CN104846058A

CN104846058A - 一种用于痰液标本的星状诺卡氏菌选择培养基

Info

Publication number: CN104846058A
Application number: CN201510299068.9A
Authority: CN
Inventors: 康丛霞
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-06-04
Filing date: 2015-06-04
Publication date: 2015-08-19

Abstract

本发明公开了一种用于痰液标本的星状诺卡氏菌选择培养基。属于检验微生物培养领域，其特征在于，配制1000ml培养基的配方中含有：牛肝粉、麦芽浸粉、酵母浸出粉、氯化钠、琼脂、卟啉铁、乳酸钙、萘啶酮酸、毛子草酮、维生素K₁、无菌脱纤维绵羊血，蒸馏水加至1000ml。本发明与现有技术相比较，具有检出可靠，星状诺卡氏菌分离率高的特点。

Description

一种用于痰液标本的星状诺卡氏菌选择培养基

技术领域

本发明涉及检验微生物培养领域，具体涉及一种用于痰液标本的星状诺卡氏菌选择培养基。

背景技术

微生物培养是一种用人工方法使微生物生长繁殖的技术，而选择性培养基是用来促进或抑制一定类型的生物体（如细胞或细菌等）而设计的培养基，利用这种培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。星状诺卡氏菌(Actinomyces eppingeri) 是需氧土壤腐生菌，属于放线菌的一种，是条件致病菌，该菌广泛存在于空气、尘埃、土壤和家畜体表，通过呼吸系统引起发病，也可经皮肤伤口或外伤创面侵入，引起人的诺卡氏菌病，星状诺卡菌主要通过呼吸道引起人的原发性、化脓性肺部感染，可出现肺结核的症状。肺部病灶可转移到皮下组织，形成脓肿、溃疡和多发性瘘管，也可扩散到其他器官。临床症状上与肺结核、肺曲菌病、肺韦格氏肉芽肿相似，很容易误诊。

近年来，星状诺卡氏菌病已不罕见，在有或无免疫异常的人群中均可发生。早期诊断并早期治疗，可100%治愈。若诊断延误，病死率可达30~50%，因此作为确诊唯一依据的临床细菌检查的正确与快速鉴定极为重要。目前，该菌属的鉴定金标准为PCR鉴定，但是PCR检测设备要求和操作成本均较高，因此临床培养多用普通血琼脂培养板（BAP）培养。而星状诺卡氏菌属于苛养菌，即对生长环境、营养要求较苛刻的细菌，在普通环境中不能或难以生长。星状诺卡氏菌生长缓慢，而痰液标本中金黄色葡萄球菌、肺炎球链菌、其他放线菌等病原菌在目前的培养基上比星状诺卡氏菌生长更快，很快就覆盖了培养基，星状诺卡菌无法生长，阳性率低，使用传统方法需要96小时方可有阳性表现，1周左右方能较准确地做出鉴定，结果延误时间，造成多处病灶转移，如转移至脑部极易造成死亡。

发明内容

本发明的技术任务是针对以上现有技术的不足，提供一种适合于痰液标本星状诺卡氏菌生长的选择培养基。

本发明解决其技术问题的技术方案是：一种用于痰液标本的星状诺卡氏菌选择培养基，其特征在，配制1000ml培养基的配方中含有：

牛肝粉5.0～15.0g；

麦芽浸粉2.0～5.0g；

酵母浸出粉5.0～10.0g；

氯化钠5.0g；

琼脂15.0～20.0g ；

卟啉铁0.01～0.05g；

乳酸钙0.01～0.05g；

萘啶酮酸0.01～0.05g；

毛子草酮0.001～0.005g；

维生素K₁ 0.01～0.1g；

无菌脱纤维绵羊血80～100ml；

蒸馏水加至1000ml。

上述培养基的制备方法为：称取牛肝粉；麦芽浸粉；酵母浸出粉；氯化钠；琼脂；乳酸钙；毛子草酮混匀蒸馏水溶解，210℃，灭菌15min，冷却到45℃，加入灭菌卟啉铁；灭菌萘啶酮酸；灭菌维生素K₁；无菌脱纤维绵羊血混匀，灭菌蒸馏水定容到1000ml后分装。

优化方案中，每1000ml培养基还含有酪蛋白磷酸肽0.1～0.5g。

优化方案中，每1000ml培养基还含有天冬酰胺0.01～0.1g。

优化方案中，每1000ml培养基还含有浓度200g/L的生地黄水煮液 200～300ml。

上述优化方案的培养基的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）取生生地黄加水煮沸30-60min，过滤，取滤液，调整体积到浓度为200g/L，得生地黄水煮液；

