CN104704362A - 鉴定或评估有益活性物质的方法以及包含其的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鉴定或评估改善皮肤细胞的代谢的护肤活性物质的方法。所述方法包括使细胞与紧张性刺激和受试试剂接触，并基于与糖酵解和/或氧化磷酸化相关联的代谢指标的变化，测定所述细胞对所述紧张性刺激和受试试剂的响应。当氧化磷酸化和/或糖酵解响应对应于细胞代谢的改善时，所述受试试剂可被鉴定为护肤活性物质。

Description

鉴定或评估有益活性物质的方法以及包含其的组合物
技术领域
本发明一般来讲涉及鉴定或评估用于个人护理组合物中的有益活性成分的方法。更具体地，本发明涉及鉴定或评估抵抗氧化应激反应对皮肤细胞的效应的活性物质的方法。
背景技术
生命的根本性基础是生物体产生能量的需求和能力。在人类中，食物被摄入并转化为化合物诸如三磷酸腺苷(“ATP”)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(“NAD”)，它们存储被身体的细胞用于进行维持生命的生物学过程的能量。将食物的有用组分(例如，碳水化合物、脂肪和蛋白质)转化为可用的能量的细胞代谢途径是复杂的，并且可以尚未被全面地理解的方式被多种因素影响。哺乳动物的皮肤细胞也不例外。皮肤细胞已知包括以动态的、复杂的关系共同起作用，以维持皮肤的健康状态的多种不同类型的细胞。例如，角质细胞增殖和分化，以提供皮肤的连续代谢周转。已知黑素细胞提供用于皮肤色素沉积的黑素合成。而成纤维细胞已知合成细胞外基质和胶原，其帮助维持皮肤的厚度和弹性。相似地，存在于皮肤或其他身体器官内或周围的其他细胞，诸如肌细胞、干细胞、皮脂腺细胞、神经细胞、和脂肪细胞，均需要来源于能够被多种不同因素不利地影响的复杂代谢途径的能量。
各种紧张性刺激对细胞的生物能量学的影响和对细胞老化、以及其他疾病(例如，癌症、神经退行性疾病、糖尿病、和心血管疾病)的影响的了解越来越多。代谢的改变在疾病状态中的一些这些效应背后的一种理论是老化的自由基理论。即，哺乳动物细胞暴露于反应性氧物质(“ROS”)导致细胞结构和细胞器(诸如线粒体)的损伤。ROS是包含氧的高度反应性的分子(例如，氧离子和过氧化物)。ROS作为氧的正常代谢的天然副产物在细胞内形成，并在细胞信号转导和体内平衡中发挥作用。然而，当细胞暴露于紧张性刺激(诸如热或紫外线辐射)时，ROS水平能够升高，并且在一些情况下显著地升高。
由于ROS导致的损伤随着时间积累，其在细胞水平导致越来越多的氧化应激反应，这最终可导致组织的损伤和/或器官功能障碍。氧化应激反应对细胞的一种效应是细胞的生物能量学能力的减弱，这能够导致降低的ATP和/或NAD水平。这对于人类皮肤而言可能是尤其成问题的，因为在人类皮肤细胞上的氧化应激反应可显示为老化的可见信号。另外，诸如紫外线辐射(“UV”)和污染物(例如，香烟烟雾、汽车尾气、臭氧)的环境紧张性刺激能够导致ROS产生水平的升高。随时间推移，这可导致皮肤的结构和形态的显著变化(例如，“光损伤”)，并且在更加极端的程度，导致皮肤癌。
人类皮肤细胞通过利用诸如谷胱甘肽和NAD的氧化还原调节剂以及能够中和ROS的各种酶来抵御ROS。然而，这些防御能够被紧张性刺激诱导的ROS的高峰击败，导致能量稳态和代谢效率的急性的以及慢性的改变，总体上导致细胞的功能障碍。使情况复杂的是，与人类皮肤相关联的细胞类型的多样性和这些细胞的代谢途径的复杂性，使得难以鉴定适合的化合物来帮助抵抗与暴露于特定的氧化紧张性刺激或紧张性刺激的组合相关联的抗衰老效应。某些氧化紧张性刺激不同地影响不同类型的细胞和/或代谢途径。这使得难以选择抵抗特定的一种或多种紧张性刺激的不期望效应的合适的护肤活性物质或活性物质的组合(其效应也可根据细胞或代谢途径的类型而变化)。由于至少一些消费者希望得到抵抗与氧化应激反应相关联的不期望的老化效应的护肤组合物，因此存在对鉴定合适的护肤化合物的方法的需求，所述护肤化合物能够被用于制备护肤组合物，以帮助减少、防止和/或逆转与各种紧张性刺激(尤其是通常的环境紧张性刺激)相关联的不期望的氧化应激反应。
作为发现抵抗氧化应激反应的代谢效应的合适的护肤活性物质的初始步骤，必须找到能够检测由紧张性刺激和活性物质导致的细胞代谢变化的方法。用于评估细胞的产能过程的多种方法是已知的。例如，Clark型电极探针用于测量氧气消耗是已知的。Clark电极提供动力学信息(即，响应的速率)，但其连续的氧气消耗引入了伪迹(即，影响测试结果的一些不期望的和/或外部的因子)，呈现了测量腔室中对细胞或分离的线粒体的氧气压力的降低。尽管氧气消耗可提供线粒体功能的指示，其仅测量了细胞的生物能学的一部分，并且没有提供对有助于生物能学平衡的其他代谢途径(即糖酵解)的评估。
用于评估细胞的产能的另一个常规方法是通过测量细胞中ATP的量。用于对总的能量代谢定量的发光ATP检测试剂盒是可商购获得的。ATP测定已知是相对灵敏的，但它们可能不是线粒体功能的理想度量，因为细胞尽力维持特定的ATP预算并将相应地调整代谢。因此，ATP水平的改变通常仅在病理生理改变期间可检测。此外，ATP测定是破坏性的(即，为了测量ATP的量，细胞被破坏)并且它们缺少动力学信息。另外，来自垂死或死亡细胞中存在的残余ATP的伪迹已被报道。并且类似Clark电极测定，ATP不能确定不同的代谢途径对总的ATP产量的相对贡献。
另一种用于评估细胞能量学的常规方法是使用可商购获得的MTT/XTT或alamarBlueTM试剂盒。虽然这些试剂盒可提供评估细胞健康状态的相对简单的方式，但它们不像ATP测定那样灵敏。此外，它们还被报道通过细胞毒性引入误差，而这正好是它们预期要测量的参数。另外，两种测定均为破坏性的，并且不提供动力学信息。
因此，希望提供鉴定和/或评估减少、防止和/或逆转在特定类型的皮肤细胞上与特定紧张性刺激相关联的不期望的氧化应激反应的活性物质的方法。也希望提供包括通过上述方法鉴定的护肤活性物质的护肤组合物。还希望提供处理被来自特定紧张性刺激的在特定类型的皮肤细胞上的氧化应激反应损伤的皮肤的方法。
附图说明
图1A、1B和1C示出了角质细胞的氧气消耗速率。
图2示出了角质细胞的氧气消耗速率。
图3A、3B和3C示出了角质细胞的细胞外酸化速率。
图4示出了角质细胞的细胞外酸化速率。
图5A、5B、5C、5D和5E示出了成纤维细胞的氧气消耗速率。
图6示出了成纤维细胞的氧气消耗速率。
图7A、7B、7C、7D和7E示出了成纤维细胞的细胞外酸化速率。
图8示出了成纤维细胞的细胞外酸化速率。
图9示出了成纤维细胞的细胞外酸化速率。
图10示出了成纤维细胞的细胞外酸化速率。
图11示出了成纤维细胞的氧气消耗速率。
发明内容
为了提供对前述问题的解决方法，本文公开了鉴定或评估改善皮肤细胞(诸如角质细胞和成纤维细胞)的代谢的护肤活性物质的方法。所述方法涉及使皮肤细胞暴露于紧张性刺激和受试试剂，并基于与糖酵解和氧化磷酸化相关联的代谢指标的变化，测定对所述受试试剂的响应。当氧化磷酸化和/或糖酵解响应对应于细胞的代谢的改善时，所述受试试剂可被鉴定为护肤活性物质。
本文还公开了一种制备提供皮肤健康有益效果并适用于局部施用至皮肤的个人护理组合物的方法，所述方法包括：根据本文所公开的方法鉴定活性物质；以及将安全且有效量的所述活性物质掺入药学上可接受的载体中。
本文还公开了改善皮肤健康状态的方法，所述方法包括：鉴定需要护肤有益效果的目标皮肤区域；以及将美容上有效量的根据本文所公开的方法制备的个人护理组合物施用至所述目标区域。
