CN104830947B - 一种测定植物亚低温或亚高温耐受性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种测定植物亚低温或亚高温耐受性的方法，包括以下步骤：(1)选取植物幼嫩组织，破碎后，加入酶解液混匀，酶解其细胞壁；(2)将产物洗涤、纯化后获得原生质体悬浮液，并在原生质体悬浮液中加入水解酶以保持细胞壁纤维素的低水平再生；(3)将加入水解酶的原生质体在亚低温或亚高温条件下温浴，温浴结束后，加超纯水以降低溶液渗透势，定时测定原生质体的直径；(4)用获得的原生质体的直径值，计算多个原生质体单位时间、单位渗透势、单位面积细胞膜上水分从细胞外进入细胞内的净速度Lp的平均值，该Lp平均值和所选植物适宜温度下的Lp值差值越大，说明其亚低温或亚高温耐受性越差。该方法具有适用性广、分辨率高的特点。

Description

一种测定植物亚低温或亚高温耐受性的方法

技术领域

本发明属于植物温度耐受性测定技术领域，具体涉及一种测定植物亚低温或亚高温耐受性的方法。

背景技术

温度是植物生长最重要的环境因子，高温或者低温都会造成植物生长发育受阻，甚至伤害。

不同的植物，对温度的要求不同，甚至同一株植物在不同的生育期对温度的要求也不同。所谓亚低温或亚高温是指仅使作物生长缓慢但不使作物受到较大伤害而导致其生长停滞的温度条件。

植物对亚低温、亚高温的耐受能力被称为亚低温耐受性或亚高温耐受性，它与植物对冷害、热害的抵抗能力即耐冷性和耐热性之间既有联系又相互区别。例如，大多起源于热带、亚热带的喜温耐热植物的亚低温范围在10～23℃左右，在该温度范围，植物并没有明显的受害症状，但表现出生长缓慢或停滞，花期延迟，花打顶，黄化，萎蔫，座果率低，畸形果多和产量下降等，从而造成经济损失。准确评价植物的亚低温耐受性，对于植物的适地种植、茬口安排以及减灾避灾有着重要意义。

亚低温或亚高温对植物多种生理生化指标均有影响。例如渗透调解物质、活性氧、保护酶、基因表达、蛋白含量在低温下均会发生变化。这些指标均可在不同水平、不同程度反映植物低温的抗性。

细胞膜是由脂类、蛋白质和碳水化合物构成的一个平衡体系，既能与外界完成信息与物质的交换，又能对外界逆境条件及时地做出响应，是最为保守的细胞结构之一，被认为是感受低温信号的器官，也是低温冷害发生的首要部位。正常情况下，细胞膜具有选择透性，可以具有选择性的与外界进行物质与离子的交换，并处于一个相对稳定的动态平衡中。

植物抗寒性的经典测定方法——电导率法，就是基于该原理建立的。在极端低温条件下，细胞膜破裂，细胞内的电解质外渗，电导值就会增大。早在1930年，Dexter和Tottingham就用该方法测定了不同温度下电解质的渗漏情况。此后，结合Logistics方程，该方法成功应用于定量评价植物的抗寒性和耐热性。

电导率法的原理是基于细胞膜的渗漏程度而测定的，而渗漏的原因是细胞膜遭到破坏，比如，在零度以下低温，细胞内形成冰晶，将细胞膜刺裂，造成细胞质渗透，从而电导率增大。然而，在亚低温或者亚高温环境下，植物细胞膜的完整性尚未受到影响，但生理活性降低。应用电导率法不能有效区分生理活性的变化情况。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种测定植物亚低温或亚高温耐受性的方法，该方法适用于测定亚低温或亚高温逆境下植物的耐受能力的细微区别，具有灵敏度高、稳定性好的特点。

细胞膜的导水性是所有细胞的基本特征，细胞内外的渗透势差直接决定水分的进出。对于从植物细胞获取的原生质体而言，体积会发生相应变化。在环境温度发生变化时，水分运输的速度发生变化，水分运输速度的变化可以通过原生质体体积的变化情况定量分析。目前，基于该原理测定、评价植物亚低温和亚高温耐受性的方法还未见报道。