（2）称取牛肝粉；麦芽浸粉；酵母浸出粉；氯化钠；琼脂；乳酸钙；毛子草酮；天冬酰胺混匀溶于步骤（1）所得的生地黄提取液中混匀，210℃灭菌15min，冷却到45℃，加入灭菌卟啉铁；灭菌萘啶酮酸；灭菌络蛋白磷酸肽；灭菌维生素K₁；无菌脱纤维绵羊血混匀，灭菌蒸馏水定容到1000ml后分装。

其中：所述的牛肝粉、麦芽浸粉提供碳源、氮源，酵母浸出粉富含蛋白质、氨基酸、多肽、核苷酸、维生素、生长因子、微量元素等营养成分，为微生物提供均衡营养，这些物质对促进星状诺卡氏菌的繁殖和生长都是很重要的因素；氯化钠维持均衡的渗透压；琼脂为培养基的凝固剂；卟啉铁为营养剂，为星状诺卡氏菌繁殖生长提供必需的铁元素；乳酸钙除了做营养增强剂外，还可以抑制革兰氏阳性菌生长；萘啶酮酸抑制革兰氏阴性菌的生长；毛子草酮（2-Ethoxymethylene-3,5-dihydroxy-y-pyrone），实验室研究表明毛子草酮可以抑制金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、溶血性链球菌、肺炎双球菌、卡他球菌、白喉杆菌、变形杆菌、肠炎杆菌等杂菌的生长，但该浓度下由于对诺卡氏菌属无抗菌抑菌作用，因此提高了星状诺卡氏菌的分离率。通过实验将同一星状诺卡氏菌接种到2个BAP培养基上，其中一个BAP培养基添加0.1%灭菌维生素k₁于37℃下培养，48小时后观察菌株，发现添加维生素k₁的BAP培养基有小的星状诺卡氏菌菌落，没有添加维生素k₁的BAP培养基未发现星状诺卡氏菌菌落，维生素k₁促进细胞生长、分化，是星状诺卡氏菌的生长因子；无菌脱纤维绵羊血提供能量环境；酪蛋白磷酸肽为激活剂，可以促进星状诺卡氏菌对铁元素、钙元素的摄取；天冬酰胺为营养强化剂，促进星状诺卡氏菌对氨基酸的摄取；生地黄为玄参科植物生地黄的新鲜或干燥块根，现代医学研究表明，生地黄根茎中含有20多种苷类；8种糖类；20余种氨基酸和20余种无机元素，生地黄水提液是良好的营养强化剂，并且有抑制金黄色葡萄球菌生长的作用。

本发明与现有技术相比较，具有检出可靠、星状诺卡氏菌分离率高的特点。

具体实施方式

以下结合实际情况，对本发明的具体实施方式作详细说明。

实施例1，配制1000ml培养基的配方中含有：牛肝粉15.0g；麦芽浸粉2.0g；酵母浸出粉5.0g；氯化钠5.0g；琼脂15.0g；卟啉铁0.01g；乳酸钙0.05g；萘啶酮酸0.05g；毛子草酮0.001g；维生素K₁ 0.1g；无菌脱纤维绵羊血100ml；蒸馏水加至1000ml。制备方法称取牛肝粉；麦芽浸粉；酵母浸出粉；氯化钠；琼脂；乳酸钙；毛子草酮混匀蒸馏水溶解，210℃，灭菌15min，冷却到45℃，加入灭菌卟啉铁；灭菌萘啶酮酸；灭菌维生素K₁；无菌脱纤维绵羊血混匀，灭菌蒸馏水定容到1000ml后分装。

实施例2，配制1000ml培养基的配方中含有：牛肝粉10.0g；麦芽浸粉5.0g；酵母浸出粉8.0g；氯化钠5.0g；琼脂15.0g；卟啉铁0.01g；乳酸钙0.03g；萘啶酮酸0.03g；毛子草酮0.003g；维生素K₁ 0.01g；络蛋白磷酸肽0.1g；无菌脱纤维绵羊血80ml；蒸馏水加至1000ml。制备方法称取牛肝粉；麦芽浸粉；酵母浸出粉；氯化钠；琼脂；乳酸钙；毛子草酮混匀，蒸馏水溶解，210℃，灭菌15min，冷却到45℃，加入灭菌卟啉铁；灭菌萘啶酮酸；灭菌维生素k₁；灭菌络蛋白磷酸肽；无菌脱纤维绵羊血混匀，灭菌蒸馏水定容到1000ml后分装。

