CN104792893B - 复方救必应制剂指纹图谱的构建方法及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种复方救必应制剂指纹图谱的构建方法及检测方法。所述构建方法包括如下步骤：(1)对照品溶液的制备：以甲醇分别制备紫丁香苷对照品溶液和α‑香附酮对照品溶液；(2)以体积分数为50‑70％甲醇回流或超声提取，制备复方救必应制剂供试品溶液；(3)分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪采用特定的色谱条件进行测定，可构建获得的指纹图谱中有19个特征共有峰，可全面表征复方救必应制剂物理化学特征，避免了因测定一、二个化学成分而判定复方救必应制剂整体质量的片面性，且具有操作简便、结果稳定、精密度高、重现性好等优点。

Description

复方救必应制剂指纹图谱的构建方法及检测方法

技术领域

本发明涉及中药制剂的质量控制领域，特别是涉及复方救必应制剂指纹图谱的构建方法及检测方法。

背景技术

复方救必应制剂由中药材救必应、东风桔、香附为原料，经水提取后，按常规的制药工艺制成，具有清热解毒、利湿止痛的功能，用于腹泻、止痛等。复方救必应制剂在中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂第十册收载有复方救必应胶囊，是深受欢迎的中药制剂。

国家标准对复方救必应胶囊的质量控制主要采用薄层色谱法，分别以救必应对照药材、东风桔对照药材和香附对照药材进行鉴别，以判断成品中是否有救必应、东风桔、香附；现有技术还公开了采用高效液相色谱法测定复方救必应胶囊中紫丁香苷的含量的方法，以表征复方救必应制剂的质量。

以上针对投料药材进行鉴别或针对个别成分含量测定的方法，难以全面表征复方救必应制剂的物理化学特征，因此，对复方救必应制剂的质量控制方法有待进一步完善。

发明内容

基于此，有必要提供一种复方救必应制剂指纹图谱的构建方法及检测方法。

一种复方救必应制剂指纹图谱的构建方法，包括如下步骤：

(1)对照品溶液的制备：

分别精密称取紫丁香苷对照品和α-香附酮对照品，加甲醇稀释，得紫丁香苷对照品溶液和α-香附酮对照品溶液；

(2)供试品溶液的制备：

精密称取复方救必应制剂，加入体积百分含量为50-70％的甲醇，回流提取或超声提取30-45分钟，过滤，即得供试品溶液；

(3)分别精密吸取紫丁香苷对照品溶液、α-香附酮对照品溶液和供试品溶液，注入高效液相色谱仪进行测定，得到由19个共有特征峰构成的复方救必应制剂指纹图谱。

本发明经发明人大量的实验和研究，得到上述复方救必应制剂指纹图谱的构建方法：该方法以紫丁香苷、α-香附酮为参照指标，配合适当的供试品提取方法和高效液相色谱仪的色谱条件，得出可全面表征复方救必应制剂物理化学特征的指纹图谱，该指纹图谱中有19个特征共有峰，注重各个构成特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，既避免了因测定一、二个化学成分而判定制剂整体质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性，能有效地表征复方救必应制剂的质量，有利于全面监控产品质量，及鉴别产品的真伪。

在其中一个实施例中，步骤(3)中，高效液相色谱仪的条件如下：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；柱温：25-30℃；检测波长为200-400nm；流速：0.8-1.2mL·min^-1；流动相：甲醇为流动相A，0.5％冰乙酸水溶液为流动相B，采用梯度洗脱方式。

在其中一个实施例中，所述梯度洗脱方式为：0-60min，流动相A的体积百分数由10％变化至95％。

在其中一个实施例中，所述柱温为25℃，检测波长为254nm，流速为1.0mL·min^-1。

在其中一个实施例中，步骤(2)中，所述体积百分含量为50-70％的甲醇的用量为每克复方救必应制剂精密加入19-21毫升。

本发明还提供一种复方救必应制剂指纹图谱的检测方法，包括如下步骤：

(1)对照品溶液的制备：

分别精密称取紫丁香苷对照品和α-香附酮对照品，加甲醇稀释，得紫丁香苷对照品溶液和α-香附酮对照品溶液；

(2)供试品溶液的制备：

精密称取复方救必应制剂，加入体积百分含量为50-70％的甲醇，回流提取或超声提取30-45分钟，过滤，即得供试品溶液；

(3)分别精密吸取紫丁香苷对照品溶液、α-香附酮对照品溶液和供试品溶液，注入高效液相色谱仪进行测定。

经由上述复方救必应制剂指纹图谱的检测方法对待测复方救必应制剂样品进行检测，可获得样品具有代表性的指纹图谱，通过与前述构建方法获得的具有19个特征共有峰的指纹图谱进行对照分析，能有效地判断复方救必应制剂的质量，有利于全面监控产品质量，及鉴别产品的真，同时避免了因测定一、二个化学成分而判定制剂整体质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性。

在其中一个实施例中，步骤(3)中，高效液相色谱仪的条件如下：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；柱温：25-30℃；检测波长为200-400nm；流速：0.8-1.2mL·min^-1；流动相：甲醇为流动相A，0.5％冰乙酸水溶液为流动相B，采用梯度洗脱方式。

