CN104739914A - 一种金属络合分离纯化鼠曲草类黄酮的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及食品、保健品、化妆品及药品行业中的类黄酮分离纯化方法，特别是涉及一种鼠曲草类黄酮分离纯化方法。本发明采用金属盐溶液与鼠曲草类黄酮粗提液反应形成鼠曲草类黄酮金属络合物，后者再经乙二胺四乙酸的解离作用，将鼠曲草类黄酮从金属络合物中解离出来，从而实现鼠曲草类黄酮的分离纯化。该法具有易操作、分离效果好、成本低、周期短等优点，可突破制约类黄酮化合物产业化分离纯化的技术瓶颈。通过本工艺能为鼠曲草类黄酮的高效利用和相关功能性食品、药品等的开发提供理论参考，对于野生资源综合利用与开发，以及提高社会效益、生态效益都具有重要的现实意义。本工艺安全可靠，亦适用于其他各种黄酮类化合物的分离纯化。

Description

一种金属络合分离纯化鼠曲草类黄酮的方法

技术领域

本发明涉及食品、保健品、化妆品及药品行业中的类黄酮分离纯化方法，特别是涉及一种鼠曲草类黄酮分离纯化方法。

背景技术

鼠曲草是菊科植物鼠曲草的全草，其以野生为主，分布区域广泛，全国大部分地区如华东、中南、西南及河北、陕西、台湾等地均可生长，资源丰富。鼠曲草性味甘、平，具有消喉火，解热，去毒，调中益气，止泄，除痰，压时气，去热嗽等功效，可用于感冒咳嗽，支气管炎，哮喘，高血压，蚕豆病，风湿，腰腿痛等治疗；外用治跌打损伤，毒蛇咬。相关研究发现，鼠曲草富含黄酮类化合物、挥发油、生物碱、甾醇等生物活性成分，民间对其药理利用及食用历史悠久。

生物类黄酮（bioflavanoids），即维生素P，为植物次级代谢产物，其基本骨架为C₆-C₃-C₆，是多种具有类似结构和活性物质的总称，因多呈黄色而被称为生物类黄酮。类黄酮具有生物活性和药理作用，对一些常见病和多发病具有治疗或预防作用：例如抗菌性；抗氧化及清除自由基；调节脂质代谢；增强机体的非特异性免疫功能和体液免疫功能；降低血糖等。

近年来社会发展的不断进步，人们生活质量的提高，越来越多的人对健康与保健有了新的认识。类黄酮作为植物次级代谢产物，因其突出生理活性和药理作用，提取分离出较高纯度的类黄酮化合物对食品和医药工业至关重要。当前关于各种植物类黄酮的分离纯化工艺研究和报道常见，目前对植物类黄酮常见的分离纯化方法有柱层析法、膜分离法、大孔树脂吸附法、高效逆流色谱法、高效制备液相色谱法、分子印迹分离法等，这些方法普遍存在生产周期长、难操作、纯化成本高、难以实现产业化等缺点，因此，寻找一种快速、安全、可行的有效分离纯化植物类黄酮的方法是当今研究类黄酮的重要课题之一。

发明内容

本发明提供了一种金属络合分离纯化鼠曲类黄酮的方法，该法具有操作简便、分离效果好、成本低、周期短等优点。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明采用金属盐溶液与鼠曲草类黄酮粗提液反应形成鼠曲草类黄酮金属络合物，后者再经乙二胺四乙酸的解离作用，将鼠曲草类黄酮从金属络合物中解离出来，从而实现鼠曲草类黄酮的分离纯化。

所述鼠曲草类黄酮粗提液的制备方法为：以鼠曲草为原料，70-75%乙醇溶液为提取剂，采用超声波辅助提取鼠曲草类黄酮，得到的提取液经醇沉、抽滤、减压浓缩、干燥得鼠曲草类黄酮粗提物；粗提物用乙醇溶液溶解，得鼠曲草类黄酮粗提液。

本发明的方法包含以下步骤：鼠曲草类黄酮提取，减压浓缩，去除多糖和蛋白质，抽滤，减压浓缩，干燥，金属络合法分离纯化鼠曲草类黄酮。

所述鼠曲草类黄酮提取技术，使用超声波辅助乙醇提取法。

    所述减压浓缩，将鼠曲草类黄酮粗提液减压浓缩至原体积的5%左右。

所述去除多糖和蛋白质，采用醇沉法。

所述干燥方法，采用冷冻干燥技术。

所述分离纯化鼠曲草类黄酮的金属络合方法，步骤如下：以乙醇溶液为溶剂配制鼠曲草类黄酮样液、金属络合反应、解离反应、浓缩、溶解、过滤、再浓缩、冷冻干燥得到鼠曲草类黄酮粉末。

