CN110604823B - 一种快速筛选抗糖化和/或抗衰老物质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种快速筛选抗糖化和/或抗衰老物质的方法，以含有待测潜在活性物质的蔗糖水溶液饲喂1‑3日龄果蝇，同时以仅饲喂蔗糖水溶液作为参照组，然后将两组果蝇饥饿处理，最后用丙酮醛饲喂，每隔一段时间统计果蝇死亡数量，直至两组的果蝇全部死亡；统计参照组的果蝇死亡率40％‑60％时，实验组果蝇的存活情况，判断待测潜在活性物质是否能够延长果蝇存活时间，如果能，则该物质为抗糖化和/或抗衰老物质。本发明在7天的实验周期内，相对于传统的细胞模型和其他动物模型，以极低的经济代价，就可以确认一种物质是否具有抗糖化和抗衰老的活性，为大规模高通量筛选具有抗糖尿病和抗衰老相关疾病的活性物质提供了一个卓越的平台。

Description

一种快速筛选抗糖化和/或抗衰老物质的方法
技术领域
本发明属于衰老研究技术领域，具体涉及一种快速筛选抗糖化和/或抗衰老物质的方法，可在7日内在动物模型中发现抗衰老活性物质。
背景技术
随着经济发展，医疗条件逐步改善，人均寿命也在大幅提高。我国国民的平均预期寿命已经从新中国成立时的35岁提高到2018年的77岁。同时，由于老年人比例的逐步提升，我国已经进入人口老龄化社会，也是世界上老年人口最多的国家。而由于老年人口越来越多，老年相关疾病，如糖尿病，癌症，心脑血管疾病，神经退行性疾病等发病率逐年提高，导致老年人致残率大幅升高，除了对社会经济造成了巨大的压力，同时也对患病个人及其家庭造成了很大的精神和经济压力。
在我国已经解决温饱问题以后，人民对健康的需求越来越高，对健康寿命的追求越来越迫切，期望在老年阶段少患病，有好的身体。世界卫生组织的报告显示，2018年中国婴儿出生时的健康预期寿命为68.7岁。因此，如何通过简单可行的策略改善老年人的健康状况，提高健康寿命，让他们安度晚年，对于经济发展和以及他们的家人，都意义重大。
为了抑制衰老对人体造成的负面影响，我们可以开发一些真正具有抗衰老的活性物质，而不是仅仅流行的具有抗氧化作用的物质。
衰老相关的假说有200多种，但是至今没有一种获得完全证实。为了快速开发具有真实的抗衰老活性的物质，本申请人选择抗糖化作为筛选的标准。因为糖化可以导致多种症状，包括体力下降，血管硬化，组织损伤，动脉粥样硬化，肝脏功能下降，肾脏功能下降，神经痛，皮肤皱纹，炎症等各种健康问题，同时糖化也是糖尿病导致各种并发症的关键机制，比如糖化可导致心脑血管疾病，白内障等。综上所述，糖化是导致衰老的一大关键原因。因此本申请人选择抗糖化作为抗衰老的模型。
人体中导致糖化的关键分子是醛类，而自然产生最多的醛类就是丙酮醛(Methylglyoxal)，其主要来自于糖代谢中间产物3-磷酸甘油醛(Glyceraldehyde-3-phosphate)，由于3-磷酸甘油醛转换成丙酮醛不需要能量以及酶催化，而几乎所有的细胞都会利用糖代谢产生能量，因此丙酮醛的产生是不可避免的。同时，蛋白质和脂类的代谢也会产生丙酮醛，所以丙酮醛的产生在人体内是不可避免的。
现有的衰老模型主要是酵母，果蝇，线虫，小鼠，大鼠，猴等。其中酵母为单细胞生物，难以模拟多细胞生物的生理反应，而线虫仅有不到1000个细胞，过于简单，在遗传上与人类差异较大，缺乏完整的神经系统，同时操作比较困难，不适合高通量筛选；大小鼠寿命为2-4年，即使是时间最短的早衰模型也需要40天左右，而且小鼠对潜在活性物质的需求量也比果蝇高很多倍，因此小鼠模型不能像果蝇模型一样进行高通量筛选；猴子的寿命约为20岁左右，实验周期太长，同时潜在活性物质消耗量太大，因此大小鼠和猴子不适合在极短时间内测试潜在的抗衰老药物，同时高通量筛选代价太大。在常见的衰老动物模型中，果蝇具有完整的中枢神经和外周神经，与人功能类似的多种器官组织，如心脏，肠道，同时人类75％的致病基因在果蝇中具有同源基因，且果蝇可在玉米培养基培养，人肉眼就可以挑取，计数。因此，本申请人建立了新的果蝇衰老模型以在一周之内筛选抗衰老活性物质。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种快速筛选抗糖化和/或抗衰老物质的方法。以果蝇为动物模型，在7天内就可以判断一种物质是否具有抗糖化和/或抗衰老的活性。这一筛选系统将同时为2型糖尿病的防治药物开发提供一个全新的高效平台。
