BR112015002103B1

BR112015002103B1 - Vesícula, processo para a preparação de vesículas, composição farmacêutica, uso de uma vesícula, e, produto cosmético

Info

Publication number: BR112015002103B1
Application number: BR112015002103-4A
Authority: BR
Inventors: Héctor Jesús Santana Milián; Leonor Ventosa Rull; Eduardo Martínez Díaz; Jorge Amador Berlanga Acosta; Ingrid Cabrera Puig; Jaume Veciana Miró
Original assignee: Centro De Ingeniería Genética Y Biotecnologia; Consejo Superior De Investigaciones Científicas
Priority date: 2012-08-02
Filing date: 2013-08-02
Publication date: 2022-11-29
Also published as: RU2015106683A; CA2880404C; JP6251740B2; US20150182590A1; CN104684575B; EP2915541A1; AU2013299036A1; AR091951A1; JP2015527337A; AU2013299036B2; EP2915541B1; KR20150041795A; CL2015000254A1; HUE033286T2; RU2649781C2; CU20120112A7; SI2915541T1; US11510965B2; HK1210970A1; CU24121B1

Abstract

VESÍCULA, PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE VESÍCULAS, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, USO DE UMA VESÍCULA, E, PRODUTO COSMÉTICO. A invenção se refere a vesículas que compreendem o fator de crescimento epidérmico (EGF), um tensoativo catiônico, e colesterol ou seus derivados. A invenção também descreve um procedimento para sua preparação, com base na tecnologia de fluidos comprimidos (FCs). As vesículas da invenção têm utilidade na fabricação de medicamentos e produtos cosméticos, e na engenharia de tecidos.

Description

CAMPO TÉCNICO

[001] A presente invenção está nos campos da medicina humana e veterinária, engenharia de cosméticos e tecidos, particularmente no campo de sistemas de liberação do tipo vesicular, compreendendo fator de crescimento epidérmico (EGF) em sua composição. As vesículas da invenção apresentam melhor eficiência terapêutica em relação a EGF livre.

DECLARAÇÃO PRÉVIA DA TÉCNICA

[002] Os sistemas de distribuição de medicamento baseiam-se em sistemas vesiculares, em geral lipossomos, compostos de moléculas anfifílicas que incorporam uma substância terapeuticamente ativa, constituem um dos sistemas mais amplamente usados no setor farmacêutico, em decorrência de poderem fornecer maior estabilidade ao princípio ativo, aumentar sua permeabilidade através de membranas biológicas, e permitir liberação lenta do ingrediente ativo sem a necessidade de administrações repetidas.

[003] EGF é um dos principais fatores de crescimento que estimulam proliferação e motilidade celular durante regeneração tecidual. Também auxilia a manter a hemostasia tecidual por meio da regulação de proliferação e migração de célula epitelial. Além disso, EGF induz a angiogênese, que fornece suporte nutricional ao tecido (Hudson e McCawley, Microsc. Res. Tech. 1998, 43: 444-455; Koivisto et al., Exp. Cell Res. 2006, 312: 27912805; Liang et al., Wound Repair Regen. 2008, 16: 691-698). Este fator de crescimento apresenta múltiplas aplicações no campo farmacêutico (Wong et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 2001, 18: 51-71; Girdler et al., Am. J. Clin. Oncol. 1995, 18: 403-406; Haedo et al., Rev. Esp. Enferm. Dig. 1996, 88: 409-413; Majima, Ophthalmologica 1998, 212:250-256); em cosméticos (Hasegawa e Yamamoto, Mech. Ageing. Dev. 1992, 66:107-114, Patent No. US 5.618.544) e na engenharia de tecidos (Christopher et al., Biomacromolecules 2011, 12: 3139-3146).

[004] Formulações de EGF usando diferentes sistemas de lipossomo foram desenvolvidas. Alguns exemplos são integração de EGF em lipossomos unilamelares compreendendo fosfatidilglicerol (PG), fosfatidilcolina (PC) e colesterol (Brown et al., Ann. Surg. 1988, 208: 788-794). A inclusão de EGF também foi relatada em lipossomos multilamelares compreendendo PC, colesterol e ácido hialurônico (Yerushalmi, et al., Arch. Biochem. Biophys. 1994, 313: 267-273); ou compreendendo colesterol e dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) (Alemdaroglu et al., J. Biomed. Mater. Res. A 2008, 85A: 271-283; Degim et al., Int. Wound. J. 2011, 8: 343-354). Uma outra classe de lipossomos que foi relatada são aquelas multivesiculares compreendendo dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dimiristoil fosfatidilglicerol (DMPG), colesterol e trioleína (Li et al., Arch. Pharm. Res. 2005, 28: 988-994).