本发明还公开了鉴定改善成纤维细胞的代谢的皮肤有益剂的方法，所述方法包括：提供多个成纤维细胞；使成纤维细胞暴露于紧张性刺激；非致死地检测与糖酵解代谢途径和氧化磷酸化代谢途径各自相关联的代谢指标，以提供每一代谢途径对所述紧张性刺激的响应；使多个成纤维细胞暴露于受试试剂；非致死地检测与糖酵解和氧化磷酸化代谢途径各自相关联的代谢指标，以提供每一代谢途径对所述受试试剂的响应；以及当所述响应中的至少一个对应于相对于相同代谢途径的成纤维细胞代谢中的改善时，将所述受试试剂鉴定为皮肤有益剂。
具体实施方式
除非另外指明，所有百分比均按个人护理组合物的重量计。除非另外特别说明，所有的比率均为重量比。所有数值范围是包括端值在内的较窄的范围；描述的范围上限和下限是可互换的，以形成没有明确描述的其它范围。有效数位的数字既不限制所指示的量也不限制测量精度。所有测量均被理解为是在约25℃和环境条件下进行的，其中“环境条件”是指在约一个大气压和约50％相对湿度下的条件。
定义。
“美容的”是指在人体的区域提供所期望的视觉效果。视觉美容效果可以是临时性的、半持久的、或持久的。“化妆品”的一些非限制性示例包括在面部留下颜色的产品，诸如粉底、睫毛膏、遮瑕膏、眼线膏、眉彩、眼影、腮红、唇膏、唇香膏、化妆底粉、固体乳液粉盒等。
“皮肤病学可接受的”是指所述组合物或其被如此描述的组分适用于与人的皮肤接触，而没有不适当的毒性、不相容性、不稳定性、变应性应答等。
“不同类型的细胞”是指在它们预期的生物性功能方面彼此不同的细胞。相对于彼此，不同类型的细胞的示例包括但不限于：成纤维细胞、角质细胞、黑素细胞、肌细胞、皮脂腺细胞、和脂肪细胞。
“设置”意思是一个元件相对于另一个元件被定位在特定位置。
“非致死”是指不旨在杀死或破坏被测试或观察的细胞的测试程序。例如，非致死地检测代谢指标是指在检测后至少75％的细胞是活的(例如，80％、85％、90％、95％或甚至多至99％或更多的细胞保持是活的)。理想的是，100％的细胞在非致死测试后是活的，但应当理解，一些细胞的死亡或破坏可能是不可避免的和/或与测试无关的。
“氧化紧张性刺激”是指导致不期望的反应性氧物质在细胞中形成的环境因素。氧化紧张性刺激的一些非限制性示例包括紫外线辐射、香烟烟雾、臭氧、发动机尾气、柴油机尾气、烟雾、表面活性剂、和来自计算机监视器或电视机的辐射。
“个人护理组合物”是指适用于局部施用在哺乳动物皮肤上的组合物。本发明的个人护理组合物可被用于护肤、美容、和护发产品中；其非限制性用途包括止汗剂、除臭剂、洗剂(如洗手液和爽身水)、护肤产品(如面部和颈部洗剂、精华液、喷剂)、仿晒美黑剂、化妆品(如粉底、遮瑕物、胭脂、唇膏、唇彩)、脱毛剂、洗发剂、调理洗发剂、毛发调理剂、毛发染料、沐浴剂、保湿沐浴剂、沐浴凝胶、洁肤剂、清洁乳、毛发和身体清洁剂、沐浴保湿剂、宠物洗发剂、剃刮准备剂、须后水、剃刀保湿/润滑条、剃刀剃刮凝胶棒、条皂、清洁用品、女性护理产品、口腔护理产品和婴儿护理产品。使用任何上述组合物的方法也包括在个人护理组合物的含义之内。
“调节皮肤状况”是指使皮肤的外观和/或感觉维持为外观和/或感觉没有或很少有劣化。
“安全有效量”是指一定量的化合物或组合物，所述量足以显著引起积极的有益效果，优选积极的皮肤或感觉有益效果，以独立或组合的形式包括本文所公开的有益效果，但所述量又足够低以避免严重的副作用，即在技术人员合理判断的范围内提供适当的效险比。
“皮肤”是指哺乳动物的最外侧的保护层，其由诸如角质细胞、成纤维细胞和黑素细胞的细胞组成。皮肤包括外侧的表皮层和下面的真皮层。皮肤还可包括通常与皮肤相关联的毛发和指/趾甲以及其他类型的细胞，诸如例如肌细胞、梅克尔细胞、朗格汉斯细胞、巨噬细胞、干细胞、皮脂腺细胞、神经细胞和脂肪细胞。
“护肤”是指调节和/或改善皮肤状况。一些非限制性示例包括通过提供更光滑、更均匀的外观和/或感觉来改善皮肤外观和/或感觉；增加一层或多层皮肤的厚度；改善皮肤的弹性或回弹力；改善皮肤的紧致度；和减少皮肤的油性的、有光泽的、和/或无光泽的外观、改善皮肤的水合状态或保湿状态、改善细纹和/或皱纹的外观、改善皮肤剥落或脱屑、使皮肤丰满、改善皮肤阻隔性、改善皮肤色调、减少发红或皮肤疹斑的外观、和/或改善皮肤的亮度、光彩、或半透明性。“护肤产品”的一些非限制示例包括护肤霜、保湿剂、洗剂、和沐浴剂。
“护肤组合物”是指调节和/或改善皮肤状况的组合物。
“护肤活性物质”是指当施用于皮肤时，向皮肤或通常存在于其中的细胞类型提供急性和/或慢性有益效果的化合物或化合物的组合。护肤活性物质可调节和/或改善皮肤或其相关联的细胞(例如，改善皮肤弹性；改善皮肤水合；改善皮肤状况；和改善细胞代谢)。
“局部施用”是指将本发明的组合物施用或铺展到角质组织的表面上。
随着人类变老，来自外部和内部的紧张性刺激在身体的细胞上的损伤积累(即，氧化应激反应)，这可导致组织和器官的效率和功能下降。氧化应激反应表现为细胞产生能量的能力的降低并不少见。减少、停止或甚至逆转氧化损伤对皮肤的效应的护肤活性物质是已知的。但由于细胞的代谢途径的复杂性和/或存在于皮肤中的不同细胞类型的数量，鉴定新的和/或更好的护肤活性物质是困难的。出人意料地，已经发现某些氧化紧张性刺激以先前没有被认识到的方式影响某些类型的皮肤细胞的生物能学。上述新的认识可被用于鉴定抵抗某些紧张性刺激在特定类型的皮肤细胞上的特定代谢效应的护肤活性物质，这继而可导致对护肤的更加整体的研究。具体地，被调制为抵抗特定氧化紧张性刺激在特定皮肤细胞类型上的效应的护肤活性物质、活性物质的组合和/或护肤方案可导致人的皮肤的总体健康状态的改善。因此，本文的新方法提供了鉴定抵抗与在特定类型的皮肤细胞上的特定紧张性刺激相关联的不期望的代谢效应的护肤活性物质的方便和准确的方法。
虽然本文的一些示例可能针对与紫外线辐射相结合的诸如角质细胞和成纤维细胞的皮肤细胞，应当理解的是，所述方法根据需要可适合用于与任何紧张性刺激相结合的任何类型的细胞的巨大优势。
哺乳动物细胞产生能量的两个关键代谢途径是氧化磷酸化(“oxphos”(氧化磷酸化))途径和糖酵解途径。两种途径在大多数哺乳动物细胞内对于维持健康的能量平衡都是必要的。氧化磷酸化涉及电子从电子供体向诸如氧化还原反应中的氧的电子受体的转移，这导致被用于形成ATP的能量的释放。在哺乳动物中，氧化还原反应通过线粒体膜内的一系列蛋白质复合物进行，而上述联系的蛋白质的组被称为电子传递链。由流经上述电子传递链的电子释放的能量被用于在被称为化学渗透的过程中跨越线粒体膜地传输质子，这产生了pH梯度形式的势能和跨越上述膜的电势。通常被称为ATP合酶的酶使得上述势能能够被用于生成ATP。由于氧化磷酸化途径使用氧气来生成ATP，细胞消耗氧气的速率可被用作该细胞的代谢指标。即，细胞的氧气消耗速率可直接与该细胞通过氧化磷酸化产生的能量相关联。除此之外或作为另外一种选择，二氧化碳产生速率也可被用作代谢指标，因为二氧化碳是细胞代谢的副产物。较高的氧气消耗速率或二氧化碳产生速率可指示来自氧化磷酸化途径的能量生产的升高，并从而指示细胞的代谢和/或健康状态的改善。相反地，较低的氧气消耗速率或二氧化碳产生速率可指示氧化磷酸化代谢的降低。因此，鉴定和/或评估减少、防止和/或逆转由氧化应激反应导致的氧化磷酸化代谢的降低的化合物将是可取的。