由于水分的跨膜运输是植物细胞的基本功能，亚低温或亚高温条件下，跨膜运输速度有着明显变化，结合该原理，本发明建立了下述测定植物亚低温或亚高温耐受性的新方法——导水系数法。

本发明的上述技术问题是通过以下技术方案来实现的：一种测定植物亚低温或亚高温耐受性的方法，包括以下步骤：

(1)选取植物幼嫩组织，破碎后，向破碎材料中加入酶解液混匀，在黑暗条件下震荡酶解植物幼嫩组织的细胞壁；

(2)酶解后过滤，收集滤液，清洗，离心，弃上清，获得原生质体悬浮液，并在原生质体悬浮液中加入水解酶以保持细胞壁纤维素的低水平再生；

(3)将加入水解酶的原生质体在亚低温或亚高温条件下温浴，温浴结束后，加超纯水以降低溶液渗透势，定时测定原生质体的直径；

(4)用步骤(3)获得的原生质体的直径值，计算多个原生质体单位时间、单位渗透势、单位面积细胞膜上水分从细胞外进入细胞内的净速度Lp的平均值，该Lp平均值和所选植物适宜温度下的Lp值差值越大，说明其亚低温或亚高温耐受性越差。

相反，如步骤(4)中该Lp平均值和所选植物适宜温度下的Lp值越接近，说明该植物的亚低温或亚高温耐受性越好。

在上述测定植物亚低温或亚高温耐受性的方法中：

步骤(1)中所述的植物幼嫩组织优选为植物的嫩叶、新梢、嫩根、细胞或者愈伤组织等。这些植物的嫩叶、新梢、嫩根或愈伤组织，优选切成长×宽为(2～3)×(2～3)mm左右的小块；对于液体培养的细胞，过滤去除培养液即可。

步骤(1)中所述的酶解液优选为纤维素酶和离析酶R-10的甘露醇或蔗糖水溶液，其中纤维素酶的浓度为2～3％w/v，离析酶R-10的浓度为0.5～1％w/v，甘露醇水溶液或蔗糖水溶液的浓度为0.3～0.5mol/L，酶解液的用量与植物幼嫩组织的用量关系为1～5mL：0.2～2g。

其中关于纤维素酶的浓度为2～3％w/v，指的是在100mL甘露醇水溶液或蔗糖水溶液中，纤维素酶的用量为2～3g，此处仅为列举，用量成倍的放大或缩小只要浓度保持在该范围内均可，其余全文中关于各物质的用量及浓度与此处相同。

或步骤(1)中所述的酶解液为纤维素酶、离析酶R-10和果胶酶的甘露醇或蔗糖水溶液，其中纤维素酶的浓度为2.5～3％w/v，离析酶R-10的浓度为0.5～1％w/v，果胶酶的浓度为0.1～0.2％w/v，甘露醇或蔗糖水溶液的浓度为0.3～0.5mol/L，酶解液的用量与植物幼嫩组织的用量关系为1～5mL：0.2～2g。

采用这两种酶解液，均可以获得满足需要的原生质体。

步骤(1)中震荡酶解时的温度优选为22～28℃，速度(摇床)优选为70～100r/min，酶解时间优选为100～160min。

步骤(2)中过滤用140～180目的尼龙网过滤，清洗采用甘露醇或蔗糖水溶液，其浓度为0.3～0.5mol/L，离心时离心机的离心力设为(5～30)×g，离心时间为3～10min，并重复清洗、离心、弃去上清一次。

步骤(2)中为降低细胞壁的再生对测定细胞膜导水系数的影响，在已制备出的原生质体悬溶液中加入水解酶，以保持细胞壁纤维素的低水平再生，提高样品一致性；步骤(2)中所述的水解酶为纤维素酶和离析酶R-10的甘露醇或蔗糖水溶液，其中纤维素酶的浓度为0.8～1.2％w/v，离析酶R-10的浓度为0.2～0.4％w/v，甘露醇水溶液或蔗糖水溶液的浓度为0.3～0.5mol/L，水解酶用量与原生质体重悬液的体积比为1:10～20。

