CN104684575A - 包含表皮生长因子的囊泡和含有所述囊泡的组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含表皮生长因子(EGF)、阳离子型表面活性剂和胆固醇或其衍生物的。本发明还公开了用于基于压缩流体(CF)技术来制备所述囊泡的方法。本发明的囊泡可用于制备药物和美容产品,和用于组织工程。
Description
技术领域
本发明属于人类医学和兽医学、美容学和组织工程的领域,特别地属于在其组成中包含表皮生长因子(EGF)的囊泡类型的释放系统的领域。本发明的囊泡具有相比于游离的EGF而言经改善的治疗效力。
现有技术
基于由并入了在治疗上有活性的物质的两亲性分子构成的囊泡系统(通常,脂质体)的药物释放系统是制药业中最常使用的系统之一,因为它们可以提供活性成分的更大的稳定性,增加其穿过生物膜的渗透性,和允许活性物质缓慢释放而无需反复施用。
EGF是在组织再生期间刺激细胞增殖和运动性的主要生长因子之一。它还通过调节上皮细胞的增殖和其迁移来帮助维持组织内环境稳定。此外,EGF诱导血管发生,其为组织提供了营养支持(Hudson和McCawley,J.Microsc.Res.Tech.1998,43:444-455;Koivisto等人,Exp.Cell Res.2006,312:2791-2805;Liang等人,Wound Repair Regen.2008,16:691-698)。该生长因子在制药领域中(Wong等人,Biotechnol.Genet.Eng.Rev.2001,18:51-71;Girdler等人,Am.J.Clin.Oncol.1995,18:403-406;Haedo等人,Rev.Esp.Enferm.Dig.1996,88:409-413;Majima,Ophthalmologica 1998,212:250-256),在美容学中(Hasegawa和Yamamoto,Mech.Ageing Dev.1992,66:107-114;US专利号5,618,544),和在组织工程中(Christopher等人,Biomacromolecules 2011,12:3139-3146)具有多种应用。
已经开发出了采用不同脂质体系统的EGF制剂。作为例子可提及:将EGF包括在包含磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰胆碱(PC)和胆固醇的单层脂质体中(Brown等人,Ann.Surg.1988,208:788-794)。还报道了将EGF包括在包含PC、胆固醇和透明质酸(Yerushalmi等人,Arch.Biochem.Biophys.1994,313:267-273)或者包含胆固醇和二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)(等人,J.Biomed.Mater.Res.A 2008,85A:271-283;等人,Int.Wound.J.2011,8:343-354)的多层脂质体中。已报道的另一类脂质体为多囊泡脂质体,其包含二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油(DMPG)、胆固醇和油酸甘油酯(Li等人,Arch.Pharm.Res.2005,28:988-994)。
另一方面,已报道了包含与EGF相缀合的阳离子型脂质的脂质体(Kikuchi等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.1996,227:666-671);包覆有聚乙二醇(PEG)的脂质体,其还包含与PC或与DPPC相组合的胆固醇和二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)(Li等人,Int.J.Pharm.2003,258:11-19)。还已报道了包含DPPC和溶血磷脂酰胆碱(LPC)的脂质体(Saddi等人,The Angle Orthodontist 2008,78:604-609;Alves等人,Life Sci.2009,85:693-699)。
采用脂质体系统的EGF制剂也已受到专利保护,例如这样的专利,其公开了:“EGF/脂质体”凝胶组合物,以及包括将EGF包载在包含中性和带负电荷的磷脂的脂质体中的方法(US专利号4944948);脂质体的凝胶组合物,以及使用带负电荷的脂质体和EGF并且包括带负电荷的脂质例如PG、PC和胆固醇的方法(国际专利申请号WO 9009782)。另一个专利申请涉及局部使用在脂质体中的EGF以防止糖尿病性足的切断术,并且使用包含PC和脱氧胆酸钠的脂质体。该专利申请限制于EGF的任何类型的脂质体/非离子型表面活性剂脂质体(niosomes)用于通过局部途径来治疗糖尿病性足的IV和V级慢性局部缺血性损伤的用途(国际专利申请号WO 2007/073704)。在现有技术中,还未发现将EGF整合入由胆固醇和阳离子型表面活性剂构成的囊泡系统中。
用于获得脂质体的传统方法例如薄膜蒸发(Agrawal等人,J.Liposome Res.2005,15:141-155)、脱水-再水化(Kirby和Gregoriadis,Nat.Biotechnol.1984,2:979-984)、冷冻-解冻(Ristori等人,Biophys.J.2005,88:535-547)和挤出(MacDonald等人,Biochim.Biophys.Acta1991,1061:297-303)具有某些缺点。这些缺点中的一些与大量的之后难以去除的溶剂的使用相关,或者与由这些方法中的一些所要求的高温相关,这些将其使用限制于热稳定的物质。另一方面,材料的大小和纳米构造结果难以控制,并且它们是在扩大期间(多阶段工艺过程)具有低的可重复性的方法。脂质体制备物的另一个缺点是其差的稳定性。
用压缩流体(CF)或高密度气体(无论以液态还是以超临界状态)作为溶媒来进行的材料加工在学术和工业上都唤起了很大的期望,以用于制备微米结构化或纳米结构化的材料,例如具有比用常规方法而得到的那种更大的结构均一性的颗粒材料、囊泡系统、复合颗粒、结构化表面等(Holmes等人,Chem.Eur.J.2003,9:2144-2150;Cooper,Adv.Mater.2001,13:1111-1114;Cooper,Adv.Mater.2003,15:1049-1059;Woods等人,J.Mater.Chem.2004,14:1663-1678)。CF或高密度气体是存在于其临界温度和压力附近或之上的并且在正常条件下为气体的物质。在超临界的区域或接近超临界条件的区域中,CF以独特的相存在,具有在气体特性和液体特性之间的中间特性。最常使用的CF为二氧化碳(CO2),其被归类为绿色溶剂,因为它是无毒的,不易燃的,易于去除,在颗粒中没有残留,便宜,并且易于回收。自90年代之初起,整个开发了一系列方法,其使用CF来制备具有微米范围、亚微米范围和纳米范围的颗粒大小的微细材料(Jung和Perrut,J.Supercrit.Fluid,2001,20:179-219)。CF的溶剂化能力可以通过温度和组成的变化而发生改变(如在常规液体溶剂的情况下一样),和还通过压力的变化(其在溶液内快得多地进行传传播)而发生改变。因此,这些脱溶方法共同地具有在非常短的时间段内达到非常高的过饱和程度的能力,这有助于向着晶体生长方向发展的成核作用,并由此获得具有非常窄的大小分布、受控的内部结构和超分子组织的微米颗粒或纳米颗粒。
用于用CF来获得微米结构化或纳米结构化的材料的方法之一是称为DELOS-SUSP(Depressurization of an Expanded Liquid OrganicSolution-SUSPension(经膨胀的液体有机溶液-悬浮液的减压))的方法(国际专利申请号WO 2006/079889;专利号EP 1843836;Cano-Sarabia等人,Langmuir 2008,24:2433-2437),其基于事先用CF使之膨胀的有机溶液的减压,通过所述减压而产生微米分散或纳米分散系统。在该过程中,CF作为共溶剂起作用,所述共溶剂在确定的压力和温度条件下与作为微米分散或纳米分散系统的待稳定化的溶质的有机溶液是完全可混溶的。所述稳定化通过在介质(通常为水性介质)中添加剂的存在来实现,在所述介质上进行经膨胀的溶液的减压,其中所述添加剂可以为乳化剂、离子型和非离子型去污剂、表面活化剂、胶体稳定剂和保护剂。通过该方法,可以获得微米分散和/或纳米分散系统,例如脂质体、乳状液或悬浮液。脂质体或囊泡由胆固醇和其他膜试剂(例如磷脂和表面活性剂)构成,并且对于其制备,需要将胆固醇和/或其他脂质溶解在经膨胀的有机溶液中,和使后者在表面活性剂的水溶液中减压。
为了可能通过DELOS-SUSP将活性物质掺入到囊泡或脂质体中,和为了产生相应的囊泡,需要将活性物质溶解在初始的经膨胀的有机溶液中,或者溶解在其中进行所述经膨胀的溶液的减压的水溶液中,并且在这两种情况下,所述溶解应当在脂质、去污剂或表面活化剂存在下进行。
