CN104755484A

CN104755484A - Bace抑制剂

Info

Publication number: CN104755484A
Application number: CN201380055699.5A
Authority: CN
Inventors: F·M·马丁; D·J·梅戈特; W·M·欧弗顿
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2012-10-26
Filing date: 2013-10-17
Publication date: 2015-07-01
Anticipated expiration: 2033-10-17
Also published as: CA2886507A1; CN104755484B; HRP20170025T1; HUE031764T2; SI2912041T1; CA2886507C; DK2912041T3; ES2616835T3; LT2912041T; US20150232483A1; WO2014066132A1; PL2912041T3; EP2912041B1; JP2015535247A; US9328124B2; JP6243921B2; EP2912041A1; ME02576B; CY1118623T1; PT2912041T

Abstract

本发明提供了可用作BACE抑制剂用于治疗例如阿尔茨海默氏病的式I化合物或其可药用盐，其中A选自下组:R¹是H或F；R²是H、-OCH₃、C₁-C₃烷基、R³是H、-CH₃或–OCH₃；并且R⁴是H或F。

Description

BACE抑制剂

本发明涉及新的四氢吡咯并噻嗪化合物、包含该化合物的药物组合物、使用该化合物治疗生理障碍的方法以及用于合成该化合物的中间体和方法。

本发明属于治疗阿尔茨海默氏病和其它涉及淀粉样β(Aβ)肽的疾病和病症的领域，所述Aβ肽是一种神经毒性的并且是高度聚集性的淀粉样前体蛋白(APP)的肽片段。阿尔茨海默氏病是一种影响世界范围内数百万患者的破坏性神经变性病症。目前已批准上市的活性剂仅能为患者提供短暂的、对症的益处，鉴于此，在阿尔茨海默氏病的治疗中仍存在大量尚未满足的需求。

阿尔茨海默氏病的特征在于脑中Aβ的产生、聚集和沉积。已证实，完全或部分抑制β-分泌酶(β-位淀粉样蛋白前体蛋白裂解酶；BACE)对小鼠模型中的斑块相关性和斑块依赖性病变有显著作用，这表明即使是Aβ肽水平的少量减少也可能引起斑块负荷和突触缺陷的长期显著减轻，由此提供显著的治疗益处，尤其是在阿尔茨海默氏病的治疗中。

US 2009/0209755公开了稠合的氨基二氢噻嗪衍生物，其进一步被公开可用作由Aβ肽引起的神经变性疾病、例如阿尔茨海默氏型痴呆的有用治疗剂。另外，J.Neuroscience,31(46),16507-16516页(2011)公开了(S)-4-(2,4-二氟-5-嘧啶-5-基-苯基)-4-甲基-5,6-二氢-4H-[1,3]噻嗪-2-基胺，这是一种口服给药的CNS-活性的BACE抑制剂。

需要有效的具有足够CNS渗透性的BACE抑制剂来提供用于Aβ肽-介导的病症例如阿尔茨海默氏病的治疗。本发明提供了一些新的化合物，这些化合物是BACE的有效抑制剂。另外，本发明还提供了具有CNS渗透性的新化合物。

因此，本发明提供了式I化合物或其可药用盐:

其中A选自：

R¹是H或F；

R²是H、-OCH₃、C₁-C₃烷基、

R³是H、-CH₃或–OCH₃；并且

R⁴是H或F。

本发明还提供了治疗患者的阿尔茨海默氏病的方法，该方法包括向需要所述治疗的患者施用有效量的式I化合物或其可药用盐。

本发明进一步提供了预防患者的轻度认知损伤向阿尔茨海默氏病进展的方法，该方法包括向需要所述治疗的患者施用有效量的式I化合物或其可药用盐。

本发明还提供了在患者中抑制BACE的方法，该方法包括向需要所述治疗的患者施用有效量的式I化合物或其可药用盐。

本发明还提供了抑制BACE-介导的淀粉样前体蛋白裂解的方法，该方法包括向需要所述治疗的患者施用有效量的式I化合物或其可药用盐。

本发明进一步提供了抑制Aβ肽的生成的方法，该方法包括向需要所述治疗的患者施用有效量的式I化合物或其可药用盐。

此外，本发明还提供了用于治疗、尤其是用于治疗阿尔茨海默氏病或用于预防轻度认知损伤向阿尔茨海默氏病进展的式I化合物或其可药用盐。此外，本发明还提供了式I化合物或其可药用盐在制备用于治疗阿尔茨海默氏病的药物中的用途。本发明还提供了式I化合物或其可药用盐在制备用于预防轻度认知损伤向阿尔茨海默氏病进展的药物中的用途。本发明还提供了式I化合物或其可药用盐在制备用于抑制BACE的药物中的用途。本发明进一步提供了式I化合物或其可药用盐在制备用于抑制Aβ肽的产生的药物中的用途。

本发明进一步提供了包含式I化合物或其可药用盐和一种或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。在一个特定的实施方案中，该组合物还包含一种或多种其它治疗剂。本发明还包括用于合成式I化合物的新中间体和工艺。

根据临床表现以及显示出轻度认知损伤的患者随时间进展为阿尔茨海默氏病，轻度认知损伤已被定义为阿尔茨海默氏病相关性痴呆症的潜在的前驱阶段(Morris等人,Arch.Neurol.,58,397-405(2001)；Petersen等人,Arch.Neurol.,56,303-308(1999))。术语“预防轻度认知损伤向阿尔茨海默氏病进展”包括减缓、阻碍或逆转患者由轻度认知损伤向阿尔茨海默氏病的进展。

本文所用的术语“C₁-C₃烷基“是指甲基、乙基、丙基和异丙基烷基基团。

本文所用的术语“治疗“包括阻碍、预防、抑制、减缓、停止或逆转现有症状或病症的进展或严重程度。

本文所用的术语“患者”是指哺乳动物，更优选人。

术语“抑制Aβ肽的产生”是指在哺乳动物中降低Aβ肽的体内水平。

本文所用的术语“有效量”是指在以单一或多剂量施用给患者时，在接受诊断或治疗的患者中提供所需效果的本发明化合物或其可药用盐的量或剂量。

有效量可由作为本领域技术人员的主治诊断医师通过利用已知的技术以及观察在类似情况下所得到的结果来容易地确定。在确定对于患者的有效量中，主治诊断医师要考虑许多因素，包括但不限于:哺乳动物的种类；其个头大小、年龄和一般健康状况；所涉及的具体疾病或病症；疾病或病症的程度或复杂情况或严重程度；个体患者的反应；所施用的具体化合物；给药方式；所施用的制剂的生物利用度特性；所选择的剂量方案；共同使用的药物和其它相关的情况。

式I化合物通常在宽的剂量范围内是有效的。例如，每天的剂量通常在约0.01至约20mg/kg/体重的范围内。在某些情况下，低于上述范围的下限的剂量水平可能是更适当的，而在其它情况下则可使用更大的剂量而具有可接受的副作用，因此，上述剂量范围绝非想要限制本发明的范围。优选将本发明化合物配制成药物组合物的形式通过任何使该化合物可被生物利用的途径给药，包括口服和胃肠外途径。最优选所述组合物是用于口服给药的组合物。该药物组合物及其制备方法是本领域已知的(参见例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy(D.B.Troy,Editor,21版,Lippincott,Williams&Wilkins,2006)。

式I化合物在本发明的治疗方法中是特别有用的，但是某些基团、取代基和构型对于式I化合物是优选的。以下段落描述了该优选的基团、取代基和构型。应理解，这些优选的选项同时适用于本发明的治疗方法和新化合物。

优选A选自:

最优选A选自:

特别优选A是:

优选R¹是F。

优选R²是H或

最优选R²是

优选R³是H。

特别优选当R¹是F且R³是H时，R²是H。

进一步特别优选当R¹是F且R³是H时，R²是

优选的实施方案包括具有提高的CNS渗透性的式I化合物。

优选的化合物是:

2-[2-[(4aR,7aR)-2-氨基-7a-吡嗪-2-基-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-基]-5-氟-嘧啶-4-基]丙-2-醇；

2-[2-[(4aR,7aR)-2-氨基-7a-(5-氟-2-吡啶基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-基]-5-氟-嘧啶-4-基]丙-2-醇；

2-[2-[(4aR,7aS)-2-氨基-7a-(3-吡啶基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-基]-5-氟-嘧啶-4-基]丙-2-醇；

(4aR,7aR)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-7a-吡嗪-2-基-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺,异构体1；及其可药用盐。

特别优选的化合物是:

2-[2-[(4aR,7aS)-2-氨基-7a-(3-吡啶基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-基]-5-氟-嘧啶-4-基]丙-2-醇；及其可药用盐。

首选的化合物是:

2-[2-[(4aR,7aR)-2-氨基-7a-吡嗪-2-基-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-基]-5-氟-嘧啶-4-基]丙-2-醇及其可药用盐。

本领域普通技术人员将会意识到，本发明化合物可以互变异构体的形式的存在，如流程A所述。在本申请中，任何提及本发明化合物的一种具体互变异构体时，均应理解成包括两种互变异构形式及其所有混合物。

流程A

本发明化合物或其盐可通过本领域已知的各种方法制备，某些方法如以下流程、制备例和实施例中所举例说明。所述各路线的具体合成步骤可以以不同的方式相组合，或与不同流程的步骤相结合，以制备式I化合物或其盐。在以下流程中，各步骤的产物可通过常规方法回收，包括萃取、蒸发、沉淀、色谱、过滤、研制和结晶。

某些立体化学中心未进行确认，并且为了清楚的原因，在以下流程中删除了某些取代基，其不打算以任何方式限制该流程的教导。此外，单独的异构体、对映体或非对映体可由本领域普通技术人员通过例如选择性结晶技术或手性色谱等方法在式I化合物合成中的任何方便的点进行分离或拆分(参见例如J.Jacques等人,“对映体、外消旋体和拆分”,John Wiley和Sons,Inc.,1981和E.L.Eliel和S.H.Wilen,“有机化合物的立体化学”,Wiley-Interscience,1994)。指定“异构体1”和“异构体2”分别是指从手性色谱中首先和第二洗脱出来的化合物，并且如果在合成的早期开始进行手性色谱，则相同的指定应用于随后的中间体和实施例。另外，以下流程中所述的中间体含有许多氮保护基。可变的保护基在每次出现时可相同或不同，这取决于待进行的特定反应条件和特定的转化反应。保护和脱保护条件是本领域技术人员已知的，并且记载于文献中(参见例如“Greene’sProtective Groups in Organic Synthesis”,第4版,Peter G.M.Wuts和Theodora W.Greene,John Wiley和Sons,Inc.2007)。