糖酵解是使葡萄糖转化为丙酮酸的代谢途径。该过程中释放的游离能量被用于形成ATP和NADH(还原的NAD)。糖酵解是涉及十种中间体化合物的固定顺序的十种反应(步骤之一涉及两种中间体)，通常在细胞的细胞溶胶中发生。中间体提供了糖酵解的切入点。例如，诸如果糖、葡萄糖、和半乳糖的单糖能够被转化为这些中间体之一。上述中间体也可被直接使用。例如，中间体二羟丙酮磷酸(DHAP)是与脂肪酸结合形成脂肪的甘油的源。糖酵解的一种副产物是乳酸，其能够在溶液中形成乳酸根阴离子加上质子。因此，乳酸、乳酸根或质子浓度能够被用作糖酵解的代谢指标。即，细胞外pH或细胞外酸化速率的变化可直接地与该细胞通过糖酵解途径的能量生产相关联。较高的细胞外酸化速率可指示通过糖酵解途径的能量生产的升高，并从而指示细胞的代谢和/或健康状态的改善。相反地，较低的细胞外酸化速率可指示糖酵解代谢的降低。因此，鉴定和/或评估减少、防止和/或逆转由氧化应激反应导致的糖酵解代谢的降低的化合物将是可取的。
角质细胞
角质细胞一般被认为是表皮中的主要细胞类型，通常占其中存在的细胞的约95％。角质细胞是通过从存在于表皮的基底层的较低部分的表皮干细胞分化形成的。角质细胞随着它们通过表皮的层(例如，棘层和颗粒层)向上移动而分开和分化，最终变成角质层中的角化细胞。分化过程期间，角质细胞产生越来越多的角蛋白(“角质化”)，并最终永久性地退出细胞周期，以形成组成角质层的硬质外层的角化细胞。随着新的细胞进来，角化细胞最终通过脱屑脱落。当氧化应激反应降低角质细胞的代谢时，角质细胞分离和分化的速率可被降低或甚至停止。这继而可降低损失的角化细胞在角质层中被替代的速率，并最终导致皮肤的阻隔性的不期望的降低。因此，鉴定减少、防止和/或逆转来自某些紧张性刺激(例如，UV-A、UV-B、香烟/烟草烟雾、烟雾、臭氧、发动机尾气、挥发性有机化合物)的氧化应激反应对角质细胞的不期望的代谢效应的护肤活性物质可以是可取的。
已知使皮肤暴露于紫外线辐射能够导致皮肤细胞的氧化应激反应。然而，在本文之前，并未完全了解特定类型的皮肤细胞在代谢上如何对不同波长的紫外线辐射起反应，或者特定类型的皮肤细胞对紫外线辐射的代谢反应在暴露于紫外线辐射之后可如何随着时间变化。现已发现角质细胞的氧化磷酸化和糖酵解代谢途径不同地响应于UV-B辐射(即，315-280nm波长范围内的电磁辐射)。具体地，已发现角质细胞暴露于UV-B辐射导致了氧化磷酸化途径中代谢活性的降低，但似乎在暴露之后的最初2小时内对糖酵解没有显著的影响。因此，鉴定直接地(即，没有紧张性刺激或ROS的存在)和/或间接地(例如，仅当细胞暴露于紧张性刺激或ROS)减少、防止和/或逆转UV-B辐射对角质细胞的不期望的代谢效应的护肤活性物质可以是可取的。
还已发现角质细胞在特定的剂量和/或暴露后的时间表现出对UV-B辐射的先前未被了解的代谢响应。上述发现提供了对筛选护肤活性物质的独特洞见，以抵抗来自UV-B辐射的氧化应激反应对角质细胞的效应。具体地，现在知道介于5毫焦耳每平方厘米(“mJ/cm2”)和50mJ/cm2之间(例如，7.5-40mJ/cm2、10-30mJ/cm2、或甚至15-30mJ/cm2)的UV-B辐射提供了足够的能量来诱导角质细胞的氧化磷酸化和/或糖酵解途径中的可测量的代谢响应，而不杀死角质细胞。另外，在一些情况下，在角质细胞暴露于紧张性刺激之后至少1小时，但通常不超过暴露后72小时(例如，2至24小时；3-23小时；4-22小时；5-21小时；6-20小时；7-19小时；8-18小时；9-17小时；10-16小时；11-15小时；或甚至12-14小时)检测所期望的代谢指标能够是重要的。如果代谢指标太早被检测，细胞可能没有足够的时间来充分响应于紧张性刺激。另一方面，如果暴露后过去了太长的时间，响应可能被错过(例如，如果细胞的代谢回到其基础值)。另外，现在已知，在一些情况下，在特定的时间观察到的动力学数据能够提供关于角质细胞对氧化紧张性刺激和/或ROS的响应的重要洞见，当采用常规的静态检测方法(例如，ATP测定法)时，这可能是不明显的。
在一些情况下，本文的方法包括使多个角质细胞暴露于紧张性刺激(诸如UV-B辐射)和/或ROS(诸如过氧化氢)，然后使角质细胞与受试试剂接触。通过检测对应于氧化磷酸化和糖酵解代谢途径各自的代谢指标，获得了角质细胞对所述紧张性刺激和受试试剂的代谢响应。代谢响应在控制环境中被实时检测，并且同时从相同的细胞获得了氧化磷酸化和糖酵解指标。在一些实施例中，可能期望提供角质细胞的氧化磷酸化和糖酵解代谢途径各自的基础值，并将代谢响应与上述基础值和/或彼此进行比较，以确定代谢途径对紧张性刺激和/或受试试剂的响应。“基础值”是指在细胞暴露于紧张性刺激或受试试剂之前，代谢指标在正常测试状态的值。通过测量所述代谢指标和/或通过参考科学文献和/或其他合适的来源，可提供细胞的基础值。然而，测量基础值可以是优选的，因为众所周知，细胞的基础代谢值可由于多种环境因素和内在因素而变化。
图1A、1B和1C示出了通过检测在暴露于UV-B辐射(312纳米)之后角质细胞的氧气消耗速率(“OCR”)获得的动力学数据。图中示出的角质细胞是从Gibco Life Technologies,Grand Island,NY,USA获得的主要的角质细胞。细胞是根据下文的“测试方法”中描述的方法制备和测试的。图1A、1B和1C各自中的上方曲线图30A、30B和30C示出了角质细胞的基础OCR值(即，没有暴露于UV-B的OCR)。图1A、1B和1C各自中的下方曲线图35A、35B和35C分别示出了在暴露于7.5、15和30mJ/cm2剂量的UV-B辐射之后角质细胞的响应OCR值。应当理解的是，提供适当的剂量(即，7.5、15或30mJ/cm2)能够取决于多种为人们所熟知的因素(例如，所期望的剂量水平、灯泡的寿命、灯泡的类型、仪器是否是热的)，并且提供所期望的UV辐射剂量无疑是在普通技术人员的能力范围内的。对照曲线图37A、37B和37C示出了在不包含任何角质细胞、但包含了与其他孔相同的培养基的孔上测量的对照OCR值。上述对照值使得能够针对可能存在的任何背景效应校正基础值和响应值。每一曲线图中的第一个数据点是在暴露于UV-B辐射之后大约一小时获取的。如图1A、1B和1C中所示，暴露于UV-B之后角质细胞的响应OCR值大体比对应的基础OCR值更低。不受理论的约束，据信图1A、1B和1C中所示的数据指示UV-B辐射降低了角质细胞的氧化磷酸化代谢。因此，期望鉴定抵抗紧张性刺激(诸如UV-B辐射)对角质细胞的氧化磷酸化代谢途径的不期望的效应和/或直接作用于改善氧化磷酸化代谢途径(即，即使没有紧张性刺激或ROS的存在也导致改善)的护肤活性物质，以及将安全且有效量的此类活性物质掺入到个人护理组合物中。
图2示出了暴露于UV-B辐射(312nm)之后24小时的角质细胞OCR响应。图2中示出的24小时值是通过将角质细胞暴露于UV-B辐射，然后以37℃和5％CO2温育平板24小时获得的。UV暴露后二十四小时，根据下文所述的方法分析了细胞。在图表49的最左侧显示了24小时基础值40。基础值40右侧紧接的是关于7.5mJ/cm2剂量的UV-B辐射的24小时响应OCR值41，然后是关于15mJ/cm2剂量的24小时响应OCR值42。图表49的最右侧是关于30mJ/cm2剂量的24小时响应OCR值43。如图2中所示，在暴露于7.5、15和30mJ/cm2的UV-B剂量之后24小时，角质细胞持续显示出OCR的降低。因此，测量暴露于UV-B之后多至24小时或更长(例如，48或72小时)的角质细胞氧化磷酸化响应可能是重要的，尤其是当筛选阻止和/或缓解UV-B对角质细胞氧化磷酸化代谢的不期望的效应的护肤活性物质时。
