CN104800161A - 一种利用新型表面活性剂制备的原花青素柔性纳米脂质体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种利用新型表面活性剂制备原花青素柔性纳米脂质体及其制备方法。所述脂质体包括原花青素、磷脂、胆固醇、表面活性剂,按比例称取大豆卵磷脂、胆固醇和表面活性剂,加入氯仿、甲醇或者无水乙醇氯仿混合液;振荡充分混合后,置于旋转蒸发器上,恒温水浴中减压蒸发除去有机溶剂使类脂溶液形成一层均匀薄膜;向薄膜中加入一定量含0.9%氯化钠的原花青素水溶液,轻摇,将脂膜洗脱并旋转水合,得到原花青素脂质体混悬液;再将混悬液置于冰水中探头超声即得;于冰箱4℃避光保存。本发明制备的原花青素柔性纳米脂质体包封率高、粒径小、体外缓释性能好、稳定性高、透皮吸收好;且制备工艺简单,易于工业化;反应条件温和,安全环保。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域,涉及一种天然抗氧化剂原花青素柔性纳米脂质体及其制备方法。
背景技术
原花青素是由(+)-儿茶素、(-)-儿茶素及(-)-表儿茶素没食子酸酯通过C4-C8键或C4-C6键连接而成的不同聚合度的多酚物质,广泛存在于葡萄籽、银杏、柏树和松树皮等植物中。原花青素(OPC)具有强抗氧化作用,人体吸收度高,可以清除体内的自由基和活性氧,预防由于人体血液中低密度脂蛋白(LDL)的氧化为主要原因而引起的动脉硬化。另外还具有一些令人注目的生理功效,如降压效应与对心肌的保护作用、抗辐射作用、抗微生物、促进细胞增殖活性、抗突变和抗癌等。
柔性纳米脂质体又名传递体、变形脂质体,是通过自身膜的高度变形性,以渗透压差为驱动力,能高效地穿透比它本身小数倍孔道的类脂聚集体。其主要成分为磷脂和表面活性剂(如胆酸钠、去氧胆酸钠等)。粒径多为数十至数百纳米,外观为胶体溶液。具有高效渗透性、高度柔韧性和亲水性。它与普通脂质体最大的区别就是加入了表面活性剂,使其具有高度变形性。该类脂质体受角质层水合所产生的渗透压的影响能发生变形并被“挤入”角质层,因而显著增加药物的经皮渗透更多的药物保留在皮肤中,减少药物进入血循环,在表皮和真皮内形成药物贮库,形成一个缓释模型,使药物持久地对病变局部起治疗作用。同时柔性纳米脂质体能改变原型药物的理化性质,增强药物的药理作用及疗效,减少胃肠道刺激性,降低药物不良反应,提高生物利用度。因此柔性纳米脂质体越来越多地用作各种大分子、水溶性药物或脂溶性药物的载体。
原花青素水溶性较好,但是稳定性较差,且天然原花青素分子量较大,结构复杂,不利于人体组织吸收。因此,限制了原花青素在各个领域的广泛应用。已有研究制备了原花青素柔性纳米脂质体,但是其忽略了不同的表面活性剂对柔性纳米脂质体制备的影响,其制备的柔性纳米脂质体包封率低,粒径大,体外缓释作用差。
发明内容
本发明的目的是探索一种新型表面活性剂以制备包封率高、粒径小、体外缓释作用好、稳定性好、透皮吸收效果好的原花青素柔性纳米脂质体。
本发明是通过如下技术方案实现的:
本发明的原花青素柔性纳米脂质体包括原花青素、磷脂、胆固醇、表面活性剂,其中,所述的表面活性剂为Tween80、Span20或去氧胆酸钠。
磷脂、胆固醇、表面活性剂的质量比为8:1:1—8:2:2;优选8:1.4:1.4—8:2:2。
磷脂、原花青素的质量比为8:0.5—8:1;优选8:0.7—8:1。
所述磷脂优选大豆卵磷脂。
本发明的原花青素柔性纳米脂质体通过如下方法制备:
按比例称取磷脂、胆固醇和表面活性剂,加入氯仿、甲醇或者无水乙醇氯仿混合液,使磷脂的浓度达到质量体积比1-2%;振荡充分混合后,置于旋转蒸发器上,40—50℃恒温水浴中,减压蒸发除去有机溶剂使类脂溶液形成一层均匀薄膜;向薄膜中加入一定量含原花青素的0.9%氯化钠水溶液,其中,原花青素浓度为1-2mg/mL,轻摇,将脂膜洗脱并旋转水合1-2h,得到原花青素脂质体混悬液;再将混悬液置于冰水中探头超声一段时间5—20min,每5s间歇一次,优选10—15min,超声功率50W,即得;于冰箱4℃避光保存。对原花青素柔性纳米脂质体进行评价,包括包封率、粒径、体外缓释作用、稳定性及透皮渗透量。