在阳离子型表面活性剂之中,季铵类型的阳离子型表面活性剂(QUAT)已在制药领域中和在美容学中广泛使用。在制药领域中,已经通过局部、眼、口服、颊和鼻途径来使用它们。以前,报道了使用DELOS-SUSP技术来制备胆固醇:溴化鲸蜡基三甲基铵(CTAB)的纳米囊泡。通过该技术来掺入水溶性化合物的例子为描述于参考文献“Liposomes and other vesicular Systems:structural characteristics,methods of preparation,and use in nanomedicine”,Progress inmolecular biology and translational science,Elsevier,2011,第104卷,第1-52页中的那个,其中“胆固醇:CTAB”囊泡用作用于包囊和施用抗生素庆大霉素的载体。必须强调,所公开的庆大霉素的包囊是非常低的(<2%)。该类型的载体从未被用于掺入蛋白质。已知离子型去污剂是引起蛋白质变性的试剂(Akin等人,Anal.Biochem.1985,145:170-176;Andersen等人,J.Mol.Biol.2009,391:207-226)。最近已通过拉曼光谱学证明了在添加CTAB之后人血清白蛋白的变性(Vlasova和Saletsky,Laser Phys.2011,21:239-244)。通常,变性伴随着蛋白质功能特性的丧失。
由于所有前面所提到的内容,获得新的EGF释放系统仍然是令人感兴趣的,所述新的EGF释放系统是可容易地标准化的,在结构上和在其物理化学特性方面具有高的均一性,并且改善药学、药理学特性和/或增加EGF的治疗活性。
发明概述
本发明涉及作为药物释放系统的囊泡,其包含EGF、阳离子型表面活性剂和胆固醇或其衍生物,并且其具有超过以前所描述的囊泡的治疗效力。
本发明还涉及用于制备所述包含EGF、阳离子型表面活性剂和胆固醇或其衍生物的囊泡的方法,其特征在于,所述方法包括:a)制备EGF和阳离子型表面活性剂的水溶液;b)将胆固醇或其衍生物溶解在用CF使之膨胀的有机溶剂中;c)通过在得自步骤a)的溶液上将得自步骤b)的溶液减压来合成囊泡。
本发明的目标还在于药物组合物,其特征在于,所述药物组合物包含含有EGF、阳离子型表面活性剂和胆固醇或其衍生物的囊泡;和至少一种药学上可接受的赋形剂。
本发明的另一个目标为所述囊泡用于制备药物和美容产品的用途。
作为本发明产品的药物组合物(其包含EGF囊泡连同其他组分)作为药物在下述方面具有用处:用于加速糖尿病性足溃疡和其他复杂伤口(例如,尤其是静脉溃疡、褥疮性溃疡、烧伤)的愈合过程;用于受损的眼睛的前房结构的修复;用在全身性粘膜炎中;和用在所有涉及需要使粘膜和粘膜下层再生的胃肠道疾病中。特别地,已发现,在糖尿病性足溃疡和静脉起源的溃疡的愈合中,这些囊泡具有相比于本发明之前的那些而言显著更优的治疗效力。
本发明还涉及美容产品,其特征在于,所述美容产品包含EGF、阳离子型表面活性剂和胆固醇或其衍生物的囊泡。
附图简述
图1.用于获得包含EGF、阳离子型表面活性剂和胆固醇或胆固醇衍生物的囊泡的设备的示意性图示,其中:C:收集器;H:热交换器;P:泵;R:反应器;V:阀门;RD:破裂盘;ST:搅拌器;FL:过滤器;TI:温度指示器;PI:压力指示器;PIC:压力指示控制器;F:流量计。
图2.通过动态光散射(DLS)测得的囊泡的颗粒大小分布,所述囊泡使1M:1M的“CTAB:胆固醇”比率保持恒定并且使“EGF:胆固醇”比率变化[0μM:1M5μM:1M15μM:1M25μM:1M和40μM:1M](A);和使1M:1M的“溴化十四烷基三甲基铵(西曲溴铵(cetrimide)):胆固醇”比率保持恒定并且使“EGF:胆固醇”比率变化[0μM:1M5μM:1M15μM:1M25μM:1M和40μM:1M](B)。
图3.EGF囊泡的低温透射电子显微术(Cryo-TEM)图像,所述EGF囊泡具有如下组成:胆固醇:CTAB:EGF(A),胆固醇:西曲溴铵:EGF(B),胆固醇:苯扎氯铵(BKC):EGF(C),和β-谷固醇:CTAB:EGF(D),其中具有1M:1M的“QUAT:胆固醇或β-谷固醇”比率和5μM:1M的“EGF:胆固醇或β-谷固醇”比率。
图4.在细胞增殖试验中各种不同的EGF制备物的比生物学活性,其中比较了游离的EGF、“DPPC:胆固醇”脂质体(具有1M:1M的“DPPC:胆固醇”比率和25μM:1M的“EGF:胆固醇”比率)以及“CTAB:胆固醇”(A)和“西曲溴铵:胆固醇”(B)的囊泡,所述囊泡使1M:1M的“QUAT:胆固醇”比率保持恒定并且使“EGF:胆固醇”比率变化(5μM:1M、15μM:1M和25μM:1M)。
图5.在37℃下暴露于胰蛋白酶不同的时间段后,游离的EGF和各种不同的囊泡制备物的蛋白水解降解的特性曲线,所述囊泡使1M:1M的“CTAB:胆固醇”比率(A)和“西曲溴铵:胆固醇”比率(B)保持恒定,并且使“EGF:胆固醇”比率变化(5μM:1M、15μM:1M和25μM:1M)。
图6.在治疗开始时(A)以及在治疗4周(B)和8周(C)后,相应于患者JLG的糖尿病性足溃疡的愈合的演变照片,所述治疗使用以包含具有1M:1M的“CTAB:胆固醇”比率和5μM:1M的“EGF:胆固醇”比率的囊泡的喷雾剂形式的局部制剂,其中具有15μg/mL的EGF等价浓度。
图7.在治疗开始时(A)以及在治疗4周(B)和8周(C)后,相应于患者ZEM的糖尿病性足溃疡的愈合的演变照片。在最初4周期间,用包含具有1M:1M的“BKC:胆固醇”比率和5μM:1M的“EGF:胆固醇”比率的囊泡的肠胃外制剂(具有75μg/mL的EGF等价浓度)通过渗透途径进行治疗。在其余4周期间(直至完成8周),用以包含具有1M:1M的“CTAB:胆固醇”比率和5μM:1M的“EGF:胆固醇”比率的囊泡的喷雾剂形式的局部制剂(具有15μg/mL的EGF等价浓度)进行治疗。
发明详述
本发明提供了囊泡,其特征在于,所述囊泡包含表皮生长因子(EGF)、阳离子型表面活性剂和胆固醇或其衍生物。在本发明的一个实施方案中,所述阳离子型表面活性剂为季铵类型的阳离子型表面活性剂。
在本发明的背景下,术语“EGF”是指EGF分子的保持了其生物学活性的任何变体:例如,在C-末端经截短的分子(Calnan等人,Gut2000,47:622-627);或在N-末端经截短的分子(Svodoca等人,Biochim.Biophys.Acta 1994,1206:35-41;Shin等人,Peptides 1995,16:205-210)。EGF可以通过使用酵母例如糖酵母属(Saccharomyces)(Valdés等人,Biotecnol.Apl.2009,26:1-9)或巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)(Research Journal of International Studies 2009,10:36-46)或使用细菌例如大肠杆菌(Escherichia coli)(Yoon等人,Biotechnol.Bioprocess Eng.1997,2:86-89;Abdull Razis等人,Appl.Biochem.Biotechnol.2008,144:249-261)的重组DNA技术;或者通过化学合成方法(Shin等人,Peptides 1995,16:205-210)来获得。作为本发明目标的EGF还包括在通过现有技术中的任何程序进行修饰之后通过前面所描述的方法而获得的任何变体,所述程序为例如氨基酸置换(Shiah等人,J.Biol.Chem.1992,267:24034-24040;Lahti等人,FEBS Lett.2011,585:1135-1139;国际专利申请号WO 2007/065464),和与聚乙二醇相缀合(Thomas等人,Bioconjugate Chem.2001,12:529-37;Lee等人,Pharm.Res.2003,20:818-25),或其他化学或遗传修饰方法。
术语“阳离子型表面活性剂”是指在分子内具有至少一个正电荷的那些表面活性剂,并且还包括一种或多种阳离子型表面活性剂的组合。例如,根据本发明,可以使用叔胺盐、季铵盐以及在不饱和和饱和杂环中的烷基铵类型的阳离子型表面活性剂。
在本发明中,术语“季铵类型的阳离子型表面活性剂(QUAT)”是指这样的季铵盐,其中氮的取代基中的至少一个为长链。诸如CTAB、西曲溴铵和BKC的化合物或者其混合物被归类为QUAT。在本发明的一个优选的实施方案中,所述阳离子型表面活性剂为在药学上可接受的表面活性剂。QUAT和其余的阳离子型表面活性剂均可以以药学和美容学品质通过商业途径获得。
在本发明中,术语“囊泡”是指胶体微米颗粒和纳米颗粒,其处于25nm和5μm之间,并且由一种或多种包含水相的两亲性分子双层形成。
在本发明的一个实施方案中,所述囊泡具有在10M:1M至1M:5M的范围内的阳离子型表面活性剂与胆固醇(或其衍生物)之间的摩尔比;和在0.5μΜ:1Μ至100μΜ:1Μ的范围内的EGF与胆固醇(或其衍生物)之间的摩尔比。
在本发明中,术语“胆固醇的衍生物”是指类固醇家族的分子,其通常从胆固醇前体分子开始来获得并且具有亲脂性质。
在本发明的一个实施方案中,所述包含EGF的囊泡的特征为:其具有单层结构,和大约在25和500nm之间,优选地在50和300nm之间的平均大小。在一个特别的实施方案中,本发明涉及其中EGF被掺入到囊泡双层中的囊泡。通过Cryo-TEM来评价囊泡的近似大小和形态学,和通过DLS来表征囊泡的大小分布。
令人惊讶地,本发明的囊泡相比于游离的EGF和在“胆固醇:DPPC”脂质体中的EGF而言显示出EGF的生物学效能的显著增加(体外测量的)。此外,这些囊泡能够保护EGF对抗蛋白酶的攻击(这是对于在作用位点处得到足够的EGF生物利用率来说非常重要的特征),并因此提高了其治疗效力。
在本发明中,首次合成了这样的EGF囊泡,其改善了该生长因子的一些药学和药理学特性,例如其效能和稳定性。已证明了,EGF掺入到囊泡结构中的程度在至少一年期间保持稳定。另外,它们使得能够增加穿过生物膜的渗透性。