图3A、3B和3C示出了通过检测在暴露于UV-B辐射(312纳米)之后角质细胞的细胞外酸化速率(“ECAR”)获得的动力学数据。角质细胞是以如上文关于图1A、1B和1C所述的相同的途径中获得的主要的角质细胞，测试是根据下文的“测试方法”部分描述的方法进行的。图3A、3B和3C各自中的上方曲线图65A、65B和65C分别示出了在暴露于7.5、15和30mJ/cm2剂量的UV-B辐射之后角质细胞的响应ECAR值。下方曲线图60A、60B和60C示出了角质细胞的基础ECAR值(即，没有UV-B暴露)。对照曲线图67A、67B和67C示出了在不包含任何角质细胞、但包含了与其他孔相同的培养基的孔上测量的对照ECAR值。如图3A、3B和3C中所述，对照值67A、67B和67C没有显示任何随时间的可测量的变化，而角质细胞的响应ECAR值大体比对应的基础ECAR值更高。ECAR响应数据的统计学分析是使用带有Dunnett校正的单因素方差分析(“ANOVA”)进行的，并且统计学分析显示，相对于对应的基础值60A、60B和60C，ECAR响应值65A、65B和65C没有统计学上显著的变化。
图4示出了在暴露于UV-B辐射(312nm)之后24小时的角质细胞ECAR响应。图4中示出的24小时值是通过将角质细胞暴露于UV-B辐射，然后以37℃和5％CO2温育平板24小时获得的。UV暴露后二十四小时，根据下文所述的方法分析了细胞。在图表79的最左侧显示了24小时基础ECAR值70。基础值70右侧紧接的是关于7.5mJ/cm2剂量的UV-B辐射的24小时响应ECAR值71，然后是关于15mJ/cm2剂量的24小时响应ECAR值72。图表79的最右侧是关于30mJ/cm2剂量的24小时响应ECAR值73。24小时ECAR响应数据的统计学分析是使用带有Dunnett校正的单因素方差分析(“ANOVA”)进行的。上述分析表明，ECAR响应值相对于基础值存在统计学上显著的变化。因此，当筛选阻止和/或缓解UV-B对角质细胞糖酵解代谢的不期望的效应的护肤活性物质时，在角质细胞暴露于紧张性刺激(诸如UV-B辐射)之后经过的时间长度可以是要考虑的重要因素。具体地，可能期望在暴露于紧张性刺激(诸如UV-B)之后等待超过2小时(例如，4、6、8、10、12、14、16、18、20、24、48、或72小时)来检测角质细胞中糖酵解的代谢指标。
成纤维细胞
在一些情况下，可能期望鉴定减少、防止和/或逆转来自某些紧张性刺激的氧化应激反应对成纤维细胞的不期望的效应的护肤活性物质。成纤维细胞存在于皮肤的表皮层和下皮(即，皮下的)层，并且一般被认为是合成细胞外基质(“ECM”)和胶原来为哺乳动物的组织提供结构框架的细胞。ECM和胶原通过向皮肤提供拉伸强度和弹性来帮助身体缓冲应力和应变。成纤维细胞还在创伤愈合中起着重要作用。当氧化应激反应降低了成纤维细胞的代谢时，身体合成胶原和ECM的能力可被降低，导致下垂、消瘦外观的皮肤。并且身体愈合创伤的能力可被阻碍。
如上文所提及的，尚未完全了解特定类型的皮肤细胞在代谢上如何对不同波长的紫外线辐射起反应，或者特定类型的皮肤细胞对紫外线辐射的代谢反应在暴露于紫外线辐射之后可如何随着时间变化。这为鉴定合适的护肤活性物质的过程增加了不确定性和困难。令人吃惊地，已发现成纤维细胞的氧化磷酸化和糖酵解代谢途径不同地响应于UV-A辐射。虽然与皮肤接触的大多数UV-B辐射被角质细胞吸收或反射，较长波长的UV-A辐射能够穿透表皮，并损伤下面的成纤维细胞和通常存在于真皮和皮下组织的其他细胞。具体地，已发现成纤维细胞对超过阈值能量水平的UV-A辐射的暴露导致氧化磷酸化途径中代谢活性的降低。成纤维细胞对UV-A辐射的暴露还可导致糖酵解途径中代谢活性的降低。此外，在不同的能量水平和暴露后的时间，两种代谢途径可表现出它们的响应的变化。上述发现提供了对于鉴定抵抗氧化紧张性刺激(诸如UV-A辐射)对成纤维细胞的效应的护肤活性物质而言重要的独特洞见。例如，现在已知在介于1和50焦耳每平方厘米(“J/cm2”)之间的UV-A辐射可提供足够的能量来诱导氧化磷酸化和/或糖酵解途径中可测量的代谢响应，但一般不杀死成纤维细胞。UV-A辐射的合适范围包括介于5和40之间、介于10和30之间、或甚至约20J/cm2。另外，现在还已知的是，在一些情况下，在成纤维细胞暴露于紧张性刺激之后至少1小时，但通常不超过暴露后24小时(例如，2至24小时；3-23小时；4-22小时；5-21小时；6-20小时；7-19小时；8-18小时；9-17小时；10-16小时；11-15小时；或12-14小时)检测代谢指标能够是重要的。如果代谢指标太早被检测，细胞可能没有足够的时间来充分响应于紧张性刺激。另一方面，如果经过了太长的时间，对紧张性刺激的重要的瞬时响应可能未被检测到。另外，现在已知，在一些情况下，在特定的时间观察到的动力学数据能够提供关于成纤维细胞对氧化紧张性刺激和/或ROS的响应的重要洞见，当采用常规的静态检测方法(例如，ATP测定法)时，这可能是不明显的。
在一些实施例中，本文的方法包括使多个成纤维细胞暴露于紧张性刺激(诸如UV-A辐射)和/或ROS(诸如过氧化氢)，然后使成纤维细胞与受试试剂接触。通过检测对应于氧化磷酸化和糖酵解代谢途径各自的代谢指标，可获得成纤维细胞对所述紧张性刺激和/或受试试剂的代谢响应。代谢响应在控制环境中被实时检测，并且同时从相同的细胞获得了氧化磷酸化和糖酵解指标。在一些实施例中，可能期望提供成纤维细胞的氧化磷酸化和糖酵解代谢途径中的至少一种的基础值，并将代谢响应与上述基础值和/或彼此进行比较，以确定代谢途径对紧张性刺激和/或受试试剂的响应。
图5A、5B、5C、5D和5E示出了通过检测在暴露于UV-A辐射(365nm)之后成纤维细胞的氧气消耗速率获得的动力学数据。成纤维细胞是购自ATCC(美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection),Bethesda,MD)的表皮成纤维细胞(BJ细胞系)。细胞是根据下文详述的方法制备和测试的。图5A、5B、5C、5D和5E各自中的上方曲线图90A、90B、90C、90D和90E示出了成纤维细胞的基础OCR值(即，没有UV-A暴露的OCR值)。图5A、5B、5C、5D和5E各自中的下方曲线图95A、95B、95C、95D和95E分别示出了在暴露于1、5、10、20和30J/cm2剂量的UV-A辐射之后成纤维细胞的响应OCR值。对照曲线图97A、97B、97C、97D和97E示出了在不包含任何成纤维细胞、但包含了与其他孔相同的培养基的孔上测量的OCR值。上述对照值使得能够针对可能存在的任何背景效应校正基础值和响应值。如图5A、5B、5C、5D和5E中所示，在暴露于UV-A之后成纤维细胞的响应OCR值大体比相应的基础OCR值更低。因此，不受理论的约束，据信图5A、5B、5C、5D和5E中所示的数据表明，大于1J/cm2的剂量的UV-A辐射可降低成纤维细胞的氧化磷酸化代谢。因此，期望鉴定抵抗紧张性刺激(诸如UV-A辐射)对成纤维细胞的氧化磷酸化代谢途径的不期望的效应和/或直接作用于改善氧化磷酸化代谢途径(即，即使没有紧张性刺激或ROS的存在也导致改善)的护肤活性物质，以及将安全且有效量的此类活性物质掺入个人护理组合物中。