在其中一个实施例中，所述梯度洗脱方式为：0-60min，流动相A的体积百分数由10％变化至95％。

在其中一个实施例中，所述柱温为25℃，检测波长为254nm，流速为1.0mL·min^-1。

在其中一个实施例中，所述体积百分含量为50-70％的甲醇的用量为每克复方救必应制剂精密加入19-21毫升。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明经发明人大量的实验和研究，以紫丁香苷、α-香附酮为参照指标，得出可全面表征复方救必应制剂物理化学特征的指纹图谱的构建方法，同时确定了制备供试品溶液和对照品溶液，及高效液相色谱仪的色谱条件的最优参数；该方法具有操作简便、结果稳定、精密度高、重现性好等优点。

(2)采用本发明的构建方法所获得的指纹图谱中有19个特征共有峰，其能有效地表征复方救必应制剂的质量，有利于全面监控产品质量，及鉴别产品的真伪；指纹图谱注重各个构成特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，既避免了因测定一、二个化学成分而判定复方救必应制剂整体质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性。

(3)本发明所述复方救必应制剂指纹图谱的检测方法，能更完整有效地判断复方救必应制剂的质量，有利于全面监控产品质量，及鉴别产品的真伪。

附图说明

图1为主要色谱峰选择HPLC图；

图2为不同流动相条件下HPLC图；

图3为流动相不同起始梯度条件下HPLC图；

图4为不同柱温条件下HPLC图；

图5为不同流速条件下HPLC图；

图6为四种提取溶剂考察HPLC图；

图7为三种提取体积考察HPLC图；

图8为不同提取方法考察HPLC图；

图9为三种提取时间考察HPLC图；

图10为四个检测波长条件下HPLC图；

图11为四种色谱柱考察HPLC图；

图12为复方救必应胶囊、紫丁香苷对照品和α-香附酮对照品的HPLC图；

图13为紫丁香苷对照品的HPLC图；

图14为α-香附酮对照品的HPLC图；

图15为复方救必应胶囊样品1-14的指纹图谱；

图16为复方救必应胶囊样品1-14生成的对照指纹图谱；

图17为救必应药材与复方救必应胶囊叠加图；

图18为香附药材与复方救必应胶囊叠加图；

图19为东风桔药材与复方救必应胶囊叠加图；

图20为待测样品的指纹图谱。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的复方救必应制剂指纹图谱的构建方法及检测方法作进一步详细的说明。

实施例1

本实施例为复方救必应制剂指纹图谱的构建方法。

一、仪器和材料

1、仪器

KQ-100B型超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)；T-214型电子分析天平(Denver公司)；Waters2695-2996高效液相色谱系统，Empower工作站，含四元梯度泵、自动进样器(Waters公司)。

2、试剂

冰乙酸(色谱纯，天津市化学试剂研究所)；甲醇(色谱纯，TEDIA公司)；水为超纯水。

对照品为紫丁香苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号111574-200603)和α-香附酮对照品(供鉴别用，中国药品生物制品检定所，批号110748200507)。

3、材料

3.1复方救必应胶囊(广州白云山星群(药业)股份有限公司提供，共14批，批号分别为GG40008、GG40009、GG40010、HG40001、HG40002、HG40003、IG40002、IG40003、IG40004、IG40015、IG40016、IG40017、LG40001、LG40002)；

3.2救必应药材(广州白云山星群(药业)股份有限公司提供，共12批，批号分别为XG1404-01，XG1307-01、XG1105-01、XG1110-02、20110401、20111201、2014-0501、2014-0502、2014-0503、2014-0504、福建、广西)；东风桔药材(广州白云山星群(药业)股份有限公司提供，共8批，批号为XG1404-01、XG1307-01、XG1104-01、XG1111-02、20110501、20111201、海南、湛江)；香附药材(广州白云山星群(药业)股份有限公司提供，共8批，批号为XG1405-01、XG1307-01、XG1104-01、XG1111-02、20110501、20111201、广西、广东)。

二、方法学考察

1、溶剂峰的考察

取复方救必应胶囊(LG40002)2粒，除去胶囊壳，将内容物混匀，称取约0.5g，置具塞锥形瓶中，精密加入体积分数70％甲醇10ml，密塞，称定重量，超声处理(功率160W，频率59kHz)45分钟，放冷，加体积分数70％甲醇补重，摇匀，过滤，取续滤液分析，以甲醇(A)-0.5％冰乙酸水(B)为流动相系统梯度洗脱(0-60min，10％A→95％A)，HPLC分析复方救必应胶囊样品和70％甲醇溶剂空白，得图1。

由图1可知，通过比较70％甲醇空白和复方救必应胶囊，可以发现，前5min的峰未能分开，峰形不好，不选作共有峰；紫外吸收较明显峰a、b、c、d、e、f、g、h选为主要考察的色谱峰；溶剂对主要的色谱峰无太大影响。

2、流动相组成的选择

取约0.5g复方救必应胶囊样品1份，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，加入甲醇10ml，密塞，称定重量，超声处理(功率160W，频率59kHz)30分钟，放冷，加甲醇补重，摇匀，过滤，取续滤液HPLC分析，流动相组成及梯度见表1，得图2。

表1四种流动相组成信息

由图2可知，流动相为甲醇-0.5％冰乙酸水时，图谱峰形相对较好，大多数峰分离良好，峰基线也比较平稳，主要色谱峰保留时间也较为合适，故流动相组成选择甲醇-0.5％冰乙酸水。

3、流动相起始梯度的选择(表2)