作为额外的优点,本发明的囊泡具有抗微生物和抗真菌效应,这在用于治疗复杂伤口和其他能够用EGF进行治疗的损伤的组合物中是所希望的。
在本发明的一个实施方案中,所述包含EGF的囊泡通过CF技术来获得。在一个特别的实施方案中,用于获得所述囊泡的CF技术包括这样的工艺过程,其包括:a)制备EGF和阳离子型表面活性剂的水溶液;b)将胆固醇或其衍生物溶解在用CF使之膨胀的有机溶剂中;和c)通过在得自步骤a)的溶液上将得自步骤b)的溶液减压来合成囊泡。在一个优选的实施方案中,在步骤a)中所使用的阳离子型表面活性剂为季铵类型的阳离子型表面活性剂。
本发明还提供了用于制备包含EGF、阳离子型表面活性剂和胆固醇或其衍生物的囊泡的方法,其特征在于,所述方法包括:a)制备EGF和阳离子型表面活性剂的水溶液;b)将胆固醇或其衍生物溶解在用CF使之膨胀的有机溶剂中;和c)通过在得自步骤a)的溶液上将得自步骤b)的溶液减压来合成囊泡。在本发明的一个实施方案中,上面所描述的方法包括季铵类型的阳离子型表面活性剂。
在本发明的一个实施方案中,上面所描述的方法的步骤b)的有机溶剂为选自下列的溶剂:一元醇,例如乙醇、甲醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、1-己醇、1-辛醇和三氟乙醇;多元醇,例如丙二醇、PEG400和1,3-丙二醇;酮类,例如丙酮、甲基·乙基酮和甲基·异丁基酮;乙二胺;乙腈;乙酸乙酯;和其混合物。在任何情况下,不论有机溶剂的性质如何,脂质组分必须是在其中可溶的,并且此外所述溶剂必须是一定与CF和水可混溶的。此外,所选择的有机溶剂应当具有相对低的毒性。
在初始缓冲液中EGF和表面活性剂的相对浓度和在有机溶剂中胆固醇的浓度将由在最终囊泡中所希望的“胆固醇:阳离子型表面活性剂:EGF”比值来确定。通常,“胆固醇:阳离子型表面活性剂:EGF”比率可以影响所获得的各种不同囊泡的物理化学和生物学特征。
在本发明的另一个实施方案中,在上面所描述的方法中所使用的CF为选自下列的化合物:CO2、乙烷、丙烷、氟氯烃(例如,CFC-22)和含氟烃(例如,HFC-134A)。优选地,在步骤b)中的CF为CO2,其被认为是生态型溶剂,因为它是无毒的,不易燃的,非腐蚀性的,对周围环境无害的,并且此外它在自然界中是非常丰富的。
在本发明的一个实施方案中,以如在图1中所呈现的那样的组合体中实施所述用于制备EGF囊泡的方法。所述组合体由高压反应器(R)组成,在大气压和工作温度(T=Tw)下向所述高压反应器中添加浓度为C1的胆固醇在乙醇中的溶液。在第二步中,添加经压缩的CO2直至工作压力(P=Pw),从而导致溶液发生体积膨胀至摩尔分数XCO2。所述添加通过使用泵P1经由阀门V-1(同时保持其余阀门关闭)来进行。将该系统在压力Pw和温度Tw下保持确定的时间以保证完全均质化和热平衡。在该时间过后,打开V-4,目的是接通反应器R与过滤器FL(其事先已用N2加压至Pw),同时保持其余阀门关闭。V-6的打开允许体积经膨胀的溶液在通过P2泵送的浓度为C2的EGF和浓度为C3的表面活性剂的水溶液上减压。在该最后一步中,将在Pw下通过V-2添加的N2流用作活塞以用于推动经膨胀的溶液,和用于在减压步骤期间保持反应器内的压力恒定。过滤器FL的存在使得能够收集在该工艺过程期间可能形成的任何沉淀物。将所形成的囊泡收集在容器C中,并随后在4℃下贮存在玻璃瓶中。一旦减压结束,就关闭V-6和V-2,并且通过重新打开V-6来进行设备的减压。
在本发明的一个实施方案中,CF的量与有机溶剂的量之间的比率相应于大约0.3至0.95,优选地0.5至0.8的CF摩尔分数。在一个特别的实施方案中,在反应器中,在大约1至30MPa的压力Pw和大约10至70℃的温度Tw下进行胆固醇(或其衍生物)在CF中的溶解。优选地,反应器的大致温度在10和50℃之间。
在作为本发明目标的方法中,将EGF溶解在包含阳离子型表面活性剂的水溶液中,所述阳离子型表面活性剂的浓度在其临界胶束浓度之上。
令人惊讶地,通过使用上面所描述的方法而合成的“胆固醇:QUAT:EGF”囊泡具有非常接近100%的EGF掺入到囊泡中的产率,这比对于任何水溶性分子的掺入所预期的产率显著地更高,考虑到以前对于庆大霉素所报道的结果。在“胆固醇-QUAT-EGF”囊泡中的这些产率也比在具有与EGF相似的结构特性的其他蛋白质(例如,牛血清白蛋白(BSA)这种水溶性蛋白质)的掺入中所获得的产率明显更高。这甚至在当为了所述BSA掺入而使用上面所描述的DELOS-SUSP程序时也出现,因为仅获得42%的掺入产率。
另一方面和也令人惊讶地,EGF掺入到“胆固醇:QUAT”囊泡中的这些产率明显高于在“胆固醇:DPPC:EGF”囊泡中所获得的产率,甚至在使用DELOS-SUSP方法来制备其的情况下。
本发明的另一个方面为药物组合物,其包含EGF囊泡、阳离子型表面活性剂和胆固醇或其衍生物,和至少一种药学上可接受的赋形剂。在药学上可接受的赋形剂(其是本发明的药物组合物的一部分)可以改善囊泡的活性。备选地,它们可以有助于本发明的组合物的操作和加工。本发明的EGF囊泡可以配制成各种药学形式,例如:注射剂、雾化液体或“喷雾剂”、凝胶、粘性溶液、霜剂、软膏剂、透皮贴剂、贮库制剂、吸入制剂和其他本领域技术人员已知的形式。
在合成本发明的囊泡期间或之后,可以混合各种不同的赋形剂,目的是形成适合于上面所提及的剂型的材料。通常,可以为了惯常的目的和以典型的量使用赋形剂例如增溶剂或溶剂、表面活性剂、pH调节剂、抗氧化剂、稀释剂、基质系统、络合剂、增粘剂、分散剂、润湿剂、着色剂、香料、防腐剂、渗透增强剂等,而不影响本发明的组合物的特征,如本领域技术人员已知的那样(Remington’sPharmaceutical Sciences(1995))。其他待在EGF囊泡的药物制剂中使用的赋形剂的另外例子可以在Handbook of PharmaceuticalExcipients(第6版)中找到。
在本发明的一个实施方案中,所述药物组合物为受控释放或持续释放形式。所述受控释放或持续释放形式通常包括基质系统、离子交换树脂或控制EGF囊泡扩散的特定屏障。
在本发明的一个实施方案中,为了制备所述药物组合物,使用本领域技术人员已知的设备,通过浓缩-渗滤方法来对EGF囊泡进行调适。本发明的药物组合物可以通过不同的途径来进行施用,尤其是通过全身途径、损伤内途径、粘膜途径、局部途径、透皮途径、眼途径,或者作为吸入制剂。
在另一个方面,本发明包括EGF、阳离子型表面活性剂和胆固醇或其衍生物的囊泡在制备药物中的用途。在本发明的一个实施方案中,所述药物旨在用于在任何哺乳动物物种中治疗其中需要辅助愈合和组织再生过程的疾病;其中组成所述囊泡的阳离子型表面活性剂、胆固醇和EGF是在药学上可接受的。在一个优选的实施方案中,所述哺乳动物为人。
上述的作为药物的用途包括施用有效量的所述囊泡以用于治疗需要外源施用EGF的疾病,以便调节上皮细胞的增殖、生长和迁移过程或者诱导血管发生。
通常,设想了,在施用本发明的EGF囊泡(或包含其的组合物)中的有效浓度将会为1.0至200μg/mL的EGF等价物/施用,优选地5.0至100μg/mL的EGF等价物/施用。施用的体积和频次取决于损伤类型、其大小和所使用的施用装置,如本领域技术人员所熟知的那样。在一天期间以合适的间隔按照两个、三个、四个或更多个亚剂量施用所需要的剂量也可以是合适的。
施用的确切用量和频次取决于待治疗的具体病况及其严重度、年龄、体重、性别、疾病的范围和患者的总体身体状况,以及向个体施用的任何其他伴随药剂,正如本领域技术人员所熟知的那样。此外,明显的是,上述的日有效量可以减少或增加,这取决于患者对于所述药剂如何反应,和/或取决于由开出本发明的药物的医生所做的评价。因此,上面所提及的日有效量应当被视为指导或建议。
在本发明的一个实施方案中,用本发明的囊泡制备的药物用于治疗任何外周软组织部位的复杂伤口。在一个特别的实施方案中,所述复杂伤口为糖尿病性足溃疡。在另一个特别的实施方案中,所述药物用于治疗静脉溃疡、褥疮性溃疡或烧伤。
在本发明的另一个实施方案中,所述药物用于治疗诸如成人呼吸窘迫的疾病。用本发明的囊泡制备的药物还可用于治疗消化道损伤,例如溃疡性结肠炎、十二指肠溃疡和末端结肠炎。在另一个实施方案中,所述药物用于治疗眼损伤。
也是本发明一部分的为美容产品,其特征在于,所述美容产品包含EGF囊泡、阳离子型表面活性剂和胆固醇或其衍生物,和至少一种在美容学或皮肤药学上可接受的赋形剂。在本发明的该方面,所述阳离子型表面活性剂、胆固醇(或其衍生物)和EGF是在药学和美容学上可接受的。
本发明的EGF囊泡可以配制成各种美容学或皮肤药学形式(固体的、液体的和半固体的均可),例如但不限于:注射液、雾化液体或“喷雾剂”、凝胶、霜剂、多重乳状液、水性分散液、乳状化妆品、香膏剂、洗剂、泡沫剂、精华液、软膏剂、透皮贴剂、擦巾、贮库制剂、发膏剂、粉剂、条状物、吸入制剂等,在所有情况下,包括持久制剂和漂洗制剂。
通常,本发明的美容组合物或皮肤药物组合物可以包含赋形剂,例如但不限于:增溶剂或溶剂、表面活性剂、pH调节剂、抗氧化剂、稀释剂、基质系统、络合剂、增粘剂、分散剂、润湿剂、胶凝性聚合物、增稠剂、软化剂、稳定剂、气味吸收剂、螯合剂、植物提取物、精油、海洋提取物、来自生物发酵程序的试剂、矿物盐、细胞提取物和阳光过滤物质(针对紫外线A和/或B具有活性的有机或无机性质的光防护试剂)、色素或着色剂、香料、防腐剂、渗透增强剂等,以及其混合物,条件是它们与本发明的组合物的其余组分在物理和化学上是相容的。可以为了惯常的目的和以典型的量使用这些赋形剂,而不影响本发明的组合物的特征,如本领域技术人员已知的那样(另外的例子可以被发现描述在CTFA Cosmetic Ingredient Handbook,第12版(2008)中)。这些额外的助剂的性质可以是合成的或天然来源的,例如植物提取物,或者来自生物发酵程序。