步骤(3)中所述的亚低温或亚高温条件指：当用于亚低温耐受性测定时，以所选植物生长适宜温度下限减去3～5℃或8～10℃为梯度，获得亚低温温度区间；当用于亚高温耐受性测定时，以所选植物生长适宜温度上限加上2～5℃或8～10℃为梯度，获得亚高温温度区间。

其中植物的适宜生长温度可以参考教科书或相关专业工具书获得，例如：《作物栽培学》、《园艺植物栽培学》、《植物栽培学》等。

步骤(3)中所述的温浴时间优选为20～40min，超纯水的加入量为加入水解酶的原生质体总体积的0.5～2倍。

步骤(4)中至少计算90个原生质体单位时间、单位渗透势、单位面积细胞膜上水分从细胞外进入细胞内的净速度Lp的平均值。

步骤(4)中每个原生质体单位时间、单位渗透势、单位面积细胞膜上水分从细胞外进入细胞内的净速度Lp的计算公式为：Lp＝(Vt₂-Vt₁)/[(t₂-t₁)×S×D_osm]，

其中，V t₂为t₂时间点原生质体的体积；V t₁为t₁时间点原生质体的体积；S为t₁时间点原生质体的表面积；D_osm为加超纯水稀释前后渗透势的差值；

D_osm由以下公式计算获得：

当渗透调节物质为甘露醇时：Y＝1.1736X；

当渗透调节物质为蔗糖时：Y＝1.4155X；

其中Y为渗透压度，单位为mM/Kg，X为酶解液或水解酶中采用的渗透调节物质甘露醇或者蔗糖水溶液的浓度，单位为mM。

亚低温或亚高温中每个温度点共测量≥90个原生质体的Lp值，求平均，比较不同温度点的Lp平均值，和适宜温度Lp值越接近就表明耐受性越好，相反，该Lp平均值和所选植物适宜温度下的Lp值差值越大，说明其亚低温或亚高温耐受性越差。

本发明具有如下优点：

(1)本发明方法和经典的电导率法相比，本发明方法虽然也是基于细胞膜的性质变化而创建，然而，本发明的方法是针对细胞膜的导水性的生理特性而建立的，和电导率法测定细胞膜损伤后电解质渗漏的原理有着本质的不同；本方法更适用于测定亚低温或亚高温逆境下植物的耐受能力的细微区别，具有灵敏度高、稳定性好、适用性广的特点，和电导率法测定植物抗寒性和耐热性的适用领域不同，本发明方法对于多层级系统评价不同温度环境下植物的适应性提供了一种新方法；

(2)本发明方法灵敏度高，可以区分不同材料间的微弱区别；

(3)本发明具有普遍适用性，可应用于所有植物；

(4)本发明方法迅速，可在1天内完成测定；

(5)本发明方法鉴定所需植物材料少，1g幼嫩组织即可完成测试；

(6)本发明方法技术原理新颖，结果可靠性高。

附图说明

图1是实施例1中从西瓜叶片制备的原生质体(标尺＝50μm)；

图2是实施例1中不同酶组合、不同酶解时间制备的原生质体数量；

图3是实施例2中不同渗透势下(不同浓度甘露醇溶液)下原生质体的数量；

图4是实施例3中低温下石斛原生质体细胞膜导水性的变化规律；

图5是实施例4中采用电导率法测定同源二倍体和四倍体西瓜叶片低温下电解质渗漏情况；

图6是实施例4中同源二倍体西瓜和四倍体西瓜亚低温耐受性的比较结果；

图7是实施例5中同源二倍体西瓜和四倍体西瓜亚高温耐受性的比较结果。

具体实施方式

实施例1不同酶组合、不同酶解时间制备原生质体的方法

(1)取生长30d左右的西瓜苗完全展开的新叶，称取1g，切成大小为2×2mm左右的块状；

(2)向材料中加入5mL的酶解液混匀，置于室温25℃，80r/min摇床上振荡酶解，酶解150min；

酶解液组合设置了2种酶液组合：

①2.7％(w/v，即100mL甘露醇水溶液中含有2.7g纤维素酶)纤维素酶+0.78％(w/v)离析酶R-10，溶解在浓度为0.4mol/L的甘露醇水溶液中；

②2.7％(w/v)纤维素酶+0.78％(w/v)离析酶R-10+0.155％(w/v)果胶酶，溶解在初始浓度为0.4mol/L的甘露醇中；

(3)酶解后的溶液用160目的尼龙网过滤，收集其滤液；

(4)接着用0.4mol/L的甘露醇清洗，定容至6mL，24×g离心5min，弃上清，重复一次；

(5)用细胞计数器计算原生质体产率，结果见图1和图2，由图1和图2可以看出，两种酶配方法，酶解时间从30min到210min，每立方毫米溶液中原生质体的数量从20几个到120几个，均可获得满足需要的原生质体。

