CN109536572A - 一种鉴定评价水稻穗颈瘟抗性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明的一种鉴定评价水稻穗颈瘟抗性的方法，利用生育期错开的诱发品种，单独接种多个单孢菌株，配合病圃已有田间菌株，使鉴定田块菌株丰富度提升的同时，使孢子释放持续时间增加，使生育期水稻品种在其整个抽穗成熟期，穗颈发病时孢子浓度足够且丰富，各个生育期不同的水稻品种能够同时播种鉴定。同时，本发明克服了直接注射品种方法发病过重以及自然发病方法导致的发病效果不稳定等缺点，可有效的作为水稻品种穗颈瘟抗性鉴定手段，为水稻亲本抗性筛选、水稻抗性育种及水稻抗性资源筛选等提供可靠方案。

Description

一种鉴定评价水稻穗颈瘟抗性的方法

技术领域

本发明涉及水稻病害鉴定方法，更具体地，涉及一种鉴定评价水稻穗颈瘟抗性的方法。

背景技术

水稻作为主要的粮食作物，每年由于病虫害损失巨大。稻瘟病是一种由稻瘟病菌Magnaporthe oryzae(无性世代：Pyricularia oryzae)引起的真菌性病害，广泛存在于世界各地，严重危害水稻、小麦等粮食作物生产安全。随着人口的逐渐增加以及耕地面积的逐渐减少，粮食产量增加面临巨大的压力。水稻稻瘟病是威胁水稻产量安全的一个重要瓶颈。稻瘟病的发生，常导致水稻产量大幅度减产。1980年，浙江省 50％以上的产量损失由稻瘟病造成；1981年南方早稻稻瘟病，给福建、广东、江西省带来10亿斤稻谷损失。中国粮食大省黑龙江省，2001年、 2005年和2006年爆发稻瘟病，发病严重地块的穗颈瘟率达70％以上，局部地块绝产。选育及推广抗性品种是防治稻瘟病最经济有效和最安全的措施(孙国昌等，2000)。近年来，生产上输送了大量优质高产高抗的水稻品种。然而抗性品种连续使用3-5年后，品种的抗性就会明显衰退，造成稻瘟病的突发和大面积爆发。这种衰退在新抗源无法持续发现的衬托下显得越发突出(Jia et al.，2009)。随着超级杂交水稻的发展，品种审定中稻瘟病抗性级别也成为限制性因素，稻瘟病的有效控制对保障我国的粮食安全具有重要意义。

稻瘟菌种群的变异性导致特异的小种可以不断产生。连续多年大面积种植具有相同或相近抗源的水稻品种会使得当地部分致病小种得到富集进而引起种群演替，致病小种的富集会增大抗性品种的感病几率，从而加速抗瘟性的丧失。大量研究表明，稻瘟菌的小种变异和种群演替是造成水稻抗性丧失的主要原因(孙国昌等，1992；柴荣耀等， 1999；Liuet al.，2010)。通过抗性品种的合理布局与轮换，能够避免品种抗瘟性的快速衰退，缓解新抗源发掘的压力，延长当前主栽品种在生产中的抗病性寿命。

水稻品种在育成过程中，筛选鉴定水稻稻瘟病抗性是必要过程。稻瘟病抗性鉴定主要包括自然病圃鉴定和人工接种鉴定两种手段。根据水稻各生长时期分为叶苗瘟鉴定和穗颈瘟抗性鉴定。传统的自然病圃水稻稻瘟病抗性鉴定主要是在稻瘟病高发区进行苗期和成株期穗颈瘟鉴定，自然病圃受当地环境影响较大，且单一病圃受菌株生理小种局限性及单一年份不可重复性等因素影响，对鉴定结果影响非常大。人工接种鉴定非常必要，且越来越作为主要鉴定手段，但是直接接种于水稻品种特别是直接注射菌液接种与自然发病状态差异较大，比品种实际抗感表现严重，容易导致淘汰某些优良品种。