因此,本发明的目标还在于上面所描述的EGF囊泡用于制备美容产品的用途。在本发明的一个实施方案中,所述美容产品为用于预防皮肤的衰老和老化的产品。
实施方式/实施例的详细描述
下面的实施例为了举例说明目的而给出,而不应当被认为是对本发明的限制。
实施例1.借助于压缩流体技术的“胆固醇:DPPC:EGF”囊泡的合成
首先,在大气压和工作温度(Tw=35℃)下将12mg胆固醇和24mg DPPC在1.2mL乙醇中的溶液引入到体积为6mL的高压反应器中。添加经压缩的CO2,从而导致溶液发生体积膨胀直至达到XCO2=0.7的摩尔分数和Pw=10MPa的工作压力。为了得到完全均质化和热平衡,将该系统在10MPa和35℃下放置大约60分钟。最后,在24mL具有所希望的浓度(在15μΜ和40μΜ之间)的EGF水溶液上,将经膨胀的有机溶液从工作压力减压至大气压。在该最后一步中,将10MPa的N2流用作活塞以用于推动用CO2进行膨胀的胆固醇和DPPC在乙醇中的溶液,目的是在减压期间保持反应器内的工作压力恒定。接着,将囊泡转移至严实封闭的容器中,该容器在5±3℃下贮存直至其使用。
结果,获得了以15μΜ至40μΜ的浓度掺入有EGF的“DPPC:胆固醇(1:1)”囊泡。物理外观、平均大小和Z-电势的结果显示在表1中。平均大小、颗粒大小分布和Z-电势通过DLS来测定。
可以观察到,各种不同的囊泡制备物不具有短期稳定性的问题,并且它们具有相对小的平均大小和多分散性指数(PDI),这使得它们从药学观点来看是有吸引力的。但是,绝对Z-电势是非常小的(<+10mV),大大低于被认为允许分散系统的胶体稳定性的值,其通常是超过30mV的绝对值(Carrion等人,J.Colloid.Interface Sci.1994,164:78-87)。该特征表明,该囊泡系统的长期稳定性可能受到危及。
表1.对于不同的组成,“胆固醇:DPPC:EGF”囊泡的各种不同变体的物理外观、平均颗粒大小和Z-电势
*Nano-ZS(Malvern Instruments,UK),PDI-多分散性指数
实施例2.借助于压缩流体技术的“胆固醇:CTAB:EGF”囊泡的合成
首先,在大气压和工作温度(Tw=35℃)下将76mg胆固醇在2.88mL乙醇中的溶液引入到体积为6mL的高压反应器中。添加经压缩的CO2,从而导致溶液发生体积膨胀直至达到XCO2=0.7的摩尔分数和Pw=10MPa的工作压力。为了得到完全均质化和热平衡,将该系统在10MPa和35℃下放置大约60分钟。最后,在24mL以所希望的浓度(在1和40μΜ之间)包含EGF的CTAB在mQ水中的溶液(C=2.83mg/mL)上,将经膨胀的水溶液从工作压力减压至大气压。在该最后一步中,将10MPa的N2流用作活塞以用于推动胆固醇在乙醇中的溶液,目的是在减压期间保持反应器内的工作压力恒定。接着,将囊泡转移至严实封闭的容器中,该容器在5±3℃下贮存直至其使用。
按照以前已描述过的技术(Progress in Molecular Biology andTranslational Science,Elsevier,2011,第104卷,第1-52页),通过cryo-TEM来评价囊泡的形态学。
获得了以1μΜ至40μΜ的浓度掺入有EGF的“CTAB:胆固醇(1:1)”囊泡。物理外观、平均大小和Z-电势的结果显示在表2中;颗粒大小分布显示在图2A中;和通过cryo-TEM测得的大小和形态学显示在图3A中。如在表2中所观察到的,使“EGF:胆固醇”比例变化的各种不同的制备物是稳定。所有制备物的Z-电势都是正的,并且大大高于+30mV,这预示了高的长期稳定性。还可以注意到,平均大小和PDI随“EGF:胆固醇”比例增加而增加。在图2A中观察到高度均一的颗粒大小分布,其平均直径不超过200nm。在图3A中观察到,关于通过cryo-TEM进行研究的囊泡的形态学,具有单层结构的球状形态占优势。各种不同囊泡制备物的所阐述的特征使得它们从药学观点来看是非常有吸引力的。
表2.对于不同的组成,“胆固醇:CTAB:EGF”囊泡的各种不同变体的物理外观、平均颗粒大小和Z-电势
*Nano-ZS(Malvern Instruments,UK),PDI-多分散性指数
实施例3.借助于压缩流体技术的“胆固醇:西曲溴铵:EGF”囊泡的合成
以与在实施例2中所使用的同样的方式来合成这些囊泡,但在该情况下使用浓度为2.61mg/mL的西曲溴铵水溶液。获得了以1μΜ至40μΜ的浓度掺入有EGF的“西曲溴铵:胆固醇(1:1)”囊泡。物理外观、平均大小和Z-电势的结果显示在表3中;颗粒大小分布显示在图2B中;和通过cryo-TEM测得的大小和形态学显示在图3B中。如在表3中所观察到的,所有制备物是稳定的,并且具有小的平均大小和PDI的值。平均大小、颗粒大小分布和Z-电势通过DLS来测定。所有制备物的Z-电势都是正的,并且大大高于+30mV,这预示了高的长期稳定性。在图2B中观察到,颗粒大小分布是高度均一的,并且其平均直径不超过200nm。在图3B中观察到,具有单层结构的球状形态占优势,根据cryo-TEM。各种不同的囊泡制备物还具有使得它们从药学观点来看是非常有吸引力的特征。
表3.对于不同的组成,“胆固醇:西曲溴铵:EGF”囊泡的各种不同变体的物理外观、平均颗粒大小和Z-电势
*Nano-ZS(Malvern Instruments,UK),PDI-多分散性指数
实施例4.借助于压缩流体技术的“胆固醇:BKC:EGF”囊泡的合成
以与在实施例2中所使用的同样的方式来合成这些囊泡,但在该实施例中,一方面使用81.46mg胆固醇在2.88mL乙醇中的溶液,和另一方面使用3.0mg/mL的BKC和所希望的浓度的EGF的水溶液。获得了以5μΜ的浓度掺入有EGF的“BKC:胆固醇(1:1)”囊泡。物理外观、平均大小和Z-电势的结果显示在表4中。观察到,囊泡制备物是稳定的,并且具有相对小的平均大小和PDI。平均大小、颗粒大小分布和Z-电势通过DLS来测定。此外,与上面提及的在其组成中包含季铵类型的阳离子型表面活性剂的囊泡制备物相似地,它们具有正的并且大大高于+30mV的Z-电势值,这预示了高的长期稳定性。在图3C中观察到,具有单层结构的球状形态占优势,根据通过cryo-TEM来进行的囊泡形态学研究。这些囊泡还具有使得它们从药学观点来看是非常有吸引力的特征。
表4.在工作组成下,“胆固醇:BKC:EGF”囊泡的物理外观、平均颗粒大小和Z-电势
*Nano-ZS(Malvern Instruments,UK),PDI-多分散性指数
实施例5.借助于压缩流体技术的“胆固醇:CTAB:BSA”囊泡的合成
以与在实施例2中所使用的同样的方式来合成这些囊泡,但在该实施例中使用在水溶液中的蛋白质BSA。获得了以0.37μΜ的浓度(相应于25μg/mL)掺入有BSA的“CTAB:胆固醇(1:1)”囊泡。物理外观、平均大小和Z-电势的结果显示在表5中。观察到,囊泡制备物是稳定的,并且具有相对小的平均大小和PDI。平均大小、颗粒大小分布和Z-电势通过DLS来测定。它们还具有正的并且大大高于+30mV的Z-电势值,这预示了高的长期稳定性。
表5.在工作组成下,“胆固醇:CTAB:BSA”囊泡的物理外观、平均颗粒大小和Z-电势
*Nano-ZS(Malvern Instruments,UK),PDI-多分散性指数
实施例6.蛋白质掺入到囊泡中的效率的测定
为了测定EGF掺入到囊泡中的效率,采用了超离心方法以用于从囊泡中分离出游离的EGF。取1.0mL的待评价的各种不同囊泡的悬浮液,置于小瓶中,并且在4℃下以高速度(100,000×g)离心60分钟。接着,通过固相免疫酶测定法(ELISA)(Vázquez等人,Biotecnol.Apl.1990,7:42-49)来测定在上清液中的蛋白质含量(游离的EGF)。EGF掺入到囊泡中的效率通过下述表达式来确定:
结果显示在表6中。呈现了EGF掺入到组成为DPPC:胆固醇(在实施例1中获得的)、CTAB:胆固醇(在实施例2中获得的)和西曲溴铵:胆固醇(在实施例3中获得的)的囊泡中的效率的结果。还评价了EGF负荷(“EGF:胆固醇”比率)的影响。对于广泛的EGF负荷(“EGF:胆固醇”比率),可以观察到高的EGF掺入到“QUAT:胆固醇”系统中的效率值(接近100%)。然而,EGF掺入到“DPPC:胆固醇”系统中的效率的结果是非常低的;对于最高的EGF负荷而言,最大的掺入效率不超过10%。
表6.EGF掺入到具有各种不同组成的囊泡中的效率
ND-未测得
在包含BSA的囊泡的特定情况下,遵循相同的对于EGF所描述的程序,除了该蛋白质的定量通过双金鸡宁酸方法(micro-BCA)(Smith等人,Anal.Biochem.1985,150:76-85)来进行之外。BSA掺入到如在实施例5中所描述的那样制备的“CTAB:胆固醇”囊泡中的效率仅为42±5%。当比较BSA与EGF(其显示在表6中)掺入到具有相同的“CTAB:胆固醇”组成的囊泡中的效率时,可以看出对于EGF来说具有相比于BSA而言显著更高的掺入。
实施例7.借助于压缩流体技术的“胆固醇:CTAB:EGF”囊泡的合成的可重复性
为了验证用于合成EGF囊泡的方法的稳固性和可重复性,测量了在组成为5μΜ:1M和15μΜ:1M的“EGF:胆固醇”的数个批次(其在不同的日期制备)中的颗粒平均大小、PDI、Z-电势和EGF掺入效率。在表7和8中汇集了所获得的结果。颗粒平均大小、PDI、Z-电势通过DLS来测定。按照在实施例6中所描述的来测定EGF的掺入效率。