采用上述两种不同的酶解液酶解，均可以获得杂质少、产率高、饱满、细胞壁纤维素再生率低的原生质体。

实施例2不同渗透势下原生质体的制备方法

(1)取生长30d左右的西瓜苗完全展开的新叶，称取1g，切成2×3mm左右的块状；

(2)向材料中加入5mL的酶解液混匀，置于室温25℃，80r/min摇床上振荡酶解；

酶解液的配方为：2.7％纤维素酶+0.78％离析酶R-10；分别溶解于0.3M、0.35M、0.4M、0.45M、0.5M的甘露醇水溶液，用于优化甘露醇水溶液浓度对原生质体产率的影响；

(3)酶解120min后，酶解液用160目的尼龙网过滤，收集其滤液；

(4)接着用0.4mol/L的甘露醇清洗，定容至6mL，离心力24×g离心5min，弃上清，重复一次；

(5)用细胞计数器计算原生质体产率，结果见图3，由图3可以看出，两种酶配方法，甘露醇水溶液浓度从0.3M到0.5M，每立方毫米溶液中原生质体的数量从60几个到80几个，均可获得满足需要的原生质体。

实施例3低温对石斛原生质体吸水膨大的影响

(1)剪取石斛新叶0.7g，切成3×3mm的碎片；

(2)转移至2mL酶解液中；

酶解液的配方为：0.16％(w/v)果胶酶+2.8％(w/v)纤维素酶+0.85％(w/v)离析酶R-10，溶解于0.35M的甘露醇水溶液中；

(3)25℃，80r/min摇床上振荡酶解100min；

(4)酶解后的溶液用160目的尼龙网过滤，收集滤液，用0.35mol/L甘露醇清洗，定容至5mL，离心力24×g离心5min，弃上清，重复一次；

(5)在已制备出的原生质体悬溶液中加入水解酶，水解酶的组成如下：1％(w/v)的纤维素酶、0.3％(w/v)的离析酶R10，溶于浓度为0.4mol/L的甘露醇水溶液中，悬浮液与水解酶的体积比为15:1；

(6)取加入水解酶的原生质体20μL，分别在15℃、20℃和25℃下温浴30min；

(7)温浴后，加入等体积水混合，即开始计时(t＝0)，迅速将混合液转移至细胞计数板上，再在40×物镜下分别于90s(t₁)和150s(t₂)照相；

(8)通过测量原生质体直径的变化计算原生质体(球体)体积的变化，再用下面公式计算细胞膜导水系数：Lp＝(Vt₂-Vt₁)/[(t₂-t₁)×S×D_osm]；

其中V t₂为t₂时间点原生质体的体积；V t₁为t₁时间点原生质体的体积；S为t₁时间点原生质体的表面积；D_osm为加水稀释前后渗透势的差值；

D_osm由以下公式计算获得：

Y＝1.1736X，其中Y为渗透压度，单位为mM/Kg，X为甘露醇水溶液的浓度，单位为mM；

(9)每个温度点测定90个以上原生质体，分别计算Lp值，求平均，结果见图4；

从图4可以看出，低温影响细胞膜吸水，温度越低，影响越大，两者具有相关性，表明该方法可以用于测定不同温度逆境对植物细胞导水系数的影响，从而反映植物亚低温或亚高温的耐受性。