为了实现发明目的，本发明采用的技术方案为：
本发明提供一种快速筛选抗糖化和/或抗衰老物质的方法，以含有待测潜在活性物质的蔗糖水溶液饲喂1-3日龄果蝇12-36小时，同时以仅饲喂蔗糖水溶液作为参照组，然后将两组果蝇饥饿处理1-8小时，最后用丙酮醛持续饲喂，每隔一段时间统计果蝇死亡数量，直至两组饲喂丙酮醛的果蝇全部死亡；统计参照组的果蝇死亡率40％-60％时，饲喂待测潜在活性物质的果蝇的存活情况，判断待测潜在活性物质是否能够延长果蝇存活时间，如果能，则待测潜在活性物质为抗糖化和/或抗衰老物质；如果不能，则不是抗糖化和/或抗衰老物质；
作为优选，将果蝇饥饿处理2小时；
作为优选，以有待测潜在活性物质的蔗糖水溶液饲喂1-3日龄果蝇24小时。
作为优选，还包括对照组，在对照组中，将丙酮醛替换为蔗糖水溶液。
作为优选，所述果蝇饲喂用的食物的制备方法：首先将80克玉米粉，137.5克蔗糖，6.5克琼脂，23.5克酵母放入775毫升去离子水搅拌均匀，然后煮熟；等食物冷却至50-60℃，加入2克苯甲酸钠，6.25毫升丙酸，150毫升去离子水混匀，得到1升果蝇食物。
作为优选，所述1-3日龄果蝇的获得方法为：将果蝇饲养在23-25℃，50％-85％湿度的环境下，每瓶放32-44只果蝇，其中雄蝇与雌蝇比例为1:3，每2-3天将成虫换到装有新鲜配制的果蝇食物的食物瓶中，从而确保新孵出的成虫年龄比较接近，得到1-3日龄果蝇。
作为优选，所述分别以蔗糖水溶液和含有待测潜在活性物质的蔗糖水溶液饲喂1-3日龄果蝇12-36小时时，是将单一性别的1-3日龄果蝇放入已经加了蔗糖水溶液或者含有待测潜在活性物质的蔗糖水溶液的玻璃果蝇管中，每根玻璃果蝇管底部都铺有2-5片直径24毫米的普通滤纸，放入果蝇之后，盖上海绵塞。
作为优选，所述蔗糖水溶液的浓度为3-10％，所述百分比为重量体积比，重量的单位为g，体积的单位为ml；
作为优选，所述蔗糖水溶液的浓度为5％。
作为优选，所述含有待测潜在活性物质的蔗糖水溶液的获得方法为：
如果待测潜在活性物质是水溶性的，则将待测潜在活性物质直接溶解到3-10％蔗糖水溶液中，浓度为0.001％-0.1％，所述百分比为重量体积比，重量的单位为g，体积的单位为ml；
如果待测潜在活性物质是脂溶性的，则将待测潜在活性物质先用100-250微升100％乙醇溶解，然后加到滤纸上，等乙醇完全挥发后，再将100-250微升3-10％蔗糖水溶液加入到滤纸上；待测潜在活性物质与蔗糖水溶液的重量体积百分比为0.001％-0.1％，重量的单位为g，体积的单位为ml。
作为优选，所述将果蝇饥饿处理是将果蝇转入滤纸上仅添加蒸馏水的玻璃瓶中，盖上海绵塞，饥饿培养1-8小时。
作为优选，所述用丙酮醛饲喂是将果蝇放入含有丙酮醛的蔗糖水溶液的玻璃果蝇管中，每根玻璃果蝇管底部都铺有2-5片直径24毫米的普通滤纸，放入果蝇之后，盖上海绵塞；
作为优选，所述丙酮醛在蔗糖水溶液中的重量百分比为3-10％；
作为进一步优选，所述丙酮醛的重量百分比浓度为6％；
作为优选，筛选过程中，环境温度维持在25℃；
作为优选，确保果蝇处于保湿的环境中。
本发明的主要模型为果蝇的丙酮醛毒理模型，通过简单的饲喂，就可以快速判断一种物质是否具有类似二甲双胍的抗糖化活性以及抗衰老活性。本发明在7天的实验周期内，相对于传统的细胞模型和其他动物模型，以极低的经济代价，就可以确认一种物质是否具有抗糖化和抗衰老的活性，为大规模高通量筛选具有抗糖尿病和抗衰老相关疾病的活性物质提供了一个卓越的平台。这为本发明用于高通量筛选提供了坚实的理论和实践基础。