[005] Por outro lado, lipossomos que compreendem lipídeos catiônicos conjugados ao EGF foram relatados (Kikuchi et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996, 227: 666-671); lipossomos revestidos com polietilieno glicol (PEG), que também compreendem colesterol e dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE) em combinação com PC ou DPPC (Li et al., Int. J. Pharm. 2003, 258: 11-19). Lipossomos compreendendo DPPC e lisofosfatidilcolina (LPC) também foram relatados (Saddi et al., The Angle Orthodontist 2008, 78: 604-609; Alves et al., Life Sci. 2009, 85: 693-699).

[006] Formulações de EGF usando sistemas lipossomais também foram protegidas por patentes, tais como aquelas que revelam a composição de EGF/lipossomo em gel e métodos compreendendo a captura de EGF em lipossomos contendo fosfolipídeos carregados negativamente e neutros (Patente U.S. 4944948); a composição em gel de lipossomos e métodos que usam lipossomos carregados negativamente e EGF, e incluem lipídeos carregados negativamente tais como: PG, PC e colesterol (pedido de patente internacional WO 9009782). Um outro pedido de patente diz respeito a aplicação tópica de EGF em lipossomos para prevenir amputação do pé diabético, e lipossomos compreendendo PC e desoxicolato de sódio são usados. Este pedido de patente é restrito ao uso de qualquer tipo de lipossomos/niossomos de EGF para o tratamento tópico de lesões isquêmicas crônicas graus IV e V de pé diabético (Pedido de patente internacional WO 2007/073704). Na técnica anterior, integração de EGF em sistemas vesiculares constituída por colesterol e agentes tensoativos catiônicos não foi observada.

[007] Métodos tradicionais para obter lipossomos, tal como evaporação de filme fino (Agrawal et al., J. Liposome Res. 2005, 15: 141155), desidratação-reidratação (Kirby e Gregoriadis, Nat. Biotechnol. 1984, 2: 979-984), congelamento-descongelamento (Ristori et al., Biophys. J. 2005, 88: 535-547) e extrusão (MacDonald et al., Biochim. Biophys. Acta 1991, 1061: 297-303) apresentam certos inconvenientes. Alguns destes inconvenientes estão associados ao uso de grandes quantidades de solventes, que são difíceis de eliminar posteriormente, ou com as temperaturas elevadas exigidas por alguns destes métodos, limitando seu uso às substâncias termicamente estáveis. Por outro lado, o tamanho e nanoestruturação do material são difíceis de controlar e estes métodos apresentam pouca reprodutibilidade durante o aumento em escala (processos multi-estágio). Um outro problema com preparações de lipossomo é sua pouca estabilidade.

[008] O processamento de materiais com fluidos comprimidos (FCs), ou gases densos, tanto no estado líquido quanto supercrítico, como solventes, tem estimulado boa expectativa nos níveis acadêmicos e industriais, para preparar materiais micro ou nanoestruturados tais como: materiais particulados, sistemas vesiculares, partículas de compósito, superfícies estruturadas, etc., com melhor homogeneidade estrutural do que aquela atingida por processamento convencional (Holmes et al., Chem. Eur. J. 2003, 9: 2144-2150; Cooper, Adv. Mater. 2001, 13: 1111-1114; Cooper, Adv. Mater. 2003, 15: 1049-1059 e Woods et al., J. Mater. Chem. 2004, 14: 16631678). Um FC ou um gás denso é uma substância que em condições normais de pressão e temperatura existe como gás, mas com o aumento da pressão pode ser convertido em fluidos líquidos ou supercríticos, e ser usado como meio solvente para processar produto químico e material. O FC mais frequentemente usado é dióxido de carbono (CO2), classificado como solvente verde, em decorrência de ser não tóxico, não inflamável, fácil de remover, não deixar nenhum resíduo nas partículas, não ser caro e fácil de recuperar. Desde os anos 90, foi desenvolvida uma série de metodologias que usa FCs para preparar materiais divididos de maneira fina, com tamanhos de partícula micro, sub-micro e nanoscópicos (Jung e Perrut, J. Supercrit. Fluid, 2001, 20: 179-219). O poder de solvência de FCs pode ser modificado por alterações de temperatura e composição, como no caso de solventes líquidos convencionais, e também por alterações de pressão, que são transmitidas muito mais rapidamente em soluções. Portanto, estes métodos de precipitação apresentam em comum a possibilidade de atingir graus muito elevados de supersaturação em intervalos de tempo muito curtos, promover a nucleação pelo crescimento de cristal e obter por maio disso micro ou nanopartículas com distribuições de tamanho muito próximas, estrutura interna controlada e organização supramolecular.