图6示出了在暴露于UV-A辐射(365nm)之后24小时的成纤维细胞OCR响应。图6中示出的24小时值是通过将成纤维细胞暴露于UV-B辐射，然后以37℃和5％CO2温育平板24小时获得的。暴露于UV-A之后二十四小时，根据下文所述的方法分析了细胞。在图表89的最左侧显示了24小时基础值80。基础值80右侧紧接的是关于1J/cm2剂量的UV-A辐射的24小时响应OCR值81，然后是关于5J/cm2剂量的24小时响应OCR值82。图表89的最右侧是关于10J/cm2剂量的24小时响应OCR值83。如图6所示，成纤维细胞似乎仅在10J/cm2的剂量表现出24小时后OCR的降低。因此，当筛选用以抵抗例如大于5J/cm2或10J/cm2的剂量的UV-A的不期望的效应的护肤活性物质时，在暴露于UV-A辐射之后多至24小时或更长(例如，48或72小时)测量成纤维细胞氧化磷酸化响应可以是重要的。然而，当在小于10J/cm2或5J/cm2的剂量筛选抵抗UV-A辐射对成纤维细胞的不期望的代谢效应的护肤活性物质时，筛选过程中消耗时间和资源的步骤可通过不测试较低的剂量而被避免。
图7A、7B、7C、7D和7E示出了通过检测成纤维细胞的细胞外酸化速率获得的动力学数据。成纤维细胞是以如上文关于图5A、5B、5C、5D和5E所述的相同的途径获得的，测试是根据下文的“测试方法”中描述的方法进行的。在图7A、7B、7C、7D和7E中，基础ECAR值表示为曲线图120A、120B、120C、120D和120E；响应ECAR值表示为曲线图125A、125B、125C、125D和125E；而对照ECAR值表示为曲线图127A、127B、127C、127D和127E。基础值120A、120B、120C、120D和120E和对照值127A、127B、127C、127D和127E是以如上文所述相同的方式获得的。响应值125A、125B、125C、125D和125E分别对应于暴露于1、5、10、20和30J/cm2的UV-A辐射(365nm)之后成纤维细胞的响应。如图7A中所见，在暴露于1J/cm2的UV-A之后成纤维细胞的响应ECAR值125A大体上与基础值120A大致相同，这表明成纤维细胞的糖酵解代谢途径在该剂量大体未受影响。但是如图7B和7C所示，在暴露于5和10J/cm2的UV-A之后成纤维细胞分别的响应ECAR值125B和125C高于对应的基础值120B和120C。令人吃惊地，当成纤维细胞暴露于20J/cm2的UV-A时，如图7D所示，响应ECAR值125D开始高于基础值120D，但似乎逐渐降低直到最终(即，大约85至102分钟)穿越基础值120D线，最终低于基础值120D。在暴露于30J/cm2之后成纤维细胞的响应ECAR值125E，如图7E所示，基本上低于基础值，这表明成纤维细胞的糖酵解代谢途径被完全关闭。因此，不受理论的约束，据信图7A、7B、7C、7D和7E所示的数据表明，当筛选抵抗UV-A辐射对成纤维细胞糖酵解的效应的护肤活性物质时，暴露后的时间和剂量都是要考虑的重要因素。具体地，高于和低于20J/cm2的剂量对成纤维细胞的糖酵解代谢可具有非常不同的效应，并且了解这些差异能够帮助鉴定抵抗UV-A的不期望的效应而不抑制所期望的效应的护肤活性物质的有益组合。
图8示出了在暴露于UV-A辐射(365nm)之后24小时的成纤维细胞ECAR响应。图8中示出的24小时值是通过将成纤维细胞暴露于UV-B辐射，然后以37℃和5％CO2温育平板24小时获得的。暴露于UV-A之后二十四小时，根据下文的“测试方法”中描述的方法分析了细胞。在图表99的最左侧显示了24小时基础ECAR值90。基础值90右侧紧接的是关于1J/cm2剂量的UV-A辐射的24小时响应ECAR值91，然后是关于5J/cm2剂量的24小时响应ECAR值92。图表99的最右侧是关于10J/cm2剂量的24小时响应ECAR值93。如图8所示，成纤维细胞似乎仅在10J/cm2的剂量表现出24小时后ECAR的降低。因此，当筛选抵抗UV-A辐射对成纤维细胞糖酵解的效应的护肤活性物质时，根据UV-A的剂量，暴露后的时间(尤其是多至24小时或更长)可以是要考虑的重要因素。
个人护理组合物以及使用其的方法
由于健康的皮肤细胞提供的皮肤健康和/或外观有益效果，可能期望将根据本文的方法鉴定的一种或多种护肤活性物质掺入化妆品组合物。即，可能期望根据本文的方法鉴定护肤活性物质，并将所述护肤活性物质作为成分包括在化妆品组合物中。此类化妆品组合物可包括皮肤病学可接受的载体以及护肤活性物质(诸如烟酰胺)，该护肤活性物质降低、防止和/或逆转氧化应激反应对角质细胞、成纤维细胞和/或通常存在于皮肤中的其他类型细胞(例如，黑素细胞、肌细胞、干细胞、皮脂腺细胞、神经细胞、和脂肪细胞)的不期望的代谢效应。本文的化妆品组合物可包括通常被包括在被提供的特定化妆品组合物中的类型的一种或多种任选的成分。例如，所述化妆品组合物可包括另外的已知用于调节和/或改善哺乳动物皮肤的状况的护肤活性物质。此类任选的成分的非限制性示例包括润肤剂、湿润剂、维生素；肽；和糖胺。其他任选的成分包括防晒活性物质(或防晒剂)和/或紫外线吸收剂。在某些实施例中，所述化妆品组合物可包含着色剂、表面活性剂、成膜组合物、和/或流变改性剂。本文的合适的化妆品组合物可以是本领域中已知的多种形式中的任何一种，包括，例如，乳液、洗剂、乳、液体、固体、霜膏、凝胶、摩丝、膏剂、糊剂、精华液、棒状物、喷雾、滋补剂、气溶胶、泡沫、笔状物等。所述化妆品组合物还可以被掺入到剃刮准备产品中，包括，例如，凝胶、泡沫、洗剂、和霜膏，并且包括气溶胶和非气溶胶型式。其他化妆品组合物包括止汗剂、除臭剂、和个人清洁组合物(诸如皂和洗发剂)。化妆品组合物和适合用于其中的任选成分的非限制性示例描述于Ha等人2010年1月21日提交的美国专利公布2010/0239510中。
掺入了通过本文所述的新方法鉴定的护肤活性物质的组合物可大体按照制备组合物和局部用组合物的领域中已知的常规方法制备。此类方法通常涉及在一个或多个步骤中将成分混合至相对均一的状态，可使用或不使用加热、冷却、施加真空等。例如，通过首先独立于脂肪相材料而混合水相材料，然后适当地混合脂肪相材料和水相材料以得到所期望的连续相，可制备乳液。在某些实施例中，可制备所述组合物以提供活性物质材料的适当的稳定性(物理稳定性、化学稳定性、光稳定性等)和/或递送。所述组合物可以在尺寸被设定成贮存用于一个处理周期的足够量的组合物的包装中被提供。包装的尺寸、形状、和设计可能变化很大。一些包装的示例描述于美国专利D570,707；D391,162；D516,436；D535,191；D542,660；D547,193；D547,661；D558,591；D563,221；和美国专利公布2009/0017080；2007/0205226；以及2007/0040306中。
本文所公开的个人护理组合物可以改善皮肤弹性、改善水合、调节或改善皮肤状况、维持或改善皮肤老化迹象、或者维持或改善受侵害的角质组织的量和频率被施用于皮肤。例如，可能期望鉴定需要护肤有益效果的目标皮肤区域，将美容上安全且有效量的所述个人护理组合物施用于所述目标区域。在一些情况下，护肤组合物可被用作用于整个面部的专门处理，集中应用于带有表情纹、皱纹、不期望的色调或斑点的区域。另外，通过向需要此类处理的哺乳动物皮肤局部施用安全且有效量的护肤组合物，本文的个人护理组合物可用于产生长期和/或短期的皮肤或美容有益效果。
测试方法