实施例4采用电导率法比较同源二倍体西瓜和四倍体西瓜的亚低温耐受性

为了证明本发明的精确性和独特性，将经典方法“电导率法”和本发明的方法对比测定同源二倍体西瓜和四倍体西瓜亚低温耐受性，测定结果如下：

(一)经典方法“电导率法”测定结果

将采集到二倍体、四倍体西瓜幼苗新展开叶片，用自来水清洗后，低温设置了5个处理分别为-20℃、0℃、15℃、20℃下水浴30min并同时以25℃为对照(适宜温度)，然后用滤纸擦拭干净，用打孔器对处理后的材料钻孔，得到叶面积大小一致的叶片，对其进行处理，测量其相对电解质的外渗率，具体的步骤及计算方法参考史树德等(2011)的测定方法，重复3次，取其平均值。

测定结果(见图5)，10℃～20℃的亚低温范围内，两者的相对电导率几乎重叠在一起，没有显著差异。从0℃到-20℃，两者相对电导率才表现出差异。说明该方法适用于测定植物低温抗寒性，而不适于测定亚低温耐受性。

(二)本发明“导水系数法”的测定结果

(1)分别取二倍体(2n)和四倍体(4n)西瓜新展开的幼叶，切成块状，称取1g，加入5mL酶解液混匀，酶解液由0.45M的甘露醇、2％(w/v)纤维素酶和1％(w/v)的离析酶R-10溶于超纯水构成，于室温25℃，80r/min摇床上振荡酶解；酶解后的溶液用160目的尼龙网过滤，收集滤液；用0.4mol/L甘露醇清洗，定容至6mL，离心力24×g离心5min，弃上清，重复一次；

(2)为降低细胞壁的再生对测定细胞膜导水系数的影响，在已制备出的原生质体悬溶液中加入水解酶(1％纤维素酶，0.3％离析酶R10，溶于0.4mol/L甘露醇)，加入量为悬浮液:酶液＝15:1；

(3)取制备好的原生质体20μL，分别在15℃、20℃和25℃下温浴30min；

(4)温浴后，加入等体积水混合，即开始计时(t＝0)，迅速将混合液转移至细胞计数板上，再在40×物镜下分别于90s(t₁)和150s(t₂)照相；

(5)通过测量原生质体直径的变化计算原生质体体积的变化，再用下面公式计算细胞膜导水系数：Lp＝(Vt₂-Vt₁)/(t₂-t₁)/S/D_osm；

其中V t₂为t₂时间点原生质体的体积；V t₁为t₁时间点原生质体的体积；S为t₁时间点原生质体的表面积；Dosm为加水稀释前后渗透势的差值；

Dosm由以下公式计算获得：

Y＝1.1736X，其中Y为渗透压度，单位为mM/Kg，X为渗透调节物质甘露醇的浓度，单位为mM；

(6)每个温度点测定90个以上原生质体的体积变化情况，求平均后和25℃处理进行比较，比较结果见图6，图6表明，20℃和15℃亚低温处理即可使ΔLp值迅速升高，二倍体(2n)和四倍体(4n)耐受性明显不同，其中二倍体的ΔLp值(与25℃时Lp值的差值)明显小于四倍体的，说明二倍体的亚低温耐受性优于四倍体的耐受性。

对比以上两种方法的结果可以发现：对于亚低温耐受性接近的材料(同源二倍体和四倍体)，本发明的方法有很好的区分度。

实施例5

比较同源二倍体西瓜和四倍体西瓜的亚高温耐受性。

除温度处理设置和实施例4不同，其余步骤均和实施例4相同。本实施例中的温度设置为25℃、30℃、35℃、40℃。结果(图7)表明，随着温度的升高，ΔLp值逐渐上升，但在正常温度范围25～35℃范围内，二倍体和四倍体差异较小，当温度升高至40℃时，两者表现出明显差异，二倍体的ΔLp值显著高于四倍体，说明二倍体的亚高温耐热性不如四倍体。

实施例6

比较不同基因型香蕉亚低温耐受性。

(1)分别取AAA基因型的香蕉品种“巴西”和ABB基因型的山芭蕉松散愈伤组织，分别称取细胞0.5g，加入酶解液2mL，酶解液为含有0.45M的蔗糖、0.2％(w/v)果胶酶、2.5％(w/v)纤维素酶和1％(w/v)离析酶R-10的水溶液，于28℃，100r/min摇床上振荡酶解100min；酶解后的溶液用180目的尼龙网过滤，收集滤液；用0.4mol/L甘露醇清洗，定容至6mL，18×g离心力下离心5min，弃上清，重复一次；