本领域普通技术人员将会意识到本发明化合物由含有至少两个手性中心的核所组成:

流程B

尽管本发明包括所述化合物的所有单独的对映体以及对映体的混合物、包括外消旋体，但是，在标记有1和2的原子处具有如流程B所示的绝对构型的化合物是优选的本发明化合物。

本文所用的缩写词按照Aldrichimica Acta,Vol.17,No.1,1984进行定义。其它缩写词定义如下：“APP”是指淀粉样前体蛋白；“BOC”是指叔丁氧基羰基；“CSF”是指脑脊液；“DCC”是指1,3-二环己基碳二亚胺；“DIC”是指二异丙基碳二亚胺；“DMEM”是指Dulbecco’s Modified Eagle’sMedium；“DMSO”是指二甲基亚砜；“EDCI”是指1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；“Ex”是指实施例；“F12”是指Ham’s F12培养基；“FBS”是指胎牛血清；“FRET”是指荧光共振能量转移；“HEK”是指人胚肾；“HOAc”是指乙酸；“HOAt”是指1-羟基-7-偶氮苯并三唑；“HOBt”是指1-羟基苯并三唑水合物；“HPLC’是指高效液相色谱；“hr是指小时；“IC₅₀”是指产生50％该活性剂可能的最大抑制响应的活性剂的浓度；“min”是指分钟；“PDAPP”是指血小板衍生的淀粉样前体蛋白；“Prep”是指制备例；“RFU”是指相对荧光单位、“R_t”是指保留时间，“THF”是指四氢呋喃。

在以下流程中，除非另有指示，否则所有取代基如前所定义。试剂和原料对于本领域普通技术人员来说通常是易于得到的。其它的可通过与合成已知的结构相似化合物相类似的有机和杂环化学的标准技术以及以下所附的制备例和实施例中所述的方法(包括任何新方法)进行制备。

流程1

流程1描述了用于形成酮(3)的Weinreb酰胺(2)的形成，然后可将该酮转化成肟。该肟可用于形成二环异唑(9)。(A)基团可在合成的不同点嵌入，如流程1所示。“PG”是用于氨基的保护基例如氨基甲酸酯和烯丙基。该基团是本领域已知的并且所认同的。

将式(1)化合物用N,O-二甲基羟基酰胺盐酸盐利用有机碱例如二异丙基乙基胺或三乙胺和偶联剂例如碳二亚胺和HOBt或HOAt转化成Weinreb酰胺(步骤1，化合物2)，以提高酰胺偶联的有效性。本领域技术人员将会认识到，对于从羧酸和胺反应形成酰胺存在许多方法和试剂。例如，有用的碳二亚胺是DCC、DIC、EDCI。

另外，还可将羧酸转化成酰氯，并且Weinreb酰胺可利用有机碱和N,O-二甲基羟基胺盐酸盐来形成。

随后将Weinreb酰胺用有机金属试剂例如格氏试剂或有机锂试剂处理得到化合物3(步骤2)。例如，杂环卤化物和烷基格氏试剂或有机锂试剂可用于形成连接有所需的(A)基团的酮(3，步骤2)。然后可将酮(3)用于与羟基胺盐酸盐和无机碱例如乙酸钠三水合物或乙酸钠或有机碱例如吡啶或利用50wt％羟基胺水溶液在极性质子溶剂例如乙醇中形成肟得到化合物6(步骤3)。或者，在两步反应中，可将β卤代的酮用保护的烯丙基胺烷基化，或通过与烯丙基胺反应、随后原位进行叔丁氧基氨基甲酰基保护，然后用羟基胺盐酸盐处理得到肟(6,步骤4)。然后可在3+2环化中将肟(6)通过多种方法转化成二环异唑(9)，例如在非极性溶剂例如甲苯或二甲苯中加热肟(6)以形成化合物9(步骤5)，或利用次氯酸钠或乙醇钛(IV)的水溶液在非极性溶剂例如甲苯或二甲苯中加热得到化合物9(步骤5)。

流程2

流程2举例说明了肟的原位形成以及随后转化形成二环异唑得到化合物(10)，步骤8。将N-[(4-甲氧基苯基甲基]羟基胺盐酸盐用化合物(3)在有机碱例如三乙胺(向其中加入乙醇钛(IV))中在加热下处理得到化合物10。将二环异唑的BOC保护的吡咯烷在本领域已知的酸性条件下脱保护。将烯丙基保护的吡咯烷用酸例如N,N-二甲基巴比妥酸用催化剂例如四(三苯基膦)钯脱保护。然后将脱保护的吡咯烷在亲核芳香取代反应(SNAr)中与取代的或未取代的芳香族嘧啶利用有机碱例如二异丙基乙基胺、三乙胺或N,N,N’,N’-四甲基胍反应得到所需的取代的保护的二环异唑(步骤9的步骤1和2)。随后将4-甲氧基苄基(PMB)保护的二环异唑在酸性条件下脱保护得到化合物11(步骤9的步骤3)。将化合物11用异硫氰酸苯甲酰基酯在极性非质子溶剂例如THF中处理得到硫脲(12，步骤10)。将异唑环用锌粉在乙酸中开环(13，步骤11)。然后将羟基化合物(13)用1-氯-N,N,2-三甲基丙烯基胺处理以形成稠合的吡咯烷保护的噻嗪(14，步骤12)。在步骤13中，将噻嗪酰胺用有机碱例如吡啶和甲基羟基胺盐酸盐在极性非质子溶剂例如乙醇中或用无机碱例如氢氧化锂在甲醇中脱保护得到式I化合物。

流程3

流程3描述了首先将保护的二环异唑(9)用Zn粉在乙酸中处理或用阮内镍在极性溶剂例如乙醇中在加压氢化条件(16、步骤16)下处理，然后与异硫氰酸苯甲酰基酯反应得到化合物17(步骤17)。噻嗪环可按照流程2,步骤12所述的方法形成得到化合物18(步骤18)。在步骤19中，将吡咯烷(18)按照流程2(步骤9的步骤1和2)所述的方法脱保护和杂芳化得到稠合的吡咯烷保护的噻嗪(化合物14，流程2)。然后将噻嗪酰胺按照流程2(步骤13)所述的方法脱保护得到式I化合物。

流程4

流程4描述了流程3和流程2的替换路线，其中，可将化合物9在SNAr反应中在吡咯烷氮处脱保护并杂芳化，然后在用苯甲酰基异氰酸酯处理二环异唑之前将异唑环开环。

例如，将吡咯烷氮按照流程2、步骤9所述的方法进行脱保护和杂芳化。将化合物11的异唑环按照流程3、步骤16所述的方法开环得到化合物19(步骤21)。用于形成保护的噻嗪(14)的两步转化可按照步骤22和24所示的以及步骤17和18、流程3所述的方法来完成，或将保护的噻嗪直接按照步骤23所示的方法在第一步骤中利用异硫氰酸苯甲酰基酯处理并在第二步骤中利用三苯基膦和偶氮二甲酸二异丙酯处理来合成。将噻嗪酰胺按照流程2、步骤13所述的方法脱保护得到式I化合物。

在任选的步骤中，式I化合物的可药用盐、例如盐酸盐可通过将适当的式I的游离碱与适当的可药用酸在适当的溶剂中在标准条件下反应来形成。另外，该盐的形成可在氮保护基脱保护的同时进行。该盐的形成是本领域已知的。参见例如Gould,P.L.,“用于基础药物的盐的选择”International Journal of Pharmaceutics,33:201-217(1986)；Bastin,R.J.等人“Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical NewChemical Entities,”Organic Process Research and Development,4:427-435(2000)；和Berge,S.M.等人,“药物盐”Journal of Pharmaceutical Sciences,66:1-19,(1977)。

制备例和实施例

以下制备例和实施例进一步解释本发明。除非有相反指示，将本文所示的化合物利用Draw 3.2版(Symyx Solutions,Inc.)或IUPACNAME ACDLABS命名和排序。

制备例1

2-氯-5-氟-4-异丙基-嘧啶

将搅拌着的5-氟-2-氯嘧啶(5.00g,37.7mmol)的1,2-二甲氧基乙烷(25mL)溶液与2M异丙基氯化镁的四氢呋喃溶液(28.3mL,56.6mmol)反应，同时将温度保持在15℃以下。将形成的溶液在氮气下搅拌1小时，然后冷却至0℃。加入三乙胺(5.76mL,37.7mmol)的四氢呋喃(5mL)溶液，然后加入碘(9.58g,37.7mmol)的四氢呋喃(20mL)溶液。加入完成后，将黑色反应混合物用水终止反应，然后加入水和饱和碳酸氢钠和饱和硫酸氢钠。将混合物用乙酸乙酯萃取(3×)。将合并的有机层用硫酸钠干燥并减压除去溶剂。将形成的残余物通过硅胶柱色谱纯化，用5-100％二氯甲烷的己烷溶液梯度洗脱得到标题化合物(2.55g,39％)。GC/MS(m/e):174。

以下化合物基本上通过制备例1的方法制备。

表1

^a使用乙基溴化镁(3.0M的二乙醚溶液)。

^b原料为5-氟-2,4-二氯-嘧啶并且使用甲基溴化镁(3M的二乙醚溶液)，用1,2-二甲氧基乙烷作为溶剂。

制备例4

2-氯-5-氟-4-甲氧基-6-甲基-嘧啶

将甲醇钠(446.53mg,8.27mmol)在0℃下分批加入到搅拌着的2,4-二氯-5-氟-6-甲基-嘧啶(1.7g,7.51mmol)的甲醇(8mL,197.66mmol)溶液中。然后将混合物在室温下搅拌1小时。将水(20mL)加入到反应混合物中，然后加入二氯甲烷。分层并将水层用二氯甲烷反萃取。将合并的有机萃取液用硫酸镁干燥并将溶剂减压蒸发得到产物与原料的8:1混合物。将粗产物通过硅胶色谱纯化，用0-99％二氯甲烷的异己烷溶液梯度洗脱得到标题化合物(1.16g,87％)。¹H NMR(CDCl₃)δ4.09(s,3H),2.45(d,3H)。