表7.在通过DELOS-SUSP进行制备后,以5μΜ的浓度掺入有EGF的“CTAB:胆固醇(1:1)”囊泡的特征
*Nano-ZS(Malvern Instruments,UK),PDI-多分散性指数
表8.在通过DELOS-SUSP进行制备后,以15μΜ的浓度掺入有EGF的“CTAB:胆固醇(1:1)”囊泡的特征
*Nano-ZS(Malvern Instruments,UK),PDI-多分散性指数
从在表7和8中所报告的值,可以得出结论:所述囊泡具有相似的特征(不依赖于其制备日期),这使得能够确认在制备EGF囊泡中DELOS-SUP方法是可重复的和稳固的。
实施例8.借助于压缩流体技术的“胆固醇:CTAB:EGF”囊泡的合成的扩大
如在实施例2中那样来合成囊泡,但是以大50倍的规模。首先,在大气压和工作温度(Tw=35℃)下将3.8g胆固醇在144mL乙醇中的溶液引入到体积为300mL的高压反应器中。添加经压缩的CO2,从而导致溶液发生体积膨胀直至达到XCO2=0.7的摩尔分数和Pw=10MPa的工作压力。为了达到完全均质化和热平衡,将该系统在10MPa和35℃下放置大约60分钟。最后,在1200mL以所希望的浓度(5至12μΜ)包含EGF的CTAB在mQ水中的溶液(C=2.83mg/mL)上,将经膨胀的液体溶液从工作压力减压至大气压。在该最后一步中,将10MPa的N2流用作活塞以用于推动胆固醇在乙醇中的溶液,目的是在减压期间保持反应器内的工作压力恒定。接着,将囊泡转移至严实封闭的容器中,该容器在5±3℃下贮存直至其使用。
获得了以5μΜ和12μΜ的浓度掺入有EGF的“CTAB:胆固醇(1:1)”囊泡。物理外观、平均大小、PDI和Z-电势的结果显示在表9中。平均颗粒大小、PDI和Z-电势通过DLS来测定。
表9.在以中试规模通过DELOS-SUSP进行制备后,对于不同的组成,“胆固醇:CTAB:EGF”囊泡的变体的物理外观、平均颗粒大小、PDI和Z-电势
*Nano-ZS(Malvern Instruments,UK),PDI-多分散性指数
在表9中,可以观察到,对于5μΜ:1M和12μΜ:1M的比例来说,“EGF:CTAB:胆固醇”囊泡是稳定的。观察到,在该扩大的方法中,获得了具有与以6mL的规模(实施例2)而取得的那些相当的物理化学特征的颗粒。在这两种情况下,都获得了低于200nm的平均颗粒大小。
实施例9.借助于在鼠类成纤维细胞A313T3中的细胞增殖试验来评价的囊泡的生物学活性
借助于细胞增殖试验(Mire-Sluis和Page,J.Immunol.Methods1995,187:191-199)来测定如在实施例1至3中所描述的那样制备的EGF囊泡的生物学活性。在该情况下,评价了游离的EGF、EGF脂质体和各种不同的包含EGF的囊泡在增加鼠类成纤维细胞系A313T3的细胞增殖方面的能力。通过下述方式来评价各种不同的囊泡悬浮液的生物学活性:直接在试验细胞上施加悬浮液的合适稀释物,从而样品的吸光度落在参考材料的工作曲线的范围之内,所述工作曲线事先针对由国家生物学标准和管控研究所(National Institute forBiological Standards and Control(NIBSC),UK)所提供的国际参考材料EGF 91/550进行了校准。
为了比较各种不同的EGF囊泡制备物的效能与游离的EGF的效能,借助于下述表达式,从生物学活性的结果开始来计算各种不同制备物的比活性:
生物学活性通过所描述的试验来进行测量,并且蛋白质的浓度通过在各种不同的囊泡制备物中的EGF等价浓度的公称值(以mg/mL表示)来给出。
作为在该细胞增殖试验中的对照,使用与所试验的各种不同变体相对应的空囊泡(没有添加EGF)。在这些样品中,在比对于具有EGF的囊泡所使用的稀释度小的稀释度下,既没有检测到任何细胞毒性效应,也没有检测到增殖的增加。
在图4A中观察到,组成为“CTAB:胆固醇”的EGF囊泡具有相比于游离的EGF和组成为“DPPC:胆固醇”的EGF囊泡而言增加的比活性。在图4B中,也观察到与前者相似的结果,当在通过相同程序制备的囊泡的组成中使用西曲溴铵代替CTAB时。该评价的目的是测定EGF的生物学功能是否受所述囊泡的组分或者所述囊泡的合成方法影响。但是,对于具有组成为“QUAT:胆固醇”的囊泡,发现了EGF的比生物学活性的出人意料的增加。
实施例10.整合到“QUAT:胆固醇”囊泡中的EGF对于蛋白酶的抗性
使用了按照本发明的实施例2和3制备的组成为“QUAT:胆固醇”(1:1)的EGF囊泡。进行该实验以评价“QUAT:胆固醇”囊泡在保持整合的EGF针对蛋白酶的稳定性方面的能力。已知,慢性伤口,例如糖尿病性足溃疡,具有可以影响用于其治疗的药物的生物利用率的蛋白水解环境(Bennett和Schultz,Am.J.Surg.1993,166:74-81)。
为了进行该评价,使用胰蛋白酶作为模型蛋白酶。在包含0.5μg/mL的最终胰蛋白酶浓度的、pH为8.5和浓度为20mM的Tris-HCl缓冲液中准备酶促反应。游离的EGF或者在各种不同囊泡制备物中EGF等价物的最终浓度为125μg/mL。样品的温育在37℃下进行4、8、16或24小时的时段。为了检测酶促反应,使用最终浓度为0.1%(v/v)的三氟乙酸(TFA)。
在检测了反应之后,将样品稀释在无水甲醇中直至80%(v/v)的最终甲醇浓度,搅拌,并且以10,000rpm在台式离心机中离心5分钟。最后,通过孔径大小为0.2μm的聚碳酸酯过滤器来过滤离心上清液;并且接着施加到HPLC系统(Merck,Germany)上。EGF标准物和所述囊泡的样品通过使用C18反相柱(Vydac,Hesperia,CA,USA)来进行分析,并且在226nm处进行检测。为此,使用20%至40%的B的线性梯度,在28分钟期间。流动相A由0.1%的TFA/水组成,和流动相B由0.05%的“TFA/乙腈”溶液组成。所分析的注射体积为5.0mL,相应于大约20μg的EGF。所使用的流速为1.0mL/分钟。从在226nm处获得的色谱图开始,通过使用EGF主峰下面积的校正曲线和已知样品的EGF浓度来进行的内插,定量了在样品中的EGF浓度。在与胰蛋白酶一起温育后在每个样品中EGF的剩余百分比从下述表达式开始来计算:
在图5A中观察到,组成为“CTAB:胆固醇”的EGF囊泡在24小时的时段内具有相对于游离的EGF而言增加的针对胰蛋白酶的稳定性。类似地,在图5B中观察到,组成为“西曲溴铵:胆固醇”的EGF囊泡具有与上面所描述的相似的行为。在所评价的各种不同的EGF负荷(“EGF:胆固醇”比率)之间,未发现显著差异。
对于掺入到“QUAT:胆固醇”囊泡中的EGF针对蛋白酶的稳定性所获得的结果总是显示,EGF囊泡具有比游离的EGF大得多的稳定性。
实施例11.“QUAT:胆固醇”囊泡的抗微生物活性的证明
评价了包含“QUAT:胆固醇”的囊泡的悬浮液以测定其是否具有抗微生物活性。该活性通过琼脂扩散法(Manual of ClinicalMicrobiology.第6版,Washington,DC:ASM;1995)来测定。通过在营养琼脂平板上的小杯技术,针对革兰氏阳性细菌(枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus));针对革兰氏阴性细菌(大肠杆菌(E.coli)、奇异变形菌(Proteusmirabilis));和针对真菌(白色假丝酵母(Candida albicans)、黑曲霉(Aspergillus niger))来检定待评价的各种不同悬浮液的效力。这些微生物由微生物保藏中心BCCM/LMG(比利时)鉴定和提供。将细菌在37℃下在胰蛋白胨大豆培养液(Oxoid)中培养过夜,和将真菌在28℃下在沙氏葡萄糖培养液(Oxoid)中温育72小时。将这些悬浮液用作接种物。将最终接种物(其使用100μl的包含108个集落形成单位/ml的细菌或104个孢子/ml的真菌的悬浮液)分别铺开在胰蛋白胨大豆琼脂平板和沙氏葡萄糖平板(Oxoid)上。用待检定的各种不同囊泡悬浮液中的每一种浸渍圆片(6mm的直径)。将环丙沙星和氟康唑(100μg/ml)分别用作关于细菌和真菌的阳性对照。对于细菌,将试验平板在37℃下温育24小时;和对于真菌,将试验平板在28℃下温育72小时,取决于对于可见生长所需要的温育时间。
在表10中观察到,各种不同的囊泡悬浮液显示出针对革兰氏阳性细菌和真菌的抗微生物效应。一般地,所述微生物对于组成为“西曲溴铵:胆固醇”的囊泡悬浮液比对于组成为“CTAB:胆固醇”的囊泡悬浮液更敏感。针对某些微生物,一些囊泡悬浮液显示出与环丙沙星和氟康唑相当的抗细菌和抗真菌活性。
表10.各种不同的“QUAT:胆固醇”囊泡悬浮液针对细菌和真菌的抗微生物和杀真菌活性
R-有抗性的
实施例12.以包含EGF囊泡的“喷雾剂”形式的液体制剂的制备
将按照实施例2获得的组成为5μΜ:1M的“EGF:胆固醇”的“CTAB:胆固醇(1:1)”囊泡悬浮液(具有25μg/mL的EGF等价浓度)在10mM磷酸钠缓冲液(pH 7.2)中稀释至15μg/mL的等价浓度。该最终溶液还包含17%(v/v)的甘油、10%(v/v)的乙醇、0.02%(w/v)的丁基羟基甲苯(BHT)、0.18%(w/v)的对羟基苯甲酸甲酯和0.02%(w/v)的对羟基苯甲酸丙酯。将所得的分散体通过0.2μm的乙酸纤维素灭菌过滤器进行过滤,并在氮气气氛中分装在玻璃球管中。
实施例13.包含EGF囊泡的凝胶制剂的制备