表2三种起始梯度信息

由图3可知，流动相甲醇-0.5％冰乙酸水的起始梯度为10:90时，图中主要峰的保留时间较为适宜，且基线较为平稳，故选择起始梯度10％甲醇:90％酸水(含0.5％冰乙酸)。

4、柱温的确定

取约0.5g复方救必应胶囊样品1份，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，加入甲醇10ml，密塞，称定重量，超声处理(功率160W，频率59kHz)30分钟，放冷，加甲醇补重，摇匀，过滤，取续滤液分析，柱温分别为25℃，28℃，30℃，其他条件相同，见图4。由图4可知，随着柱温的升高，前15min的峰形变差，综合考虑特征峰的保留时间和对色谱柱的保护，选择柱温为25℃。

5、流速的确定

取约0.5g复方救必应胶囊样品1份，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，加入甲醇10ml，密塞，称定重量，超声处理(功率160W，频率59kHz)30分钟，放冷，加甲醇补重，摇匀，过滤，取续滤液分析，流速分别为0.8、1.0、1.2ml·min^-1，其他条件相同，见图5。

由图5可知，流速为1.0ml/min时，图中主要峰的保留时间较为适宜且基线平稳，故选择流速为1.0ml/min。

6、提取溶剂比较

取约0.5g复方救必应胶囊样品4份，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，分别加入甲醇、50％甲醇、70％乙醇、和95％乙醇10ml(均为体积分数)，称定重量，密塞超声30min(功率160W，频率59kHz)，放冷后，分别用甲醇、50％甲醇、70％甲醇、和95％乙醇补重，摇匀，滤过，取续滤液分析。主要色谱峰峰面积见表3，结果见图6。

表3四种提取溶剂主要色谱峰峰面积

峰号	保留时间	甲醇	50％甲醇	70％甲醇	95％乙醇
						a	6.778	151694	1627104	1603375	60663
b	8.008	19715	518822	481948	_
						c	8.980	74210	731210	755505	52467
d	10.103	35303	557830	497615	_
						e	14.153	2753382	13305120	13713516	13696998
f	17.546	29360	442334	434046	15761
						g	51.323	877618	739641	795522	807676
h	54.962	465600	368892	432343	435648

结合图6和表3可知，提取溶剂为95％乙醇时，所得图谱中的特征峰均不完整；提取溶剂分别为70％甲醇、50％甲醇和甲醇时，所得图谱中的特征峰均完整，70％甲醇和50％甲醇的提取效果明显比甲醇的效果要好，但基线不如甲醇平稳。50％甲醇和70％甲醇提取的主要色谱峰峰面积相当，70％甲醇的8个主要色谱峰的峰面积略大于50％甲醇，故选择70％甲醇为提取溶剂。

7、提取体积的比较

取约0.5g复方救必应胶囊样品3份，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，分别加入体积分数70％甲醇10ml、20ml、30ml，称定重量，密塞超声30min(功率160W，频率59kHz)，放冷后，体积分数70％甲醇补重，摇匀，滤过，取续滤液分析。结果见图7，主要色谱峰峰面积见表4。

表4三种提取体积主要色谱峰峰面积

峰号	保留时间	10ml	20ml	30ml
					a	6.574	1744213	799710	432470
b	7.884	626438	222647	74892
					c	8.834	825402	353780	201169
d	9.964	612630	199042	117622

e	14.004	13737312	6736018	4505537
					f	17.214	604096	190334	123708
g	51.140	760096	339038	222521
					h	54.756	407995	175179	109153

结合图7和表4可知，提取溶剂为10ml时，提取色谱峰的面积最大，提取效果最好，选择提取体积10ml较为合适。

8、提取方法的比较

取0.5g复方救必应胶囊样品1份，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，加入体积分数70％甲醇10ml，称定重量，分别密塞超声30min(功率160W，频率59kHz)和90℃水浴回流30min，放冷后，体积分数70％甲醇补重，摇匀，滤过，取续滤液分析。结果见图8，主要色谱峰峰面积见表5。

表5不同提取方法主要色谱峰峰面积

从表5和图8中可知，超声提取与回流提取相当，但考虑到提取的方便，选择提取方式为超声提取。

9、超声提取时间的比较

取0.5g复方救必应胶囊样品1份，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，加入体积分数70％甲醇10ml，称定重量，分别密塞超声(功率160W，频率59kHz)15min，30min和45min，放冷后，体积分数70％甲醇补重，摇匀，滤过，取续滤液分析。结果见图9，主要色谱峰峰面积见表6。

表6三种提取时间主要色谱峰峰面积

峰号	保留时间	15min	30min	45min
					a	6.498	1147633	1264042	1277187
b	7.830	416604	449392	504683
					c	8.810	718789	778470	777132
d	9.906	437701	461535	497965
					e	13.973	13500140	13772880	13857648
f	17.191	326155	348608	427592
					g	51.186	759111	798531	767501
h	54.810	414785	416627	423008

结合图9和表6可知，三种超声时间分别所得图谱中的8个主要色谱峰的峰面积相当，其中超声时间为15min的图谱中8个主要色谱峰的峰面积均较其他两种超声时间的小，45min的图谱中主要色谱峰的峰面积比30min的峰面积略大，选择超声时间45min较为合适。