制备例5

1-(2-氯-5-氟-嘧啶-4-基)乙酮

将室温下的5-氟-2,4-二氯-嘧啶(20g,119.8mmol)和(1-乙氧基乙烯基)三甲基锡烷(43.26g,119.8mmol)的二甲基甲酰胺(200mL)溶液用氮气净化。加入二(三苯基膦)氯化钯(II)(1.70g,2.40mmol)并将形成的混合物在氮气下在70℃下加热2小时。将反应液冷却至50℃并加入5N盐酸水溶液(100mL)并搅拌2小时。将反应液冷却并用水(200mL)和盐水稀释，然后用二乙醚萃取5次。将合并的有机层用硫酸钠干燥并真空浓缩。将粗产物用硅胶柱色谱纯化，用5-50％乙酸乙酯的己烷溶液梯度洗脱得到标题化合物(19.2g,92％)。GC/MS(m/e):174和176。

制备例6

2-(2-氯-5-氟-嘧啶-4-基)丙-2-醇

向搅拌着的-78℃的1-(2-氯-5-氟-嘧啶-4-基)乙酮(10.06g,57.6mmol)的四氢呋喃(100mL)溶液中在氮气下加入甲基溴化镁的二乙醚溶液(3M,124mL,72.04mmol)并将形成的混合物在-78℃下搅拌20分钟。用饱和氯化铵水溶液终止反应并将混合物升温至室温。将反应混合物用乙酸乙酯萃取三次。将合并的有机层用硫酸钠干燥并真空浓缩。将粗产物用硅胶柱色谱纯化，用5-100％乙酸乙酯的己烷溶液梯度洗脱得到标题化合物(7.06g,64％)。ES/MS(m/e):191和193(M+1)。

制备例7

2-氯-5-氟-4-(1-氟-1-甲基-乙基)嘧啶

将二乙基氨基三氟化硫(6.53g,40.5mmol)在氮气下滴加到-78℃的2-(2-氯-5-氟-嘧啶-4-基)丙-2-醇(4.825g,25.31mmol)的二氯甲烷(70mL)溶液中。将反应液在-78℃下在氮气下搅拌30分钟，用饱和碳酸氢钠水溶液终止反应并升温至室温。将反应混合物用乙酸乙酯萃取三次。将合并的有机层用硫酸钠干燥并真空浓缩。将形成的粗产物用硅胶柱色谱纯化，用5-100％乙酸乙酯的己烷溶液梯度洗脱得到标题化合物(4.23g,87％)。ES/MS(m/e):193和195(M+1)。

制备例8

(叔丁氧基羰基氨基)叔丁基碳酸酯

将羟基胺盐酸盐(550.0g,7.9mol)、水(5.5L)和庚烷/MTBE溶液(5:1,5.5L)的混合物冷却至-5℃。在2小时内缓慢加入预先冷却的(-5℃)的二碳酸二叔丁酯(3.55Kg,16.3mol)、三乙胺(1.67Kg,16.5mol)的庚烷/MTBE(5:1,1.1L)溶液。将反应液在-5℃下搅拌1小时，然后升温至室温并搅拌过夜。分层并将有机层用饱和氯化铵水溶液(2L)和饱和氯化钠水溶液(1L)洗涤两次，用硫酸钠干燥，过滤并浓缩得到油，该油结晶形成白色固体。将固体与庚烷(1L)在冰水浴中搅拌并过滤得到标题产物(1360.2g,73％)。¹H NMR(d₆-DMSO)δ10.7(bs,1H),1.44(s,9H),1.40(s,9H)。

制备例9

[叔丁氧基羰基-[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基]叔丁基碳酸酯

在氮气下，向20L反应器中加入(叔丁氧基羰基氨基)叔丁基碳酸酯(812.9g,3.48mol)、二甲基甲酰胺(4.4L)、碳酸钾(626.5g,4.52mol)和1-(氯甲基)-4-甲氧基-苯(462mL,2.56mol)。将混合物在40℃下搅拌过夜。¹HNMR分析显示反应未完成。补加碳酸钾(626.5g,4.52mol)并将混合物在40℃下搅拌。48小时后，¹H NMR分析显示反应仍未完成。补加碳酸钾(482g,3.49mol)并将混合物在40℃下搅拌。过夜反应后，¹H NMR分析显示完全反应，未剩余原料。加入水(5L)和MTBE(5L)并分层。将有机层用水洗涤(3×3L)，用硫酸钠干燥并浓缩得到标题化合物(1.21Kg,98％)。¹H NMR(d₆-DMSO)δ7.20(d,J＝8.3Hz,2H),6.91(d,J＝8.3Hz,2H),3.73(s,2H),3.35(s,3H),1.41(s,18H)。

制备例10

N-[(4-甲氧基苯基)甲基]羟基胺盐酸盐

将[叔丁氧基羰基-[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基]叔丁基碳酸酯(1.125Kg,3.1mol)溶于1,4-二恶烷(2.8L)并在1小时30分钟内滴加盐酸溶液(4M的二恶烷溶液,3.15L,12.4mol)。将溶液在室温下搅拌过夜。将标题产物通过过滤收集，为白色固体(488.0g,81％)。¹H NMR(d₆-DMSO)δ11.71(s,2H),10.94(s,1H),7.44(d,J＝8.8Hz,2H),6.95(d,J＝8.8Hz,2H),4.22(s,2H),3.75(s,3H)。

制备例11

2-(烯丙基(叔丁氧基羰基)氨基)乙酸

向含有碳酸钾(100g,724mmol)、碘化钠(110g,727mmol)、二甲基甲酰胺(300mL)、三乙胺(200mL,1.44mol)和2-丙烯-1-胺(24g,426mmol)的圆底烧瓶中在0℃下滴加2-溴乙酸乙酯(60.2g,360mmol)的二甲基甲酰胺(40mL)溶液。将反应液升温至室温并搅拌14小时。通过过滤除去固体并用二乙醚洗涤。将饱和氯化钠水溶液(1L)加入到滤液中并分层。将水层用二乙醚萃取。将有机相合并，用硫酸镁干燥，过滤并减压除去溶剂得到残余物。在0℃下向粗残余物的乙醇(500ml)和三乙胺(40g,395mmol)溶液中一次性加入二碳酸二叔丁酯(105g,467mmol)。将反应液升温至室温并搅拌14小时。将反应液减压浓缩并用水(200mL)和饱和碳酸氢钠水溶液(200mL)稀释，用二乙醚萃取。将有机相合并，用硫酸镁干燥，过滤并减压浓缩得到残余物。向该残余物中加入甲醇(200mL)和2N氢氧化钠(500mL)。将形成的溶液在室温下搅拌3小时。将体积减压浓缩至约200ml并将形成的溶液用盐酸(12N)酸化至pH 4。将形成的浅橙色固体通过过滤收集，用水洗涤并干燥得到标题化合物(50g,65％)。¹H NMR(CDCl₃)两种旋转异构体的混合物(50:50)δ1.43,1.45(s,9H),3.86-3.99(m,4H),5.10-5.20(m,2H),5.71-5.83(m,1H)。

制备例12

N-烯丙基-N-[2-(甲氧基(甲基)氨基)-2-氧代-乙基]氨基甲酸叔丁酯

将2-(烯丙基(叔丁氧基羰基)氨基)乙酸(49.6g,156mmol)在0℃下加入到四氢呋喃(600mL)中，然后加入三乙胺(36.3g,359mmol)和新戊酰氯(31g,353mmol)。将反应液在室温下搅拌3小时，然后冷却至0℃。然后加入N,O-二甲基羟基胺盐酸盐(28g,283mmol)、三乙胺(33mL,237mmol)和四氢呋喃(400mL)。除去冰浴并将反应液在室温下搅拌3小时并减压浓缩。将形成的固体溶于水并用乙酸乙酯萃取。将有机相合并，用硫酸钠干燥，过滤并减压除去溶剂得到残余物。将残余物通过硅胶柱色谱纯化，用0-50％丙酮的己烷溶液梯度洗脱得到标题化合物(32g,54％)。¹H NMR(CDCl₃)两种旋转异构体的混合物(60:40)δ1.42,1.44(s,9H),3.16,3.17(s,3H),3.66,3.69(s,3H),3.88-3.98(m,2H),4.01,4.11(s,2H),5.10-5.18(m,2H),5.73-5.85(m,1H)。

制备例13

2-溴-(3-吡啶基)乙酮氢溴酸盐

向剧烈搅拌着的1-(3-吡啶基)-乙酮(7.2mL,65.44mmol)在乙酸(65mL)和48％溴化氢水溶液(11mL,97.88mmol)中的溶液中在0℃下滴加溴(3.5mL,68.11mmol)。将反应液在剧烈搅拌下升温至40℃并搅拌2小时。然后将反应液升温至75℃并搅拌2小时。将反应混合物冷却至室温并用二乙醚稀释。将形成的沉淀物收集，用二乙醚洗涤并真空干燥得到标题化合物，为白色结晶固体(18.27g,99％)。¹H NMR(d₆-DMSO)δ14.53-14.47(m,1H),9.35(d,J＝1.5Hz,1H),9.01(d,J＝4.9Hz,1H),8.72(d,J＝7.8Hz,1H),7.97-7.91(m,1H),5.09(s,2H)。

以下化合物基本上通过制备例13的方法利用2-乙酰基吡啶制备。以4等份滴加溴。

表2

制备例15

2-溴-1-(4-吡啶基)乙酮氢溴酸盐

向搅拌着的4-乙酰基吡啶(3.62g,29.88mmol)的乙酸(30mL)溶液中加入48％溴化氢水溶液(5.3mL,47.16mmol)。以4等份滴加溴(1.6mL,31.14mmol)。将反应液搅拌约2小时，有固体析出。加入溴(1.6mL,31.14mmol)并将反应液搅拌过夜。将形成的沉淀物收集，用二乙醚洗涤并真空干燥得到标题化合物(8.6g,102％)。¹H NMR(d₆-DMSO)δ9.02(d,2H),8.17(d,2H),5.08(2H)。

制备例16

2-溴-1-吡嗪-2-基-乙酮氢溴酸盐

向搅拌着的乙酰基吡嗪(10g,81.88mmol)的乙酸(70mL)溶液中加入溴化氢(38％乙酸溶液,16mL)，然后一次性加入三溴化吡啶(28g,83.17mmol)。将反应液在室温下搅拌约1.5小时。在该时间内形成悬浮液。加入二乙醚(500mL)并将形成的沉淀物通过过滤收集。将分离出的产物用乙腈和二乙醚洗涤并真空干燥得到浅棕色固体(23.2g,定量收率)。¹H NMR(d₆-DMSO)δ9.19(1H,m),8.95(1H,m),8.84(1H,m),5.02(2H,s)。