所述分离纯化工艺的具体步骤如下：

1）鼠曲草类黄酮的提取：称取干燥并过80-100目的鼠曲草粉末，按1:15--40的料液比加入70-75%乙醇溶液，先浸润30 - 60 min，然后置于超声波功率为100-500 W，提取温度为30-50 ℃的超声波设备中提取20 - 60 min，重复提取一次，合并提取液；

2）沉淀多糖、蛋白质：将提取液浓缩后用无水乙醇沉淀多糖和蛋白质，抽滤、减压浓缩、冷冻干燥得鼠曲草类黄酮粗提物；

3）分离纯化：将鼠曲草类黄酮粗提物用无水乙醇配制成鼠曲草类黄酮乙醇样液，调节其pH为7.0 - 11.0，并在搅拌条件下缓慢加入金属盐溶液进行络合反应，离心，收集沉淀物，分散于20%-50%乙醇溶液中，并在搅拌条件下加入乙二胺四乙酸，于60 ℃恒温水浴中反应至沉淀完全溶解，过滤，减压浓缩，再用无水乙醇溶解，过滤，浓缩，冷冻干燥得到黄色鼠曲草类黄酮粉末。

步骤3）所述鼠曲草类黄酮乙醇样液的浓度为0.5 - 5.0 mg /mL。

步骤3）中采用食品级的柠檬酸或碳酸钠调节鼠曲草类黄酮粗提液的pH为7.0 - 11.0。

步骤3）所述金属盐溶液为乙酸锌、乙酸钙、硫酸铜、硝酸铝或硫酸亚铁溶液，溶液浓度为5.0-15.0 mg /mL；络合反应时间为10-60 min。

    本发明提供的一种分离纯化鼠曲草类黄酮的方法，以鼠曲草为原料，采用超声波辅助提取法提取鼠曲草类黄酮，并利用类黄酮化合物能够与金属盐形成稳定的络合物的特点而实现与其它成分分离，后者再采用适当的解离剂如乙二胺四乙酸（EDTA）将鼠曲草类黄酮从金属络合物中解离出来实现纯化，其类黄酮纯度可达65-70%左右，该法具有操作简便、分离效果好、成本低、周期短等优点，可突破制约类黄酮化合物产业化分离纯化的技术瓶颈。通过本工艺能为鼠曲草类黄酮的高效利用和相关功能性食品、保健品、化妆品与药品等的开发提供理论参考，对促进野生资源的综合开发利用以及提高社会效益、生态效益都具有重要的现实意义。本工艺容易实施、操作方便、安全可靠，亦适用于其他各种黄酮类化合物的分离纯化。

具体实施方式

     以下为本发明的具体实例，进一步描述本发明，但是本发明不仅限于此。

实施例1

1）鼠曲草类黄酮提取：准确称取10 kg干燥过100目鼠曲草粉末，按1:35的料液比加入一定70%乙醇溶液作提取剂浸润30 min左右，置于超声波功率为250 W，提取温度为35 ℃的超声波设备中提取60 min，合并提取液；

2）减压浓缩：将提取液抽滤并旋转蒸发浓缩至原体积的5%左右；

3）去除多糖和蛋白质：按1：9比例加无水乙醇溶解静置12 h，沉淀多糖和蛋白质，抽滤，真空浓缩，冷冻干燥成鼠曲草类黄酮粗提物固体粉末。

4）分离纯化：称取鼠曲草类黄酮粗提物固体粉末1 kg，用无水乙醇配制成初始浓度为1.5 mg/ mL的鼠曲草类黄酮样液，用柠檬酸和碳酸钠调节样液pH至8.0，在搅拌条件下缓慢加入浓度为15.0 mg/ mL的乙酸锌溶液，络合反应10 min，于3500×g下 离心20 min ，收集沉淀，并以1:6的比例分散于50%的乙醇水溶液，然后加入1.5%的解离剂乙二胺四乙酸（EDTA），于60 ℃水浴锅中恒温搅拌至沉淀完全消失，冷却至室温，过滤，减压浓缩至干，再用15倍乙醇溶解，过滤，浓缩至原体积的5%，冷冻干燥得到纯度为70.20%的鼠曲草类黄酮粉末。