发明内容

本发明提供一种鉴定评价水稻穗颈瘟抗性的方法，以解决上现有水稻稻瘟病抗性鉴定不准确导致容易淘汰优良品种的技术问题。

根据本发明的一个方面，提供一种鉴定评价水稻穗颈瘟抗性的方法，包括以下步骤：

步骤S1，每年采集穗颈瘟标样，进行单孢分离，以获取并保存菌株；

步骤S2，对每年分离保存的菌种进行生理小种鉴定，以获取每个菌株的致病性；并基于每个菌株的致病性，按每个生理小种所占比例及对单基因系致病覆盖度选择10个产孢好的菌株进行培养，以获取孢子并保存；

步骤S3，选取常年湿度大，雾多、结露时间长的常发病稻区作为鉴定病圃，并选定至少两个生育期错开的发病率稳定且成熟期发病率高的品种作为诱发品种；

步骤S4，取步骤S2所获取的孢子配制浓度为5×104/ml孢子液，对步骤S3中诱发品种注射接种所述孢子液，且每株水稻接种2-3穗；

步骤S5，待步骤S4中的诱发品种黄熟期后进行调查，调查每个品种全部发病穗发病等级，按其损失率定级，且所述水稻品种黄熟期为 80％以上稻穗尖端谷粒成熟，以计算获取损失率。

在上述方案基础上优选，所述步骤S1详细包括：

步骤S1.1，在全田圃四周或沿对角线采集病穗，去除谷粒，剪去多余部分，留取病斑前后10-15cm穗轴及枝梗，晾、晒至干燥；

步骤S1.2，对同田圃的标样装入信封内，登记、编号，注明采集地点、经纬度、海拔、品种和采集人信息；

步骤S1.3，将发病穗颈标样进行单孢分离，并将菌株保存于滤纸片干燥后于-20℃保存。

在上述方案基础上优选，所述步骤S2中，所述菌种培养采用大麦产孢法进行培养。

在上述方案基础上优选，所述大麦产孢法具体包括：

步骤S2.1，将大麦粒在沸水中煮5min，使大麦粒充分吸水，装入瓶中灭菌待用；

步骤S2.2，将培养于培养皿的菌株分别打取菌块接种于大麦培养基，每瓶约6-8块，摇匀后置于28℃下培养14天

步骤S2.3，取出培养皿内的培养基用清水冲洗，保湿培养逐天检查产孢情况；

步骤S2.4，清水冲洗步骤S2.3所获取的大麦粒，将培养好的孢子抽滤到滤纸，干燥保存。

在上述方案基础上优选，所述步骤S3中，选择的诱发品种为两个，且两个所述诱发品种的生育期相差30-35天。

在上述方案基础上优选，所述步骤S4中，每组水稻注射2ml所述孢子液。

在上述方案基础上优选，所述步骤S5中发病等级包括：

一级：小枝梗发病，每穗损失≤5.0％；

二级：主轴或穗颈发病，每穗损失5.1％～20.0％；

五级：主轴或穗颈发病，谷粒半瘪，每穗损失20.1％～50.0％；

七级：穗颈发病，大部分瘪谷，每穗损失50.1％～70.0％；

九级：每穗损失＞70.0％。

本发明与现有技术相比，其有益效果是：

本发明的鉴定评价水稻穗颈瘟抗性的方法，通过选择生育期相差多天的诱发品种，单独接种多个单孢菌株，配合病圃已有田间菌株，使鉴定田块菌株丰富度提升的同时，使孢子释放持续时间增加，使生育期水稻品种在其整个抽穗成熟期，穗颈发病时孢子浓度足够且丰富，各个生育期不同的水稻品种能够同时播种鉴定。此外，本发明的方法能够更加客观的反应水稻品种抗性水平，克服了直接注射品种方法发病过重以及自然发病方法导致的发病效果不稳定等缺点。可有效的作为水稻品种穗颈瘟抗性鉴定手段，为水稻亲本抗性筛选、水稻抗性育种及水稻抗性资源筛选等提供可靠方案。

