CN102577802A - 一种棉花耐热性苗期快速鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种棉花耐热性苗期快速鉴定方法，其为将三叶期～四叶期的棉花幼苗用40～45℃处理5～12h，同时设正常生长条件的对照，分别测定处理后的和正常生长的所述棉花幼苗的抗坏血酸过氧化物酶活性、相对电导率和幼苗萎蔫率，计算抗坏血酸过氧化物酶活性、相对电导率和幼苗萎蔫率相对于正常生长的相对值，确定其耐热性。本发明的方法能够有效快速地鉴定不同棉花种质资源的耐热性，为耐高温育种提供合适的亲本材料。

Description

一种棉花耐热性苗期快速鉴定方法

技术领域

本发明涉及植物的耐热性鉴定，具体涉及一种棉花耐热性苗期快速鉴定方法。

背景技术

随着全球暖化，温度升高引起的热胁迫已经给许多国家和地区的农业造成了影响(Hall，2001)。人类活动所排放的气体，增加了温室气体的浓度，特别是二氧化碳、甲烷、氯氟化碳和一氧化氮的浓度。这些温室气体将逐渐的提高平均环境温度，根据关于气候变化的政府间座谈会议的报告，全球平均温度将每十年升高0.3度，导致全球变暖(Jones et al.，1999)。持续升高的温度可能会改变农作物的地理分布和生长季节，提前发育和成熟来避过生长发育的极限高温(Porter，2005)。

在非常高的温度下，短时间内，细胞组织就会受到灾难性的损坏，导致细胞严重破坏，甚至是细胞死亡。但是在适当的高温环境中，细胞损害和死亡需要很长一段时间。一般而言，当周围的温度瞬时提高10-15℃时，就被认为是热激或者是热胁迫。而耐热性指的是植物在高温条件下的生长能力和产生的经济效益(Peet and Willits，1998)。无论是短暂的高温还是长期高温，都将对植物形态、生理和生化的改变，从而影响了植物的生长发育，导致植物的减产，降低了经济效益。但是胁迫带来的不良影响可以通过不同的遗传方法，改良作物的耐热性来解决。不同植物不同发育阶段能够承受极限高温不同，例如棉花的高温极限是45℃，而水稻只有34℃，但是热胁迫能影响植物整个发育过程。高温所造成的直接伤害包括蛋白质变性聚集，提高膜脂流动性。间接或缓慢热害降低了线粒体和叶绿体的酶活性、抑制蛋白合成、蛋白质降解，破坏膜的完整性(Howarth，2005)。这些伤害最终导致生长受阻、减少离子流量，有毒物质和活性氧的积累。

棉花的生长发育周期长，在不同生长发育时期所处的外界环境温度不同，但是棉花种子萌发、幼苗生长、根发育、发芽、开花、皮棉产量和酶功能的最适温度均为28±3℃(John J.Burke and DonaldF.Wanjura，2010)。夏季(棉花盛花期和结铃期)，当持续35℃周期性高温发生时，会影响棉花花粉发育、授粉和受精，导致蕾铃脱落，影响棉花的产量和品质。在早期棉花育种过程中，主要关注是产量性状的筛选，忽略了一些其它重要性状。经过多年的驯化和育种家的选育，其中很多与棉花抗逆相关的基因被忽视，这使得棉花更易受到环境的影响。

田间自然高温胁迫下，棉花花粉的成熟、花粉管的生长、花粉管在柱头中的生长以及受精过程等都受高温的影响(Barrow Jerry，1983；郑东官等，1995)，最终导致蕾铃的脱落。Liuzhi(2006)等研究表明不同棉花种质资源最高花粉萌发率、最长花粉萌发长度与高温下棉花蕾铃脱落率之间有显著的相关性，并且根据这一相关性，鉴定出不同棉花种质资源的耐高温特性。

在我国棉花种植区域，特别是长江流域棉区，周期性的热害在7至8月份期间经常发生，此时棉花正处于盛花期和结铃期，从而严重影响结铃率和皮棉产量(Zhou et al.1996；Miao et al.1998)。目前关于棉花耐热性的鉴定很少(袁小玲等，2009；邓茳明等，2010；蔡义东等，2010)，主要是在7月-9月棉花盛花期和结铃期，对棉花花粉萌发率和花粉管长度、叶片酶活性、和蕾铃脱落率进行调查；然后根据这几个指标对棉花耐热性进行鉴定分类。但是这些方法受外界环境的影响较大，鉴定程序繁琐。特别是在我国北方棉区，夏季温度高于35℃高温周期短，难易进行田间自然高温的鉴定。而且花粉相关性状的调查在7月份就可以进行，而蕾铃脱落率的调查的时间为8月份，时间跨度太长。