本发明整合了传统中医药中的抗衰老理论和现代科学中普遍采用的果蝇毒理学模型，根据导致衰老的最基本的机制，设计了高效率的筛选抗糖化和/或抗衰老物质的技术平台，本发明与现有技术平台相比具有以下优势：
1.成本低。因为果蝇食物主要成分价格低，而且维持25℃的环境用普通空调就可以完成，玻璃果蝇管可以重复使用，所以代价低，便于开展大规模筛选。单只果蝇只有1毫克左右，待筛选药物需求量极小，有利于低成本地快速地筛选一些价格昂贵的物质。
2.速度快。这是目前为止已知的可发现具抗衰老活性物质的最快的动物模型，会极大的节省筛选时间和经济成本。
3.数据可信。每管动物数可达20只甚至更多，因此3次的实验后每一组的动物数量可达到60只或以上，而表型就是果蝇的存活，结果不存在主观成分，统计结果更可信。
4.可自动化。果蝇食物配制可以自动化，饲养可以自动化，果蝇分离可自动化，果蝇存活率统计与分析也可以自动化，因此大规模自动化很有希望。
5.此模型也可作为新的抗糖尿病活性物质筛选模型。作为一种“富贵病”，2型糖尿病的发病率在我国18岁以上成人已经达到10.4％，男性11.1％，女性9.6％，而60岁以上的老年人糖尿病患病率均在20％以上。因此，开发新的有望治愈2型糖尿病的新药，让糖尿病人摆脱终生用药，就显得非常迫切。
6.可快速确定待测物质的毒性，同时果蝇实验不涉及伦理问题。即使是新合成的毒性未明的化合物也可以利用果蝇模型快速检测，不经过细胞实验就可以获得相关化合物的毒性及潜在的抗衰老活性，降低了研发风险。
本发明相对于传统的抗糖化和/或抗衰老物质筛选方法，具有操作简单，需要潜在活性物质的量极低，成本低廉等优点，可高通量筛选潜在活性物质，快速发现具有抗糖化和/或抗衰老的活性物质。利用这一方法，本申请人已经发现天然产物提取物以及小分子化合物具有显著的抗衰老活性。本发明将加速开发新型抗衰老药物、化妆品，有利于企业在相关领域占得先机。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为果蝇在不同的处理下的存活率。
图2为本发明方法的准确性验证实验。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。
本发明中所用的材料：
w1118果蝇
玉米粉
安琪酵母
蔗糖
琼脂(Agar，A109144，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)
苯甲酸钠(S104124-5kg，国药集团化学试剂有限公司)
丙酸(P110449-1L，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)
丙酮醛(M109035，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)
盐酸二甲双胍(M107827，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)
黄芪多糖(天津赛诺制药有限公司)。
本发明中所用的试剂：
3-10％蔗糖水溶液：将3g-10g蔗糖加入70ml去离子水中，搅拌均匀，定容至100ml，得到3-10％蔗糖水溶液。比如需获得5％蔗糖水溶液，则将5g蔗糖加入70ml去离子水中，搅拌均匀，定容至100ml，得到5％蔗糖水溶液。
本发明根据导致衰老的最基本的生物化学机制，结合果蝇的病理毒理模型，首次将筛选抗糖化和/或抗衰老活性物质的时间缩短到一周之内。