附图说明

图1为本发明的鉴定评价水稻穗颈瘟抗性的方法的流程框图；

图2为本发明的待水稻品种和诱发品种田间布局示意图；

图3为本发明的注射接种诱发品种穗后待鉴定品种颈瘟发病图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

为了更接近自然鉴定环境，并且更加高效真实的反应品种抗性，本发明通过接种诱发品种来反应水稻穗颈瘟的抗性鉴定方法主要包括以下步骤：(1)菌株的采集、分离与保存；(2)菌株的选择与培养； (3)诱发品种的选择；(4)自然鉴定病圃的选择；(5)待鉴定水稻品种与诱发品种的播种、育秧与移栽；(6)菌株接种；(7)病害调查与评价。

以下将详细说明上述操作步骤，以方便理解上述步骤。

步骤S1，菌株的采集、分离与保存

水稻黄熟期(半穗黄)后，在发病稻区、区试鉴定病圃、大面积生产上稻瘟病病田，尤其是新丧失抗性品种田，每年采集穗颈瘟标样。全田四周或沿对角线采集病穗，去除谷粒，剪去多余部分，留取病斑前后10-15cm穗轴及枝梗，晾、晒至完全干燥。同田标样装入信封内，登记、编号，注明采集地点、经纬度、海拔、品种和采集人信息。将病穗颈标样进行单孢分离，而后将菌株保存于滤纸片干燥后于-20℃保存。

步骤S2，菌株的选择与培养

在对每年分离保存的穗颈瘟菌株进行生理小种鉴定，包括接种中国稻瘟病生理小种鉴定系的7个鉴定品种及以丽江新团黑谷为背景的单基因系以掌握了解每个菌株的致病性。通过对连续多年的菌株分析，按每个生理小种所占比例及对单基因系致病覆盖度选择10个产孢好的菌株进行培养。培养方法为大麦产孢法：将大麦粒在沸水中煮5分钟，使其充分吸水，装入茄瓶灭菌待用。将培养于培养皿的菌株分别打取菌块接种于大麦培养基，每瓶约6-8块，摇匀后置于28℃下培养14天，然后取出用清水冲洗，保湿培养逐天检查产孢情况。用清水冲洗大麦粒，将培养好的孢子抽滤到滤纸，干燥保存待用。

步骤S3，诱发品种的选择及自然鉴定病圃的选择

诱发品种选择在当地长期稳定发病，成熟期发病率高的品种，本发明选择2个诱发品种，一个生育期在80-90天，一个生育期在110-120 天。

在选择自然鉴定病圃时，选择常年湿度大，雾多、结露时间长的常发病稻区，其中，本发明的湿度大所指的范围是湿度大于40％，一年中有雾和结露时间大于100天以上的常发病稻区。水稻主要生长时期 5-10月份常年均温20-30℃的山区，最高温35℃以上天很少甚至没有的田块。

在每年5月底至6月初，均温20℃以上时诱发品种和鉴定品种同时期分开播种，每个鉴定品种约10克，诱发品种播种量根据鉴定品种数量调整，2个诱发品种用种量分别与鉴定品种总用种量1∶1。育秧过程中，如遇低温架竹弓、钢筋拱，覆盖薄膜，旱育秧出苗1cm后，用百菌清1∶1500倍(国产百菌清则为1∶600倍)稀释液喷雾至土表轻微积水，以防立枯病。按每亩10公斤尿素施肥一次，灌水一次，喷施吡虫灵，防止蓟马危害。大田移栽时每个待鉴定品种插秧5乘以5共25株，行间距20cm左右，隔一行为下一品种，纵行2个诱发品种各插一行，待鉴定品种全部插完，在外围插满2个诱发品种一圈，具体的移栽分布图见图 2。在分蘖期及孕穗期各施尿素10kg每亩，其余按常规管理，喷施农药防治虫害。

步骤S4，菌株接种

用灭菌后的毛笔刷，从已保存好的各菌株孢子从滤纸上洗刷下来，纱布过滤后配成浓度为5×10⁴/ml孢子液待用。在2个诱发品种孕穗后期即将抽穗时，选择下午5点以后，用一次性注射器将孢子液分2次(因2 个品种生育期不同)注射接种于诱发品种穗包，待孢子液从穗包顶端溢出为止，每穗约2ml左右，每株水稻接种2-3穗。