实施例3，配制1000ml培养基的配方中含有：牛肝粉15.0g；麦芽浸粉3.0g；酵母浸出粉10.0g；氯化钠5.0g；琼脂20.0g；卟啉铁0.02g；乳酸钙0.05g；萘啶酮酸0.05；毛子草酮0.005g；维生素K₁ 0.05g；天冬酰胺0.01g；无菌脱纤维绵羊血90ml；蒸馏水加至1000ml。制备方法称取牛肝粉；麦芽浸粉；酵母浸出粉；氯化钠；琼脂；乳酸钙；毛子草酮；天冬酰胺混匀，蒸馏水溶解，210℃，灭菌15min，冷却到45℃，加入灭菌卟啉铁；灭菌萘啶酮酸；灭菌维生素K₁；无菌脱纤维绵羊血混匀，灭菌蒸馏水定容到1000ml后分装。

实施例4，配制1000ml培养基的配方中含有：牛肝粉5.0g；麦芽浸粉5.0g；酵母浸出粉8.0g；氯化钠5.0g；琼脂20.0g；卟啉铁0.03g；乳酸钙0.03g；萘啶酮酸0.01g；毛子草酮0.001g；维生素K₁ 0.03g；无菌脱纤维绵羊血90ml；200g／L生地黄水提液200ml；蒸馏水加至1000ml。制备方法：（1）取40g生地黄加水煮沸30min，过滤，取滤液，根据滤液体积，采取浓缩或者加水调整体积到浓度为200g/L，得生地黄水提液200ml；（2）称取牛肝粉；麦芽浸粉；酵母浸出粉；氯化钠；琼脂；乳酸钙；毛子草酮；混匀溶于步骤1所得的生地黄提取液中，210℃，灭菌15min，冷却到45℃，加入灭菌卟啉铁；灭菌萘啶酮酸；灭菌维生素K₁；无菌脱纤维绵羊血混匀，灭菌蒸馏水定容到1000ml后分装。

实施例5，配制1000ml培养基的配方中含有：牛肝粉15.0g；麦芽浸粉2.0g；酵母浸出粉5.0g；氯化钠5.0g；琼脂15.0g；卟啉铁0.05g；乳酸钙0.05g；萘啶酮酸0.03g；毛子草酮0.003g；维生素K₁ 0.01g；络蛋白磷酸肽0.5g；天冬酰胺0.05g；无菌脱纤维绵羊血90ml；蒸馏水加至1000ml。制备方法称取牛肝粉；麦芽浸粉；酵母浸出粉；氯化钠；琼脂；乳酸钙；毛子草酮；天冬酰胺混匀蒸馏水溶解，210℃，灭菌15min，冷却到45℃，加入灭菌卟啉铁；灭菌萘啶酮酸；灭菌络蛋白磷酸肽；灭菌维生素K₁；无菌脱纤维绵羊血混匀，灭菌蒸馏水定容到1000ml后分装。

实施例6，配制1000ml培养基的配方中含有：牛肝粉5.0g；麦芽浸粉3.0g；酵母浸出粉5.0g；氯化钠5.0g；琼脂20.0g；卟啉铁0.02g；乳酸钙0.03g；萘啶酮酸0.01g；毛子草酮0.001g；维生素K₁ 0.03g；络蛋白磷酸肽0.3g；无菌脱纤维绵羊血90ml；浓度200g／L的生地黄水提液250ml；蒸馏水加至1000ml。制备方法制备方法：（1）取50g生地黄加水煮沸45min，过滤，取滤液，根据滤液体积，采取浓缩或者加水调整体积到浓度为200g/L，得生地黄水提液250ml；（2）称取牛肝粉；麦芽浸粉；酵母浸出粉；氯化钠；琼脂；乳酸钙；毛子草酮混匀溶于步骤（1）所得的生地黄提取液中混匀，210℃灭菌15min，冷却到45℃，加入灭菌卟啉铁；灭菌萘啶酮酸；灭菌络蛋白磷酸肽；灭菌维生素K₁；无菌脱纤维绵羊血混匀，灭菌蒸馏水定容到1000ml后分装。

实施例7，配制1000ml培养基的配方中含有：牛肝粉10.0g；麦芽浸粉5.0g；酵母浸出粉8.0g；氯化钠5.0g；琼脂15.0g；卟啉铁0.05g；乳酸钙0.01g；萘啶酮酸0.03g；毛子草酮0.003g；维生素K₁ 0.05g；天冬酰胺0.1g；无菌脱纤维绵羊血100ml；浓度200g／L的生地黄水提液300ml；蒸馏水加至1000ml。制备方法：（1）取60g生地黄加水煮沸60min，过滤，取滤液，根据滤液体积，采取浓缩或者加水调整体积到浓度为200g/L，得生地黄水提液300ml；（2）称取牛肝粉；麦芽浸粉；酵母浸出粉；氯化钠；琼脂；乳酸钙；毛子草酮；天冬酰胺混匀溶于步骤（1）所得的生地黄提取液中混匀，210℃灭菌15min，冷却到45℃，加入灭菌卟啉铁；灭菌萘啶酮酸；灭菌维生素K₁；无菌脱纤维绵羊血混匀，灭菌蒸馏水定容到1000ml后分装。