本方法允许在控制环境中对与氧化磷酸化和糖酵解代谢途径相关联的代谢指标的非致死的、同时的检测。本方法还允许对动力学数据的收集。当评估对紧张性刺激或受试试剂的代谢响应时，重要的是同时评估两种代谢途径，以了解这两种代谢途径如何与紧张性刺激或受试试剂和/或与彼此相互作用。另外，重要的是实时(即，反复周期性地测量)监控代谢途径，以观察当使用仅提供静态数据的方法时可能被错过的趋势和/或瞬时响应。因此，破坏性检测不适合用于本文，因为它们通常仅允许单种测量。
另外重要的是在控制环境中检测代谢指标，以降低引入伪迹的可能性。合适的控制环境应当最小化或防止外部环境条件(例如，温度、压力、湿度、光照、和与不期望的气态、液态和/或固态污染物的接触)的任何不期望的影响。例如，如果被检测的代谢指标是氧气消耗速率而受试样品对环境开放，所测量的氧气浓度可能没有准确地反映细胞所消耗的氧气的量，因为至少一些被消耗的氧气可被环境的氧气代替。另外，测试方法自身不应当向测量中引入伪迹。例如，已知Clark电极消耗氧气，这恰好是它应当检测的东西。因此，通过Clark电极装置测量的氧气浓度可能没有正确地反映测试中的细胞所消耗的氧气的量。
应当理解，环境变化(诸如培养基的温度变化)可导致不期望的测量误差。具体地，培养基容纳溶解的气体的能力随着温度变化，并从而可导致溶解的气体浓度随着培养基趋于与周围环境的平衡而明显地改变。另外，至少一些类型的传感器的测量性能可随着温度变化。因此，可能尤其期望控制诸如测试容器中的培养基和/或周围环境的温度的环境条件，或对测量应用校正因子。相似地，由于诸如湿度或暴露于空气流的其他非控制环境条件导致的任何从培养基的蒸发可人为地影响由各种传感器(包括溶解的气体、离子、和温度的那些)进行的测量。因此，提供控制环境以最小化或消除这些因子能够是重要的。
在一些情况下，用于检测代谢参数的设备可包括适用于接收容纳细胞的测试容器(例如，多孔微孔板)的台。所述设备还可包括被配置为接收用于将测试容器内的环境与外部环境分隔的阻隔的活塞。所述阻隔可被配置为与测试容器的一部分机械式协作，以密封测试容器的开口，例如，通过与测试容器壁中的座或台阶配合。除此之外或作为另外一种选择，所述活塞和阻隔可被配置为减少和/或扩展测试容器的体积和测试容器内包括细胞的至少一部分(例如5-50％)的培养基的体积。例如，所述阻隔可通过所述台和活塞的相对运动被插入和/或缩出测试容器。在一些实施例中，所述方法可包括通过所述容器灌注附加的培养基和/或补充培养基。减小培养基的体积使得能够在较大体积的细胞培养基中临时形成高度浓缩的细胞的体积，以改善传感器检测培养基内由细胞的生物学活性导致的代谢指标的敏感变化的能力。通过临时地而非永久性地减小培养基体积(并从而浓缩细胞/培养基混合物)，细胞被暴露于非正常的环境仅仅一段短暂的时间，并从而可不被测量过程有害地影响(例如，杀死)。
所述设备还可包括能够分析所期望的代谢指标的传感器。在一些实施例中，传感器可被设置在阻隔和/或活塞上。传感器应当处于与培养基的传感通讯中，并被配置为检测所期望的代谢指标。传感器可被配置为感测所述代谢指标的存在和/或浓度；感测所述代谢指标的浓度的变化速率；和/或感测第一代谢指标的第一浓度、感测第二代谢指标的第二浓度、和确定所述第一浓度和第二浓度之间的关系。可能期望将传感器配置为检测所述代谢参数而不干扰细胞。所述设备还可包括被设置程序为自动操作所述测试的一个或多个方面(包括数据采集和记录、通过一个或多个测试步骤的循环和将受试试剂或紧张性刺激转移至细胞外环境)的计算机。在一些实施例中，传感器可联接到计算机。
提供控制环境的设备的合适的非限制性示例、对代谢指标的非致死和同时检测、和动力学数据公开于美国专利7,276,351；7,638,321；和授予Teich等人的7,851,201；以及授予Neilson等人的美国专利8,202,702中。尤其合适的装置是可购自Seahorse Bioscience,Massachusetts的XFExtracellular Flux Analyzer(XF细胞外流量分析仪)。
细胞培养和样品制备
将要根据本文的方法被测试的细胞可通过本领域中已知的任何合适的方法获得。例如，细胞可分离自天然环境(例如，人的皮肤)或购自合适的商业来源。细胞可以是原发细胞系(即，分离自生物组织源并在正常的组织培养条件下增殖的细胞系)或无限增殖化细胞系(即，通过化学或遗传修饰被改变，使得其增殖和倍增指数显著高于从原发细胞系所能得到的细胞系)。在一些实施例中，可以从合适的商业来源获得冷冻的原发细胞系或无限增殖化细胞系，并用适当的生长培养基稀释至组织培养瓶中(例如，可购自BD Biosciences的涂覆有胶原的T-75瓶)用于温育(例如，在37℃)。一旦细胞准备好用于测试，即可将它们置于合适的测试容器中(例如，多孔容器、单孔容器、一个或多个管、和常规测试平板诸如12孔板、96孔板等)。测试培养基可在测试容器中被提供，以形成细胞外环境。测试容器应当保持细胞至少在测试持续时间内(例如，至少4小时、8小时、12小时、24小时、48小时或72小时)内存活和健康。每一孔中细胞的数量应当足够进行合适的测量(例如，就角质细胞而言4×104细胞/孔以及就成纤维细胞而言1×105细胞/孔)。应当理解，在测试过程中，细胞可以被悬浮在测试培养基中、附着在设置于测试容器中的合适的基质上和/或附着在测试容器上。
以举例的方式，上文关于图1A、1B、1C、2、3A、3B、3C和4所论及的角质细胞是从Gibco Life Sciences获得的冷冻的人类主要的角质细胞。角质细胞在补充有人类角质细胞生长补充剂和庆大霉素/两性霉素B×500溶液(二者均可购自Invitrogen)的品牌角质细胞培养基(可购自Invitrogen,Grand Island,NY)中生长至70-80％聚集。对于每一测试，培养了两个单独的供体的角质细胞，并将每一供体的相等数量的细胞混合在测试容器中。在该示例中，来自每一供体的2×104个角质细胞被置于涂覆有明胶的24孔板中，每一孔总共大约4×104个角质细胞。存在的细胞的数量可通过本领域中已知的任何合适的方法测定(例如，使用Coulter计数器)。在测试前24小时将角质细胞置于涂覆有明胶的平板中，并将100μL的上文所述的角质细胞培养基添加至每一孔。测试培养基是通过改性缺少缓冲液、钙、葡萄糖、丙酮酸、和谷氨酰胺的可商购获得的培养基制备的。培养基是通过添加10ng/ml胰岛素；10ng/ml氢化可的松；60μM氯化钙；10mM葡萄糖；1mM丙酮酸；和2mM谷氨酰胺改性的。将测试培养基加热至37℃并用氢氧化钠将pH调节至7.4。在进行测量前1小时，用测试培养基替换了孔中的角质细胞培养基。
关于上文在图5A、5B、5C、5D、5E、6、7A、7B、7C、7D、7E和8中讨论的成纤维细胞，冷冻的人类表皮成纤维细胞得自可从ATCC,Bethesda,MD商购获得的BJ细胞系。使成纤维细胞在补充有10％胎牛血清(“FBS”)和庆大霉素/两性霉素B×500溶液的Eagle最低必需培养基(Eagle’s Minimum Essential Medium(“EMEM”))的培养基中生长至70-80％聚集(EMEM和FBS可购自ATCC，庆大霉素/两性霉素B×500溶液可购自Invitrogen)。在测试前24小时将成纤维细胞以1×105细胞每孔铺板在涂覆有明胶的平板中。每一孔包括100μL上文所述的成纤维细胞培养基。由杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)(可购自Seahorse Bioscience)，25mM葡萄糖和1mM丙酮酸制备了测试培养基。将测试培养基加热至37℃并将pH调节至7.4。以37℃和5％CO2空气使细胞生长和铺板。在进行测量前1小时，用测试培养基替换了孔中的成纤维细胞培养基。