步骤S5，病害调查与评价：穗颈瘟调查标准

在待鉴定水稻品种黄熟期(80％稻穗尖端谷粒成熟时)进行调查，调查每个品种全部发病穗发病等级，按其损失率定级。1级：小枝梗发病，每穗损失≤5.0％(个别小枝梗发病)；3级：主轴或穗颈发病，每穗损失5.1％～20.0％(1/3左右枝梗发病)；5级：主轴或穗颈发病，谷粒半瘪，每穗损失20.1％～50.0％；7级：穗颈发病，大部分瘪谷，每穗损失50.1％～70.0％；9级：每穗损失＞70.0％(穗颈发病，造成白穗，在统计损失率时按每穗损失100％统计)。其损失率评价如下：

计算公式：

备注：各级损失率分别取0、0.05、0.2、0.5、0.7、1。

其评级标准为：

以下为了进一步验证本发明的技术方案效果，在大围山连续从 2012年-2016年自然发病稻曲采集穗颈瘟发病标样，烘干后保存。而后通过单孢分离得到数百个单孢菌株。首先进行中国生理小种鉴定品系接种，确定其根据中国生理小种分类得到其分类结果(表1)。通过生理小种鉴定后，再将所有菌株接种于以丽江新团黑谷为背景的24个单基因系。选取1个ZF、1个ZG、1个ZD、1个ZA、2个ZC和4个ZB 系菌株，这些菌株致病性可以覆盖24个单基因系，而后对这10个菌株进行大麦粒接种，培养14天后，用清水冲洗产生大量孢子，然后抽滤到滤纸干燥后保存待用。

表1 2012年-2016年大围山菌株生理小种种群分布

生理小种群体	菌株占比(％)
		ZA	13
ZB	63
		ZC	17
ZD	2
		ZE	0
ZF	1.1
		ZG	3.3
ZH	0.6

选择Co39和湘晚籼11号2个品种为诱发品种，与2017年待鉴定138个品种浸种、催芽后，按顺序分别播种于大围山选择好的大田。每个待鉴定品种至少10克，保证发芽率以确保可以25株苗的种量。每个品种间隔15cm以上，浇水盖土，架竹弓、钢筋拱，覆盖薄膜，保证正常出苗生长。待出苗10天后酌施氮肥，保持稻苗嫩绿。播种后25 天，对秧苗进行移栽，每个待鉴定品种插秧5乘以5共25株，行间距 20cm左右，隔一行为下一品种，纵行在待鉴定品种间2个诱发品种各插一行，在待鉴定品种全部插完后，在其外围插满2个诱发品种各一圈，且2个诱发品种各作为一个感病对照品种，请参阅图3所示。

在分蘖期及孕穗期接种前各施尿素10kg每亩。在孕穗后期，用灭菌后的毛笔刷，从已保存好的各菌株孢子从滤纸上洗刷下来，单孢菌株分开洗刷，4层纱布过滤后配成浓度为5×10⁴/ml孢子液。选择某个阴天下午5点以后，用一次性注射器将孢子液分2次(因2个品种生育期不同)注射接种于诱发品种穗包，待孢子液从穗包顶端溢出为止，每穗约2ml左右，每株水稻接种2-3穗，10个菌株分别按顺序接种2 个诱发品种。

在待鉴定水稻品种黄熟期(80％稻穗尖端谷粒成熟时)进行调查，调查及评价标准按前述。结果2个诱发品种发病等级都为9级，其鉴定品种颈瘟发病图如图3所示，说明发病条件合适。待鉴定138个品种品种结果如(表2)。待鉴定水稻品种通过本发明方法鉴定出发在7 级及以上的水稻品种为28个，占比20.3％；小于等于3级的为91个，占比65.9％；通过室内叶瘟鉴定7级及以上为33个，占比23.9％，小于等于3级的为88个，占比63.8％；而自然病圃穗颈瘟自然发病7级及以上为21个，占比15.2％，小于等于3级的为96个，占比69.6％；通过3种鉴定方法比较可以得出结论：通过接种不同生理小种菌株于诱发品种进而长期保持田间鉴定长时间拥有大量且丰富的菌源，这种方法既能够克服自然病圃由于环境田间不适宜菌源量不够而导致的鉴定结果偏轻，相对于室内培养室的极端优越发病环境导致的发病过重又更真实的反应了田间水稻实际发病条件下的发病情况。鉴定抗感效果明显，可为水稻抗性育种大规模筛选及各种水稻材料抗性鉴定提供好的解决方案。