10、检测波长的考察

比较254、280、300和320nm四个波长下的特征峰。结果见图10，在254nm波长下出峰较多且特征峰明显，故选择254nm作为最佳吸收波长。

11、色谱柱的考察

取约0.5g复方救必应胶囊样品1份，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，加入体积分数70％甲醇10ml，称定重量，密塞超声45min(功率160W，频率59kHz)，放冷后，体积分数70％甲醇补重，摇匀，滤过，取续滤液，分别采用不同的色谱柱(见表7)进样分析，结果见图11。

表7色谱柱信息

由图11可知，四种色谱柱分析所得图谱的特征峰峰形都较好，均可用于复方救必应胶囊的HPLC分析。

三、复方救必应胶囊指纹图谱的构建

经方法学考察后，优选为采用如下条件进行复方救必应胶囊指纹图谱的构建：

1、色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18(250mm×4.6mm，5μm)，以甲醇(A)-0.5％冰乙酸水溶液(B)为流动相系统梯度洗脱(0-60min，10％A→95％A)，流速为1.0mL·min^-1，检测波长254nm，检测器：紫外检测；柱温25℃，进样量10μL。

2、对照品溶液的制备

精密称取紫丁香苷对照品约12mg，加甲醇适量，配制成每1ml含1.22mg的溶液，即得紫丁香苷对照品溶液；

用微量进样器吸取α-香附酮对照品200ul，加甲醇适量，配制每1ml含10μl的溶液，即得α-香附酮对照品溶液。

3、供试品溶液的制备

3.1取复方救必应胶囊2粒，除去胶囊壳，将内容物混匀，精密称取0.5g，置具塞锥形瓶中，精密加入体积分数70％甲醇10ml，密塞，称定重量，超声处理(功率160W，频率59kHz)45分钟，放冷，体积分数加70％甲醇补重，摇匀，滤过(针式过滤器0.22μm)，取续滤液，即得供试品溶液。

3.2取药材粉末(过60目筛)约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积分数70％甲醇10ml，密塞，称重，超声处理(功率160W，频率59kHz)45分钟，放冷，再称定重量，用体积分数70％甲醇补足减失的重量，摇匀，0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

4、结果

4.1、图谱

复方救必应胶囊、紫丁香苷对照品和α-香附酮对照品的HPLC图如图12-14所示。

4.2所有样品

样品选用同一公司生产的不同批号的复方救必应胶囊，共14批，见表8。

表8样品信息

4.3复方救必应胶囊图谱

使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2.0版)，导入样品后，参照图谱为S1，对照指纹图谱生成方法采用平均数法，时间窗宽度分别设在0.1-0.5之间，相似度结果稳定，所以选择时间窗宽度为0.1，自动匹配生成对照指纹谱图(R)，14个样品整体指纹谱图输出见图15。使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2.0版，导入对照指纹图谱，输出图像，得到图16。

比较各批色谱图，均有稳定的19个峰，且分离度良好。因此确定此19个峰为共有峰。

4.4色谱图信息

样品按照相同方法处理，均有19个共有峰，且各共有峰的保留时间RSD％均小于0.46％(表9-11)。

表9

峰号	保留时间	S1	S2	S3	S4	S5	S6
								1	6.926	1769.825	1709.332	1793.338	1322.411	1479.036	1234.964
2	7.967	173.584	168.167	206.572	260.386	325.467	247.001
								3	8.395	255.493	250.352	282.064	318.477	407.797	313.595
4	9.256	813.547	776.962	877.229	698.83	837.171	659.309
								5	10.527	161.173	157.954	211.125	304.489	470.767	331.251
6	14.58	1372.079	1312.625	2922.123	5628.096	5456.004	4726.202
								7	16.758	258.383	247.293	310.017	324.51	640.916	427.778
8	18.149	342.41	328.435	397.333	578.686	1031.199	714.103
								9	26.344	160.904	150.455	115.78	174.19	451.593	280.205
10	27.141	185.666	187.503	120.229	136.959	612.544	434.408
								11	28.335	234.426	216.782	130.959	284.134	1221.858	627.915
12	30.796	377.034	371.138	247.339	203.818	769.253	330.549
								13	32.095	308.491	303.468	278.647	481.253	982.694	417.482
14	33.308	279.022	266.242	291.274	397.285	614.508	273.189
								15	34.622	282.922	277.638	308.629	222.355	358.243	188.28
16	43.577	113.172	107.458	159.389	189.425	175.966	156.881
								17	51.572	181.096	157.412	225.389	161.309	116.148	91.167
18	53.986	127.573	124.301	128.077	104.187	95.441	95.776
								19	55.229	599.303	564.337	833.358	352.719	365.457	409.695

表10

峰号	保留时间	S7	S8	S9	S10	S11	S12
								1	6.926	1625.285	1493.86	1531.667	1523.368	1553.183	745.199
2	7.967	179.039	173.956	211.702	203.493	216.5	205.286

3	8.395	438.642	405.962	429.096	435.716	460.886	250.92
								4	9.256	688.175	643.762	1082.504	1047.595	1056.237	536.304
5	10.527	443.752	424.413	381.876	372.671	389.699	305.989
								6	14.58	13764.67	12878.44	5724.323	5701.738	5869.831	8339.353
7	16.758	309.887	382.092	286.192	302.498	359.509	304.011
								8	18.149	477.428	453.91	520.263	525.921	559.928	434.487
9	26.344	270.52	312.79	228.01	223.394	207.045	236.846
								10	27.141	117.008	160.468	157.043	152.349	165.765	203.578
11	28.335	154.231	228.389	146.336	140.206	160.14	392.254
								12	30.796	140.301	164.066	179.478	193.606	231.72	532.507
13	32.095	128.736	71.636	138.517	124.067	124.589	447.088
								14	33.308	165.238	120.743	172.195	163.169	170.411	523.107
15	34.622	217.348	204.177	103.346	100.634	112.567	131.831
								16	43.577	179.142	165.931	166.593	159.073	162.512	170.564
17	51.572	844.601	716.712	553.44	589.361	563.08	179.814
								18	53.986	150.931	129.912	211.83	205.303	213.766	77.797
19	55.229	551.109	385.855	459.288	397.939	268.842	886.329