[009] Um dos processos para obter materiais micro ou nanoestruturados com FCs é o método denominado DELOS-SUSP - Despressurização de uma solução-suspensão orgânica líquida expandida- (Pedido de patente internacional WO 2006/079889; patente EP 1843836; Cano-Sarabia et al., Langmuir 2008, 24: 2433-2437), que baseia-se em despressurização de uma solução orgânica previamente expandida por um FC, gerando tanto um sistema micro quanto um nanodisperso pela dita despressurização. Neste processo, o FC age como co-solvente, sendo completamente miscível em certas condições de pressão e temperatura, com a solução orgânica do soluto a ser estabilizado como sistema micro ou nanodisperso. A dita estabilização é atingida na presença de aditivos no meio, em geral aquoso, em que a despressurização da solução expandida é realizada. Os aditivos podem ser emulsificadores, detergentes iônicos e não iônicos, agentes tensoativos, estabilizantes e protetores em coloide. Usando este método, sistema micro- e/ou nanodisperso, tais como lipossomos, emulsões ou suspensões, pode ser obtido. Os lipossomos ou vesículas são compostos de colesterol e outros agentes de membrana, tais como fosfolipídeos e agentes tensoativos, e sua preparação exige a dissolução de colesterol e/ou outros lipídeos na solução orgânica expandida e sua despressurização em uma solução tensoativa aquosa.

[0010] Para a possível incorporação de compostos ativos em vesículas ou lipossomos por DELOS-SUSP, e para gerar as vesículas correspondentes, exige-se que dissolver o ingrediente ativo na solução expandida inicial, ou na solução aquosa, em que a despressurização da dita solução expandida seja realizada e, em ambos os casos, esta dissolução tenha que ser realizada na presença de lipídeos, detergentes ou agentes tensoativos ativos.

[0011] Entre os agentes tensoativos catiônicos, aqueles do tipo amônio quaternário (QUATs) têm sido amplamente usados em produtos farmacêuticos e cosméticos. No campo farmacêutico, têm sido usados por vias tópicas, oftálmicas, orais, bucais e nasais. Previamente, foi relatada a preparação de nanovesículas de colesterol:brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB) usando tecnologia de DELOS-SUSP. Um exemplo da incorporação de compostos solúveis em água por esta tecnologia é descrito na referência " Liposomes and other vesicular systems: structural characteristics, methods of preparation, and use in nanomedicine " (Progress in Molecular Biology and Translational Science, Elsevier, 2011, vol.104, pp. 1-52), onde as vesículas de colesterol:CTAB são usadas como vesícula para encapsulação e administração do antibiótico gentamicina. Tem sido enfatizado que as encapsulações de gentamicina relatadas são muito baixas (<2 %). Este tipo de vesícula nunca foi usado para incorporar proteínas. Sabe-se que detergentes iônicos são agentes que causam desnaturação de proteína (Akin et al., Anal. Biochem. 1985, 145: 170-176; Andersen et al., J. Mol. Biol. 2009, 391: 207-226). A desnaturação de albumina sérica humana após a adição de CTAB foi recentemente demonstrada pela espectroscopia de Raman (Vlasova e Saletsky, Laser Phys. 2011, 21: 239-244). Desnaturação, como uma regra, é acompanhada pela perda de propriedades funcionais da proteína.

[0012] Em virtude de todas as razões anteriormente mencionadas, ainda é de interesse atingir novos sistemas de liberação de EGF, fácil de padronizar, com elevada homogeneidade no nível estrutural e em suas propriedades físico-químicas, que melhoram as propriedades farmacêuticas e farmacológicas e/ou aumentam a atividade terapêutica de EGF.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[0013] A presente invenção diz respeito às vesículas, como sistema de distribuição de medicamento, que compreendem EGF, um agente tensoativo catiônico e colesterol ou um de seus derivados, e apresentam melhor eficiência terapêutica do que aquela previamente descrita.

[0014] A presente invenção também diz respeito a um processo para a preparação das ditas vesículas compreendendo EGF, um agente tensoativo catiônico e colesterol ou derivados destes, que incluem: a) preparação de uma solução aquosa de EGF e um agente tensoativo catiônico, b) a dissolução de colesterol ou um de seus derivados em um solvente orgânico expandido com um FC, c) a síntese das vesículas por despressurização da solução resultante do estágio b) na solução resultante do estágio a).

[0015] Uma composição farmacêutica caracterizada por compreender vesículas que incluem EGF, um agente tensoativo catiônico e colesterol, ou derivados destes, e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável também é um objetivo da invenção. Um outro objetivo da invenção é o uso das ditas vesículas para a fabricação de medicamentos e cosméticos.