本申请人通过尝试不同物质的浓度：蔗糖浓度，从2％至20％的浓度都进行了尝试，浓度低于3-10％果蝇的状态不好，浓度高于3-10％浪费蔗糖，同时影响果蝇生理健康，最佳浓度为5％；丙酮醛从2％至12％的浓度都进行了尝试，浓度低于3-10％时果蝇死亡太慢，而高于3-10％时果蝇死亡又太快，最佳浓度为6％。另一方面，待测潜在活性物质处理时间，比较了12-48小时，发现12-36小时的喂养时间就可以充分体现出待测潜在活性物质的药效，最优时间为24小时。比较不同的饥饿时间，0-12小时，发现1-8小时比较合适，时间太短难以完全消除待测潜在活性物质与丙酮醛在果蝇体内的直接反应可能，时间太长会导致大部分甚至所有待测潜在活性物质代谢掉，最佳时间为2小时；通过比较先用待测潜在活性物质还是丙酮醛处理果蝇，发现先用待测潜在活性物质的重复性更好。通过大量的比较尝试，本发明发现了可在一周内筛选出具有抗衰老活性的物质的方法，具体配方和步骤如下：
实验分为四组，分别为：
第一组：果蝇处理步骤：蔗糖+饥饿+蔗糖；
第二组：果蝇处理步骤：待测潜在活性物质+饥饿+蔗糖；
第三组：果蝇处理步骤：蔗糖组：蔗糖+饥饿+丙酮醛；
第四组：果蝇处理步骤：潜在活性物质组：待测潜在活性物质+饥饿+丙酮醛。
第一组和第二组是对照组，目的是为了证明蔗糖并不会导致果蝇在实验期间内死亡，待测潜在活性物质也没有毒性，不会导致果蝇在实验期间内死亡。
将1-3日龄果蝇用100-250微升3-10％的蔗糖水溶液或者含有待测潜在活性物质的蔗糖水溶液处理12-36小时，然后将果蝇转入仅添加蒸馏水的玻璃瓶中，饥饿培养1-8小时后，换成新鲜的100-250微升3-10％蔗糖水溶液，或者100-250微升添加了重量百分比3-10％衰老诱导剂丙酮醛的3-10％蔗糖水溶液继续处理果蝇，并每8-12小时计数果蝇的死亡数量，直至第三和第四组果蝇全部死亡。在上述实验过程中，实验环境温度维持25℃。
比较当第一组和第二组果蝇没有死亡的情况下，第三组果蝇死亡40％-60％时，饲喂潜在活性物质组的果蝇的存活情况，重复3次以上，确定待测潜在活性物质是否真的可以延长致死压力下的果蝇存活时间。根据不同组别的存活率差异确定待测潜在活性物质是否真的具有抗衰老活性，能够可以提高果蝇的抗衰老能力，延长果蝇寿命，从而发现新的抗衰老的物质。
在实验过程中，1升果蝇饲喂用的食物的制备方法为：首先将80克玉米粉，137.5克蔗糖，6.5克琼脂，23.5克酵母放入775毫升去离子水搅拌均匀，然后煮熟。等食物冷却至50-60℃，加入2克苯甲酸钠，6.25毫升丙酸，150毫升去离子水混匀。然后将食物分装到尺寸为24毫米×95毫米的玻璃果蝇管中，每根玻璃果蝇管中放入20-30毫米深的食物，用来饲养并繁殖果蝇。
1-3日龄果蝇的获得方法为：将果蝇饲养在23-25℃，50％-85％湿度的环境下，每瓶放40只左右果蝇，其中10只左右雄蝇，30只左右雌蝇，每2-3天将成虫换到装有新鲜配制的果蝇食物的食物瓶中，从而确保新孵出的成虫年龄比较接近，得到1-3日龄果蝇。将1-3日龄果蝇用麻醉枪麻醉，放在白色透气圆盘上，用毛刷分离雄蝇和雌蝇。
将分离后的单一性别的20只果蝇(雄蝇或雌蝇)放入已经加了蔗糖水溶液或者含有待测潜在活性物质的蔗糖水溶液的玻璃果蝇管中，每根玻璃果蝇管底部都铺有2-5片直径24毫米的普通滤纸。在放入果蝇之后，盖上海绵塞，之后将玻璃果蝇管放在可以保湿的盒子中，防止干燥。
整个实验期间，玻璃果蝇管均放在湿盒里以防止滤纸片上的液体蒸发。
含有待测潜在活性物质的蔗糖水溶液的获得方法为：
如果是水溶性的，则将待测潜在活性物质直接溶解到3-10％蔗糖水溶液中，待测潜在活性物质浓度为0.001％-0.1％，所述百分比为重量体积比，重量的单位为g，体积的单位为ml。
如果是脂溶性的，则将待测潜在活性物质先用100-250微升100％乙醇溶解，然后加到滤纸上放置过夜，等乙醇完全挥发后，再将100-250微升3-10％蔗糖水溶液加入到滤纸片上，用于果蝇的活性物质筛选实验；待测潜在活性物质与蔗糖水溶液的重量体积百分比为0.001％-0.1％，重量的单位为g，体积的单位为ml。对照组则是直接将100％乙醇加到滤纸上放置过夜，等乙醇完全挥发后，再将100-250微升3-10％蔗糖水溶液加入到滤纸片上。