实施例2

1）鼠曲草类黄酮提取：准确称取5 kg干燥过100目鼠曲草粉末，按1:15的料液比加入一定75%乙醇溶液作提取剂浸润60 min左右，置于超声波功率为450 W，提取温度为45 ℃的超声波设备中提取45 min，合并提取液；

2）减压浓缩：将提取液抽滤并旋转蒸发浓缩至原体积的5%左右；

3）去除多糖和蛋白质：按1：4比例加无水乙醇溶解静置12 h，沉淀多糖和蛋白质，抽滤，真空浓缩，冷冻干燥成鼠曲草类黄酮粗提物固体粉末。

4）分离纯化：称取鼠曲草类黄酮粗提物固体粉末0.50 g，用无水乙醇配制成初始浓度为3.5 mg/ mL的鼠曲草类黄酮样液，用柠檬酸和碳酸钠调节样液pH至9.5，在搅拌条件下缓慢加入浓度为5.0 mg/ mL的乙酸锌溶液，络合反应30 min，于3500×g下 离心20 min ，收集沉淀，并以1:15的比例分散于20%的乙醇水溶液中，然后加入1.5%的解离剂乙二胺四乙酸（EDTA），于60 ℃水浴锅中恒温搅拌至沉淀完全消失，冷却至室温，过滤，减压浓缩至干，再用10倍乙醇溶解，过滤，浓缩至原体积的5%，冷冻干燥得到纯度为66.63%的鼠曲草类黄酮粉末。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (6)

1.一种金属络合分离纯化鼠曲草类黄酮的方法，其特征在于：所述方法采用金属盐溶液与鼠曲草类黄酮粗提液反应形成鼠曲草类黄酮金属络合物，后者再经乙二胺四乙酸的解离作用，将鼠曲草类黄酮从金属络合物中解离出来，从而实现鼠曲草类黄酮的分离纯化。

2.根据权利要求1所述的金属络合分离纯化鼠曲草类黄酮的方法，其特征在于：所述鼠曲草类黄酮粗提液的制备方法为：以鼠曲草为原料，70-75%乙醇溶液为提取剂，采用超声波辅助提取鼠曲草类黄酮，得到的提取液经醇沉、抽滤、减压浓缩、干燥得鼠曲草类黄酮粗提物；粗提物用乙醇溶液溶解，得鼠曲草类黄酮粗提液。

3.根据权利要求1所述的金属络合分离纯化鼠曲草类黄酮的方法，其特征在于：所述方法的具体步骤如下：

1）鼠曲草类黄酮的提取：称取干燥并过80-100目的鼠曲草粉末，按1:15--40的料液比加入70-75%乙醇溶液，先浸润30 - 60 min，然后置于超声波功率为100-500 W，提取温度为30-50 ℃的超声波设备中提取20 - 60 min，重复提取一次，合并提取液；

2）沉淀多糖、蛋白质：将提取液浓缩后用无水乙醇沉淀多糖和蛋白质，抽滤、减压浓缩、冷冻干燥得鼠曲草类黄酮粗提物；

3）分离纯化：将鼠曲草类黄酮粗提物用无水乙醇配制成鼠曲草类黄酮乙醇样液，调节其pH为7.0 - 11.0，并在搅拌条件下缓慢加入金属盐溶液进行络合反应，离心，收集沉淀物，分散于20%-50%乙醇溶液中，并在搅拌条件下加入乙二胺四乙酸，于60 ℃恒温水浴中反应至沉淀完全溶解，过滤，减压浓缩，再用无水乙醇溶解，过滤，浓缩，冷冻干燥得到黄色鼠曲草类黄酮粉末。

4.根据权利要求3所述金属络合分离纯化鼠曲草类黄酮的方法，其特征在于：步骤3）所述鼠曲草类黄酮乙醇样液的浓度为0.5 - 5.0 mg /mL。

5.根据权利要求3所述金属络合分离纯化鼠曲草类黄酮的方法，其特征在于：步骤3）中采用食品级的柠檬酸或碳酸钠调节鼠曲草类黄酮粗提液的pH为7.0 - 11.0。

6.根据权利要求3所述金属络合分离纯化鼠曲草类黄酮的方法，其特征在于：步骤3）所述金属盐溶液为乙酸锌、乙酸钙、硫酸铜、硝酸铝或硫酸亚铁溶液，溶液浓度为5.0-15.0 mg /mL；络合反应时间为10-60 min。