表11

4.514批复方救必应胶囊样品相似度考察

14批复方救必应胶囊样品与对照指纹图谱比较相似度(表12-13)：

表12

表13

1-14号样品为同一生产企业不同批号的复方救必应胶囊，由以上数据可知，14批复方救必应胶囊样品均能检测出19个共有峰，指纹图谱中共有峰峰面积的差别在一定程度上反映了批间产品质量情况。所有样品中除样品1(S1)和样品2(S2)与对照指纹图谱的相似度为0.747和0.745之外，其他样品具有良好的相似性，相似度均在0.9以上，说明19个共有峰的相似程度较高，可以作为复方救必应制剂的质量控制和评价指标。

4.6复方救必应胶囊共有峰的归属

4.6.1所有药材信息

救必应药材共计14批，香附和东风桔药材各8批，见表14。

表14药材信息

样品号	药材名称	公司名称	批号或产地
				1	救必应	广州白云山星群(药业)股份有限公司	20111201
2	救必应	广州白云山星群(药业)股份有限公司	20140501
				3	救必应	广州白云山星群(药业)股份有限公司	20140502
4	救必应	广州白云山星群(药业)股份有限公司	20140503
				5	救必应	广州白云山星群(药业)股份有限公司	20110401
6	救必应	广州白云山星群(药业)股份有限公司	20140504
				7	救必应	广州白云山星群(药业)股份有限公司	XG110501
8	救必应	广州白云山星群(药业)股份有限公司	XG111002
				9	救必应	广州白云山星群(药业)股份有限公司	XG130702
10	救必应	广州白云山星群(药业)股份有限公司	XG140401
				11	救必应	广州白云山星群(药业)股份有限公司	福建
12	救必应	广州白云山星群(药业)股份有限公司	广西
				13	香附	广州白云山星群(药业)股份有限公司	20110501
14	香附	广州白云山星群(药业)股份有限公司	XG111102
				15	香附	广州白云山星群(药业)股份有限公司	XG140501
16	香附	广州白云山星群(药业)股份有限公司	20111201
				17	香附	广州白云山星群(药业)股份有限公司	XG130701
18	香附	广州白云山星群(药业)股份有限公司	XG110401
				19	香附	广州白云山星群(药业)股份有限公司	海南
20	香附	广州白云山星群(药业)股份有限公司	湛江
				21	东风桔	广州白云山星群(药业)股份有限公司	20111201
22	东风桔	广州白云山星群(药业)股份有限公司	20110501
				23	东风桔	广州白云山星群(药业)股份有限公司	XG140401
24	东风桔	广州白云山星群(药业)股份有限公司	XG110401

25	东风桔	广州白云山星群(药业)股份有限公司	XG130701
				26	东风桔	广州白云山星群(药业)股份有限公司	XG111101
27	东风桔	广州白云山星群(药业)股份有限公司	广东
				28	东风桔	广州白云山星群(药业)股份有限公司	广西

4.6.2确定复方救必应胶囊共有峰的归属

(1)救必应药材图谱与胶囊图谱叠加比较

使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2.0版)，导入复方救必应胶囊样品1图谱及12批救必应药材图谱后，参照图谱设为复方救必应胶囊样品1图谱即S1，对照指纹图谱生成方法采用平均数法，选择时间窗宽度为0.1，自动匹配，得到匹配的8个峰，整体输出见图17。

由图17可知，就必应药材与复方救必应胶囊共有的峰为峰1、峰3、峰4、峰5、峰6、峰8、峰10、峰11。

(2)香附药材图谱与胶囊图谱叠加比较

使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2.0版)，导入复方救必应胶囊样品1图谱及8批香附药材图谱后，参照图谱设为复方救必应胶囊样品1图谱即S1，对照指纹图谱生成方法采用平均数法，选择时间窗宽度为0.1，自动匹配，得到匹配的9个峰，整体输出见图18。

由图可知，香附药材与复方救必应胶囊共有的峰为峰6、峰12、峰13、峰14、峰15、峰16、峰17、峰18、峰19。

(3)东风桔药材图谱与胶囊图谱叠加比较

使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2.0版)，导入复方救必应胶囊样品1图谱及8批东风桔药材图谱后，参照图谱设为复方救必应胶囊样品1图谱即S1，对照指纹图谱生成方法采用平均数法，选择时间窗宽度为0.1，自动匹配，得到匹配的7个峰，整体输出见图19。