进行丙酮醛处理时，是将丙酮醛溶解在3-10％蔗糖水溶液里，丙酮醛在蔗糖水溶液中的重量百分比浓度为3-10％，然后将丙酮醛的蔗糖水溶液加入玻璃果蝇管中。
各步骤操作中，每根玻璃果蝇管底部都铺有2-5片直径24毫米的普通滤纸。
果蝇品系可以为实验室常用的w1118果蝇，选用年龄在1-3天的雄性果蝇或雌性果蝇，所有果蝇随机分配到装有添加不同物质滤纸片的玻璃管中，每管20只果蝇。
实施例1
本发明的一种快速筛选抗糖化和/或抗衰老物质的方法步骤如下：
实验分为四组，分别为：
第一组：果蝇处理步骤：蔗糖+饥饿+蔗糖；
第二组：果蝇处理步骤：待测潜在活性物质+饥饿+蔗糖；
第三组：果蝇处理步骤：蔗糖组：蔗糖+饥饿+丙酮醛；
第四组：果蝇处理步骤：潜在活性物质组：待测潜在活性物质+饥饿+丙酮醛。
(1)1L果蝇饲喂用的食物的制备方法为：首先将80克玉米粉，137.5克蔗糖，6.5克琼脂，23.5克酵母放入775毫升去离子水搅拌均匀，然后煮熟。等食物冷却至60℃，加入2克苯甲酸钠，6.25毫升丙酸，150毫升去离子水混匀。然后将食物分装到尺寸为24毫米×95毫米的玻璃果蝇管中，每根玻璃果蝇管中放入30毫米深的食物，用来饲养并繁殖果蝇。
(2)1-3日龄果蝇的获得：将w1118果蝇饲养在25℃，70％湿度的环境下，每瓶放40只果蝇，其中10只雄蝇，30只雌蝇，每3天将成虫换到装有新鲜配制的食物瓶中，从而确保新孵出的成虫年龄比较接近，得到1-3日龄果蝇。将1-3日龄果蝇用麻醉枪麻醉，放在白色透气圆盘上，用毛刷分离雄蝇和雌蝇。
(3)含有待测潜在活性物质的蔗糖水溶液的获得方法为：如果是水溶性的，则将待测潜在抗衰老活性物质直接溶解到5％蔗糖水溶液中，浓度为0.002％，所述百分比为重量体积比，重量的单位为g，体积的单位为ml。
如果是脂溶性的，则将待测潜在抗衰老活性物质先用150微升100％乙醇溶解，然后加到滤纸上放置过夜，等乙醇完全挥发后，再将150微升5％蔗糖水溶液加入到滤纸片上，用于果蝇的活性物质筛选实验；待测潜在活性物质与蔗糖水溶液的重量体积百分比为0.002％，重量的单位为g，体积的单位为ml。对照组则是直接将100％乙醇加到滤纸上放置过夜，等乙醇完全挥发后，再将150微升5％蔗糖水溶液加入到滤纸片上。
(4)将步骤(2)分离后的单一性别的1-3日龄的20只果蝇(雄蝇)，放入含有150微升5％的蔗糖水溶液或者含有待测潜在活性物质的蔗糖水溶液的玻璃果蝇管中处理24小时。
(5)将果蝇转入滤纸上仅添加蒸馏水的玻璃瓶中，饥饿培养2小时。
(6)将果蝇转入含有150微升5％的蔗糖水溶液的玻璃果蝇管中，或者含有150微升添加了6％丙酮醛的5％的蔗糖水溶液的玻璃果蝇管中处理，并每12小时计数果蝇的死亡数量，直至第三组和第四组果蝇全部死亡。比较当第一组和第二组果蝇没有死亡的情况下，第三组果蝇死亡45％时，第四组的果蝇的存活情况，重复3次以上，确定待测潜在活性物质是否真的可以延长致死压力下的果蝇存活时间。
在上述实验过程中，实验环境温度维持在25℃。在步骤(4)-(6)中，每根玻璃果蝇管底部都铺有3片直径24毫米的普通滤纸。在放入果蝇之后，盖上海绵塞，之后将玻璃果蝇管或玻璃瓶放在可以保湿的盒子中，防止干燥。
实施例2
本实施例与实施例1的不同之处在于：比较当第一组和第二组果蝇没有死亡的情况下，第三组果蝇死亡60％时，第四组的果蝇的存活情况，重复3次以上，确定待测潜在活性物质是否真的可以延长致死压力下的果蝇存活时间。
其余步骤均相同。
实施例3
本发明的一种快速筛选抗糖化和/或抗衰老物质的方法步骤如下：
实验分为四组，分别为：
第一组：果蝇处理步骤：蔗糖+饥饿+蔗糖；
第二组：果蝇处理步骤：待测潜在活性物质+饥饿+蔗糖；
第三组：果蝇处理步骤：蔗糖组：蔗糖+饥饿+丙酮醛；