植物在不同温度下的受害程度不一样。确定合适的热胁迫温度对于短时间内比较鉴定出各品种耐热性强弱非常重要(吴国胜，1995)。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种棉花耐热性苗期快速鉴定方法。

本发明提供的方法，为将三叶期～四叶期的棉花幼苗用40～45℃处理5～12h，同时设正常生长条件的对照，分别测定处理后的和正常生长的所述棉花幼苗的抗坏血酸过氧化物酶活性、相对电导率和幼苗萎蔫率，计算抗坏血酸过氧化物酶活性、相对电导率和幼苗萎蔫率相对于正常生长的相对值，确定其耐热性。

其中，优选的处理温度为40℃，优选的处理时间为8h。

其中，所述的正常生长条件为30℃。

其中，设测试对照品种：耐高温对照南丹巴地大花和高温敏感对照早熟长绒7号。

本发明中，计算得到抗坏血酸过氧化物酶活性、相对电导率和幼苗萎蔫率相对于正常生长的相对值，用这三个指标对鉴定材料进行聚类分析，根据下述标准确定耐热性：与耐高温对照一类为耐热性材料，与高温敏感对照一类为感高温材料。

本发明还提供了上述方法在棉花种质资源筛选和棉花育中的应用

本发明方法的效果：

本发明在三叶期～四叶期的棉花幼苗用40～45℃处理5～12h后，不同棉花材料幼苗的萎蔫率、相对电导率都有极显著差异，抗坏血酸过氧化物酶活性都有显著差异，能够有效快速地鉴定不同棉花种质资源的耐热性，为耐高温育种提供合适的亲本材料。

附图说明

图1为本发明29份种质资源耐热性聚类分析；

图2为本发明15份种质资源基于室内耐热性鉴定的主成份分析。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本申请中所涉及的所有棉花品种可市售获得或可获自国家棉花种质资源中期库。

实施例1耐热性材料的筛选

在不同植物中，脱落率与花粉萌发率之间的相关性已经证明能用做棉花耐热性鉴定指标(Prasad et al.1999；Aloni et al.2001；Reddy et al.1999)。

2007年在新疆吐鲁番(生长期间通常在35℃以上，甚至有时高达40℃以上)种植不同棉花种质资源或品种200份，在7月～8月持续高温期调查棉花的蕾铃脱落率、叶片萎蔫程度、不孕籽率、花粉形态、花粉活力等性状，鉴定出不同棉花的耐热特性。

为了排除田间持续高温对花粉离体培养产生影响，找出最佳田间鉴定耐热指标。首先分析29份感、耐热性材料的蕾铃脱落率的高低(脱落率＞60％为感高温，脱落率＜10％抗高温，脱落率10-60％为中间类型)，与蕾铃脱落率、叶片萎蔫程度、不孕籽率、田间自然高温条件下的花粉形态、自然高温条件下花粉活力、以及不同温度离体培养的花粉萌发率等十个指标的相关性。其中不孕籽率与脱落率程极显著正相关(R2＝0.36，P＜0.01)，与脱落率程显著正相关的是花粉形态(R2＝0.25，0.01＜P＜0.05)。花粉不同温度离体培养中，45℃和50℃离体培养的花粉萌发率与脱落率程显著负相关，其决定系数分别为0.22(0.01＜P＜0.05)和0.14(0.01＜P＜0.05)。花粉30℃离体培养的萌发率与脱落率程极显著负相关(R2＝0.40，P＜0.01)。花粉35℃和40℃离体培养萌发率与脱落率也程极显著负相关，它们的决定系数分别为0.19和0.34。花粉形态与不孕籽率程显著正相关，相关系数为0.72(P＜0.01)，决定系数等于0.58。不同温度离体培养的花粉萌发率之间也存在着极显著的正相关性(表1)。