将按照实施例3获得的组成为5μΜ:1M的“EGF:胆固醇”的“西曲溴铵:胆固醇(1:1)”囊泡悬浮液(具有25μg/mL的EGF等价浓度)稀释至15μg/mL的等价浓度。该制剂还包含10mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.2);和最终浓度为1.25%(w/v)的卡波姆(Carbopol 940);3%(w/v)的甘油;和20mM的L-甲硫氨酸。此外,该制剂还包含0.02%(w/v)的BHT,以及作为抗微生物防腐剂的0.18%(w/v)的对羟基苯甲酸甲酯和0.02%(w/v)的对羟基苯甲酸丙酯。
实施例14.包含EGF囊泡的肠胃外制剂的制备
将按照实施例4获得的组成为5μΜ:1M的“EGF:胆固醇”的“BKC:胆固醇(1:1)”囊泡悬浮液(具有25μg/mL的EGF等价浓度)引入到切向流超滤装置Sartocon Slice 200的小室中。对于囊泡的超滤,使用具有孔径大小为30kDa的膜的盒。浓缩-渗滤方法在25±3℃的温度下进行,并且在盒的入口处的最大压力下降保持低于4巴。在该方法中,悬浮液被浓缩5倍(125μg/mL的最终EGF等价浓度)。在浓缩之后,将囊泡稀释在10mM磷酸钠缓冲液(pH 7.2)中,直至75μg/mL的EGF等价浓度。此外,该制剂还包含20mM的L-甲硫氨酸和0.02%(w/v)的BHT。将所得的悬浮液通过0.2μm灭菌过滤器进行过滤,并在氮气气氛中分装在玻璃球管中。
实施例15.包含EGF的脂质体和囊泡在愈合动物模型中的药效动力学效应的比较
实验方法:
为了评价下面提及的制剂的药理学功效,开发了在大鼠背部上的全厚慢性溃疡的实验模型。使用体重为250-270克的Sprague Dawley大鼠,其被随机分配以组成7个实验组,每个组具有10只动物。通过腹膜内途径用氯胺酮/赛拉嗪的组合将大鼠麻醉,以便大面积地除去其背部区域的毛。制造两个直径为8mm且全厚(直至上筋膜(其被保留))的对称、双侧和肩胛后的溃疡。立即开始以敷布形式施加曲安奈德,最初三天期间每天一次,以阻止愈合并诱导慢性化的特有改变。7天过后,通过肉芽组织的缺乏和上皮边缘的肥大来确认愈合过程的停止和溃疡的慢性化。从该时刻起,开始进行待研究的治疗的应用,如下面所描述的那样:
组1:没有治疗(盐水)。在与其余组相同的操控和操作条件下进行,并且以喷雾化形式施用无菌的生理盐水溶液。
组2:空的“DPPC-胆固醇”脂质体。
组3:空的“CTAB-胆固醇”囊泡。
组4:空的“西曲溴铵-胆固醇”囊泡。
组5:以25μg/ml的浓度荷载有EGF的“DPPC-胆固醇”脂质体。
组6:以25μg/ml荷载有EGF的“CTAB-胆固醇”囊泡。
组7:以25μg/ml荷载有EGF的“西曲溴铵-胆固醇”囊泡。
每天清洁伤口。在清洁它们之后,向每个组施用在每种情况下所指明的悬浮液。悬浮液的施用在14天期间以每天两次来进行。通过经由喷雾而局部施用囊泡或脂质体的悬浮液来治疗所述实验系统。
在已开始进行分派给每个组的治疗后的14天过后,使所有动物经历尸体剖检和取样。将样品在10%的中性福尔马林中进行固定,并且在72小时后统一地进行对切,以便后来将其包埋在石蜡中。所采用的着色为下列:苏木精-伊红染色、Mallory三色反应、Verhoeff染色和Gomori网状组织染色。样品由两个独立的研究者以不知情的方式进行分析。
结果:
不需要排除受污染的溃疡,因此对于所述6个实验组中的每一个使用总共20个损伤。概言之,可以确认,所有的EGF囊泡的药学呈现形式都显著地刺激了总的医治过程,相比于没有EGF的囊泡的组(空白)、以25μg/ml荷载有EGF的脂质体的组和用盐水进行治疗的实验对照组而言。所记录的数据涉及两个在不同时候所做的独立研究的平均值。使用Mann-Whitney U检验和Student t检验以用于进行比较。所有参数都遵从正态分布的标准。所研究的参数和结果在下面显示在表11中。
表11.在慢性伤口大鼠模型中所评价的悬浮液的药效动力学效应
*表明p≤0.05的值;**表明p≤0.01的值。
该实验证明,荷载有EGF的“CTAB-胆固醇”囊泡和“西曲溴铵-胆固醇”囊泡具有强有力的愈合效应。相比于其余的治疗而言,对于组6和7所证实的抗炎效应是明显的。可能的是,纤维血管发生增进和收缩的效应与浸润到新真皮中的免疫炎性细胞的平衡下降有关。类似地,证实了显著的促进上皮迁移的效应,其中在显微镜下显示出复层上皮的存在。对于用荷载有EGF的脂质体进行治疗的组所获得的应答比在组6和7中所检测到的小。在组6和7上施用的、包括荷载有EGF的囊泡悬浮液的治疗的优越性在其他相似的实验(其中通过甲基乙二醛的局部施用诱导了伤口的慢性)中也得到了揭示。
实施例16.基于向具有糖尿病性足溃疡的患者局部施用包含EGF的囊泡来进行的治疗
对于临床病例,按照由德克萨斯大学建立的定级标准,大多数所治疗的损伤超过90%的切断术可能性。所述治疗通过局部途径来施行。
所治疗的患者的一般特征:
长期演变的I和II型糖尿病,用胰岛素、磺酰脲类或双胍类作为口服降血糖药进行药物治疗。他们有愈合差的个人病史,同时他们中的一些已经经历了先前的对侧切断术。所有用所述治疗进行对待的下肢损伤都相应于局部缺血性或神经病性糖尿病性足。总体而言,损伤被分类为慢性的、复杂的和顽固的。损伤的演变期在少于一个月和7年之间。所治疗的损伤的大小在20和80平方厘米之间。在一些损伤中的深度达到危及骨外膜。从解剖学的观点看,所治疗的损伤位于跟骨和/或跖骨的侧面区域。所有患者都接受了在住院制度下的初次治疗,其中同时需要施行在麻醉下的切除程序,以及通过肠胃外途径的抗生素疗法。在具有上皮迁移迹象的伤口的完全愈合和肉芽形成之时,使患者经历关于其医治和药物治疗的隔天的门诊和追踪制度。在完全上皮化之后,追踪每位患者直至愈合了12个月。为此目的,进行复发出现的评价、不良反应的记录和患者一般状况的评价。
在表12中,显示了接受通过局部途径进行的治疗的患者群的人口学和流行病学特征。
表12.接受局部治疗的患者群的人口学和流行病学特征
*DM:糖尿病,**y:岁(年)
下面描述了关于每一位患者所追踪的治疗表现。
患者JLG:男性,56岁,用胰岛素进行控制,并且没有其他在临床上显现出的糖尿病并发症。呈现出具有局部缺血性组分的正面的大范围损伤,其在经跖骨切断术两年后继续存在。在组建抗微生物疗法和臭氧疗法两年之后,在肉芽形成和上皮化过程方面没有结果。在施行外科手术清洗和边缘复苏后,着手隔天地用以在实施例12中所描述的包含“EGF:CTAB:胆固醇”囊泡的“喷雾剂”形式的局部制剂来进行治疗。在八周的治疗中,取得了损伤的完全上皮化。结果显示在图6中。
患者OFS:女性,吸烟者,肥胖,并且具有动脉高血压病史。其用口服降血糖药进行控制。从一次局部叮咬起始,呈现出迅速发展的软组织部位和腱的坏死。进行了坏死物质的切除外科手术。组建了抗微生物疗法,并且隔天地对损伤进行医治。由于14天的干预过后肉芽形成过程是不活跃的且缓慢的,因而开始应用隔天地用以在实施例12中所描述的包含“EGF:CTAB:胆固醇”囊泡的“喷雾剂”形式的局部制剂来进行的治疗。在八周的治疗中,取得了损伤的完全上皮化。
患者AVL:男性,52岁,用格列本脲进行控制,神经病性沙尔科足,这是一种足底损伤,其自产生起已肉芽形成了7年,但没有收缩/上皮化的迹象。在施行外科手术清洗和边缘复苏后,着手隔天地用以在实施例13中所描述的包含“EGF:西曲溴铵:胆固醇”囊泡的凝胶形式的局部制剂来进行治疗。在八周的治疗中,取得了损伤的完全上皮化。
患者PAT:男性,47岁,没有其他在临床上显现出的糖尿病并存病或并发症,虽然检测到外周动脉疾病。作为局部创伤的结果,发展出了经跖骨脓肿,其导致具有明显炎症性征候的几乎整个足前半部分的液化性坏死。实施了经跖骨切断术,并且开始了抗生素疗法。作为其结果,切断术的残留基部在30天后没有令人满意地发生演变,应当实施大范围的清创术,因为存在局部缺血性微斑;决定用以在实施例13中所描述的包含“EGF:西曲溴铵:胆固醇”囊泡的凝胶形式的局部制剂对患者进行干预。将所述制剂施加在伤口的边缘和表面处。所述治疗隔天地进行并且延续4周。从首次施用起,就消除了局部缺血性斑块的存在,并且开始发展出生产性和出血性的肉芽组织,其后来促进没有皮肤的部分厚移植物的施用。
患者GMA:男性,69岁,用胰岛素进行控制,并且没有其他在临床上显现出的糖尿病并发症。呈现出残留的正面损伤,其在经跖骨切断术6个月后继续存在。在组建抗微生物疗法和臭氧疗法3个月之后,在肉芽形成和上皮化过程方面没有结果。在施行外科手术清洗后,着手隔天地用以在实施例12中所描述的包含“EGF:CTAB:胆固醇”囊泡的“喷雾剂”形式的局部制剂来进行治疗。在六个月的治疗中,取得了损伤的完全上皮化。
实施例17.基于向具有糖尿病性足溃疡的患者渗入EGF囊泡来进行的治疗
对于临床病例,按照由德克萨斯大学建立的定级标准,大多数所治疗的损伤超过90%的切断术可能性。所述治疗通过渗入途径来施行。所治疗的患者的一般特征与在实施例16中所描述的一致。
对于该渗入式治疗,使用在实施例14中所提及的肠胃外制剂,其使用“EGF:BKC:胆固醇”囊泡。该治疗的要点在于等距离地在每个点在损伤的边缘和底部处进行损伤内和损伤周围的内部注射。通过下述方式来置放材料:将针以15-45度的角度引导至溃疡的基部或者楔骨的深处,总是包括真皮-表皮接界,以刺激边缘的收缩。在每个点置放100至1000μL,这取决于组织的临床外观和其特征。每周进行两至三次。所治疗的损伤和所治疗的人群的人口学特征描述在表13中。在所有所治疗的病例中,防止了或大或小的切断术的实施。
表13.接受渗入式治疗的患者群的人口学和流行病学特征
*DM:糖尿病,**y:岁(年)
下面描述了关于每一位患者所追踪的治疗表现。