制备例17

N-烯丙基-N-[2-氧代-2-(3-吡啶基)乙基]氨基甲酸叔丁酯

在5分钟内于0℃下将2-溴-1-(3-吡啶基)乙酮氢溴酸盐(9.35g,21.96mmol)分批加入到搅拌着的2-丙烯-1-胺(1.82mL,24.16mmol)和二异丙基乙基胺(7.66mL,43.93mmol)的四氢呋喃(270mL)溶液中。将反应混合物在0℃下搅拌1小时40分钟。加入二碳酸二叔丁酯(9.40mL,41.73mmol)的四氢呋喃(10mL)溶液并在0℃下继续反应1小时40分钟。用饱和碳酸氢钠(120mL)终止反应。加入二氯甲烷(300mL)并分相。将水相用二氯甲烷反萃取(300mL)。将合并的有机相用硫酸镁干燥，过滤并真空浓缩。将粗产物通过硅胶色谱纯化，依次用0-5％丙酮的二氯甲烷溶液、5-10％丙酮的二氯甲烷溶液和100％丙酮梯度洗脱得到标题化合物(1.15g,19％)。ES/MS(m/e):277(M+1)。

以下化合物基本上通过制备例17的方法利用适当的吡啶或吡嗪制备。

表3

^a反应时间:与2-丙烯-1-胺反应70分钟，对于氨基甲酸叔丁酯的形成，反应70分钟。纯化通过硅胶色谱进行，用0至10％丙酮的二氯甲烷溶液梯度洗脱。

^b溶剂为二甲基甲酰胺，与2-丙烯-1-胺的反应时间是10分钟，氨基甲酸叔丁酯的形成在四氢呋喃/二甲基甲酰胺中进行。纯化通过硅胶色谱进行，用0至35％乙酸乙酯的异-己烷溶液梯度洗脱。

^c在10分钟内分批加入2-溴-1-(4-吡啶基)乙酮氢溴酸盐并将反应液在0℃下搅拌15分钟，然后搅拌2小时45分钟以形成氨基甲酸叔丁酯。纯化通过硅胶色谱进行，用0至5％甲醇的二氯甲烷溶液梯度洗脱。

制备例21

N-烯丙基-N-[2-(5-氟-2-吡啶基)-2-氧代-乙基]氨基甲酸叔丁酯

在搅拌及氮气下、于室温下将2-溴-5-氟-吡啶(2.46g,13.98mmol)的四氢呋喃(20mL)溶液滴加到异丙基氯化镁溶液(15mL,30.00mmol 2M的四氢呋喃溶液)中。将形成的反应混合物在室温下搅拌2小时。然后在室温下滴加N-烯丙基-N-[2-[甲氧基(甲基)氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸叔丁酯(3.4g,13.16mmol)的四氢呋喃(15mL)溶液并将形成的混合物搅拌过夜。加入稀盐酸和乙酸乙酯。分层并将水相用乙酸乙酯反萃取。将合并的有机萃取液用硫酸镁干燥，过滤并减压浓缩至干。将形成的残余物通过硅胶柱色谱纯化，用0-40％丙酮的异己烷溶液梯度洗脱得到标题化合物(1.27g,33％)。ES/MS(m/e):317(M+23)。

制备例22

2-(二烯丙基氨基)-1-(3-吡啶基)乙酮

在5分钟内将2-溴-1-(3-吡啶基)乙酮氢溴酸盐(10g,23.49mmol)在0℃下分批加入到搅拌着的二烯丙基胺(5.2mL,42.29mmol)和二异丙基乙基胺(10.24mL,58.73mmol)的四氢呋喃(150mL)溶液中。将形成的混合物在0℃下搅拌1小时。通过加入饱和碳酸氢钠水溶液(100mL)和二氯甲烷(300mL)终止反应。分层并将水相用二氯甲烷反萃取(300mL)。将合并的有机层用硫酸镁干燥并减压除去溶剂得到粗产物，将其通过硅胶柱色谱纯化，用0-5％0.14M氨/甲醇的二氯甲烷溶液梯度洗脱得到标题化合物(4.75g,93％)。ES/MS(m/e):217(M+1)。

制备例23

N-烯丙基-N-(2-羟基亚氨基-2-吡嗪-2-基-乙基)氨基甲酸叔丁酯

在氮气下、在搅拌下将N-烯丙基-N-(2-氧代-2-吡嗪-2-基-乙基)氨基甲酸叔丁酯(6.53g,23.55mmol)溶于乙醇(22mL)。加入羟基胺盐酸盐(3.80g,54.16mmol)和吡啶(2.67mL,32.97mmol)并将形成的溶液在80℃下在氮气下加热80分钟。然后将反应液冷却至室温并减压浓缩至小体积。加入二氯甲烷(200ml)和1M氢氧化钠水溶液(60ml)并分相。将水相用二氯甲烷反萃取(2×200mL)。将合并的有机萃取液用硫酸镁干燥并将溶剂减压蒸发。将粗产物通过硅胶色谱纯化，用0-5％0.14M氨/甲醇的二氯甲烷溶液梯度洗脱得到标题化合物，为E/Z异构体混合物(6.61g,96％)。ES/MS(m/e):293(M+1)。

以下化合物基本上通过制备例23的方法制备。

表4

^a将反应液加热过夜。

制备例25

N-烯丙基-N-[2-(5-氟-2-吡啶基)-2-羟基亚氨基-乙基]氨基甲酸叔丁酯

在搅拌及氮气下，于室温下将2-溴-5-氟-吡啶(6.475g,36.79mmol)的四氢呋喃(20mL)溶液滴加到异丙基氯化镁(20mL,40.00mmol 2M的四氢呋喃溶液)中。将形成的反应混合物在室温下搅拌2小时。然后在室温下滴加N-烯丙基-N-[2-[甲氧基(甲基)氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸叔丁酯(4.43g,17.15mmol)的四氢呋喃(15mL)溶液并将形成的混合物在室温下搅拌4小时30分钟。通过加入氯化铵水溶液和乙酸乙酯终止反应。分层并将水相用乙酸乙酯反萃取。将合并的有机萃取液用硫酸镁干燥，过滤并减压浓缩至干。在搅拌下向所形成的黑色油中加入乙醇(60mL)。加入50wt％羟基胺水溶液(3mL,55.09mmol)并将形成的溶液在60℃下加热一个周末。将反应液冷却至室温并减压浓缩。将粗产物通过硅胶色谱纯化，用0-35％异己烷的乙酸乙酯溶液梯度洗脱得到标题化合物，为E/Z异构体混合物(4.9g,92％)。ES/MS(m/e):310(M+1)。

制备例26

6a-吡嗪-2-基-3,3a,4,6-四氢-1H-吡咯并[3,4-c]异唑-5-甲酸叔丁酯

将N-烯丙基-N-(2-羟基亚氨基-2-吡嗪-2-基-乙基)氨基甲酸叔丁酯(6.6g,22.58mmol)的甲苯(80mL)溶液在120℃下搅拌22小时。将反应液冷却并将溶剂减压蒸发。将粗产物通过硅胶柱色谱纯化，用0-5％0.14M氨/甲醇的二氯甲烷溶液梯度洗脱得到标题化合物(5.13g,74％)。ES/MS(m/e):293(M+1)。

以下化合物基本上通过制备26的方法制备。

表5

^a反应时间是3小时30分钟并通过硅胶柱色谱纯化，用5-80％丙酮的异己烷溶液梯度洗脱。

^b反应时间是在120℃下反应1小时30分钟，然后在130℃下反应18小时，然后在140℃下继续反应几天并通过硅胶柱色谱纯化，用0-10％乙醇在二氯甲烷和异己烷的1:1混合物中的溶液洗脱。

制备例29

1-[(4-甲氧基苯基)甲基]-6a-(3-吡啶基)-3,3a,4,6-四氢吡咯并[3,4-c]异唑-5-甲酸叔丁酯

向搅拌着的N-烯丙基-N-[2-氧代-2-(3-吡啶基)乙基]氨基甲酸叔丁酯(2.3g,8.32mmol)的无水甲苯(38mL)溶液中加入N-[(4-甲氧基苯基)甲基]羟基胺盐酸盐(2.05g,10.82mmol)和三乙胺(1.74mL,12.48mmol)。加入乙醇钛(IV)(6.09mL,29.13mmol)并将混合物在75℃下加热5小时。将反应液冷却至室温，加入水(60mL)和乙酸乙酯(50mL)并将混合物搅拌10分钟并通过硅藻土过滤。分相并将有机相用硫酸镁干燥，过滤并真空浓缩。将粗产物通过硅胶色谱纯化，用0-40％丙酮的异-己烷溶液梯度洗脱得到标题化合物(2.9g,76％)。ES/MS(m/e):412(M+1)。

以下化合物基本上通过制备例29的方法制备，加热2.5小时至6小时。

表6

^a通过硅胶色谱纯化，用0-50％乙酸乙酯的异己烷溶液梯度洗脱。

^b通过硅胶色谱纯化，用0-100％乙酸乙酯的异己烷溶液梯度洗脱。

制备例33

2-(二烯丙基氨基)-1-(3-吡啶基)乙酮肟

将2-(二烯丙基氨基)-1-(3-吡啶基)乙酮(4.75g,21.96mmol)在氮气氛下溶于乙醇(47mL)。然后加入羟基胺盐酸盐(3.55g,50.51mmol)和吡啶(2.5mL,30.75mmol)。将形成的溶液在70℃下在氮气下加热140分钟。然后将反应液冷却至室温并将溶剂部分减压蒸发。将形成的残余物在1M氢氧化钠水溶液(50ml)和二氯甲烷(250mL)之间进行分配。分相并将水相用乙酸乙酯反萃取(250mL)。将有机层合并并将溶剂蒸发。将粗产物通过硅胶柱色谱纯化，用0-10％0.14M氨/甲醇的二氯甲烷溶液梯度洗脱得到标题化合物(3.95g,78％)，为E/Z异构体的混合物。ES/MS(m/e):232(M+1)。