实施例8，配制1000ml培养基的配方中含有：牛肝粉10.0g；麦芽浸粉3.0g；酵母浸出粉10.0g；氯化钠5.0g；琼脂20.0g；卟啉铁0.01g；乳酸钙0.05g；萘啶酮酸0.05g；毛子草酮0.005g；维生素K₁ 0.05g；络蛋白磷酸肽0.3g；天冬酰胺0.01g；无菌脱纤维绵羊血100ml；浓度200g／L的生地黄水提液300ml；蒸馏水加至1000ml。制备方法：（1）取60g生地黄加水煮沸60min，过滤，取滤液，根据滤液体积，采取浓缩或者加水调整体积到浓度为200g/L，得生地黄水提液300ml；（2）称取牛肝粉；麦芽浸粉；酵母浸出粉；氯化钠；琼脂；乳酸钙；毛子草酮；天冬酰胺混匀溶于步骤（1）所得的生地黄提取液中混匀，210℃灭菌15min，冷却到45℃，加入灭菌卟啉铁；灭菌萘啶酮酸；灭菌络蛋白磷酸肽；灭菌维生素K₁；无菌脱纤维绵羊血混匀，灭菌蒸馏水定容到1000ml后分装。

所述生地黄水提液浓度200g/L指的是每升含有生药200g。

本发明所得星状诺卡氏菌选择培养基用于痰液标本，具有检出可靠、星状诺卡氏菌分离率高的特点，为临床资料充分证明，有关资料如下。

1对象与方法。

1.1培养基制备：实验组共设4组，分别为实施例1方案组；实施例2方案组、实施例6方案组、实施例8方案组和对照组，对照组为普通血琼脂培养板（BAP）培养基，其配方为：牛肉粉5g／L、蛋白胨12g／L、琼脂15g／L、氯化钠5g／L、无菌脱纤维绵羊血100ml／L。

1.2痰液采集培养方法：高度疑似星状诺卡氏菌肺炎患者26例，取晨痰，先用20ml生理盐水洗涤两次，经过10ml生理盐水稀释后，加入1%的pH 7.6的胰蛋白酶溶液消化90min后用接种环分区划线接种于实施例1方案组；实施例2方案组；实施例6方案组；实施例8方案组和对照组培养基。37℃保温，保温箱培养48h、96h挑取细小菌落进行菌属鉴定。各样本编号送检PCR做分子生物学鉴定。

1.3检出阳性标准：取出培养皿，观察培养基上小菌落，生长慢，菌落皱褶，呈颗粒状，无菌丝，带有黄色或深橙色的菌落生长情况，挑选目标菌涂片，革兰氏染色，显微镜镜检出阳性，依据《临床微生物学诊断与图解》检验，最终结果金标准为PCR鉴定。

2 结果：26份高度疑似星状诺卡氏菌肺炎患者痰液标本经PCR最后鉴定为星状诺卡氏菌阳性的为21例。48h各组检出阳性、假阳性、阴性、假阴性菌株例数见下表，

上述结果可以看出，培养48小时后，各实施例组与对照组阳性检出率比较均具有极明显差异（P<0.001），假阴性率明显低于对照组（P<0.001）。各实施例组与PCR检测结果比较，阳性检出率差异无统计学意义（P>0.05）。

96h各组检出阳性、假阳性、阴性、假阴性菌株例数见下表，

上述结果可以看出，培养96小时后，各实施例组与对照组阳性检出率比较，均具有明显差异（P<0.05），假阴性率明显低于对照组（P<0.05）。各实施例组与PCR检测结果比较，阳性检出率差异无统计学意义（P>0.05）。

以上结果表明，痰液标本经过本发明实施例培养基培养后，星状诺卡氏菌阳性率与PCR检测差异无统计学差异，且48小时分离率明显高于现有的培养基，96小时后，各实施例与对照组阳性检出率比较差异缩小，但区别仍具有统计学意义，普通BAP培养基营养不足细菌生长缓慢，需要96h以上才出现菌株阳性生长，本发明培养基48h就可以得到尽量准确的菌株阳性率，星状诺卡氏菌检出可靠，分离率高，从而缩短确诊时间。

Claims

1.一种用于痰液标本的星状诺卡氏菌选择培养基，其特征在于配制1000ml培养基的配方中含有：