患者HCJQ:局部缺血性的,没有远端脉搏,并且自腘部起阻塞。该损伤在于第五趾的侧切断术的残留基部,其显示出在明显的局部缺血性坏死中暴露的被膜和腱。该损伤被分类为根据Wagner定级标准的IV级。10×4厘米的大小。当在切断术的第六天发现切断术的残留基部在临床上缺乏张力和发绀(以这种方式进展了5天,尽管采用了所有全身或局部的药理学措施)时,组建该治疗。在坏死物质的外科手术清创术之后开始进行渗入,以期改善局部微环境和促进肉芽组织的出现。这从第五期渗入起开始观察到。患者接受总共12期渗入。该治疗促进了生产性和出血性的肉芽组织的存在。观察到强烈的向心性上皮迁移,尽管没有明显的边缘收缩。在所述治疗开始38天过后,损伤完全上皮化而无需移植物。未观察到急性或迟来的不良反应。在12个月时,损伤没有局部复发。
患者OFW:神经病性的,演变了81天,在入院的时候具有可分类为Wagner IV的经跖骨切断术的残留基部。损伤的大小为14×7平方厘米。察觉到具有0.9的ABI的远端脉搏,尽管有着感觉迟钝的征候。当在42天的局部医治和生理盐水溶液敷布施用期间损伤显示出非常差的肉芽形成应答时,组建该治疗。开始进行渗入,并且在第一周的治疗期间每天施行以挽救局部细胞。随后,按照每周两次的制度继续进行,持续三周。用该方案,取得了完全的生产性和出血性的肉芽形成。组织被从对侧大腿前部区域获得的部分厚皮肤移植物覆盖。与前面所描述的那位患者类似地,该治疗很好地被耐受,并且在一年时,损伤保持仍是上皮化的。
患者JIFM:女性,曾吸烟者,年龄为61岁。左下肢中具有0.4的ABI,该左下肢在足的跖骨区和足底区中显示出坏死性筋膜炎。该损伤被分类为根据Wagner定级标准的V级。通过外科手术对患者进行治疗,其中实施所有坏死组织和/或被污染的软组织和骨组织的切除术。建立通过全身途径的多价抗生素疗法制度。外科手术干预48小时过后,进行损伤的初次检查,施行其局部清洁,并且开始用所述囊泡进行渗入式治疗。在最初10天期间,建立以攻击剂量用EGF囊泡进行治疗的制度,其随后允许减少至在5周期间两期渗入。该治疗使得能够拯救足而无需治疗备选方案。该患者具有正常的步态和该下肢远端部分的令人满意的运动支配。
实施例18.基于向具有糖尿病性足溃疡的患者实施使用EGF囊泡的可渗入和局部联合施用来进行的治疗
对于临床病例,按照由德克萨斯大学建立的定级标准,大多数所治疗的损伤超过90%的切断术可能性。所述治疗通过联合渗入途径和局部途径来施行。所治疗的患者的一般特征与在实施例16中所描述的一致。
对于该联合治疗,首先使用渗入途径,其中使用包含EGF囊泡的肠胃外制剂(在实施例14中所提及的)。然后,对于局部途径,备选地使用以在实施例12中所描述的喷雾剂形式的制剂和以在实施例13中所描述的凝胶形式的制剂。
所治疗的人群的人口学特征和损伤的特征描述在表14中。在所有所治疗的病例中,防止了或大或小的切断术的实施。
表14.接受通过渗入途径和局部途径的联合治疗的患者群的人口学和流行病学特征
*DM:糖尿病,**y:岁(年)
下面描述了关于每一位患者所追踪的治疗表现。
患者AFG:男性,具有长时期的糖尿病和差的对于治疗的坚持的历史。显示出没有远端脉搏的腘阻塞模式。该损伤以水疱形式首次出现,其被污染并迅速发展至跟骨区域的所有软组织部位坏死。在初次外科手术医治中,去除了软组织部位。在五天后,需要另一次外科手术干预,其导致骨物质的破坏。建立加强的使用抗生素的多价疗法,并且在初次外科手术干预20天结束时开始以渗入形式用EGF囊泡进行治疗。在最初的两周内,建立一期每天的局部治疗和医治。接着,在随后的8周期间,通过在伤口的边缘和表面处隔天地用以在实施例13中所描述的包含按照实施例3制备的“EGF:西曲溴铵:胆固醇”囊泡的凝胶形式的局部制剂来进行医治和治疗而继续进行。在10周的治疗过后,损伤已完全上皮化了。
患者LATR:局部缺血性的,没有远端脉搏,并且具有双下肢大血管疾病。存在0.6的ABI;由于钙化而没有血管再生成外科手术的可能性。先前的对侧切断术是三年前进行的。第四和第五趾具有细动脉血栓形成,其中进行了这两趾的切断术,具有大范围的且深的侧楔骨。外科手术两周过后,切断术的残留基部显示出缺乏张力的征候并且抗拒肉芽形成。如此,在第三周,开始用所述囊泡进行治疗,其中最初采用以25至125μg EGF/注射点的剂量(其被置放在外科手术区域的边缘和底部)来进行的渗入式治疗。采用该治疗样式,直至达到使所有窝洞和隧洞被肉芽组织覆盖,这在大约三周时发生。随后,决定继续采用以凝胶形式用在实施例13中所描述的且包含“EGF:西曲溴铵:胆固醇”囊泡的组合物通过局部途径来进行的治疗。该治疗在伤口的边缘和表面处进行,尤其应当强调在伤口的真皮-上皮边缘处,以便刺激再上皮化。该治疗隔天地进行,直至5周内完全上皮化。
患者ZEM:女性,57岁,具有Wagner III级损伤和神经病的迹象,足底损伤,其自产生起已肉芽形成了7年,但没有收缩/上皮化的迹象。在施行外科手术清洗和边缘复苏后,着手以75μg EGF等价物/注射点的剂量进行渗入式治疗,其中使用在实施例14中所描述的包含“EGF:BKC:胆固醇”囊泡的制剂,其被置放在手术区域的边缘处。该治疗样式在最初四周期间隔天地施行。随后,决定继续采用隔天地用以在实施例12中所描述的包含“EGF:CTAB:胆固醇”囊泡的“喷雾剂”形式的局部制剂来进行的治疗。对于该治疗,使EGF囊泡在损伤的边缘和表面处雾化,尤其应当强调在伤口的真皮-上皮边缘处,以便刺激再上皮化。该治疗隔天地进行,直至8周内完全上皮化。愈合过程的演变显示在图7中。
患者JLHB:神经病性的,其从在右下肢的足上的干烧伤起始发展出了大范围的感染性损伤。最后,导致经跖骨切断术,向其附加了长度为10厘米的侧楔骨。建立了通过静脉内途径用抗生素来进行的治疗和系统性的局部医治(每48小时)。在干预20天过后,该损伤显示出非常缓慢地进行肉芽形成和边缘缺乏张力的倾向。组建了隔天地用负荷为75μg EGF的囊泡来进行的渗入式治疗,在残留基部中以及在楔骨中。在治疗的第三周,开始隔天地用以在实施例12中所描述的包含“EGF:CTAB:胆固醇”囊泡的“喷雾剂”形式的局部制剂来进行施用,直至到达侧楔骨的深层区域。所述治疗的联合加速了完全肉芽形成,以及面积大于60平方厘米的自发上皮化。
实施例19.在急性肺损伤(ALI)或成人呼吸窘迫综合征(ARDS)的大鼠致死模型中使用EGF囊泡的治疗功效的证明
使用体重为250至280克的雄性Sprague Dawley大鼠。在全身麻醉(氯胺酮/赛拉嗪)下通过气管内滴注基于脂多糖(LPS)-酵母聚糖的组合来诱导肺损伤。此后紧接着,将动物随机分配至三个实验组,每个组12只动物。
组A:用生理盐水溶液进行治疗,
组B:以25μg/ml/kg的浓度用EGF在生理盐水中的气雾剂进行治疗,
组C:用在实施例4中所描述的“胆固醇:BKC:EGF”囊泡进行治疗,所述囊泡具有25μg/mL的EGF等价浓度,并且如在组B中那样进行施用。
让动物在没有任何治疗的情况下发生演变,直至初期症状建立。在施用LPS/酵母聚糖后六小时,大鼠显示出与用力呼气相关的呼吸急促。在该点处,动物显示出65%的动脉PO2饱和度和明显的呼吸性酸中毒的模式。
因此,所述治疗在滴注毒素大约8小时时开始。该实验旨在评价用所述两种EGF制剂进行的治疗专门对于ARDS的急性期的效应。所述治疗借助于从挥发性麻醉机改造的口面罩来施行。所述治疗每天进行两次。作为辅佐,还每天一次用醋酸氢化可的松(10mg/kg)对动物进行治疗。
在所述治疗开始72小时过后,停止该研究。将存活的动物麻醉,并且使其经历用5ml无菌盐水的深支气管肺泡灌洗以用于细胞学和生物化学研究,以及经历动脉血抽取以用于气体定量法参数的测定。然后,向肺中吹入10ml 10%的中性福尔马林,并且进行加工处理以用于组织学研究。
表15显示了每个组的日死亡率的结果。如可以观察到的,用EGF喷雾进行的治疗控制了急性肺损害的进展。明显地,在存活方面最好的效应相应于接受了掺入到囊泡中的EGF的组。这暗示,延长的对于多种EGF受体的占据发挥比以在生理盐水中进行运载的简单液体气溶胶的颗粒形式的EGF更牢固的药理学效应。
表15.每个组中的死亡率
支气管肺泡灌洗的结果确认了由EGF所发挥的对于肺泡壁和对于中隔毛细血管内皮的保护作用。此外还观察到,由用掺入到囊泡中的EGF进行的治疗所赋予的保护作用包括通气能力的改善,其表现为更大的动脉PO2指数和非常接近正常值的动脉pH的保持。这些数据展示在表16中。
表16.支气管肺泡灌洗和肺功能的结果
组 | 炎性细胞/ml | 红细胞/ml | 总磷脂/g肺组织 | 动脉饱和度 | 动脉pH |
A | 3.0×104 | 2.0×103 | 188.6μg | 51.8±2.2 | 6.58±0.4 |
B | 2.2×103 | 5.0×102 | 241.0μg | 76±8.3 | 7.12±0.1 |
C | 0.5×103 | -- | 1.32mg | 91.7±5.6 | 7.33±0.2 |
每个组的肺的组织学分析证明,用EGF进行的治疗保护了肺实质,特别是在接受囊泡制剂的组中。这通过“肺泡/中隔”比率的保持的存在、中隔壁的渗透性水肿的减少以及在肺泡腔中出血灶和嗜酸性物质的存在而得到证实。相比于接受生理盐水溶液的动物而言,在用掺入到囊泡中的EGF的制剂进行治疗的动物中显示出更少的炎症反应。该实验使得我们能够推断:用在实施例4中所描述的“胆固醇:BKC:EGF”囊泡进行的干预对于暴露于已知的ALI诱导物的肺实质发挥了更强烈的/延长的药理学效应。所赋予的保护作用不仅涵盖了肺的结构完整性的改善,而且还呈现了功能参数的重大改正。
实施例20.用EGF囊泡对具有成人呼吸窘迫综合征(ARDS)的危重患者进行的同情型治疗(compassionate treatment)
