CN105519367A - 野生棉苗期耐低温鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物生理学，具体地，涉及野生棉苗期耐低温鉴定方法。所述方法包括步骤1)种子硫酸脱绒和切口处理；2)催芽处理；3)培养幼苗，选择3-5叶期长势一致的棉花幼苗；4)选择更接近自然条件的低温胁迫处理，5)根据棉花幼苗的受害情况进行评分，对野生棉的抗性水平进行分级。该方法选择在对低温最敏感的幼苗期进行严苛的低温胁迫处理，以期筛选到真正具有较高抗性水平的耐低温棉花材料；而且根据棉花叶片受害情况进行评分，客观分级，极大降低了人为因素造成的误差。该方法不受季节限制，随可进行大批量材料的鉴定，易于推广和利用。

Description

野生棉苗期耐低温鉴定方法

技术领域

本发明涉及植物生理学和作物栽培学，具体地，本发明涉及野生棉苗期耐低温鉴定方法。

背景技术

棉属包括4个栽培棉种和47个野生棉种，栽培棉种经过长期的人为定向选择(偏向纤维)，缺少逆境生存的优良特性。而野生棉种长期生活在自然环境中，不经受人工选择压力，具有多样性丰富、抗逆性强等优良性状。若要充分利用棉花野生资源所特有的抗逆性状，必然需要对棉花野生资源的耐低温性状进行鉴定和评价，其首要条件是寻找到一种合理有效的适合野生棉花的耐低温鉴定方法。

目前，针对棉花栽培品种耐低温鉴定方法主要有萌发期出苗率鉴定法和苗期大田直接鉴定法。萌发期出苗率鉴定法主要是针对栽培棉种，而野生棉的种子外壳极度致密坚硬，自然条件无法正常萌发，所以传统的萌发期耐低温鉴定法并不适合野生棉种；苗期大田鉴定法，受年份、地区、温度、湿度等环境因素的影响极大，实验重复性差。而且缺少明确的评价体系，结果受个人主观因素影响很大。因此，探索一种适合野生棉的苗期耐低温鉴定的标准方法和高效的评价体系，对棉花野生资源的利用及耐低温棉花新品种的培育具有重要的指导意义。

发明内容

本发明的目的是探索一种适合棉花野生种质资源的苗期耐低温鉴定方法，以期快速高效地对棉花野生种质资源进行客观可靠的鉴定，为棉花耐低温新品种的培育奠定理论基础和材料基础。

根据本发明的棉花苗期耐低温鉴定方法，包括以下步骤：

1)种子的前处理：种子硫酸脱绒，选择籽粒饱满成熟的种子，用单面刀片在种子合点端(钝端)切小口，大小1mm×1mm，种壳切破露出种仁即可。

2)催芽：准备砂床，选择合适的砂土洗净，煮沸灭菌后，将湿砂铺在发芽盒中。将切口的野生棉种子，播种在准备好的沙床上，然后加盖一层松散砂，砂床含水量为12％-15％。置于恒温光照培养箱中培养，常温培养2～3天。野生棉难以出苗，经以上处理保证野生棉能够正常发芽。

3)移苗和育苗：将萌发的种子移入装好营养土和蛭石的营养钵内，人工气候室培养，常规管理，培育幼苗至3-5叶期。

4)低温胁迫处理：移入低温5℃的人工气候培养箱内，其他光照和湿度条件与常温(30℃)条件完全一致。处理48h后，调查幼苗的受害情况。将处理后的幼苗转移到常温条件下恢复生长两周，再次调查幼苗长势。目前棉花陆地棉报道的15℃以上的低温，对野生棉棉种起不到鉴定作用，在15℃处理条件下，材料之间没有区别把，温度设置为5℃，所有野生棉种包括陆地棉对照中都有明显的区别。