第四组：果蝇处理步骤：潜在活性物质组：待测潜在活性物质+饥饿+丙酮醛。
(1)1L果蝇饲喂用的食物的制备方法为：首先将80克玉米粉，137.5克蔗糖，6.5克琼脂，23.5克酵母放入775毫升去离子水搅拌均匀，然后煮熟。等食物冷却至60℃，加入2克苯甲酸钠，6.25毫升丙酸，150毫升去离子水混匀。然后将食物分装到尺寸为24毫米×95毫米的玻璃果蝇管中，每根玻璃果蝇管中放入30毫米深的食物，用来饲养并繁殖果蝇。
(2)1-3日龄果蝇的获得：将w1118果蝇饲养在25℃，70％湿度的环境下，每瓶放36只果蝇，其中9只雄蝇，27只雌蝇，每3天将成虫换到装有新鲜配制的食物瓶中，从而确保新孵出的成虫年龄比较接近，得到1-3日龄果蝇。将1-3日龄果蝇用麻醉枪麻醉，放在白色透气圆盘上，用毛刷分离雄蝇和雌蝇。
(3)含有待测潜在活性物质的蔗糖水溶液的获得方法为：如果是水溶性的，则将待测潜在抗衰老活性物质直接溶解到3％蔗糖水溶液中，浓度为0.001％，所述百分比为重量体积比，重量的单位为g，体积的单位为ml。
如果是脂溶性的，则将待测潜在抗衰老活性物质先用150微升100％乙醇溶解，然后加到滤纸上放置过夜，等乙醇完全挥发后，再将150微升3％蔗糖水溶液加入到滤纸片上，用于果蝇的活性物质筛选实验；待测潜在活性物质与蔗糖水溶液的重量体积百分比为0.001％，重量的单位为g，体积的单位为ml。对照组则是直接将100％乙醇加到滤纸上放置过夜，等乙醇完全挥发后，再将150微升3％蔗糖水溶液加入到滤纸片上。
(4)将步骤(2)分离后的单一性别的1-3日龄的20只果蝇(雄蝇)，放入含有150微升3％的蔗糖水溶液或者含有待测潜在活性物质的蔗糖水溶液的玻璃果蝇管中处理36小时。
(5)将果蝇转入滤纸上仅添加蒸馏水的玻璃瓶中，饥饿培养8小时。
(6)将果蝇转入含有150微升3％的蔗糖水溶液的玻璃果蝇管中，或者含有150微升添加了3％丙酮醛的3％的蔗糖水溶液的玻璃果蝇管中处理，并每10小时计数果蝇的死亡数量，直至第三组和第四组果蝇全部死亡。比较当第一组和第二组果蝇没有死亡的情况下，第三组果蝇死亡60％时，第四组的果蝇的存活情况，重复3次以上，确定待测潜在活性物质是否真的可以延长致死压力下的果蝇存活时间。
在上述实验过程中，实验环境温度维持在25℃。在步骤(4)-(6)中，每根玻璃果蝇管底部都铺有2片直径24毫米的普通滤纸。在放入果蝇之后，盖上海绵塞，之后将玻璃果蝇管或玻璃瓶放在可以保湿的盒子中，防止干燥。
实施例4
本发明的一种快速筛选抗糖化和/或抗衰老物质的方法步骤如下：
(1)1L果蝇饲喂用的食物的制备方法为：首先将80克玉米粉，137.5克蔗糖，6.5克琼脂，23.5克酵母放入775毫升去离子水搅拌均匀，然后煮熟。等食物冷却至60℃，加入2克苯甲酸钠，6.25毫升丙酸，150毫升去离子水混匀。然后将食物分装到尺寸为24毫米×95毫米的玻璃果蝇管中，每根玻璃果蝇管中放入30毫米深的食物，用来饲养并繁殖果蝇。
(2)1-3日龄果蝇的获得：将w1118果蝇饲养在25℃，70％湿度的环境下，每瓶放44只果蝇，其中11只雄蝇，33只雌蝇，每3天将成虫换到装有新鲜配制的食物瓶中，从而确保新孵出的成虫年龄比较接近，得到1-3日龄果蝇。将1-3日龄果蝇用麻醉枪麻醉，放在白色透气圆盘上，用毛刷分离雄蝇和雌蝇。
(3)含有待测潜在活性物质的蔗糖水溶液的获得方法为：如果是水溶性的，则将待测潜在抗衰老活性物质直接溶解到10％蔗糖水溶液中，浓度为0.1％，所述百分比为重量体积比，重量的单位为g，体积的单位为ml。
如果是脂溶性的，则将待测潜在抗衰老活性物质先用150微升100％乙醇溶解，然后加到滤纸上放置过夜，等乙醇完全挥发后，再将150微升10％蔗糖水溶液加入到滤纸片上，用于果蝇的活性物质筛选实验；待测潜在活性物质与蔗糖水溶液的重量体积百分比为0.1％，重量的单位为g，体积的单位为ml。对照组则是直接将100％乙醇加到滤纸上放置过夜，等乙醇完全挥发后，再将150微升10％蔗糖水溶液加入到滤纸片上。