涂覆有明胶的平板可通过用稀释于磷酸盐缓冲盐水(“PBS”)中的0.2％明胶(可购自Sigma的蛋白质溶液)涂覆多孔板(例如，可购自Seahorse Biosciences,Massachusetts的24孔或96孔板)的每一孔而制备。明胶在37℃在无菌的PBS中以1:10被稀释至0.2％，然后将50uL的经稀释的明胶溶液添加至每一孔，并于室温温育30分钟。通过抽吸而不触及孔，去除了多余的液体，并使表面干燥至少2小时。
细胞暴露于紧张性刺激或受试试剂
细胞可通过本领域中已知的任何合适的方法暴露于紧张性刺激或受试试剂。在一些实施例中，细胞可以在将所述细胞置于将被用于检测代谢参数的设备中之前被暴露于紧张性刺激。例如，在将细胞置于XFExtracellular Flux Analyzer中之前，可使用BIO-SUN品牌太阳模拟器(可购自Vilber Lourmat,France)使细胞暴露于紫外线辐射。在该示例中，可以从平板的孔去除测试培养基，并替换为100uL的PBS，以减小测试培养基可能对紫外线辐射具有的任何不期望的效应(例如，吸收或反射)。在其中代谢指标将在暴露后的合适时间内不被检测的实施例中(例如，当进行24小时测量时)。PBS可以在暴露于紧张性刺激之后但是在将细胞置于培养箱中之前立即被适当的培养基(例如，上文所述的角质细胞或成纤维细胞培养基)替换。为了从未被辐照的细胞获得数据，可以用诸如铝箔的紫外线不可穿透的材料覆盖包含不被辐照的细胞的平板的部分。在一些情况下，紧张性刺激和/或受试试剂可以在细胞被置于测试装置中之前和/或之后被引入测试容器中。例如，测试装置可包括使得物质能够在测试之前、期间和/或之后被直接引入测试容器的一个或多个注入口。
氧化磷酸化和糖酵解代谢指标的测量
可使用XF Extracellular Flux Analyzer或等同物来检测氧气消耗速率和细胞外酸化速率。所述装置应当能够在控制环境中非致死地和同时地检测氧化磷酸化和糖酵解途径的代谢指标，以及提供动力学数据。细胞可以在适和与所述设备一起使用的多孔板(例如，24孔板或96孔板)中被提供，并在测试前被洗涤。细胞可以通过本领域中已知的任何合适的方法被洗涤(例如，使用Seahorse Biosciences XF准备平台)。当洗涤细胞时，可能期望从孔中去除培养基，并用合适量的测试培养基(例如，96孔板中180μL或24孔板中600μL)洗涤细胞三次。在洗涤细胞之后，将合适量的测试培养基置于每一孔中，并在将平板置于用于测试的设备中之前，于37℃在无CO2的培养箱中平衡细胞1-1.5小时。在平衡期之后，将包含细胞的平板装入设备，并按照制造商的说明书进行平衡。整个测试在37℃进行。在一些实施例中，可能期望设置设备，以提供用于角质细胞的三分钟的混合周期、两分钟的等待周期、和3分钟的测量周期和用于成纤维细胞的两分钟的混合周期、两分钟的等待周期和3分钟的测量周期。上述循环应当被重复至少88分钟。应当理解，上述周期和时间可根据需要按照细胞类型和实验设计被修改。
实例1
下列实例示出了本文的方法如何能够被用于鉴定护肤活性物质。过氧化氢是熟知的ROS，并且在本实例中被用于展示与细胞暴露于氧化紧张性刺激相关联的不期望的代谢效应。过氧化氢以在上文所述的成纤维细胞测试培养基中的工作浓度的10X被制备。受试试剂是烟酰胺(也被称为维生素B3)，其可从Sigma商购获得。受试试剂以在上文所述的成纤维细胞测试培养基中的最终工作浓度的10X被制备，以提供受试试剂溶液。紧张性刺激溶液和受试试剂溶液均被加热至37℃，并且pH被调节至7.4。细胞是从ATCC获得的冷冻的人类表皮成纤维细胞(BJ细胞系)。细胞根据上文所述的测试方法被培养和制备。成纤维细胞被铺板在2个涂覆有明胶的24孔V7板中。每一孔包含大约1×105细胞和37℃、pH 7.4的600μL成纤维细胞测试培养基(即，DMEM,25mM葡萄糖和1mM丙酮酸)。
XF Extracellular Flux Analyzer被用于检测对应于糖酵解和氧化磷酸化代谢途径的代谢指标(即，细胞外酸化速率和氧气消耗速率)。板被装入分析仪，并按照制造商的说明书进行平衡。受试试剂溶液和紧张性刺激溶液被各自置于XF套盒平板的自动化注入口中。分析仪被编程为依序运行两分钟的混合周期、两分钟的等待周期、和3分钟的测量周期，连续进行至少88分钟。由分析仪收集并记录数据点。使分析仪在紧张性刺激溶液或受试试剂溶液的添加之前完成三个循环，以提供每一代谢指标的基础值。在三个循环完成后(即，检测开始后约21分钟)，由分析仪从适当的注入口将受试溶液和/或紧张性刺激溶液添加至孔中。紧张性刺激溶液以足够在孔中提供1.5mM过氧化氢的量被添加至孔中。受试溶液以足够在孔中提供0.1mM、0.25mM、0.5mM或1.0mM烟酰胺的量被添加。所测试的第一平板具有仅添加了1.5mM过氧化氢的六个孔(孔编号4、5、6、11、和12)；仅添加了0.25mM烟酰胺的六个孔(孔编号2、3、7、8、和9)；具有同时添加的0.1mM烟酰胺和1.5mM过氧化氢的组合的六个孔(孔编号13、14、19、20、和12)；和具有同时添加的0.25mM烟酰胺和1.5mM过氧化氢的组合的6个孔(孔编号16、17、18、22、和23)。第二平板具有仅添加了1.5mM过氧化氢的六个孔(孔编号4、5、6、11、和12)；仅添加了1.0mM烟酰胺的六个孔(孔编号2、3、7、8、和9)；具有同时添加的0.5mM烟酰胺和1.5mM过氧化氢的组合的六个孔(孔编号13、14、19、20、21)；和具有同时添加的1.0mM烟酰胺和1.5mM过氧化氢的组合的6个孔(孔编号16、17、18、22、23)。孔编号1、10、15、和24是空白孔。结果示于下面的表1、表2和表3以及图9、图10和图11中。
表1–糖酵解(平板编号1)
表1示出过氧化氢和烟酰胺单独地和组合的对来自所测试的成纤维细胞第一平板的成纤维细胞的细胞外环境的酸化速率的效应。通过XF软件版本1.8分析了来自表1的数据，以计算每一处理组在每一时间点的平均值，并与基线的变化加以比较为百分比，所述百分比图示在图9中。如上文所述，在添加过氧化氢或烟酰胺之前进行了前三次测量以提供基础值。图9示出针对表1中每一条件的曲线图，即1.5mM H2O2单独101；0.25mM烟酰胺单独100；0.25mM烟酰胺和1.5mM H2O2组合103；以及0.1mM烟酰胺和1.5mM过氧化氢组合102。如表1和图9所示，过氧化氢单独地似乎导致了细胞外酸化速率的实质性下降。因此，可得出过氧化氢导致人类成纤维细胞中糖酵解代谢的降低这一合理结论。烟酰胺当单独以0.25mM被添加时，似乎首先导致酸化速率的降低，然后在其向孔中的添加之后约20分钟内回到基础水平或略高。从这能够得出0.25mM烟酰胺没有显著地影响糖酵解代谢这一合理结论。然而，当与过氧化氢组合地添加时，烟酰胺似乎减轻了过氧化氢对糖酵解代谢的有害效应。即，0.1mM和0.25mM的烟酰胺浓度似乎减慢了细胞外酸化速率的降低并且防止了酸化速率下降得像过氧化氢被单独添加时那样远低于基础水平。
表2–糖酵解(平板编号2)