制备例34

N-烯丙基-N-[2-羟基亚氨基-2-(3-吡啶基)乙基]氨基甲酸叔丁酯

在搅拌下、在氮气下将N-烯丙基-N-[2-氧代-2-(3-吡啶基)乙基]氨基甲酸叔丁酯(31.34g 113.41mmol)溶于乙醇(110mL)。加入羟基胺盐酸盐(18.31g,260.85mmol)和吡啶(12.84mL,158.78mmol)。将形成的溶液在80℃下在氮气下加热2小时，然后冷却至室温。然后将溶剂部分蒸发并将形成的残余物在2M氢氧化钠(150ml)和二氯甲烷(500mL)之间进行分配。分相并将水相用二氯甲烷反萃取(2×250mL)。将有机萃取液合并并减压蒸发。将粗产物通过硅胶柱色谱纯化，用0-10％0.14M氨/甲醇的二氯甲烷溶液梯度洗脱得到标题化合物(30.34g,91.82％)，为E/Z异构体的混合物。ES/MS(m/e)M+1＝292。

制备例35

5-烯丙基-6a-(3-吡啶基)-3,3a,4,6-四氢-1H-吡咯并[3,4-c]异唑

将2-(二烯丙基氨基)-1-(3-吡啶基)乙酮肟(3.95g,17.08mmol)的甲苯(56mL)溶液在120℃下加热18小时。减压除去溶剂。将粗产物通过硅胶柱色谱纯化，用0-5％0.14M氨/甲醇的二氯甲烷溶液梯度洗脱得到标题化合物(2.14g,43％)。ES/MS(m/e):232(M+1)。

制备例36

6a-(4-吡啶基)-1,3,3a,4,5,6-六氢吡咯并[3,4-c]异唑

向1-[(4-甲氧基苯基)甲基]-6a-(4-吡啶基)-3,3a,4,6-四氢吡咯并[3,4-c]异唑-5-甲酸叔丁酯(1.3g,3.16mmol)的二氯甲烷(30mL)溶液中加入三氟乙酸(7mL,94.77mmol)。将形成的溶液在室温下搅拌1小时。将反应液浓缩并将形成的残余物保持在室温下过夜。然后将该残余物负载到离子交换柱上并将该柱首先用甲醇洗脱，然后用2M氨/甲醇溶液洗脱。将所需的碱性级分收集并减压浓缩得到标题化合物(592mg,98％)。ES/MS(m/e):192(M+1)。

制备例37

6a-吡嗪-2-基-1,3,3a,4,5,6-六氢吡咯并[3,4-c]异唑

在室温下将三氟乙酸(40mL)加入到搅拌着的6a-吡嗪-2-基-3,3a,4,6-四氢-1H-吡咯并[3,4-c]异唑-5-甲酸叔丁酯(5.14g,17.58mmol)的二氯甲烷(200mL)溶液中。将混合物搅拌1小时并将溶剂减压蒸发。将形成的残余物溶于甲醇(100mL)并负载到离子交换柱(50g)上并将该柱首先用甲醇(110mL)洗脱，然后用7M氨/甲醇溶液(150mL)洗脱。将该碱性级分减压浓缩得到粗产物，将其进一步通过硅胶柱色谱纯化，用0-10％0.14M氨/甲醇的二氯甲烷溶液梯度洗脱得到标题化合物(2.4g,71％)。ES/MS(m/e):193(M+1)。

以下化合物基本上通过制备例37的方法制备。

表7

^a反应时间是2小时并通过离子交换柱纯化，首先用甲醇洗脱，然后用2M氨/甲醇溶液洗脱。

制备例39

6a-(3-吡啶基)-1,3,3a,4,5,6-六氢吡咯并[3,4-c]异唑

将5-烯丙基-6a-(3-吡啶基)-3,3a,4,6-四氢-1H-吡咯并[3,4-c]异唑(2.14g,7.40mmol)和N,N-二甲基巴比妥酸(6.93g,44.41mmol)溶于氯仿(80mL)并将形成的溶液用液氮脱气两次。加入四(三苯基膦)钯(1.28g,1.11mmol)并将混合物在室温下搅拌2小时。将反应液减压浓缩。将形成的残余物溶于二甲基亚砜/甲醇的1:1混合物(40ml)并将溶液负载到离子交换柱上。将该物质用甲醇(70mL)洗脱，然后用7M氨/甲醇溶液(70mL)洗脱。将碱性级分收集并减压浓缩。将产物进一步通过硅胶柱色谱纯化，用0-15％0.14M氨/甲醇的二氯甲烷溶液梯度洗脱得到标题化合物(1.28g,86％)。ES/MS(m/e):192(M+1)。

制备例40

5-(5-氟-4-甲氧基-6-甲基-嘧啶-2-基)-6a-吡嗪-2-基-3,3a,4,6-四氢-1H-吡咯并[3,4-c]异唑

向搅拌着的6a-吡嗪-2-基-1,3,3a,4,5,6-六氢吡咯并[3,4-c]异唑(1.4g,7.28mmol)的1,4-二恶烷(30mL)溶液中加入2-氯-5-氟-4-甲氧基-6-甲基-嘧啶(5.14g,29.13mmol)和二异丙基乙基胺(5.7mL,32.77mmol)。将形成的溶液在110℃下加热4小时。将反应液冷却并减压浓缩。将形成的残余物通过硅胶柱色谱纯化，用0-5％0.14M氨/甲醇的二氯甲烷溶液梯度洗脱得到标题化合物(0.93g,38％)。ES/MS(m/e):333(M+1)。

以下化合物基本上通过制备例40的方法利用适当的嘧啶制备，加热时间从4小时至4.5小时，温度范围为100-110℃。

表8

^a通过硅胶柱色谱纯化，用0-12％2M氨/甲醇的二氯甲烷溶液梯度洗脱。

^b纯化通过离子交换色谱进行，首先用甲醇洗脱，然后用2M氨/甲醇洗脱得到标题化合物。

制备例45

1-[(4-甲氧基苯基)甲基]-6a-(3-吡啶基)-3a,4,5,6-四氢-3H-吡咯并[3,4-c]异唑

向搅拌着的1-[(4-甲氧基苯基)甲基]-6a-(3-吡啶基)-3,3a,4,6-四氢吡咯并[3,4-c]异唑-5-甲酸叔丁酯(2.9g,7.05mmol)的二氯甲烷(80mL)溶液中加入三氟乙酸(16mL)。将反应混合物在室温下搅拌1小时30分钟。浓缩溶剂并将残余物在饱和碳酸氢钠水溶液(30mL)和二氯甲烷(100mL)之间进行分配。将形成的溶液搅拌30分钟，然后分相。将水相用二氯甲烷反萃取。将合并的二氯甲烷萃取液用硫酸镁干燥，过滤并真空浓缩得到残余物。将残余物通过硅胶色谱纯化，用0-10％0.14M氨/甲醇的二氯甲烷溶液梯度洗脱得到标题化合物(1.33g,43％)。ES/MS(m/e):312(M+1)。

以下化合物基本上通过制备例45的方法制备。

表9

^a未进行水性后处理，将反应液减压浓缩并通过离子交换色谱纯化，用甲醇洗脱，然后用2M氨/甲醇溶液洗脱。

^b未进行水性后处理，将反应液减压浓缩并通过离子交换色谱纯化，用甲醇洗脱，然后用2M氨/甲醇溶液洗脱得到产物，将其进一步通过硅胶柱色谱纯化，用0-10％0.14M氨/甲醇的二氯甲烷溶液梯度洗脱。

制备例48

5-(5-氟嘧啶-2-基)-1-[(4-甲氧基苯基)甲基]-6a-(3-吡啶基)-3,3a,4,6-四氢吡咯并[3,4-c]异唑

向搅拌着的1-[(4-甲氧基苯基)甲基]-6a-(3-吡啶基)-3a,4,5,6-四氢-3H-吡咯并[3,4-c]异唑(1.33g,4.27mmol)的1,4-二恶烷(30mL)溶液中加入2-氯-5-氟-嘧啶(2.55g,19.22mmol)和二异丙基乙基胺(3.72mL,21.36mmol)。将形成的溶液在110℃下加热3小时。将反应液冷却并真空蒸发溶剂得到残余物。将残余物通过硅胶色谱纯化，用0-5％0.14M氨/甲醇的二氯甲烷溶液梯度洗脱得到标题化合物(1.11g,54％)。ES/MS(m/e):408(M+1)。

以下化合物基本上通过制备例48的方法制备。

表10

^a反应在2小时内在110℃下完成并且纯化通过硅胶色谱进行，用0至8％2M氨/甲醇的二氯甲烷溶液梯度洗脱。

制备例51

5-(5-氟嘧啶-2-基)-6a-(3-吡啶基)-3,3a,4,6-四氢-1H-吡咯并[3,4-c]异唑,

将5-(5-氟嘧啶-2-基)-1-[(4-甲氧基苯基)甲基]-6a-(3-吡啶基)-3,3a,4,6-四氢吡咯并[3,4-c]异唑(1.11g,2.32mmol)的三氟乙酸(9.3mL)溶液在60℃下搅拌1小时。蒸发溶剂并将形成的残余物在二氯甲烷(100mL)和饱和碳酸钠水溶液(25mL)之间进行分配。将有机相分离并将水相用二氯甲烷(100mL)反萃取。将合并的有机萃取液用硫酸镁干燥，过滤并真空蒸发溶剂得到残余物，将其通过硅胶色谱纯化，用0-10％0.14M氨/甲醇的二氯甲烷溶液梯度洗脱得到标题化合物(0.64g,96％)。ES/MS(m/e):288(M+1)。

以下化合物基本上通过制备例51的方法制备。

表11

^a通过离子交换色谱纯化，用四氢呋喃洗脱，然后用7M氨/甲醇/四氢呋喃溶液洗脱得到标题化合物。

^b通过离子交换色谱纯化，用甲醇洗脱，然后用2M氨/甲醇溶液洗脱得到产物，将其进一步通过硅胶柱色谱纯化，用0-10％0.14M氨/甲醇的二氯甲烷溶液梯度洗脱。

制备例54

N-[5-(5-氟嘧啶-2-基)-6a-(3-吡啶基)-3,3a,4,6-四氢吡咯并[3,4-c]异唑-1-硫代羰基]苯甲酰胺

在0℃下将异硫氰酸苯甲酰基酯(511μL 3.79mmol)滴加到搅拌着的5-(5-氟嘧啶-2-基)-6a-(3-吡啶基)-3,3a,4,6-四氢-1H-吡咯并[3,4-c]异唑(640mg,2.23mmol)的四氢呋喃(20mL)溶液中。将形成的混合物在0℃下搅拌1小时并在1小时内升温至室温。真空蒸发溶剂并将形成的残余物通过硅胶色谱纯化，用0-5％0.14M氨/甲醇的二氯甲烷溶液梯度洗脱得到标题化合物(1.1g,定量)。ES/MS(m/e):451(M+1)。