(4)将步骤(2)分离后的单一性别的1-3日龄的20只果蝇(雌蝇)，放入含有150微升10％的蔗糖水溶液或者含有待测潜在活性物质的蔗糖水溶液的玻璃果蝇管中处理12小时。
(5)将果蝇转入滤纸上仅添加蒸馏水的玻璃瓶中，饥饿培养1小时。
(6)将果蝇转入含有150微升添加了10％丙酮醛的10％的蔗糖水溶液的玻璃果蝇管中处理，并每8小时计数果蝇的死亡数量，直至两组饲喂丙酮醛的果蝇全部死亡。比较10％蔗糖组果蝇死亡40％时，饲喂待测潜在活性物质组的果蝇的存活情况，重复3次以上，确定待测潜在活性物质是否真的可以延长致死压力下的果蝇存活时间。
在上述实验过程中，实验环境温度维持在25℃。在步骤(4)-(6)中，每根玻璃果蝇管底部都铺有5片直径24毫米的普通滤纸。在放入果蝇之后，盖上海绵塞，之后将玻璃果蝇管或玻璃瓶放在可以保湿的盒子中，防止干燥。
实施例5鉴定黄芪多糖的抗糖化和抗衰老性能
将20只1-3日龄成年w1118雄蝇放入铺有3层圆形滤纸片已经加入150微升不同配方水溶液的玻璃果蝇管中培养24小时。每一组平行处理两瓶果蝇。
第一组的水溶液为5％蔗糖。
第二组的水溶液为5％蔗糖+0.002％黄芪多糖。
24小时后，将各组果蝇转入铺有3层圆形滤纸片且滤纸上只添加蒸馏水的玻璃瓶中，饥饿培养6.5小时后将果蝇分成两组，一组只加5％蔗糖水溶液，另一组加含6％丙酮醛的蔗糖水溶液，然后每12小时计数一次果蝇死亡的数量，数据记录在玻璃瓶外壁，一直到所有加丙酮醛的果蝇死亡为止。
其余未详细描述的步骤与实施例1相同。
最后，利用Excel统计果蝇存活几率，并利用T-test分析数据，结果见图1。
图1为果蝇在不同的处理下的存活率。其中sucrose代表蔗糖，APS(Astragaluspolysaccharides)代表黄芪多糖，MG(methylglyoxal)代表丙酮醛。
结果表明，浓度低至0.002％的黄芪多糖可以显著提高果蝇抗丙酮醛毒性的能力，提示低浓度黄芪多糖具有抗衰老的活性。
实施例6
为了验证本发明方法的准确性，本申请人还对一种已知具有抗衰老攻效的物质，二甲双胍(Metformin,MF)用本发明实施例2中的方法进行实验。根据图2所示结果，二甲双胍能够显著延长丙酮醛处理下的果蝇寿命。
图2为本发明方法的准确性验证实验。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (17)

1.一种快速筛选抗糖化和/或抗衰老物质的方法，其特征在于：以含有待测潜在活性物质的蔗糖水溶液饲喂1-3日龄果蝇12-36小时，同时以仅饲喂蔗糖水溶液作为参照组，然后将两组果蝇饥饿处理1-8小时，最后用丙酮醛持续饲喂，每隔一段时间统计果蝇死亡数量，直至两组饲喂丙酮醛的果蝇全部死亡；统计参照组的果蝇死亡率40％-60％时，饲喂待测潜在活性物质的果蝇的存活情况，判断待测潜在活性物质是否能够延长果蝇存活时间，如果能，则待测潜在活性物质为抗糖化和/或抗衰老物质；如果不能，则不是抗糖化和/或抗衰老物质。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：还包括对照组，在对照组中，将丙酮醛替换为蔗糖水溶液。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：将果蝇饥饿处理2小时。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：以有待测潜在活性物质的蔗糖水溶液饲喂1-3日龄果蝇24小时。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述果蝇饲喂用的食物的制备方法：首先将80克玉米粉，137.5克蔗糖，6.5克琼脂，23.5克酵母放入775毫升去离子水搅拌均匀，然后煮熟；等食物冷却至50-60℃，加入2克苯甲酸钠，6.25毫升丙酸，150毫升去离子水混匀，得到1升果蝇食物。