyen los cánceres colorrectal, de páncreas, de hígado, de mama,y de vejiga, se ha demostrado que se asocian de manera significativa con la diabetes mellitus de tipo 1 o 2.

Los resultados de la Tabla 2 desvelan una comparación de los niveles de MG en sangre en pacientes de cáncer de acuerdo con los tipos de tumor:

De hecho, en comparación con los controles normales (y los pacientes normoglucémicos tratados de diabetes de tipo 2) los niveles de MG en sangre están significativamente aumentados en pacientes que padecen cánceres de cabeza y cuello, de pulmón, de mama, de próstata, colorrectal, de páncreas y/o otros cánceres digestivos y demuestran que, en estos pacientes, los diferentes valores de MG son entre 1,5 y 2 veces mayores que el valor normal de control, en función del tipo tumoral. Cabe destacar la diferencia estadísticamente significativa con respecto a los controles normales del nivel de MG obtenido para los cánceres de mama y de próstata, que son los cánceres más frecuentes; y las diferencias altamente y estadísticamente significativas de los niveles de MG para los cánceres de pulmón, colorrectal, de páncreas y de cabeza y cuello, para los que actualmente no existen biomarcadores de detección temprana.

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Claims

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