5)耐低温水平分级：根据叶片受害情况对棉花幼苗耐低温水平进行调查和评分，计算耐低温指数，根据耐低温指数对其耐低温水平进行分级。

具体地，根据本发明的具体实施方式的方法，包括：1)种子的前处理：种子硫酸脱绒后，选择籽粒饱满成熟的种子。采用机械损伤的方法切口(用单面刀片在种子合点端(钝端)切小口，大小1mm×1mm即可。一般不在种子珠孔端(尖端)切口，避免损伤胚根。由于野生棉种子外壳特别致密坚硬，必须通过切口，以促进种子吸水萌发。2)催芽：选择大小均匀，直径为0.05mm～0.80mm的沙子，洗涤，煮沸30min～1h进行灭菌，烘干备用。加入适量的无菌水，拌匀，将湿砂铺入发芽盒中，厚度约15mm。砂子颗粒不能太大，太大保水性不好；也不能太小，太小的砂粒透气性不好，容易造成种子缺氧烂种子。将切口的野生棉种子，播种在准备好的沙床上，粒与粒之间保持一定的距离，然后加盖10-20mm厚度的松散砂，砂床含水量为12％-15％。置于恒温光照培养箱中培养，温度28℃，湿度85％，光照12h，黑暗12h，培养2～3天。催芽时间长短要合适，催芽时间过短，萌发的种子过小，种壳没有脱掉；催芽时间过长，幼苗长得过大，移苗时容易伤根。3)移苗和育苗：将营养土与蛭石按照1:1比例混匀，装入10cm*10cm营养钵内，然后摆放在托盘内，在托盘内加入适量的水，待营养钵最上面的混合土浸湿为止。每个营养钵中间扎一个深浅一致的小穴，大约2cm深浅，把正常萌发，长势一致的幼苗，胚根朝下，子叶朝上放入小穴内，然后覆盖上一层混合土，上面喷洒适量水分，保持培养基湿润。移入人工气候室内，30℃,12h光照，常规管理，培养至3-5叶期(最顶端的真叶展平)。该时期的棉花幼苗对低温胁迫最为敏感，能真实反映棉花耐低温水平。4)低温胁迫处理：挑选生长旺盛、长势一致的3-5叶期棉花幼苗，移入低温5℃的人工气候培养箱内，其他光照和湿度条件与对照(30℃)完全一致。由于野生棉具有较好的抗逆性，不能直接参考栽培棉的低温胁迫温度(15℃～20℃)，本发明重新探索适合野生棉的有效胁迫温度为5℃。低温胁迫处理48h，第一次调查幼苗的长势。然后将处理后的幼苗转移到与对照一样的正常条件中恢复两周，然后第二次调查幼苗长势。5)耐低温水平分级：根据两次幼苗长势调查结果，按照以下标准对棉花受害情况调查和评分：

(1)0分-整株萎蔫死亡；

(2)1分-有1片绿色的叶子(至少2/3的叶子为绿色)；

(3)2分-有2片绿色的叶子；

(4)3分-有2片绿色的叶子，并且有新的叶子出现。

耐低温指数计算公式为：耐低温指数＝(∑fx)/(n×3)×100，f为该级别的株数，x为相应级别的指(0-3)，n为调查总株数。

根据耐低温指数定性鉴定材料对低温冷害的抗性级别：

耐低温级别	耐低温指数(％)
		高抗	≥90.0
抗	80.0～89.9
		耐	50.0～79.9
感	20.0～49.9
		高感	＜20.0

本发明为野生棉幼苗期耐低温研究提供了一种新鉴定方法，具有以下创新点和优点：

(1)首次采用极度低温胁迫(5℃)进行鉴定，与之前的15℃低温鉴定相比筛选条件更严苛。目前棉花陆地棉报道的15℃以上的低温，对野生棉棉种苗期鉴定起不到区别作用，本发明的方法把温度设置为5℃，所有野生棉种包括陆地棉对照中都有明显的区别。一是该筛选温度更接近某些地区的“倒春寒”的冷害低温，二是可以筛选到真正具有较高抗性水平的耐低温材料。另外，该方法选择3-5叶期的棉花幼苗，该时期的棉苗对温度最为敏感，能真实反映棉花的耐低温水平，结果更客观和可靠。

(2)该方法根据棉花叶片受害情况进行评分，计算耐低温指数，然后根据指数大小进行客观分级。为棉花耐低温鉴定提供了系统客观的评价标准，对叶片受害情况进行量化，极大降低了人为主观因素造成的误差。本发明首次提出了苗期鉴定方法的评价分级标准，该标准在陆地棉上同样适用。现有报道的大田直接鉴定法，受环境因素的影响很大，而且没有评价标准，材料之间的抗性结果重复性较差。

(3)与大田直接鉴定法相比，该方法采用室内人工气候培养箱培养，温度、湿度和光照等环境因素均可控，减少了环境因素导致的误差，使结果更加可靠。

(4)该方法不受季节限制，随时随地均可进行，节约时间；并且操作简单，人力物力成本低，占用空间少，可进行大批量材料的鉴定；易于推广和利用。

附图说明

图1，棉花低温胁迫前后对比：1-a，野生棉(克劳茨基棉)常温条件生长正常，1-b,野生棉(克劳茨基棉)5℃低温胁迫48h后，叶片稍微低垂，没有明显的受害特征，生长良好，耐低温水平为高抗。1-c,野生棉(雷蒙德氏棉)常温条件生长正常，1-d,野生棉(雷蒙德氏棉)5℃低温胁迫48h后，植株开始萎蔫，部分叶片明显受害，耐低温水平为耐。1-e，栽培棉(中50)常温条件生长正常；1-f,栽培棉(中50)5℃低温胁迫48h后，整个植株完全萎蔫至死亡，移到常温条件不能恢复生长，耐低温水平为高感；黄色箭头所指为受害叶片。