由图可知，东风桔药材与复方救必应胶囊共有的峰为峰4、峰6、峰8、峰12、峰13、峰16、峰19。

综上所述，复方救必应胶囊19个共有峰的归属为：

(1)能确定来源于救必应药材的共有峰：峰1、峰3、峰5、峰10、峰11

(2)能确定来源于香附药材的共有峰：峰14、峰15、峰17、峰18

(3)救必应药材和东风桔药材中均存在的共有峰：峰4、峰8

(4)香附药材和东风桔药材中均存在的共有峰：峰12、峰13、峰16、峰19

(5)救必应、香附和东风桔三味药材中均存在的共有峰：峰6

(6)三味药材中均没有的共有峰：峰2，峰7，峰9。

注：19个共有峰中确定的已知成分为两个标准品峰，即峰6为紫丁香苷(救必应药材中的成分)；峰19为α-香附酮(香附药材中的成分)。

5、方法学

5.1精密度考察

取批号为LG40002的复方救必应胶囊供试品溶液，在上述色谱条件下，连续进样5次，记录色谱指纹图谱，结果表明，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于5％，符合要求。具体数据见表15、表16。

表15相对保留时间精密度

峰号	第1次	第2次	第3次	第4次	第5次	RSD％
							1	0.2634	0.2637	0.2634	0.2636	0.2641	0.10
2	0.3089	0.3043	0.3040	0.3041	0.3047	0.11
							3	0.3193	0.3197	0.3195	0.3196	0.3201	0.10
4	0.3522	0.3523	0.3495	0.3521	0.3526	0.36
							5	0.4003	0.4007	0.4007	0.4007	0.4014	0.11
6	0.5532	0.5535	0.5534	0.5534	0.5539	0.04
							7	0.6363	0.6368	0.6367	0.6367	0.6372	0.05
8	0.6900	0.6905	0.6905	0.6904	0.6908	0.05
							9	1.0000	1.0000	1.0000	1.0000	1.0000	0.00
10	1.0299	1.0299	1.0298	1.0295	1.0296	0.02
							11	1.0728	1.0729	1.0729	1.0729	1.0728	0.02
12	1.1685	1.1683	1.1685	1.1683	1.1687	0.01
							13	1.2168	1.2167	1.2169	1.2163	1.2167	0.02
14	1.2632	1.2629	1.2634	1.2628	1.2630	0.02
							15	1.3124	1.3131	1.3133	1.3129	1.3131	0.03
16	1.6527	1.6522	1.6529	1.6523	1.6519	0.02
							17	1.9541	1.9533	1.9543	1.9530	1.9522	0.04
18	2.0453	2.0445	2.0457	2.0442	2.0433	0.05
							19	2.0922	2.0913	2.0924	2.0910	2.0900	0.05

表16相对峰面积精密度

峰号	第1次	第2次	第3次	第4次	第5次	RSD％
							1	4.3473	4.3189	4.7046	4.4935	4.4390	3.44
2	0.5481	0.5525	0.6000	0.5730	0.5536	3.81
							3	1.4831	1.4324	1.5476	1.4963	1.4783	2.78
4	1.9172	1.9068	2.0520	1.9717	1.9473	2.96
							5	1.5974	1.5585	1.7068	1.6455	1.6200	2.91
6	43.799	43.305	43.143	45.154	44.052	3.42
							7	1.8039	1.7845	1.9127	1.8495	1.7910	2.93
8	1.6084	1.5801	1.7090	1.6356	1.6237	2.95
							9	1.0000	1.0000	1.0000	1.0000	1.0000	0.00
10	0.4088	0.4113	0.4402	0.4226	0.4229	2.95
							11	0.6266	0.5868	0.6521	0.6536	0.6188	4.38
12	0.2278	0.2246	0.2469	0.2444	0.2371	4.17
							13	0.2791	0.2707	0.2897	0.2816	0.2830	2.45
14	0.1981	0.1990	0.2095	0.2068	0.2038	2.40
							15	0.6224	0.6083	0.6606	0.6327	0.6177	3.19
16	0.2463	0.2438	0.2672	0.2534	0.2539	3.60
							17	2.4830	2.4541	2.6625	2.5517	2.5011	3.24
18	0.4385	0.4327	0.4740	0.4525	0.4438	3.59
							19	1.3054	1.2931	1.4022	1.3440	1.3182	3.25

5.2重复性考察

取批号为LG40002的复方救必应胶囊供试品6份，精密称定，按“供试品溶液的制备”项下制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样分析，以相对保留时间和相对峰面积的值为指标，计算其RSD，其RSD均小于5.0％，符合要求。具体数据见表17、表18。

表17相对保留时间重复性

峰号	第1份	第2份	第3份	第4份	第5份	第6份	RSD％
								1	0.2637	0.2644	0.2632	0.2636	0.2646	0.2637	0.20
2	0.3043	0.3052	0.3036	0.3041	0.3053	0.3043	0.21
								3	0.3197	0.3206	0.3191	0.3195	0.3208	0.3197	0.21
4	0.3524	0.3536	0.3521	0.3523	0.3537	0.3525	0.20
								5	0.4010	0.4023	0.4004	0.4009	0.4026	0.4012	0.22
6	0.5535	0.5556	0.5532	0.5534	0.5557	0.5538	0.21
								7	0.6365	0.6391	0.6365	0.6368	0.6395	0.6371	0.21
8	0.6901	0.6929	0.6900	0.6920	0.6932	0.6905	0.21
								9	1.0000	1.0000	1.0000	1.0000	1.0000	1.0000	0.00
10	1.0293	1.0331	1.0291	1.0293	1.0331	1.0291	0.20