表2 138待鉴定水稻品种3种叶瘟穗颈瘟抗性鉴定方法鉴定结果

Claims (7)

1.一种鉴定评价水稻穗颈瘟抗性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤S1，每年采集穗颈瘟标样，进行进行单孢分离，以获取并保存菌株；

步骤S2，对每年分离保存的菌种进行生理小种鉴定，以获取每个菌株的致病性；并基于每个菌株的致病性，按每个生理小种所占比例及对单基因系致病覆盖度选择10个产孢好的菌株进行培养，以获取孢子并保存；

步骤S3，选取鉴定病圃，并选定至少两个生育期错开的发病率稳定且成熟期发病率高的品种作为诱发品种；

步骤S4，取步骤S2所获取的孢子配制浓度为5×10⁴/ml孢子液，对步骤S3中诱发品种注射接种所述孢子液，且每株水稻接种2-3穗；

步骤S5，待步骤S4中的诱发品种黄熟期后进行调查，调查每个品种全部发病穗发病等级，按其损失率定级，且所述水稻品种黄熟期为80％以上稻穗尖端谷粒成熟，以计算获取损失率。

2.如权利要求1所述的一种鉴定评价水稻穗颈瘟抗性的方法，其特征在于，所述步骤S1详细包括：

步骤S1.1，在全田圃四周或沿对角线采集病穗，去除谷粒，剪去多余部分，留取病斑前后10-15cm穗轴及枝梗，晾、晒至干燥；

步骤S1.2，对同田圃的标样装入信封内，登记、编号，注明采集地点、经纬度、海拔、品种和采集人信息；

步骤S1.3，将病穗颈标样进行单孢分离，并将菌株保存于滤纸片干燥后于-20℃保存。

3.如权利要求1所述的一种鉴定评价水稻穗颈瘟抗性的方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述菌种培养采用大麦产孢法进行培养。

4.如权利要求1所述的一种鉴定评价水稻穗颈瘟抗性的方法，其特征在于，所述大麦产孢法具体包括：

步骤S2.1，将大麦粒在沸水中煮5min，使大麦粒充分吸水，装入茄瓶灭菌待用；

步骤S2.2，将培养于培养皿的菌株分别打取菌块接种于大麦培养基，每瓶约6-8块，摇匀后置于28℃下培养14天

步骤S2.3，取出培养皿内的培养基用清水冲洗，保湿培养逐天检查产孢情况；

步骤S2.4，清水冲洗步骤S2.3所获取的大麦粒，将培养好的孢子抽滤到滤纸，干燥保存。

5.如权利要求1所述的一种鉴定评价水稻穗颈瘟抗性的方法，其特征在于，所述步骤S3中，选择的诱发品种为两个，且两个所述诱发品种的生育期相差30-35天。

6.如权利要求1所述的一种鉴定评价水稻穗颈瘟抗性的方法，其特征在于，所述步骤S4中，每组水稻注射2ml所述孢子液。

7.如权利要求1所述的一种鉴定评价水稻穗颈瘟抗性的方法，其特征在于，所述步骤S5中发病等级包括：

一级：小枝梗发病，每穗损失≤5.0％；

二级：主轴或穗颈发病，每穗损失5.1％～20.0％；

五级：主轴或穗颈发病，谷粒半瘪，每穗损失20.1％～50.0％；

七级：穗颈发病，大部分瘪谷，每穗损失50.1％～70.0％；

九级：每穗损失＞70.0％。