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述1-3日龄果蝇的获得方法为：将果蝇饲养在23-25℃，50％-85％湿度的环境下，每瓶放32-44只果蝇，其中雄蝇与雌蝇比例为1:3，每2-3天将成虫换到装有新鲜配制的果蝇食物的食物瓶中，从而确保新孵出的成虫年龄比较接近，得到1-3日龄果蝇。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述1-3日龄果蝇的获得方法为：将果蝇饲养在23-25℃，50％-85％湿度的环境下，每瓶放32-44只果蝇，其中雄蝇与雌蝇比例为1:3，每2-3天将成虫换到装有新鲜配制的果蝇食物的食物瓶中，从而确保新孵出的成虫年龄比较接近，得到1-3日龄果蝇。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述分别以蔗糖水溶液和含有待测潜在活性物质的蔗糖水溶液饲喂1-3日龄果蝇12-36小时时，是将单一性别的1-3日龄果蝇放入已经加了蔗糖水溶液或者含有待测潜在活性物质的蔗糖水溶液的玻璃果蝇管中，每根玻璃果蝇管底部都铺有2-5片直径24毫米的普通滤纸，放入果蝇之后，盖上海绵塞。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述蔗糖水溶液的浓度为3-10％，所述百分比为重量体积比，重量的单位为g，体积的单位为ml。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述蔗糖水溶液的浓度为5％。
11.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述含有待测潜在活性物质的蔗糖水溶液的获得方法为：
如果待测潜在活性物质是水溶性的，则将待测潜在活性物质直接溶解到3-10％蔗糖水溶液中，浓度为0.001％-0.1％，所述百分比为重量体积比，重量的单位为g，体积的单位为ml；
如果待测潜在活性物质是脂溶性的，则将待测潜在活性物质先用100-250微升100％乙醇溶解，然后加到滤纸上，等乙醇完全挥发后，再将100-250微升3-10％蔗糖水溶液加入到滤纸上；待测潜在活性物质与蔗糖水溶液的重量体积百分比为0.001％-0.1％，重量的单位为g，体积的单位为ml。
12.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述将果蝇饥饿处理是将果蝇转入滤纸上仅添加蒸馏水的玻璃瓶中，盖上海绵塞，饥饿培养1-8小时。
13.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述用丙酮醛饲喂是将果蝇放入含有丙酮醛的蔗糖水溶液的玻璃果蝇管中，每根玻璃果蝇管底部都铺有2-5片直径24毫米的普通滤纸，放入果蝇之后，盖上海绵塞。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于：所述丙酮醛在蔗糖水溶液中的重量百分比为3-10％。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于：所述丙酮醛的重量百分比浓度为6％。
16.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：筛选过程中，环境温度维持在25℃。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于：确保果蝇处于保湿的环境中。
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