具体实施方式

实施例1采用野生棉苗期耐低温鉴定方法对野生棉(瑟伯氏棉、克劳茨基棉、拟似棉、三裂棉、雷蒙德氏棉)以及栽培棉(中50)的耐低温水平进行鉴定和评价。

1、棉花材料：

野生棉(瑟伯氏棉、克劳茨基棉、拟似棉、三裂棉、雷蒙德氏棉)，陆地棉(中50)为栽培棉对照材料。已报道这些野生棉具有良好的低温抗性。

2、种子的前处理:

将所有带短绒的种子进行硫酸脱绒，挑选大小一致，乌黑饱满、无虫害的完整的成熟种子。用单面刀片将野生棉的种子合点端(钝端)切小口，露出种仁即可。

3、催芽：

采用砂床培养法，将洗净煮沸灭菌后的湿砂铺在发芽盒中，将切口后的野生棉种子，播种在准备好的沙床上，然后加盖一层松散砂，置于恒温光照培养箱中，常温培养2～3天。

4、移苗和育苗：

准备好大小合适的营养钵，装入等量的混合土(营养土和蛭石比例为1：1)，摆放在配套的托盘中，直接在托盘中加入适量的水至营养钵最上层的土壤湿润为止。在营养钵中间扎1cm深的小穴，然后胚根朝下轻轻放入萌发的种子，然后覆盖上一层混合土。喷洒适量的水保持湿度。放置在人工气候培养室中，常规管理，培育幼苗生长至3-5叶期。

5、低温胁迫处理：

选择生长旺盛健壮、长势一致的3叶期幼苗，移入温度为5℃的人工气候培养箱内，对照处理的温度为30℃，其他光照与湿度培养条件二者完全相同。每个材料每个处理为30棵，处理48h后，首次调查幼苗的受害情况。将低温胁迫的幼苗转移到常温条件下恢复培养2周，再次调查棉花幼苗生长情况。

6、耐低温水平分级：按照本发明的评分标准，对每个材料进行评分，依据公式计算耐低温指数，对材料的耐低温水平进行分级，结果见表1：

表1棉花耐低温水平的评价结果

材料名称	耐低温指数(％)	耐低温级别
			瑟伯氏棉	88.9	抗
克劳茨基棉	91.2	高抗
			拟似棉	27.3	感
雷蒙德氏棉	52.4	耐
			三裂棉	50.0	耐
中50	0	高感

Claims (2)

1.野生棉苗期耐低温鉴定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)对野生棉种子进行硫酸脱绒和切口处理；

2)催芽：选择直径为0.05mm～0.80mm的沙子，洗涤，灭菌，烘干，加入无菌水，拌匀，将湿砂铺入发芽盒中，将切口的野生棉种子，播种在准备好的沙床上，然后加盖10-20mm厚度的松散砂，砂床含水量为12％-15％，置于温度28℃，湿度85％，光照12h，黑暗12h，培养2～3天；

3)移苗和育苗：将营养土与蛭石混匀，装入营养钵内，把萌发的幼苗，胚根朝下，子叶朝上放入小穴内，然后覆盖上一层混合土，喷洒水分，保持培养基湿润，移入人工气候室内，30℃,12h光照培养至3-5叶期；

4)低温胁迫处理：挑选3-5叶期棉花幼苗，在胁迫温度为5℃的条件下，低温胁迫处理48h，第一次调查幼苗的长势，然后将处理后的幼苗转移到与对照一样的正常条件中恢复两周，然后第二次调查幼苗长势；

5)抗性分级：根据棉花叶片受害情况，进行评分，评价棉花野生资源的抗性水平。

2.根据权利要求1所述的野生棉苗期耐低温鉴定方法，其特征在于，根据两次幼苗长势调查结果，按照以下标准对棉花受害情况调查和评分：

(1)0分-整株萎蔫死亡；

(2)1分-有1片绿色的叶子(至少2/3的叶子为绿色)；

(3)2分-有2片绿色的叶子；

(4)3分-有2片绿色的叶子，并且有新的叶子出现。

耐低温指数计算公式为：耐低温指数＝(∑fx)/(n×3)×100，f为该级别的株数，x为相应级别的指(0-3)，n为调查总株数。