制备例55

N-[6-(5-氟嘧啶-2-基)-7a-(3-吡啶基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺

将N-[5-(5-氟嘧啶-2-基)-6a-(3-吡啶基)-3,3a,4,6-四氢吡咯并[3,4-c]异唑-1-硫代羰基]苯甲酰胺(550mg,1.22mmol)和锌粉(798.33mg,12.21mmol)的乙酸(5mL)混合物在室温下超声处理2小时。将混合物用乙酸乙酯(100mL)和饱和碳酸氢钠水溶液(30mL)萃取。将水相用二氯甲烷反萃取三次(100mL)。将合并的有机萃取液用硫酸镁干燥，过滤并浓缩得到残余物。将残余物通过硅胶色谱纯化，用0-10％0.14M氨/甲醇的二氯甲烷溶液梯度洗脱得到中间体N-[[1-(5-氟嘧啶-2-基)-4-(羟基甲基)-3-(3-吡啶基)吡咯烷-3-基]硫代氨基甲酰基]苯甲酰胺(145mg)。将其溶于二氯甲烷(6mL)并冷却至0℃。然后加入1-氯-N,N,2-三甲基丙烯基胺(0.05g,374.19μmol)并将混合物在0℃下搅拌1小时。加入饱和碳酸氢钠水溶液(10mL)和二氯甲烷(100mL)。分相并将有机相用硫酸镁干燥，过滤并浓缩。将残余物通过硅胶色谱纯化，用0-5％0.14M氨/甲醇的二氯甲烷溶液梯度洗脱得到标题产物(110mg,17％)。ES/MS(m/e):435(M+1)。

制备例56

[4-氨基-1-(5-氟-4-甲氧基-6-甲基-嘧啶-2-基)-4-吡嗪-2-基-吡咯烷-3-基]甲醇

将5-(5-氟-4-甲氧基-6-甲基-嘧啶-2-基)-6a-吡嗪-2-基-3,3a,4,6-四氢-1H-吡咯并[3,4-c]异唑(0.92g,2.77mmol)的乙醇(40mL)溶液在50psi下在阮内镍(水浆液的形式)(2.7g,45.54mmol)的存在下用PARR加氢器氢化5小时。加入甲醇并通过硅藻土垫过滤除去催化剂。将硅藻土垫用甲醇洗涤。将合并的滤液减压浓缩得到标题化合物(0.92g,99％)。ES/MS(m/e):335(M+1)。

以下化合物基本上通过制备例56的方法制备，反应时间从5小时至3天，利用PARR加氢器或流动加氢器(flow hydrogenator)。

表12

制备例65

N-[[1-(5-氟-4-甲氧基-6-甲基-嘧啶-2-基)-4-(羟基甲基)-3-吡嗪-2-基-吡咯烷-3-基]硫代氨基甲酰基]苯甲酰胺

向搅拌着的[4-氨基-1-(5-氟-4-甲氧基-6-甲基-嘧啶-2-基)-4-吡嗪-2-基-吡咯烷-3-基]甲醇(930mg,2.78mmol)的四氢呋喃(29mL)溶液中在氮气氛下加入异硫氰酸苯甲酰基酯(613μL,4.45mmol)。将反应液在室温下搅拌1小时，然后减压除去溶剂。将形成的残余物通过硅胶柱色谱纯化，用0-5％0.14M氨/甲醇的二氯甲烷溶液梯度洗脱得到标题化合物(1.32g,95％)。ES/MS(m/e):498(M+1)。

以下化合物基本上通过制备例65的方法制备。

表13

^a纯化条件:硅胶柱，用0-10％0.14M氨/甲醇的二氯甲烷溶液梯度洗脱。

^b纯化条件:硅胶柱，用0-15％2M氨/甲醇的二氯甲烷溶液梯度洗脱。

^c反应在室温下进行一个周末。将产物通过硅胶柱色谱纯化，用0-40％丙酮的二氯甲烷溶液梯度洗脱。

^d反应在室温下进行1小时20分钟。将产物通过硅胶柱色谱纯化，用0-10％0.14M氨/甲醇的二氯甲烷溶液梯度洗脱。

^e反应在0℃下进行1小时，用乙酸乙酯稀释并用盐水溶液洗涤。将有机层干燥并浓缩得到标题化合物。

制备例74

外消旋的N-[6-(5-氟嘧啶-2-基)-7a-(2-吡啶基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺

将4-氨基-1-(5-氟嘧啶-2-基)-4-(2-吡啶基)吡咯烷-3-基]甲醇(240mg,0.83mmol)溶于四氢呋喃(25mL)。将混合物在氮气下冷却至0℃并加入异硫氰酸苯甲酰基酯(120mg,0.74mmol)。将形成的混合物搅拌30分钟。加入三苯基膦(260mg,0.981mmol)，然后加入偶氮二甲酸二异丙酯(340mg,1.68mmol)并将反应液升温至室温。1小时后将反应液减压浓缩。将形成的残余物通过硅胶柱色谱纯化，用0-50％四氢呋喃的环己烷溶液梯度洗脱。将其进一步通过手性SFC(超临界流体色谱)(柱:Princeton DNP(二硝基苯基)(5μ),21.2×250mm；洗脱剂:15-30％甲醇(0.2％二乙基甲基胺)的CO₂溶液梯度洗脱；流速:65mL/min，在UV 240nm下监测)纯化得到标题化合物(160mg,44％)。ES/MS(m/e):435(M+1)。

制备例75

外消旋的N-[6-(5-氟-4-甲氧基-6-甲基-嘧啶-2-基)-7a-吡嗪-2-基-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺

在室温下将1-氯-N,N,2-三甲基丙烯基胺(492μL,3.71mmol)加入到搅拌着的N-[[1-(5-氟-4-甲氧基-6-甲基-嘧啶-2-基)-4-(羟基甲基)-3-吡嗪-2-基-吡咯烷-3-基]硫代氨基甲酰基]苯甲酰胺(1.32g,2.65mmol)的二氯甲烷(30mL)溶液中。将反应混合物搅拌1小时30分钟。然后加入饱和碳酸氢钠水溶液(20mL)和二氯甲烷(70mL)。分层并将水层用二氯甲烷反萃取(70mL)。将合并的有机层用硫酸镁干燥并将溶剂减压蒸发。将形成的残余物溶于甲醇(40mL)并负载到离子交换柱上。将该柱用甲醇(60mL)洗脱，然后用7M氨/甲醇溶液(100mL)洗脱。将碱性溶剂级分收集并减压蒸发。将分离出的残余物进一步通过硅胶柱色谱纯化，用0-5％0.14M氨/甲醇的二氯甲烷溶液梯度洗脱得到标题化合物(820mg,64％)。ES/MS(m/e):480(M+1)。

以下化合物基本上通过制备例75的方法制备。

表14

^a未使用离子交换纯化。纯化由硅胶柱色谱组成，用30％乙酸乙酯的异己烷溶液恒溶剂洗脱，然后梯度升高至80％乙酸乙酯的异己烷溶液得到标题化合物。

^b反应在0℃下进行1小时，然后在室温下进行16小时。通过硅胶柱色谱纯化，用0至5％2M氨/甲醇的氯仿溶液梯度洗脱得到标题化合物。

制备例81

外消旋的2-苯甲酰基氨基-7a-吡嗪-2-基-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸叔丁酯

在室温下将1-氯-N,N,2-三甲基丙烯基胺(409.71μL,3.10mmol)加入到搅拌着的3-(苯甲酰基硫代氨基甲酰基氨基)-4-(羟基甲基)-3-吡嗪-2-基-吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(1.09g,2.38mmol)的二氯甲烷(30mL)溶液中。将反应液在室温下搅拌3小时，然后加入饱和碳酸钠水溶液(15mL)并将混合物搅拌5分钟。加入二氯甲烷(80mL)并分层。将水层用二氯甲烷反萃取(70mL)。将合并的有机层用硫酸镁干燥并减压浓缩。将分离出的产物溶于甲醇(60mL)并通过离子交换柱色谱纯化，用甲醇(60mL)洗脱，然后用7M氨/甲醇溶液(120mL)洗脱。将碱性级分收集并将形成的产物进一步通过硅胶柱色谱纯化，用0-5％0.14M氨/甲醇的二氯甲烷溶液梯度洗脱得到标题产物(747mg,71％)。ES/MS(m/e)440(M+1)。

以下化合物基本上通过制备例81的方法制备。

表15

^a反应时间是18小时并将产物通过硅胶柱色谱纯化，用0-12％丙酮的二氯甲烷溶液梯度洗脱得到标题化合物。

^b将产物通过硅胶柱色谱纯化，用0-5％0.14M氨/甲醇的二氯甲烷溶液梯度洗脱得到标题化合物。

制备例84

(4aR,7aR)-2-苯甲酰基氨基-7a-吡嗪-2-基-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸叔丁酯

将外消旋的2-苯甲酰基氨基-7a-吡嗪-2-基-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸叔丁酯通过手性SFC(超临界流体色谱)(柱:Chiralpak AD-H(5μ),30X 250mm；洗脱剂:50％异丙醇(0.2％二乙基甲基胺)的CO₂溶液；流速:120mL/min，UV 260nm)分离成其组成成分对映体。首先洗脱出的异构体是标题化合物。

制备例85

(4aR,7aR)-2-苯甲酰基氨基-7a-(5-氟-2-吡啶基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸叔丁酯

将外消旋的2-苯甲酰基氨基-7a-(5-氟-2-吡啶基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸叔丁酯通过手性SFC(柱:Chiralpak AD-H(5μ),30X 250mm；洗脱剂:40％甲醇(0.％二乙基甲基胺)的CO₂溶液；流速:120mL/min，UV 260nm)分离成其组成成分对映体。第二洗脱出的异构体是标题化合物。

制备例86

(4aR,7aS)-2-苯甲酰基氨基-7a-(3-吡啶基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸叔丁酯