试验结果表明,本发明具有如下优点:
1、制备的原花青素柔性纳米脂质体把原花青素包裹在脂质体内水相中,降低了其对外界环境的敏感度,增强其稳定性。
2、制备的原花青素柔性纳米脂质体包封率高、粒径小、体外缓释作用好、稳定性高、透皮吸收好。
3、工艺简单,易于工业化。
4、反应条件温和,安全环保。
附图说明
图1为实施例5条件下原花青素柔性纳米脂质体、原花青素普通脂质体和原花青素溶液的体外释药图。
图2为实施例5条件下原花青素柔性纳米脂质体、原花青素普通脂质体和原花青素溶液在不同温度下的保留率图
a为原花青素柔性纳米脂质体、原花青素普通脂质体和原花青素溶液在4℃下的保留率图;b为原花青素柔性纳米脂质体、原花青素普通脂质体和原花青素溶液在室温(25℃)下的保留率图;c为原花青素柔性纳米脂质体、原花青素普通脂质体和原花青素溶液在室外温度(30℃)的保留率图。
图3为实施例5条件下原花青素柔性纳米脂质体、原花青素普通脂质体和原花青素溶液的皮肤渗透量图。
具体实施方案:
本发明可以按照下列实施例进行具体说明其制备过程和效果。
实施例1:
1、分别称取300mg大豆卵磷脂、37.5mg胆固醇和37.5mg Tween80,加入15mL无水乙醇氯仿混合液(1:2);
2、振荡充分混合后,置于旋转蒸发器上,40—50℃恒温水浴中,减压蒸发除去有机溶剂使类脂溶液形成一层均匀薄膜;
3、称取37.5mg原花青素并溶解于37.5mL含0.9%氯化钠的水溶液中,将原花青素溶液加入薄膜中,轻摇,将脂膜洗脱并旋转水合1h,得到原花青素脂质体混悬液;
4、再将混悬液置于冰水中探头超声10min即得,超声5s,间歇5s,超声功率50W;于冰箱4℃避光保存;
5、同法制备原花青素溶液和不含Tween80的普通脂质体;
6、所得的原花青素柔性纳米脂质体包封率为78.9%,粒径为139.4nm;原花青素普通脂质体包封率为61.1%,粒径为279.4nm。
实施例2:
1、分别称取300mg大豆卵磷脂、52.5mg胆固醇和52.5mg Span20,加入15mL无水乙醇氯仿混合液(1:2);
2、振荡充分混合后,置于旋转蒸发器上,40—50℃恒温水浴中,减压蒸发除去有机溶剂使类脂溶液形成一层均匀薄膜;
3、称取26.25mg原花青素并溶解于26.25mL含0.9%氯化钠的水溶液中,将原花青素溶液加入薄膜中,轻摇,将脂膜洗脱并旋转水合1h,得到原花青素脂质体混悬液;
4、再将混悬液置于冰水中探头超声20min即得,超声3s,间歇3s,超声功率30W;于冰箱4℃避光保存;
5、同法制备原花青素溶液和不含Span20的普通脂质体;
6、所得的原花青素柔性纳米脂质包封率为67.2%,粒径为238.4nm原花青素普通脂质体包封率为60.2%,粒径为218.6nm。
实施例3:
1、分别称取300mg大豆卵磷脂、37.5mg胆固醇和37.5mg Tween80,加入15mL无水乙醇氯仿混合液(1:2);
2、振荡充分混合后,置于旋转蒸发器上,40—50℃恒温水浴中,减压蒸发除去有机溶剂使类脂溶液形成一层均匀薄膜;
3、称取18.75mg原花青素并溶解于18.75mL含0.9%氯化钠的水溶液中,将原花青素溶液加入薄膜中,轻摇,将脂膜洗脱并旋转水合1h,得到原花青素脂质体混悬液;
4、再将混悬液置于冰水中探头超声5min即得,超声7s,间歇7s,超声功率70W;于冰箱4℃避光保存;
5、同法制备原花青素溶液和不含Tween80的普通脂质体;
6、所得的原花青素柔性纳米脂质体包封率为82.1%,粒径为146.3nm;原花青素普通脂质体包封率为63.6%,粒径为277.4nm。;
实施例4:
1、分别称取300mg大豆卵磷脂、37.5mg胆固醇和37.5mg去氧胆酸钠,加入15mL无水乙醇氯仿混合液(1:2);
2、振荡充分混合后,置于旋转蒸发器上,40—50℃恒温水浴中,减压蒸发除去有机溶剂使类脂溶液形成一层均匀薄膜;
3、称取37.5mg原花青素并溶解于37.5mL含0.9%氯化钠的水溶液中,将原花青素溶液加入薄膜中,轻摇,将脂膜洗脱并旋转水合1h,得到原花青素脂质体混悬液;
4、再将混悬液置于冰水中探头超声5min即得,超声3s,间歇3s,超声功率70W;于冰箱4℃避光保存;
5、同法制备原花青素溶液和不含去氧胆酸钠的普通脂质体;
6、所得的原花青素柔性纳米脂质体包封率为70.9%,粒径为170.4nm;原花青素普通脂质体包封率为59.1%,粒径为283.4nm。
实施例5:
1、分别称取300mg大豆卵磷脂、52.5mg胆固醇和52.5mg Tween80,加入15mL无水乙醇氯仿混合液(1:2);
2、振荡充分混合后,置于旋转蒸发器上,40—50℃恒温水浴中,减压蒸发除去有机溶剂使类脂溶液形成一层均匀薄膜;
3、称取26.25mg原花青素并溶解于26.25mL含0.9%氯化钠的水溶液中,将原花青素溶液加入薄膜中,轻摇,将脂膜洗脱并旋转水合1h,得到原花青素脂质体混悬液;
4、再将混悬液置于冰水中探头超声10min即得,超声5s,间歇5s,超声功率50W;于冰箱4℃避光保存;
5、同法制备原花青素溶液和不含Tween80的普通脂质体;
6、所得的原花青素柔性纳米脂质体包封率为80.3%,粒径为140.64nm;原花青素普通脂质体包封率为63.8%,粒径为280.2nm。
实施例6:体外缓释性
分别取5mL实施例5制备的原花青素柔性纳米脂质体混悬液、原花青素普通脂质体和原花青素溶液置于已处理的透析袋(分子截留量8000-14000)中,再将透析袋置于具塞试管中,分别加入50mL PH=7.4的PBS,避光条件下在37℃的水浴中搅拌,在1,2,4,6,8,10,12,24,48h时取1mL接受液并补充相应的新鲜介质。采用下述的HPLC方法检测释放出原花青素,计算累计释药百分率。每个样品平行实验3次。结果见图1。
原花青素的测定
采用中华人民共和国国家标准GB/T 22244-2008测定原花青素的含量。具体方法如下:
标准曲线制备:
称取0.01g纯度≥98%的原花青素标准品(精确至0.0001g),用甲醇(色谱纯)溶解并定容至10mL棕色容量瓶中,此溶液现用现配。
吸取标准溶液0.10、0.25、0.50、1.0、1.5mL置于10mL棕色容量瓶中,加甲醇(分析纯)至刻度,摇匀。
将正丁醇与盐酸按95:5的体积比混合后,取出15mL置于具塞锥瓶中,加入0.5mL硫酸铁铵溶液,再各加入2mL标准溶液,混匀,置沸水浴回流,精确加热4min后,立即置冰水中,经0.45um滤膜过滤,待进高效液相色谱分析。
得到的原花青素粉末含量测定:
称取300mg(精确至0.001g)原花青素粉末于50mL棕色容量瓶中,加入30mL甲醇(分析纯),充分溶解。
将正丁醇与盐酸按95:5的体积比混合后,取出15mL置于具塞锥瓶中,加入0.5mL硫酸铁铵溶液,再加入2mL标准溶液,混匀,置沸水浴回流,精确加热40min后,立即置冰水中,经0.45um滤膜过滤,待进高效液相色谱分析。
液相色谱参考条件:
色谱柱:耐低pH型的ODS C18柱,4.5mm×150mm,5um;柱温:35℃;检测器:紫外检测器;检测波长:525nm;流动相:水:甲醇(色谱纯):异丙醇:甲酸=73:13:6:8;进样量:10uL;流速:1.0mL/min;色谱分析:取标准溶液及试样溶液注入色谱仪中以保留时间定性,以试样峰高或面积与标准比较定量。
结果计算:
试样中原花青素含量计算公式
式中:X-试样中原花青素含量,单位为克每千克或克每升(g/kg或g/L);
X1-从标准曲线上得到的含量,单位为毫克每毫升(mg/mL);
V-试样定容体积,单位为毫升(mL);
f-稀释倍数;