(2)在已制备出的原生质体悬溶液中加入水解酶(1％(w/v)纤维素酶，0.3％(w/v)离析酶R10，溶于浓度为0.3mol/L的蔗糖中)，加入量为悬浮液:水解酶＝20:1；

(3)取制备好的原生质体20μL，分别在15℃、20℃和25℃下温浴30min；

(4)温浴后，加入等体积水混合，即开始计时(t＝0)，迅速将混合液转移至细胞计数板上，再在40×物镜下分别于90s(t₁)和150s(t₂)照相；

(5)通过测量原生质体直径的变化计算原生质体体积的变化，再用下面公式计算细胞膜导水系数：Lp＝(Vt₂-Vt₁)/(t₂-t₁)/S/D_osm；

其中V t₂为t₂时间点原生质体的体积；V t₁为t₁时间点原生质体的体积；S为t₁时间点原生质体的表面积；Dosm为加水稀释前后渗透势的差值；

Dosm由以下公式计算获得：

Y＝1.4155X，其中Y为渗透压度，单位为mM/Kg，X为等渗溶液中蔗糖的浓度，单位为mM；

(6)每个温度点测定90个以上原生质体，计算Lp值，求平均后分别和25℃处理进行比较。

结果表明：在20℃和15℃，山芭蕉的ΔLp值显著小于巴西蕉的ΔLp值，表明山芭蕉的亚低温耐受性优于巴西蕉。

实施例7

比较不同葡萄亚高温耐受性。

(1)分别取河岸葡萄和沙地葡萄悬浮培养细胞1mL，过滤，分别称取细胞0.5g，加入酶解液3mL，酶解液为含有0.45M的蔗糖、0.1％(w/v)果胶酶、3％(w/v)纤维素酶和0.5％(w/v)离析酶R-10的水溶液，于28℃，100r/min摇床上振荡酶解100min；酶解后的溶液用150目的尼龙网过滤，收集滤液；用0.4mol/L甘露醇清洗，定容至5mL，12×g离心力下离心5min，弃上清，重复一次；

(2)在已制备出的原生质体悬溶液中加入水解酶(1.2％纤维素酶，0.2％离析酶R-10，溶于0.5mol/L蔗糖)，加入量为(悬浮液:酶液＝20:1)；

(3)取制备好的原生质体20μL，分别在35℃和25℃下温浴20min；

(4)温浴后，加入0.5倍体积水混合，即开始计时(t＝0)，迅速将混合液转移至细胞计数板上，再在40×物镜下分别于90s(t₁)和150s(t₂)照相；

(4)通过测量原生质体直径的变化计算原生质体体积的变化，再用下面公式计算细胞膜导水系数：Lp＝(Vt₂-Vt₁)/(t₂-t₁)/S/D_osm；

其中V t₂为t₂时间点原生质体的体积；V t₁为t₁时间点原生质体的体积；S为t₁时间点原生质体的表面积；D_osm为加水稀释前后渗透势的差值；

D_osm由以下公式计算获得：

Y＝1.4155X，其中Y为渗透压度，单位为mM/Kg，X为等渗溶液中蔗糖的浓度，单位为mM；

(5)每个温度点测定90个以上原生质体，计算Lp值，求平均后分别和25℃处理进行比较。

结果表明：在35℃，沙地葡萄的ΔLp值显著小于河岸葡萄的ΔLp值，表明沙地葡萄的亚高温耐受性优于河岸葡萄。

显然，上述内容只是为了说明本发明的特点，而并非对本发明的限制，有关技术领域的普通技术人员根据本发明在相应的技术领域做出的变化应属于本发明的保护范畴。

Claims (7)