将外消旋的2-苯甲酰基氨基-7a-(3-吡啶基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸叔丁酯通过手性SFC(柱:Chiralpak AD-H(5μ),30X 250mm；洗脱剂:35％异丙醇(0.2％二乙基甲基胺)的CO₂溶液；流速:130mL/min，UV 260nm)分离成其组成成分对映体。首先洗脱出的异构体是标题化合物。

制备例87

N-[(4aR,7aR)-7a-吡嗪-2-基-4a,5,6,7-四氢-4H-吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺

在室温下将三氟乙酸(1.5mL)加入到搅拌着的(4aR,7aR)-2-苯甲酰基氨基-7a-吡嗪-2-基-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸叔丁酯(299mg,0.680mmol)的二氯甲烷(6mL)溶液中。将反应液在室温下搅拌80分钟并将溶剂减压蒸发。将形成的残余物溶于甲醇(20mL)并将该溶液负载到离子交换柱上，用甲醇洗脱，然后用7M氨/甲醇溶液洗脱。将碱性级分收集并减压浓缩得到标题化合物(231mg,定量)。ES/MS(m/e):340(M+1)。

以下化合物基本上通过制备例87的方法制备。

表16

制备例90

N-[(4aR,7aR)-6-[5-氟-4-(1-羟基-1-甲基-乙基)嘧啶-2-基]-7a-吡嗪-2-基-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺

将N-[(4aR,7aR)-7a-吡嗪-2-基-4a,5,6,7-四氢-4H-吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺(231mg,0.680mmol)溶于1,4-二恶烷(4mL)。加入2-(2-氯-5-氟-嘧啶-4-基)丙-2-醇(648.60mg,3.40mmol)和二异丙基乙基胺(653μL,3.74mmol)。将反应液在110℃下加热6小时，然后冷却至室温并减压浓缩。将形成的残余物通过硅胶柱色谱纯化，用0-5％0.14M氨/甲醇的二氯甲烷溶液梯度洗脱得到标题化合物(330mg,98％)。ES/MS(m/e):494(M+1)。

以下化合物基本上通过制备例90的方法制备。

表17

^a将反应液加热8小时。

^b将反应液加热1小时30分钟。将产物通过硅胶柱色谱纯化，用0-20％甲醇的二氯甲烷溶液梯度洗脱。

^c将反应液加热过夜。将产物通过硅胶柱色谱纯化，用0-20％甲醇的二氯甲烷溶液梯度洗脱。

^d将反应液在110℃下加热23小时。将其通过硅胶柱色谱纯化，用0-20％甲醇的二氯甲烷溶液梯度洗脱。

^e将反应液在110℃下加热过夜。将其通过硅胶柱色谱纯化，用0-10％甲醇的二氯甲烷溶液梯度洗脱。

实施例A

2-[2-[(4aR,7aR)-2-氨基-7a-吡嗪-2-基-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-基]-5-氟-嘧啶-4-基]丙-2-醇

将N-[(4aR,7aR)-6-[5-氟-4-(1-羟基-1-甲基-乙基)嘧啶-2-基]-7a-吡嗪-2-基-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺(330mg,0.668mmol)在搅拌下溶于甲醇(8mL)。加入氢氧化锂(42.51mg,1mmol)并将反应液在60℃下加热5小时30分钟。将反应液冷却至室温并负载到硅胶柱上。将该柱用0-5％0.14M氨/甲醇的二氯甲烷溶液梯度洗脱。将得到的产物进一步通过制备型HPLC纯化，用10％B至100％B经过9分钟以60mL/分钟梯度洗脱(柱＝Phenomenex Gemini NX C18,30×100mm,5μm。流动相A:含10mM碳酸氢铵的水，将pH用氨调节至pH 10。流动相B:乙腈)得到标题化合物(146mg,56％)。ES/MS(m/e):390(M+1)。

以下化合物基本上通过实施例A的方法制备。

表18

^a纯化通过制备型LCMS进行，用10％B至100％B的梯度以45mL/分钟洗脱(柱＝X-Bridge C18,30×100mm,5μ。流动相A:含10mM碳酸氢铵的水，将pH用氨调节至pH 10。流动相B:50/50甲醇/乙腈)。

^b通过硅胶柱色谱纯化，用0-20％2M NH₃甲醇溶液的二氯甲烷溶液梯度洗脱

实施例J

外消旋的6-(5-氟嘧啶-2-基)-7a-(3-吡啶基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺

向搅拌着的N-[6-(5-氟嘧啶-2-基)-7a-(3-吡啶基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺(110mg,0.210mmol)的乙醇(10mL)溶液中加入吡啶(187μL,2.31mmol)和O-甲基羟基胺盐酸盐(143mg,1.68mmol)。将混合物在70℃下搅拌加热17小时。减压除去溶剂。将残余物通过硅胶色谱纯化，用0-10％0.14M氨/甲醇的二氯甲烷溶液梯度洗脱得到标题化合物(62mg,89％)。ES/MS(m/e):331(M+1)。

以下实施例基本上通过实施例J的方法制备，反应时间为2-18小时，温度范围为65-80℃。

表19

^a通过硅胶柱色谱纯化，用0至10％2M氨/甲醇的氯仿溶液梯度洗脱得到标题化合物。

实施例R

(4aR,7aR)-6-(5-氟-4-甲氧基-6-甲基-嘧啶-2-基)-7a-吡嗪-2-基-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺

将外消旋的6-(5-氟-4-甲氧基-6-甲基-嘧啶-2-基)-7a-吡嗪-2-基-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺(490mg,1.3mmol)通过手性SFC(柱:Chiralcel OD-H(5μ),21.2×250mm；洗脱剂:50％甲醇(0.2％二乙基甲基胺)的CO₂溶液；流速:70mL/min，UV 260nm)分离成其组成成分对映体。首先洗脱出的异构体是标题化合物(206mg,32％)。ES/MS(m/e):376(M+1)。

实施例1

(4aR,7aS)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-7a-(3-吡啶基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺

将外消旋的6-(5-氟嘧啶-2-基)-7a-(3-吡啶基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺(137mg,0.415mmol)通过手性SFC(柱:ChiralpakAD-H(5μ),21.2×250mm；洗脱剂:35％异丙醇(0.2％二乙基甲基胺)的CO₂溶液；流速:70mL/min，UV 260nm)分离成其组成成分对映体。第二洗脱出的异构体是标题化合物(19mg)。ES/MS(m/e):331(M+1)。

实施例2

(4aR,7aS)-6-(5-氟-4-异丙基-嘧啶-2-基)-7a-(3-吡啶基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺

将外消旋的6-(5-氟-4-异丙基-嘧啶-2-基)-7a-(3-吡啶基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺(210mg,0.564mmol)通过手性SFC(柱:Chiralcel OD-H(5μ),21.2×250mm；洗脱剂:25％甲醇(0.2％二乙基甲基胺)的CO₂溶液；流速:70mL/min，UV 260nm)分离成其组成成分对映体。将首先洗脱出的异构体进一步通过手性SFC(柱:Chiralcel OD-H(5μ),21.2×250mm；洗脱剂:15％甲醇(0.2％二乙基甲基胺)的CO₂溶液；流速:70mL/min，UV 260nm)纯化得到标题化合物(71mg)。ES/MS(m/e):373(M+1)。

实施例3

(4aR,7aR)-6-(5-氟-4-异丙基-嘧啶-2-基)-7a-吡嗪-2-基-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺,异构体1

将外消旋的6-(5-氟-4-异丙基-嘧啶-2-基)-7a-吡嗪-2-基-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺(127mg,0.340mmol)通过手性SFC(柱:Chiralcel OD-H(5μ),21.2×250mm；洗脱剂:50％乙醇(0.2％二乙基甲基胺)的CO₂溶液；流速:70mL/min，UV 260nm)分离成其组成成分对映体。首先洗脱出的异构体是标题化合物(54mg)。ES/MS(m/e):374(M+1)。

实施例4

(4aR,7aR)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-7a-(2-吡啶基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺

将外消旋的6-(5-氟嘧啶-2-基)-7a-(2-吡啶基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺(82mg)通过手性SFC(柱:Chiralpak IC(5μ),30×250mm；洗脱剂:55％异丙醇(0.4％二乙基甲基胺)的CO₂溶液；流速:70mL/min，UV 240nm)分离成其组成成分对映体。首先洗脱出的异构体是标题化合物(37.7mg)。ES/MS(m/e):331(M+1)。

实施例5

(4aR,7aR)-7a-(5-氟-2-吡啶基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺,异构体-2

将外消旋的7a-(5-氟-2-吡啶基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺(60mg,0.172mmol)通过手性SFC(柱:ChiralpakAD-H(5μ),21.2×250mm；洗脱剂:40％乙醇(0.2％二乙基甲基胺)的CO₂溶液；流速:70mL/min，UV 260nm)分离成其组成成分对映体。第二洗脱出的异构体是标题化合物(23.8mg)。ES/MS(m/e):349(M+1)。

实施例6

(4aR,7aS)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-7a-(4-吡啶基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺,异构体-2

将外消旋的6-(5-氟嘧啶-2-基)-7a-(4-吡啶基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺(185mg,0.56mmol)通过手性SFC(柱:ChiralcelOJ-H(5μ),21.2×250mm；洗脱剂:25％乙醇(0.2％二乙基甲基胺)的CO₂溶液；流速:70mL/min，UV 260nm)分离成其组成成分对映体。第二洗脱出的异构体是标题化合物(40mg)。ES/MS(m/e):331(M+1)。

实施例7

(4aR,7aR)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-7a-吡嗪-2-基-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺,异构体1

将外消旋的6-(5-氟嘧啶-2-基)-7a-吡嗪-2-基-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺(520mg,1.57mmol)通过手性SFC(柱:ChiralcelOD-H(5μ),21.2×250mm；洗脱剂:45％甲醇(0.2％二乙基甲基胺)的CO₂溶液；流速:70mL/min，UV 260nm)分离成其组成成分对映体。首先洗脱出的异构体是标题化合物(230mg)。ES/MS(m/e):332(M+1)。

实施例8

2-[2-[(4aR,7aR)-2-氨基-7a-吡嗪-2-基-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-基]-5-氟-嘧啶-4-基]丙-2-醇盐酸盐

将2-[2-[(4aR,7aR)-2-氨基-7a-吡嗪-2-基-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-基]-5-氟-嘧啶-4-基]丙-2-醇(120mg,0.308mmol)溶于0.1M HCl(3.1mL)和乙腈(1mL)。将形成的溶液冷冻干燥得到标题化合物，为白色固体。ES/MS(m/e):390(M+1)。