m-试样的质量或体积,单位为克或毫升(g或mL)。
计算结果保留3位有效数字。
从图1可以看出,柔性纳米脂质体和普通脂质体都具有缓释作用,但在24h和48h时,柔性纳米脂质体的释药百分率都明显低于普通脂质体。所以柔性纳米脂质体比普通脂质体具有更好的缓释作用。
实施例7:稳定性
分别将原花青素柔性纳米脂质体、原花青素普通脂质体和原花青素溶液置于4℃、室温(25℃)和室外温度(30℃)的条件下,在第7、15、25、35、45和60天采用上述HPLC方法测定原花青素含量,每个样品平行实验3次。结果见图2。
从结果可以看出柔性纳米脂质体具有较好的稳定性,并且在4℃条件下保存时稳定性最好。
实施例8:体外透皮吸收
取体重合格的健康小鼠,脱颈处死,剪净腹部的毛,然后剥离此处皮肤,剔除皮下脂肪组织,用蒸馏水冲洗干净后即用;将皮肤夹于双室扩散池中间,角质层面向供给池,真皮层面向接收池;供给池分别注入10mL原花青素柔性纳米脂质体、原花青素普通脂质体以及原花青素溶液,接收池中分别加入20mL PBS,在0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、7、8h时取1mL接受液并补充相应的新鲜介质,采用上述HPLC方法测定原花青素含量,计算原花青素的透皮渗透量,每个样品平行实验3次。8小时后,用PBS洗掉皮肤上的原花青素,将皮肤粉碎并用甲醇浸泡使滞留在皮肤中的原花青素浸出,然后4000rpm离心10分钟,采用上述HPLC方法测定上清液中的原花青素含量,计算原花青素在皮肤中的滞留量,每个样品平行实验3次。结果见图3和表1。
表1不同样品在鼠皮中的滞留量(n=3)
样品 | 平均滞留量(ug.cm-2) | SD |
柔性纳米脂质体 | 97.6 | 3.7 |
普通脂质体 | 30.4 | 2.5 |
原花青素溶液 | 15.6 | 2.1 |
从结果可以看出,柔性纳米脂质体较普通脂质体和药物溶液具有明显的皮肤透过性并显著地提高活性药物在皮肤中的滞留量。
Claims (9)
1. 一种利用新型表面活性剂制备的原花青素柔性纳米脂质体,其特征在于:包括原花青素、磷脂、胆固醇、表面活性剂,所述的表面活性剂为Tween80、Span20或去氧胆酸钠。
2.如权利要求1所述的原花青素柔性纳米脂质体,其特征在于:所述的表面活性剂为Tween80。
3.如权利要求1或2所述的原花青素柔性纳米脂质体,其特征在于:磷脂、胆固醇、表面活性剂比例为8:1:1—8:2:2。
4.如权利要求1-3任何一项所述的原花青素柔性纳米脂质体,其特征在于:磷脂、胆固醇、表面活性剂比例为8:1.4:1.4—8:2:2。
5.如权利要求1-4任何一项所述的原花青素柔性纳米脂质体,其特征在于:磷脂、原花青素比例为8:0.5—8:1。
6.如权利要求1-5任何一项所述的原花青素柔性纳米脂质体,其特征在于:磷脂、原花青素比例为8:0.7—8:1。
7.如权利要求1-6任何一项所述的原花青素柔性纳米脂质体,其特征在于:所述磷脂为大豆卵磷脂。
8.如权利要求1所述的利用新型表面活性剂制备的原花青素柔性纳米脂质体的制备方法,其特征在于,按比例称取磷脂、胆固醇和表面活性剂,加入氯仿、甲醇或者无水乙醇氯仿混合液,使磷脂的浓度达到质量体积比为1-2%;振荡充分混合后,置于旋转蒸发器上,40—50℃恒温水浴中,减压蒸发除去有机溶剂使类脂溶液形成一层均匀薄膜;向薄膜中加入一定量含原花青素的0.9%氯化钠水溶液,其中,原花青素浓度为1-2mg/mL,轻摇,将脂膜洗脱并旋转水合1-2h,得到原花青素脂质体混悬液;再将混悬液置于冰水中探头超声一段时间即得,超声5—20min,于冰箱4℃避光保存。
9. 按照权利要求8所述一种利用新型表面活性剂制备原花青素柔性纳米脂质体的方法,其特征在于:超声时间为10—15min。
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