表1棉花耐高温性状间的相关分析

注：*、**分别表示5％、1％显著水平。

根据相关分析的结果，与蕾铃脱落率有显著正相关或者负相关的鉴定指标有不孕籽率、花粉形态和不同温度花粉离体培养的萌发率。不孕籽率和花粉形态是在新疆田间自然高温条件下调查的，因此能直观的反应不同棉花种质资源在高温条件下的不同反应。虽然30℃离体培养的花粉萌发率在不同棉花种质资源间的差异极显著，但是棉花理想生长温度是20℃～30℃(Burk et al.1988；Reddy et al.1991a，1997)，所以30℃离体培养的花粉萌发率不能反应高温对花粉萌发的影响。而且45℃和50℃的温度又过高(Liu zhi.et al，2006)，导致部分耐热性好的花粉不能萌发。因此将这三个与脱落率有负相关性的指标排除，最后用蕾铃脱落率、不孕籽率、花粉形态、35℃离体培养花粉萌发率和40℃离体培养花粉萌发率这五个指标对29份材料进行聚类分析，鉴定其耐热性。

以蕾铃脱落率、叶片萎蔫程度、不孕籽率、花粉形态等田间耐热鉴定指标，将29份棉花种质资源分为4类：第一类为抗高温型，其中包括河北清苑樊庄乡洋棉、中棉所36、常抗棉、吉扎45、南丹巴地大花、平果那沙大花和FJA；第二类为耐高温型：ACALA1517-70、中泸值PL9321、松滋大铃、越南大桃、美中棉971、Arcot-1、大铃启东、石系亚1号和海7124；第三类是较敏感型：HG-BR-8、MCU-5、浙农大Y192、CS-85、荆96273、豫棉2067、LINEF和河南79等；第四类是高温敏感型：岱字棉55、贝尔斯诺、早熟长绒7和非洲E40(图1)。

最后，筛选出具有代表性的耐热型材料常抗棉和南丹巴地大花，高温敏感型材料岱字棉55和早熟长绒7号等4个材料进行生理生化和分子生物学的研究。并确定在今后试验中，以南丹巴地大花为抗高温对照和以早熟长绒7号为高温敏感对照。

实施例2棉花生长时期和逆境条件的筛选

在棉花苗期的6个不同时期即：子叶期、一叶期、二叶期、三叶期、四叶期和五叶期的棉苗分别进行对照(30℃)、35℃、40℃、45℃、48℃处理实施例1筛选出的耐热型材料常抗棉和南丹巴地大花、高温敏感型材料岱字棉55和早熟长绒7号处理8h后，测定其抗坏血酸过氧化物酶(APX)和相对电导率的评价指标，结果见表2。

南丹巴地大花和常抗棉在各个时期都表现为较强的耐热性，而且南丹巴地大花的耐热性要强于常抗棉。子叶期，各个材料的耐热性差别不大，不能用作鉴定指标。一叶期时，高温处理3个指标耐高温材料和高温敏感材料中都有显著差异。但是一叶期，不仅对高温敏感材料有破坏，对耐热性材料也破坏严重，不能准确的反应高温对不同耐热性材料的影响程度。而二叶期和五叶期不同温度处理，不同指标间差异也很明显，但是不如三叶期和四叶期明显，因此三叶期和四叶期鉴定棉花耐热性最为可靠。

就不同温度而言，植物在不同温度下的受害程度不一样。确定合适的热胁迫温度对于短时间内比较鉴定出各品种耐热性强弱非常重要(吴国胜，1995)。34℃以上高温处理大白菜品种时，各供试品种都产生明显的热害症状。32℃处理就能分析出各个品种的耐热性强弱。用对照(30℃)、35℃、40℃、45℃、48℃处理不同耐热性的棉花种质资源，研究结果表明，对照(30℃)和35℃处理时，差别不明显。即使有差异，但是没有规律性，且不属于高温范畴，因此不能用于鉴定棉花的耐热性。48℃处理时，耐高温材料常抗棉和南丹巴地大花的个指标与高温敏感材料的指标差异明显，但是48℃处理对两个材料的危害都很大，且在早期外观差异不如40℃和45℃明显，也不适于苗期棉花耐热性鉴定。45℃处理后，3个鉴定指标中，其它各时期和各鉴定指标在耐高温材料和高温敏感材料测差异没有40℃显著，因此40℃处理是最为理想的鉴定温度。

表2不同耐热性材料生理生化指标适宜温度和叶龄期筛选

1)抗坏血酸过氧化物酶(APX)的评价指标

在不同叶龄期对耐高温材料和高温敏感材料进行不同温度处理后，参与H₂O₂清除系统中的APX的含量在不同耐热性材料中的差异也很显著。子叶期时，对照(30℃)和35℃处理时，APX酶活性没有规律性，且这几个温度间的差异也不明显。在35℃处理时，只有常抗棉APX的活性高于高温敏感材料，达到168.86U/g*min。而另一个耐高温材料南丹巴地大花的APX活性与高温敏感材料岱字棉55没有差异(P＞0.05)，分别为143.22U/g*min和142.37U/g*min。40℃、45℃和48℃处理时，耐高温材料的APX活性都要极显著的高于高温敏感材料(P＜0.01)。