表2示出了过氧化氢和烟酰胺单独的和组合的对来自所测试的成纤维细胞第二平板的成纤维细胞的细胞外环境的酸化速率的效应。通过XF软件版本1.8分析了来自表2的数据，以计算每一处理组在每一时间点的平均值，并与基线的变化加以比较为百分比，所述百分比图示在图10中。图10示出针对表2中每一条件的曲线图，即1.5mM H2O2单独201；1.0mM烟酰胺单独200；0.5mM烟酰胺和1.5mM H2O2组合202；以及1.0mM烟酰胺和1.5mM过氧化氢组合203。如表2和图10所示，1.5mM过氧化氢似乎导致了与上文表1所示的相同的代谢响应。相似地，烟酰胺单独地在1.0mM似乎导致了与上文表1关于0.25mM烟酰胺所示的基本上相同的代谢响应缺乏。然而，当与过氧化氢组合地添加时，与0.1mM和0.25mM的浓度相比，0.5mM和1.0mM的烟酰胺似乎进一步减轻了糖酵解的降低。0.5mM和1.0mM烟酰胺浓度甚至看起来防止了酸化速率降低至低于基础值。重要的是，单独的烟酰胺显示出对成纤维细胞糖酵解基本上没有影响，但当与过氧化氢一起被添加时，烟酰胺的代谢效应看起来随着浓度的升高而提高。因此，能够得出烟酰胺抵抗过氧化氢对糖酵解的不期望的代谢效应，而不是自身直接改善糖酵解这一合理结论。
表3–氧化磷酸化
表3示出了过氧化氢和烟酰胺单独的和组合的对来自所测试的成纤维细胞第二平板的成纤维细胞的细胞外环境的氧气消耗速率的效应。通过XF软件版本1.8分析了来自表3的数据，以计算每一处理组在每一时间点的平均值，并与基线的变化加以比较为百分比，所述百分比图示在图11中。图11示出针对表3中每一条件的曲线图，即1.5mM H2O2单独301；1.0mM烟酰胺单独300；0.5mM烟酰胺和1.5mM H2O2组合302；以及0.1mM烟酰胺和1.5mM过氧化氢组合303。如表3和图11所示，1.5mM过氧化氢单独地首先导致OCR相对急剧的降低，然后是没有那么迅速的升高。添加过氧化氢后约20分钟左右，OCR开始接近相对恒定的速率，其比基础速率低得多。因此，可得出过氧化氢导致人类成纤维细胞氧化磷酸化代谢的降低这一合理结论。烟酰胺当单独地以1.0mM被添加时，看起来对人类成纤维细胞的氧化磷酸化代谢没有显著的影响。当烟酰胺以0.25μM的浓度与1.5mM过氧化氢一起被添加时，烟酰胺看起来对PCR没有显著的影响。当烟酰胺以1.0mM的浓度与1.5mM过氧化氢组合地添加时，其看起来一定程度上减轻了OCR初始的降低，但除此之外没有显示出具有显著的影响。因此，能够得出0.5mM和1.0mM浓度的烟酰胺没有显著地抵抗过氧化氢对人类成纤维细胞的氧化磷酸化代谢的效应这一合理结论。尽管更高浓度的烟酰胺可进一步减少过氧化氢对氧化磷酸化代谢的有害效应，此类浓度可能不适合用于局部护肤组合物中，因为，例如，生产成本的升高或不期望的副作用。
本文所公开的量纲和值不应被理解为严格限于所引用的精确值。相反，除非另外指明，每个这样的量纲旨在表示所引用的值以及围绕该值功能上等同的范围。例如，本发明所公开的量纲“40mm”旨在表示“约40mm”。另外，本文所述的性能可包括一个或多个数值范围。应当了解这些范围包括所述范围内的每个值，即使所述范围内的单个值可能未明确地公开。
具体实施方式中的所有引用文献的相关部分均以引用方式并入本文；任何文献的引用不可解释为是对其作为本发明的现有技术的认可。具体地，美国临时申请序列号61/711,500和61/711,521全文以引用方式并入本文。当本文献中术语的任何含义或定义与引入本文以供参考的文献中相同术语的任何含义或定义冲突时，将以赋予本文献中那个术语的含义或定义为准。
尽管已用具体实施例举例说明和描述了本发明，但对于本领域中技术人员将显而易见的是，在不脱离本发明的实质和范围的情况下可作出多种其它的改变和修改。因此，所附权利要求书旨在涵盖本发明范围内的所有此类改变和修改。

Claims (15)

1.一种将受试试剂鉴定为改善角质细胞的代谢的护肤活性物质的方法，所述方法包括：
a.提供多个角质细胞；
b.使所述角质细胞暴露于紧张性刺激；
c.非致死地检测与糖酵解和氧化磷酸化各自相关联的代谢指标，以提供所述每一个对所述紧张性刺激的响应；
d.使所述多个角质细胞暴露于受试试剂；
e.非致死地检测与糖酵解和氧化磷酸化各自相关联的代谢指标，以提供所述每一个对所述受试试剂的响应；以及
f.当(e)的响应中的至少一个指示相对于(c)的对应响应的角质细胞代谢的改善时，将所述受试试剂鉴定为护肤活性物质。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述紧张性刺激选自紫外线辐射、香烟烟雾、臭氧、发动机尾气、柴油机尾气、烟雾、表面活性剂、和来自计算机监视器或电视机的辐射。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述紧张性刺激是具有约315nm至约280nm的波长的紫外线辐射。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括提供与糖酵解和氧化磷酸化相关联的代谢指标各自的基础值，以及比较(c)的响应与对应的基础值，以确定是否某一代谢途径表现出比其他更大的代谢的降低。
5.根据权利要求4所述的方法，其中当(e)中的响应之一对应于表现出更大的代谢的降低的代谢途径的改善时，将所述受试试剂鉴定为护肤活性物质。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述基础值是通过测量尚未暴露于所述紧张性刺激的角质细胞中的所述代谢指标来提供的。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述代谢指标在相同的测试容器中被检测。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述代谢指标在基本上相同的时间被检测。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述代谢指标的检测在控制环境中进行。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述代谢指标在暴露于所述紧张性刺激后至少1小时被检测。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中与所述氧化磷酸化途径相关联的代谢指标是通过测量氧气消耗速率和二氧化碳生成速率中的至少一种来检测的。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中与所述糖酵解途径相关联的代谢指标是通过测量细胞外酸化速率、细胞外乳酸比率和乳酸根浓度比率来检测的。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括对选自成纤维细胞、黑素细胞、肌细胞、干细胞、皮脂腺细胞、神经细胞、和脂肪细胞的多种非角质细胞重复步骤(a)至(f)，以及当所重复的步骤(e)的响应中的至少一种指示相对于所重复的步骤(c)的对应响应的所述非角质细胞的代谢中的改善时，将所述受试试剂鉴定为护肤活性物质。
14.一种制备提供皮肤健康有益效果并适用于局部施用至皮肤的个人护理组合物的方法，所述方法包括：
a.根据前述权利要求中任一项所述的方法鉴定活性物质；以及
b.将安全且有效量的所述活性物质掺入药学上可接受的载体中。
15.一种改善皮肤健康的方法，所述方法包括：
a.鉴定需要护肤有益效果的目标皮肤区域；以及
b.将美容上有效量的根据权利要求14所述的方法制备的个人护理组合物施用至所述目标区域。
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