11	1.0726	1.0764	1.0724	1.0723	1.0764	1.0721	0.19
								12	1.1687	1.1730	1.1684	1.1685	1.1728	1.1684	0.19
13	1.2168	1.2213	1.2165	1.2163	1.2209	1.2164	0.20
								14	1.2631	1.2678	1.2628	1.2626	1.2675	1.2626	0.20
15	1.3129	1.3178	1.3128	1.3126	1.3176	1.3148	0.18
								16	1.6529	1.6589	1.6523	1.6524	1.6584	1.6513	0.20
17	1.9536	1.9608	1.9533	1.9531	1.9602	1.9524	0.20
								18	2.0450	2.0525	2.0446	2.0444	2.0519	2.0438	0.20
19	2.0918	2.0994	2.0914	2.0911	2.0989	2.0905	0.20

表18相对峰面积重复性

峰号	第1份	第2份	第3份	第4份	第5份	第6份	RSD％
								1	4.8599	4.9512	4.8988	4.7908	5.0855	5.0133	2.16
2	0.6100	0.6039	0.6123	0.5913	0.6300	0.5997	2.17
								3	1.5608	1.5812	1.5784	1.5525	1.6695	1.6396	2.93
4	2.0925	2.1756	2.1660	2.0946	2.1977	2.1698	2.08
								5	1.6951	1.7071	1.7124	1.6800	1.7190	1.7120	0.84
6	47.768	48.623	48.885	47.663	49.713	48.896	1.59
								7	1.5739	1.7379	1.7405	1.7103	1.7464	1.7545	1.03
8	1.5254	1.5494	1.5470	1.5354	1.5615	1.5681	1.02
								9	1.0000	1.0000	1.0000	1.0000	1.0000	1.0000	0
10	0.4640	0.4689	0.4590	0.4588	0.4766	0.4738	1.61
								11	0.5164	0.5274	0.5242	0.5233	0.5459	0.5324	1.92
12	0.3728	0.3509	0.3582	0.3748	0.3943	0.3743	4.08
								13	0.3060	0.3181	0.3157	0.3001	0.3273	0.3183	2.71
14	0.2427	0.2460	0.2369	0.2461	0.2457	0.2474	1.58
								15	0.6852	0.7099	0.7073	0.6816	0.7128	0.7207	2.25
16	0.3112	0.3150	0.3259	0.3164	0.3458	0.3399	4.38
								17	2.7480	2.7652	2.8785	2.7392	2.8587	2.8517	2.23
18	0.3614	0.3846	0.3738	0.3632	0.3761	0.3667	2.38
								19	1.4086	1.3950	1.4134	1.4325	1.3992	1.4180	0.96

5.3稳定性考察

取同一份供试品溶液，于室温下放置，分别在0、4、8、12、15、24h进样分析，计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，其RSD均小于5.0％，实验结果表明，供试品溶液在24h内稳定性良好。具体数据见表19、表20。

表19相对保留时间稳定性

峰号	0h	4h	8h	12h	15h	24h	RSD％
								1	0.2636	0.2648	0.2651	0.2651	0.2654	0.2656	0.27
2	0.3038	0.3054	0.3055	0.3058	0.3063	0.3065	0.32

3	0.3194	0.3209	0.3210	0.3212	0.3217	0.3220	0.28
								4	0.3523	0.3531	0.3532	0.3533	0.3535	0.3536	0.13
5	0.4007	0.4022	0.4024	0.4025	0.4033	0.4034	0.24
								6	0.5534	0.5544	0.5546	0.5547	0.5551	0.5551	0.12
7	0.6369	0.6379	0.6378	0.6380	0.6384	0.6386	0.10
								8	0.6904	0.6915	0.6913	0.6914	0.6918	0.6921	0.08
9	1.0000	1.0000	1.0000	1.0000	1.0000	1.0000	0.00
								10	1.0291	1.0292	1.0291	1.0290	1.0290	1.0288	0.01
11	1.0726	1.0720	1.0724	1.0723	1.0725	1.0685	0.15
								12	1.1687	1.1683	1.1683	1.1685	1.1684	1.1685	0.01
13	1.2164	1.2161	1.2161	1.2161	1.2157	1.2156	0.02
								14	1.2721	1.2719	1.2716	1.2718	1.2714	1.2716	0.02
15	1.3126	1.3123	1.3119	1.3119	1.31118	1.3118	0.02
								16	1.6521	1.6514	1.6514	1.6513	1.6507	1.6504	0.04
17	1.9517	1.9504	1.9505	1.9502	1.9487	1.9482	0.07
								18	2.0428	2.0414	2.0416	2.0412	2.0396	2.0392	0.06
19	2.0893	2.0879	2.0881	2.0878	2.0860	2.0856	0.07