在一叶期，对照(30℃)和35℃处理的不同耐热性材料时，耐高温材料和高温敏感材料之间差异不明显(P＞0.05)。当40℃处理时，南丹巴地大花大花(347.89U/g*min)的APX活性不仅极显著的高于高温敏感材料岱字棉55APX活性(225.59U/g*min)和早熟长绒7号(187.50U/g*min)的APX活性，同时还极显著的高于另一个耐高温材料常抗棉APX活性(262.92U/g*min)。这说明耐高温材料中，南丹巴地大花耐热性要好于常抗棉。

在二叶期时，对照(30℃)和35℃处理不同耐热性材料时，耐高温材料APX活性与不耐高温材料基本没有差异(P＞0.054)，三叶期在这三个温度处理时也没有差异。并且这两个时期都是在40℃处理时，差异最显著。

三叶期40℃处理后，常抗棉、南丹巴地大花、岱字棉55和早熟长绒7号的APX活性分别为543.25U/g*min、567.47U/g*min、436.81U/g*min和419.22U/g*min。

在四叶期和五叶期，耐高温材料和高温敏感材料差异最明显的处理温度是48℃处理，其次是40℃处理。其中四叶期48℃处理后，常抗棉、南丹巴地大花、岱字棉55和早熟长绒7号的活性分别为311.85U/g*min、312.97U/g*min、164.31U/g*min和161.96U/g*min。

2)幼苗萎蔫率的评价指标

在新疆吐鲁番(生长期间通常在35℃以上，甚至有时高达40℃以上)自然条件下，不同棉花种质资源的脱落率、不孕籽率、花粉形态、花粉活力和叶片萎蔫程度有着显著的差异。室内高温胁迫下，棉花幼苗首先表现生理的一系列变化，但最为直接的变化是幼苗发生不同程度的萎蔫，而且品种间也有明显差异，为此，幼苗萎蔫率是室内材料耐热性鉴定较为重要的一个指标。

高温室内胁迫：设置四个温度梯度35℃，40℃，45℃，48℃加对照(30℃)分别对五个生长时期(一叶期，二叶期，三叶期，四叶期，五叶期)的棉苗进行处理，处理后观测胁迫处理后外部形态的变化，每隔两个小时观察一次，记录其叶片伤害程度，当敏感品种损伤的到达最大程度时统计其萎蔫率(一般在高温处理8-12后，观察幼苗情况，并计算萎蔫幼苗占总幼苗的百分率，既是幼苗萎蔫率)。

对不同耐高温材料和高温敏感材料，在一叶期，对照(30℃)和35℃等温度处理时，四个材料的幼苗萎蔫率差异不显著(P＞0.05)，在40℃、45℃和48℃处理时，耐热型材料常抗棉和南丹巴地大花的幼苗萎蔫率低于高温敏感型材料，但是差异不如二叶期、三叶期和五叶期明显。从第三叶期到第五叶期的45℃和48℃高温处理后，耐高温材料和高温敏感材料的幼苗萎蔫率差异很明显。在三叶期至五叶期，40℃高温处理后，耐高温材料南丹巴地大花和常抗棉与高温敏感材料岱字棉55和早熟长绒7号之间的差异也很明显。

在不同温度，第三叶期、四叶期和五叶期外的三个时期，经过40℃、45℃和48℃高温处理后，耐高温材料的幼苗萎蔫率要显著低于高温敏感材料，能作为棉花苗期耐热性的鉴定；且在三叶期的40℃高温处理8h后，两个耐热型材料的幼苗萎蔫率分别为16.7％和21.7％，而高温敏感型材料达42.7％。

3)相对电导率的评价指标

植物细胞中与外界联系的介质细胞膜的组成、性质与植物细胞所处的外界环境密切相关。外界环境对植物的胁迫都首先表现在膜系统的变化(王邦锡，1991)。无论是直接或者间接高温胁迫危害，都将引起膜结构的破坏，导致细胞内电解质外渗，外液电导率增大，因此可以用电导率的相对变化来表示植物细胞的受损程度(张桂莲，2006；杨景峰，1984)。

在不同时期不同温度下，所有材料相对电导率的变化趋势都基本一致。在子叶期40℃处理8h时，常抗棉、南丹巴地大花、岱字棉55和早熟长绒7号四个材料的相对电导率差异不显著(P＞0.05)，当温度升至45℃时，其差异明显，且耐热型材料南丹巴地大花和常抗棉的相对电导率小于高温敏型材料岱字棉55和早熟长绒。48℃高温处理与45℃处理8h相似。