1.一种测定植物亚低温或亚高温耐受性的方法，其特征是包括以下步骤：

（1）选取植物幼嫩组织，破碎后，向破碎材料中加入酶解液混匀，在黑暗条件下震荡酶解植物幼嫩组织的细胞壁；

（2）酶解后过滤，收集滤液，清洗，离心，弃上清，获得原生质体悬浮液，并在原生质体悬浮液中加入水解酶以保持细胞壁纤维素的低水平再生；

（3）将加入水解酶的原生质体在亚低温或亚高温条件下温浴，温浴结束后，加超纯水以降低溶液渗透势，定时测定原生质体的直径；

（4）用步骤（3）获得的原生质体的直径值，计算多个原生质体单位时间、单位渗透势、单位面积细胞膜上水分从细胞外进入细胞内的净速度Lp的平均值，该Lp平均值和所选植物适宜温度下的Lp值差值越大，说明其亚低温或亚高温耐受性越差；

步骤（1）中所述的酶解液为纤维素酶和离析酶R-10的甘露醇或蔗糖水溶液，其中纤维素酶的浓度为2~3%w/v，离析酶R-10的浓度为0.5~1%w/v，甘露醇水溶液或蔗糖水溶液的浓度为0.3~0.5mol/L，酶解液的用量与植物幼嫩组织的用量关系为1~5mL：0.2~2g；

或步骤（1）中所述的酶解液为纤维素酶、离析酶R-10和果胶酶的甘露醇或蔗糖水溶液，其中纤维素酶的浓度为2.5~3%w/v，离析酶R-10的浓度为0.5~1%w/v，果胶酶的浓度为0.1~0.2%w/v，甘露醇或蔗糖水溶液的浓度为0.3~0.5mol/L，酶解液的用量与植物幼嫩组织的用量关系为1~5mL：0.2~2g；

步骤（1）中震荡酶解时的温度为22~28℃，速度为70~100 r/min，酶解时间为100~160min。

2.根据权利要求1所述的测定植物亚低温或亚高温耐受性的方法，其特征是：步骤（2）中过滤用140~180目的尼龙网过滤，清洗采用甘露醇或蔗糖水溶液，其浓度为0.3~0.5 mol/L，离心时离心机的离心力为5×g ~30×g，离心时间为3~10 min，并重复清洗、离心、弃去上清一次。

3.根据权利要求1所述的测定植物亚低温或亚高温耐受性的方法，其特征是：步骤（2）中所述的水解酶为纤维素酶和离析酶R-10的甘露醇或蔗糖水溶液，其中纤维素酶的浓度为0.8~1.2%w/v，离析酶R-10的浓度为0.2~0.4%w/v，甘露醇水溶液或蔗糖水溶液的浓度为0.3~0.5mol/L，水解酶用量与原生质体重悬液的体积比为1:10~20。

4.根据权利要求1所述的测定植物亚低温或亚高温耐受性的方法，其特征是：步骤（3）中所述的亚低温或亚高温条件指：当用于亚低温耐受性测定时，以所选植物生长适宜温度下限减去3~5℃或8~10℃为梯度，获得亚低温温度区间；当用于亚高温耐受性测定时，以所选植物生长适宜温度上限加上2~5℃或8~10℃为梯度，获得亚高温温度区间。

5.根据权利要求1所述的测定植物亚低温或亚高温耐受性的方法，其特征是：步骤（3）中温浴时间为20~40min，超纯水的加入量为加入水解酶的原生质体总体积的0.5~2倍。

6.根据权利要求1所述的测定植物亚低温或亚高温耐受性的方法，其特征是：步骤（4）中至少计算90个原生质体单位时间、单位渗透势、单位面积细胞膜上水分从细胞外进入细胞内的净速度Lp的平均值。

7.根据权利要求1或6所述的测定植物亚低温或亚高温耐受性的方法，其特征是：步骤（4）中每个原生质体单位时间、单位渗透势、单位面积细胞膜上水分从细胞外进入细胞内的净速度Lp的计算公式为：Lp=(Vt₂-Vt₁)/[(t₂-t₁)×S×D_osm]，

其中，V t₂为t₂时间点原生质体的体积；V t₁为t₁时间点原生质体的体积；S为t₁时间点原生质体的表面积；D_osm为加超纯水稀释前后渗透势的差值；

D_osm由以下公式计算获得：

当渗透调节物质为甘露醇时：Y=1.1736X；

当渗透调节物质为蔗糖时：Y=1.4155X；

其中Y为渗透压度，单位为mM/Kg，X为酶解液或水解酶中采用的渗透调节物质甘露醇或者蔗糖水溶液的浓度，单位为mM。