临床病例的描述:患者AGJ,男性,57岁,没有病理学病史,其患有演变为脓毒性休克的腹部创伤。作为演变并发症,出现了ARDS,其导致具有对氧气疗法抗拒的呼吸困难和发绀的通气困难、低饱和度(11mm Hg)和血液pH改变。放射线图像显现出在双肺实质中的棉花状斑点。决定开始用正的呼气末压力和其他常规药理学物质来进行治疗。为了在急性渗出期中保护肺实质,每天两次以200μg EGF等价物/升医用氧的剂量施用在实施例4中所描述的“胆固醇:BKC:EGF”囊泡。所述措施允许患者向正常状态有利和渐进地演变,从而防止了到达纤维化肺泡炎的阶段。在治疗的第三天,可以暂停在正压力下的通气;和在第五天,棉花状图像已完全变清了。
实施例21.在具有左远端溃疡性结肠炎的患者中使用EGF囊泡的治疗功效的证明
从所施行的数个结肠镜检查和活组织检查起始,治疗被诊断具有远端溃疡性结肠炎的一群8位患者。所述患者接受专门的医学饮食,以及用水杨酸偶氮磺胺吡啶或柳氮磺吡啶进行的药理学治疗。根据该群人已保持在临床上活跃超过12个月并且对所有药理学干预(包括肾上腺皮质激素)抗拒,决定富于同情心地评价用在实施例3中所描述的“胆固醇:西曲溴铵:EGF”囊泡借助于通过低位灌肠法的施用来进行的治疗的效应。为此,将“胆固醇:西曲溴铵:EGF”囊泡在生理盐水溶液中以50μg/ml的EGF等价浓度进行施用,以20ml的体积。每晚在睡眠时刻之前,以左侧卧位应用灌肠法。在开始与其余的先前医学措施相关联的灌肠法7天时,根除了黑粪症、疼痛和一般性全身累及。在治疗10天过后,实施结肠镜检查,其中检测到重大的粘膜消炎、大多数损伤的愈合和St.Mark指数的显著下降。在开始21天时暂停所述治疗,其时重复结肠镜检查,其中确认了由用包含“胆固醇:西曲溴铵:EGF”囊泡的灌肠剂进行的治疗所引起的愈合和消炎效果。在开始治疗21天时取自所述8位患者的活组织检查证明了隐窝炎的消失。
实施例22.用于恢复由肿瘤学化学疗法引起的粘膜损伤的EGF囊泡的同情型使用
患者QED:男性,32岁,其从在骨髓移植后用环磷酰胺和白消安进行治疗起始发展出了膀胱和下泌尿道的出血性粘膜炎。在具有血尿和大量蛋白尿(400mg/24小时)72小时过后,连同一般的医学支持措施一起,患者接受了膀胱灌洗,通过其进行了包含按照实施例2制备的“胆固醇:CTAB:EGF”囊泡的生理盐水溶液(具有150μg/mL的EGF等价浓度)的输注。在最初24小时结束时,仅检测到在尿中痕量的红细胞和170mg/24小时的蛋白尿。
患者IRT:女性,27岁,其在用于治疗非霍奇金淋巴瘤的综合化学疗法过程中发展出了上胃肠道的粘膜炎。出现了多样的临床情景,其包括口疮表现、流涎、呕血、腹部膨胀、全身累及、发热和其他症状。用药理学支持措施而开始管控了该过程,所述药理学支持措施包括质子泵抑制剂、粘膜保护剂、血量的重建和肠胃外阿片类镇痛药。在建立该情景24小时过后,患者接受口服施用包含按照实施例3制备的“胆固醇:西曲溴铵:EGF”囊泡的盐水溶液(具有50μg/mL的EGF等价浓度)。借助于鼻胃导管,每四小时滴注体积为250ml的所述溶液。呕血以及膨胀和急性轻瘫的情景在开始胃冲洗的24小时时停止。同样地,对于容量支持和其他管控措施的需要也逐渐地减少。
实施例23.借助于压缩流体技术的“β-谷固醇:CTAB:EGF”囊泡的合成
以与在实施例2中所使用的同样的方式来合成这些囊泡,但在该情况下,一方面使用77.71mgβ-谷固醇在2.88mL乙醇中的溶液,和另一方面使用2.83mg/mL CTAB和所希望的浓度的EGF的水溶液。获得了以5μΜ的浓度掺入有EGF的“CTAB:β-谷固醇(1:1)”囊泡。物理外观、平均大小和Z-电势的结果显示在表17中。观察到,囊泡制备物是稳定的,并且具有相对小的平均大小和PDI。平均大小、颗粒大小分布和Z-电势通过DLS来测定。此外,与在前面的实施例中所提及的在其组成中包含季铵类型的阳离子型表面活性剂的囊泡制备物相似地,它们具有正的并且大大高于+30mV的Z-电势值,这预示了高的长期稳定性。在图3D中观察到,具有单层结构的球状形态占优势,根据通过cryo-TEM来进行的囊泡形态学研究。这些囊泡还具有使得它们从药学观点来看是非常有吸引力的特征。
表17.在给定组成下,“β-谷固醇:CTAB:EGF”囊泡的物理外观、平均颗粒大小和Z-电势
*Nano-ZS(Malvern Instruments,UK),PDI-多分散性指数
Claims (29)
1.囊泡,其特征在于,所述囊泡包含表皮生长因子(EGF)、阳离子型表面活性剂和胆固醇或其衍生物。
2.权利要求1的囊泡,其中所述阳离子型表面活性剂为季铵类型的阳离子型表面活性剂。
3.权利要求2的囊泡,其中所述季铵类型的阳离子型表面活性剂为选自溴化鲸蜡基三甲基铵(CTAB)、西曲溴铵和苯扎氯铵(BKC)的表面活性剂。
4.权利要求1-3的囊泡,其中所述阳离子型表面活性剂与所述胆固醇或其衍生物之间的摩尔比例在10M:1M至1M:5M的范围内;并且所述EGF与所述胆固醇或其衍生物之间的摩尔比例在0.5μM:1M至100μM:1M的范围内。
5.权利要求1-4的囊泡,其特征在于,所述囊泡具有单层结构和大约在25和500nm之间,优选地在50和300nm之间的平均大小。
6.权利要求1-5的囊泡,其中将所述EGF掺入到囊泡双层中。
7.权利要求1-6的囊泡,其特征在于,所述囊泡通过压缩流体(CF)技术来获得。
8.权利要求7的囊泡,其中所述CF技术包括这样的工艺过程,其包括:
a)制备EGF和阳离子型表面活性剂的水溶液,
b)将胆固醇或其衍生物溶解在用CF使之膨胀的有机溶剂中,
c)通过在得自步骤a)的溶液上将得自步骤b)的溶液减压来合成囊泡。
9.权利要求8的囊泡,其中所述阳离子型表面活性剂为季铵类型的阳离子型表面活性剂。
10.用于制备包含EGF、阳离子型表面活性剂和胆固醇或其衍生物的囊泡的方法,其特征在于,所述方法包括:
a)制备EGF和阳离子型表面活性剂的水溶液,
b)将胆固醇或其衍生物溶解在用CF使之膨胀的有机溶剂中,
c)通过在得自步骤a)的溶液上将得自步骤b)的溶液减压来合成囊泡。
11.权利要求10的方法,其中所述阳离子型表面活性剂为季铵类型的阳离子型表面活性剂。
12.权利要求10的方法,其中步骤b)的有机溶剂为选自下列的溶剂:一元醇、多元醇、酮类、乙二胺、乙腈、乙酸乙酯和其混合物。
13.权利要求10的方法,其中所述CF为选自下列的化合物:二氧化碳、乙烷、丙烷、氟氯烃和含氟烃。
14.权利要求10-13的方法,其中CF的量与有机溶剂的量之间的比率相应于大约0.3至0.95,优选地0.5至0.8的摩尔分数。
15.权利要求10-13的方法,其中在具有大约1至30MPa的压力和大约10至70℃,优选地10至50℃的温度的反应器中施行所述胆固醇或其衍生物在CF中的溶解。
16.权利要求10-15的方法,其中将所述EGF溶解在包含阳离子型表面活性剂的水溶液中,所述阳离子型表面活性剂的浓度在其临界胶束浓度之上。
17.药物组合物,其特征在于,所述药物组合物包含权利要求1-9中任一项的囊泡,和至少一种药学上可接受的赋形剂。
18.权利要求17的组合物,其特征在于,所述组合物可以通过全身、损伤内、粘膜、局部、透皮、眼途径进行施用,或者作为吸入制剂进行施用。
19.权利要求1-9中任一项的囊泡用于制备药物的用途。
20.权利要求19的用途,其中所述药物用于治疗任何外周软组织部位的复杂伤口。
21.权利要求20的用途,其中所述复杂伤口为糖尿病性足溃疡。
22.权利要求20的用途,其中所述复杂伤口为静脉溃疡、褥疮性溃疡或烧伤。
23.权利要求19的用途,其中所述药物用于治疗成人呼吸窘迫。
24.权利要求19的用途,其中所述药物用于治疗消化道损伤。
25.权利要求24的用途,其中所述药物用于治疗粘膜炎、溃疡性结肠炎、十二指肠溃疡或末端结肠炎。
26.权利要求19的用途,其中所述药物用于治疗眼损伤。
27.美容产品,其特征在于,所述美容产品包含权利要求1-9中任一项的囊泡,和至少一种赋形剂。
28.权利要求1-9中任一项的囊泡用于制备美容产品的用途。
29.权利要求28的用途,其中所述美容产品为用于预防皮肤的衰老和老化的产品。
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ELISA ELIZONDO等: "Influence of the Preparation Route on the Supramolecular Organization of Lipids in a Vesicular System", 《JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY》, vol. 134, 28 December 2011 (2011-12-28), pages 1918 - 1, XP002716085, DOI: doi:10.1021/ja2086678 * |
唐冰等: "人表皮活性因子柔性纳米脂质体的制备及相关性质研究", 《中国药业》, vol. 22, no. 23, 5 December 2013 (2013-12-05), pages 12 - 14 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN113727727A (zh) * | 2019-03-18 | 2021-11-30 | 遗传工程与生物技术中心 | 表皮生长因子在治疗糖尿病性足溃疡中的用途 |
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