在苗期除了子叶期外，各处理温度对细胞膜破坏程度随着叶龄期的增加而降低，这说明棉花子叶期比其它5个叶龄期更抗高温，且不同耐热性材料的的抗性差别不大。就破坏程度而言，一叶期受温度破坏最为严重，且不同温度处理间的差异最大，所有材料的膜透性都高于其他时期，也就是说一叶期不管是耐热性好的材料常抗棉和南丹巴地大花，还是高温敏感材料岱字棉55和早熟长绒7号都受损严重，一叶期也不适于用来鉴定。同时其它5个叶龄期不同温度处理，相对电导率的差异也极显著(P＜0.01)；就温度而言，经过40℃高温处理后，耐热型和高温敏感型材料细胞膜透性差异最显著，其次是35℃处理。

在二叶期、三叶期和四叶期的35℃和40℃高温处理差异不大，但是与子叶期和五叶期的差异极显著，而其它温度处理在不同时期都存在极显著差异(P＜0.01)。这说明这三个时期测定40℃的相对电导率最有代表性，且在三叶期的40℃高温处理8h后，两个耐热型材料的相对电导率分别为42.4％和41.6％，高温敏感型材料超过47.0％。

综上所述，可用于棉花耐热性鉴定的为三叶期和四叶期高温处理同时三叶期在不同鉴定指标中的差异更为显著，所以在三叶期鉴定更佳，就温度而言，最合适的鉴定温度是40℃处理8h。

实施例3

将15份不同耐热性材料正常环境下种植在营养盆(大小0.03m2)中，每盆5株，每材料种植三重复，生长到三叶期(三片展开真叶)。将三叶期幼苗置于光温培养箱40℃处理8h(相对湿度为70％)；同时设相应材料的对照：幼苗置于光温培养箱30℃处理8h，相对湿度为70％。处理和对照材料同时取鲜叶(全取)进行抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性含量、相对电导率测定和幼苗萎蔫率，采用其相对值P[P＝(X-Y)/Y；X逆境下的测定值，Y为正常条件下的对照测定值]作为评价指标。

从表3可知，15份材料间的APX、相对电导率和幼苗萎蔫率指标存在显著或极显著的差异(P＜0.01)；通过对15份材料的APX、幼苗萎蔫率、相对电导率与其田间蕾铃脱落率的相关性分析，APX(r＝-0.567；0.01＜P＜0.05)、相对电导率(r＝0.8005；P＜0.01)、幼苗萎蔫率(r＝0.7957；P＜0.01)与蕾铃脱落率有显著或极显著相关性。

将幼苗萎蔫率、相对电导率和APX三个生化指标对15份材料进行耐热性聚类分析(图2)，其结果可把15份棉花种质资源分为三类，抗高温材料常抗棉、南丹巴地大花，耐高温材料越南大桃、中泸值PL9321等，高温敏感性材料岱字棉55、早熟长绒7号等，结果与田间鉴定结果一致。

表3三叶期40℃处理不同生理生化指标鉴定

与脱落率的相关系数  -0.5670*    0.8005**    0.7957**

注：*、**分别表示5％、1％显著水平；小、大写字母也分别表示5％、1％显著。

▲幼苗萎蔫率：高温处理8-12后，观察幼苗情况，并计算萎蔫幼苗占总幼苗的百分率.。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种棉花耐热性苗期快速鉴定方法，其为将三叶期～四叶期的棉花幼苗用40～45℃处理5～12h，同时设正常生长条件的对照，分别测定处理后的和正常生长的所述棉花幼苗的抗坏血酸过氧化物酶活性、相对电导率和幼苗萎蔫率，计算抗坏血酸过氧化物酶活性、相对电导率和幼苗萎蔫率相对于正常生长的相对值，确定其耐热性。

2.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，其中的处理温度为40℃，处理时间为8h。

3.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述的正常生长条件为30℃。

4.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，设测试对照品种：耐高温对照南丹巴地大花和高温敏感对照早熟长绒7号。

5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，利用抗坏血酸过氧化物酶活性、相对电导率和幼苗萎蔫率的相对值进行聚类分析，确定其耐热性。

6.权利要求1～5任一项所述的方法在棉花种质资源筛选中的应用。

7.权利要求1～5任一项所述的方法在棉花育种中的应用。

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