以下化合物基本上通过实施例8的方法制备。

表20

体外试验方法:

对于体外酶和细胞试验，将待测化合物在DMSO中制备成10mM储备液。将该储备液在DMSO中系列稀释得到10个点的稀释曲线，在96-孔圆底板中进行体外酶和完整细胞试验前，最终化合物的浓度是10mM至1nM。

重组的人BACE1的制备

通过室温-PCR从全脑cDNA克隆人BACE1(保藏号:AF190725)。将对应于氨基酸序列#1至460的核苷酸序列插入编码人IgG₁(Fc)多肽的cDNA(Vassar等人1999)。将该BACE1(1-460)和人Fc的融合蛋白(命名为huBACE1:Fc)构建到pJB02载体中。将人BACE1(1-460):Fc(huBACE1:Fc)在HEK293细胞中瞬时表达。将每个构建体的250μg cDNA与Fugene 6混合并加入到1升HEK293细胞中。转染4天后，收获条件培养液用于纯化。将huBACE1:Fc通过Protein A色谱纯化。将酶以小等分样保存在–80℃下。

体外蛋白酶抑制试验:

BACE1 FRET试验

如上所述制备待测化合物的系列稀释液。将化合物在KH₂PO₄缓冲液中进一步稀释20倍。将10μL各稀释液加入到相应的含有反应混合物(25μL50mM KH₂PO₄,pH 4.6,1mMX-100,1mg/mL牛血清白蛋白和15μM FRET底物)的低蛋白结合黑色板的A至H行上的每个孔中(参见Yang等人,J.Neurochemistry,91(6)1249-59(2004))。将内含物在板振荡器上良好混合10分钟。将15μL位于KH₂PO₄缓冲液中的200pM人BACE1(1-460):Fc(See Vasser等人,Science,286,735-741(1999))加入到含底物和待测化合物的板中以开始反应。在板振荡器上简短混合后，在激发波长355nm和发射波长460nm下记录混合物在0时刻的RFU。将反应板用铝箔覆盖并在黑色加湿的烘箱中在室温下保存16至24小时。在与0时刻所用的激发和发射设置相同的条件下记录保温结束时的RFU。0时刻和保温结束时的RFU差值反映了经化合物处理的BACE1的活性。绘制RFU的差值对抑制剂浓度的曲线，并将该曲线用四参数Logistic方程拟合得到IC₅₀值(参见Sinha等人,Nature,402,537-540(2000))。

将本文实施例1-17的化合物基本如上所述进行试验，它们对BACE1表现出小于约1μM的IC₅₀值。将以下列举的化合物基本如上所述进行试验，它们对BACE1表现出以下活性:

表21

实施例#	BACE1 IC₅₀(nM)
		8	105(±28.0,n＝5)
12	73.4(±13.8,n＝6)
		15	93.5(±22.7,n＝4)

平均值±SEM；SEM＝平均值的标准误差

这些代表性的数据表明表21的化合物在体外有效地抑制纯化的重组BACE1酶活性。

用于测定对β-分泌酶活性的抑制作用的完整细胞试验

HEK293Swe完整细胞试验

用于测定对β-分泌酶活性的抑制作用的常规完整细胞试验利用稳定表达人APP751cDNA的人胚肾细胞系HEK293p(ATCC保藏号CRL-1573)进行，所述人APP751cDNA含有从Lys651Met652到Asn651Leu652的天然双突变，其通常被称为瑞典型突变(著名的HEK293/APP751sw)并显示出可过度产生Aβ(Citron等人,Nature,360,672-674(1992))。体外Aβ降低试验已有文献记载(参见Dovey等人,Journal of Neurochemistry,76,173-181(2001)；Seubert等人,Nature,361,260(1993)；和Johnson-Wood等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94,1550-1555(1997))。

将细胞(HEK293/APP751sw，3.5x10⁴细胞/孔，含有200μL培养液，含10％FBS的DMEM)在37℃下、在存在/不存在所需浓度的抑制剂(在DMSO中稀释)的条件下孵育4至24小时。在孵育结束时，通过例如对Aβ肽的分析对条件培养液进行分析以证明β-分泌酶活性。通过夹层ELISA测定总的Aβ肽(Aβ1-x)，用单克隆的266作为捕获抗体并用生物素化的3D6作为报告抗体。或者，还可通过夹层ELISA测定Aβ1-40和Aβ1-42肽，利用单克隆2G3作为Aβ1-40的捕获抗体，利用单克隆21F12作为Aβ1-42的捕获抗体。Aβ1-40和Aβ1-42ELISA均利用生物素化的3D6作为报告抗体。在化合物处理后，在条件培养液中释放的Aβ浓度对应于BACE1在该条件下的活性。绘制10个点的抑制曲线并用四参数Logistic方程拟合得到Aβ-降低效应的IC₅₀值。以下列举的化合物基本如上所述进行试验并且对于Aβ降低效应表现出以下活性:

表22

这些数据表明表22的化合物在体外在细胞内抑制天然的内源性人BACE1。

PDAPP原代神经元试验

还在由PDAPP转基因小鼠胚胎产生的原代神经元培养物中进行了验证性完整细胞试验。原代皮层神经元从胚胎16天的PDAPP胚胎制备并在96孔板中培养(15x 10⁴细胞/孔，在DMEM/F12(1:1)加10％FBS中)。在体外2天后，将培养液用含有B27补充剂和2μM(终浓度)Ara-C(Sigma,C1768)的不含血清的DMEM/F12(1:1)代替。在体外的第5天，将神经元在37℃下、在存在/不存在所需浓度的抑制剂(用DMSO稀释)的条件下孵育24小时。在孵育结束时，通过例如对Aβ肽的分析对条件培养液进行分析以证明β-分泌酶活性。通过夹层ELISA测定总的Aβ肽(Aβ1-x)，用单克隆的266作为捕获抗体并用生物素化的3D6作为报告抗体。或者，还可通过夹层ELISA测定Aβ1-40和Aβ1-42肽，利用单克隆2G3作为Aβ1-40的捕获抗体，利用单克隆21F12作为Aβ1-42的捕获抗体。Aβ1-40和Aβ1-42ELISA均利用生物素化的3D6作为报告抗体。在化合物处理后，在条件培养液中释放的Aβ浓度对应于BACE1在该条件下的活性。绘制10个点的抑制曲线并用四参数Logistic方程拟合得到Aβ-降低效应的IC₅₀值。以下列举的化合物基本如上所述进行试验并且对于Aβ降低效应表现出以下活性:

表23

这些数据表明表23的化合物在体外在细胞内抑制天然的内源性鼠BACE1。

β-分泌酶的体内抑制

许多动物模型、包括小鼠、大鼠、豚鼠、狗和猴子均可用于筛选化合物处理后β-分泌酶活性的体内抑制。在本发明中所用的动物是如Games等人,Nature 373,523-527(1995)所述的转基因PDAPP小鼠，其可用于分析在抑制性化合物存在下Aβ产生的体内抑制。向两个月大的PDAPP小鼠施用在N-甲基吡咯烷酮的水溶液中配制的化合物。施用化合物3小时后，将动物杀死并取出脑部以分析Aβ片段(参见Dovey等人,Journal of Neurochemistry,76,173-181(2001)；和Johnson-Wood等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94,1550-1555(1997))。

为了标准的体内药理学研究，将动物用各种浓度的化合物给药并与在同一时间给药的用溶媒处理的对照组相比较。在试验期结束时，将动物杀死并将脑部组织通过特异性夹层ELISA试验分析Aβ肽的存在。本文所用的“Aβ1-x肽”是指从残基1开始并在大于残基28的C-末端结束的Aβ种类的总和。其检测了大多数的Aβ种类，通常称作“总Aβ”。

施用了抑制性化合物的动物(PDAPP或其它APP转基因或非转基因小鼠)可表现出与溶媒处理的对照或0时刻的对照相比，脑组织中Aβ降低。例如，将实施例8的化合物以10mg/kg或30mg/kg的口服剂量施用给年幼的雌性PDAPP小鼠3小时后，与溶媒处理的小鼠相比，Aβ1-x肽水平在脑海马体中分别显著降低约19％和46％，在大脑皮层中分别降低约23％和53％。在口服给药实施例8的化合物之后，总Aβ的显著的和剂量响应性降低与BACE(β-分泌酶)的体内抑制机理相一致。这些研究表明，本发明化合物抑制BACE，因此可用于降低Aβ水平。因此，本发明化合物是BACE的有效抑制剂。

Claims

1.下式化合物或其可药用盐:

其中A选自：

R¹是H或F；

R²是H、-OCH₃、C₁-C₃烷基、

R³是H、-CH₃或–OCH₃；并且

R⁴是H或F。

2.根据权利要求1所述的化合物或盐，其中A选自:

3.根据权利要求1或权利要求2所述的化合物或盐，其中A选自:

4.根据权利要求1-3中的任一项所述的化合物或盐，其中A是:

5.根据权利要求1至4中的任一项所述的化合物或盐，其中R²是

6.根据权利要求1至5中的任一项所述的化合物或盐，其中R¹是F。

7.根据权利要求1所述的化合物或盐，所述化合物是2-[2-[(4aR,7aR)-2-氨基-7a-吡嗪-2-基-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-基]-5-氟-嘧啶-4-基]丙-2-醇。

8.治疗患者的阿尔茨海默氏病的方法，该方法包括向需要所述治疗的患者施用有效量的权利要求1-7中的任一项所述的化合物或其可药用盐。

9.预防有出现阿尔茨海默氏病风险的患者的疾病进展的方法，该方法包括向需要所述治疗的患者施用有效量的权利要求1-7中的任一项所述的化合物或其可药用盐。

10.抑制患者的BACE的方法，该方法包括向需要所述治疗的患者施用有效量的权利要求1-7中的任一项所述的化合物或其可药用盐。

11.用于治疗的根据权利要求1-7中的任一项所述的化合物或其可药用盐。

12.用于治疗阿尔茨海默氏病的根据权利要求1-7中的任一项所述的化合物或其可药用盐。

13.药物组合物，其包含根据权利要求1-7中的任一项所述的化合物或其可药用盐和一种或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂。

14.根据权利要求13所述的药物组合物，其还包含一种或多种其它治疗剂。