表20相对峰面积稳定性

峰号	0h	4h	8h	12h	15h	24h	RSD％
								1	4.8540	4.6063	4.7135	4.7869	4.7490	4.7015	1.77
2	0.6154	0.5340	0.5652	0.5575	0.5691	0.5573	4.75
								3	1.6133	1.5317	1.5636	1.5470	1.5562	1.5301	1.96
4	2.1366	2.0148	2.0736	2.1010	2.0746	2.0354	2.12
								5	1.7581	1.6682	1.6868	1.6978	1.7100	1.6772	1.89
6	48.649	46.001	46.924	47.549	47.250	46.393	1.98
								7	1.6897	1.5613	1.5775	1.6109	1.6060	1.6062	2.75
8	1.5474	1.4855	1.4732	1.5055	1.4948	1.4537	2.14
								9	1.0000	1.0000	1.0000	1.0000	1.0000	1.0000	0
10	0.4576	0.4277	0.4583	0.4259	0.4364	0.4056	4.66
								11	0.6148	0.5900	0.5979	0.5990	0.5887	0.5902	1.65
12	0.3236	0.3024	0.3215	0.3275	0.3251	0.3318	3.18
								13	0.2587	0.2412	0.2523	0.2671	0.2491	0.2548	3.45
14	0.2316	0.1992	0.2187	0.2130	0.2147	0.2220	4.96
								15	0.7507	0.7183	0.7394	0.7104	0.6949	0.6650	4.34
16	0.2682	0.2616	0.2554	0.2701	0.2663	0.2662	2.04
								17	2.7899	2.6621	2.7746	2.7498	2.7881	2.7627	1.73
18	0.3879	0.3586	0.3584	0.3801	0.3772.	0.3749	3.24
								19	1.4669	1.3584	1.3788	1.3894	1.3678	1.3842	2.79

综上可知，本发明所述复方救必应指纹图谱的构建方法具有良好的精密度、重复性和稳定性。

实施例2

本实施例一种复方救必应指纹图谱的检测方法，包括如下步骤：

(1)对照品溶液的制备：

精密称取紫丁香苷对照品约12mg，加甲醇适量，配制成每1ml含1.22mg的溶液，即得紫丁香苷对照品溶液；

用微量进样器吸取α-香附酮对照品200ul，加甲醇适量，配制每1ml含10μl的溶液，即得α-香附酮对照品溶液。

(2)供试品溶液的制备：

取待测样品(批号为：LG40004的复方救必应胶囊，广州白云山星群(药业)股份有限公司提供)2粒，除去胶囊壳，将内容物混匀，精密称取0.5g，置具塞锥形瓶中，精密加入体积分数70％甲醇10ml，密塞，称定重量，超声处理(功率160W，频率59kHz)45分钟，放冷，体积分数加70％甲醇补重，摇匀，滤过(针式过滤器0.22μm)，取续滤液，即得供试品溶液。

(3)分别精密吸取紫丁香苷对照品溶液、α-香附酮对照品溶液和供试品溶液，注入高效液相色谱仪进行测定，色谱条件如下：

色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18(250mm×4.6mm，5μm)，以甲醇(A)-0.5％冰乙酸水溶液(B)为流动相系统梯度洗脱(0-60min，10％A→95％A)，流速为1.0mL·min^-1，检测波长254nm，检测器：紫外检测；柱温25℃，进样量10μL。

待测样品的指纹图谱如图20所示。

通过与图16比较，可知，该待测样品的指纹图谱与对照指纹谱图的相似度为0.98，可以认为该待测样品质量稳定，符合质量要求，为合格产品。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (6)

1.一种复方救必应制剂指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)对照品溶液的制备：

分别精密称取紫丁香苷对照品和α-香附酮对照品，加甲醇稀释，得紫丁香苷对照品溶液和α-香附酮对照品溶液；

(2)供试品溶液的制备：

精密称取复方救必应制剂，加入体积百分含量为50-70％的甲醇，回流提取或超声提取30-45分钟，过滤，即得供试品溶液；

(3)分别精密吸取紫丁香苷对照品溶液、α-香附酮对照品溶液和供试品溶液，注入高效液相色谱仪进行测定，得到由19个共有特征峰构成的复方救必应制剂指纹图谱，其中，所述高效液相色谱仪的条件如下：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；柱温：25-30℃；检测波长为200-400nm；流速：0.8-1.2mL·min^-1；流动相：甲醇为流动相A，0.5％冰乙酸水溶液为流动相B，采用梯度洗脱方式：0-60min，流动相A的体积百分数由10％变化至95％。

2.根据权利要求1所述的复方救必应制剂指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述柱温为25℃，检测波长为254nm，流速为1.0mL·min^-1。

3.根据权利要求1所述的复方救必应制剂指纹图谱的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述体积百分含量为50-70％的甲醇的用量为每克复方救必应制剂精密加入19-21毫升。

4.一种复方救必应制剂指纹图谱的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)对照品溶液的制备：

分别精密称取紫丁香苷对照品和α-香附酮对照品，加甲醇稀释，得紫丁香苷对照品溶液和α-香附酮对照品溶液；

(2)供试品溶液的制备：

精密称取复方救必应制剂，加入体积百分含量为50-70％的甲醇，回流提取或超声提取30-45分钟，过滤，即得供试品溶液；

(3)分别精密吸取紫丁香苷对照品溶液、α-香附酮对照品溶液和供试品溶液，注入高效液相色谱仪进行测定，其中，所述高效液相色谱仪的条件如下：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；柱温：25-30℃；检测波长为200-400nm；流速：0.8-1.2mL·min^-1；流动相：甲醇为流动相A，0.5％冰乙酸水溶液为流动相B，采用梯度洗脱方式：0-60min，流动相A的体积百分数由10％变化至95％。

5.根据权利要求4所述的复方救必应制剂指纹图谱的检测方法，其特征在于，所述柱温为25℃，检测波长为254nm，流速为1.0mL·min^-1。

6.根据权利要求4所述的复方救必应制剂指纹图谱的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述体积百分含量为50-70％的甲醇的用量为每克复方救必应制剂精密加入19-21毫升。