[0016] As composições farmacêuticas desta invenção, que contêm vesículas com EGF com outros componentes, são usadas como medicamentos para acelerar o processo de cicatrização de úlceras de pé diabético e outras feridas complexas, tais como: úlceras venosas, úlceras venosas de decúbito, queimaduras, entre outros; para reparar as estruturas de câmara anterior em olhos avariados, em mucosite sistêmica e em todas as doenças to trato gastrointestinal que envolvem a necessidade de regenerar mucosa e submucosa. Em particular, observa-se que estas vesículas apresentam eficiência terapêutica significativamente melhor para cicatrizar úlceras de pé diabético e úlceras venosas do que aquelas descritas na técnica anterior.

[0017] A invenção também diz respeito a um produto cosmético caracterizado por compreender vesículas de EGF, um agente tensoativo catiônico e colesterol ou derivados destes.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0018] Figura 1. Representação esquemática de um equipamento para obter vesículas compreendendo EGF, um agente tensoativo catiônico e colesterol ou um derivado de colesterol onde: C, Coletor; H, Permutador térmico; P, Bomba; R, Reator; V, Válvula; RD, Disco de ruptura; ST, Agitador; FL, Filtro; TI, Indicador de temperatura; PI, Indicador de pressão; PIC, Controlador do indicador de pressão; F, Medidor de fluxo.

[0019] Figura 2. Distribuição por tamanho de partícula por dispersão dinâmica da luz (DLS) das vesículas que mantêm uma razão constante de CTAB:colesterol em 1 M:1 M e que variam a razão EGF:colesterol (0 μM:1 M (—-), 5 μM:1 M (-*--), 15 μM:1 M (—e-), 25 μM:1 M ( ■ ) e 40 μM:1 M (- *- -) (A); e que mantêm a relação de brometo de tetradecil metilamônio (cetrimida):colesterol constante em 1 M:1 M e que variam a razão EGF: colesterol (0μM:1M (--^--), 5 μM:1 M (^—), 15 μM:1 M (- *- -), 25 μM:1 M ( ■ ) e 40 μM:1 M ( ■-- ) (B).

[0020] Figura 3. Figuras de microscopia eletrônica por crio- transmissão (Crio-TEM) de vesículas com EGF com composição colesterol:CTAB:EGF (A), colesterol:cetrimida:EGF (B), composição colesterol:cloreto de benzalcônio (BKC):EGF (C) e μ-Sitosterol:CTAB:EGF (D) com razão de QUATs:colesterol ou μ-Sitosterol de 1M:1M e razão EGF:colesterol ou μ-Sitosterol de 5 μM:1 M.

[0021] Figura 4. Atividade biológica específica de diferentes preparações de EGF em um ensaio de proliferação celular, onde EGF livre, lipossomos de DPPC:colesterol (com razão DPPC:colesterol 1M:1M e EGF:colesterol 25μM:1M) e as vesículas CTAB:colesterol (A) e vesículas de cetrimida:colesterol (B) mantendo a razão QUATs:colesterol 1M:1M constante e variando a razão EGF:colesterol (5μM:1M, 15μM:1M e 25μM:1M) são comparados.

[0022] Figura 5. Perfil de degradação proteolítica após exposição à tripsina a 37 °C durante diferentes intervalos de tempo, de EGF livre e diferentes preparações de vesículas mantendo constante a razão CTAB:colesterol (A) e a razão cetrimida:colesterol (B) e 1M:1M, e variando a razão EGF:colesterol (5 μM:1 M, 15 μM:1 M e 25 μM:1 M).

[0023] Figura 6. Fotografias da evolução de cicatrização da úlcera de pé diabético correspondente ao paciente JLG no início do tratamento (A), após 4 semanas (B) e 8 semanas (C) de tratamento com uma formulação de aspersão tópica contendo vesículas com razão CTAB:colesterol 1 M:1 M e razão EGF:colesterol 5 μM:1 M, com uma concentração de EGF equivalente de 15 μg/mL.

[0024] Figura 7. Fotografias da evolução de cicatrização da úlcera de pé diabético correspondente ao paciente ZEM no início do tratamento (A), após 4 semanas (B) e 8 semanas (C) de tratamento. Durante as primeiras 4 semanas o tratamento foi realizado por infiltração com uma formulação parenteral contendo vesículas com razão BKC:colesterol 1 M:1 M e razão EGF:colesterol 5 μM:1 M, com uma concentração equivalente de EGF de 75 μg/mL. Nas outras 4 semanas, até completar 8 semanas, o tratamento foi realizado usando uma formulação de aspersão tópica contendo vesículas com razão CTAB:colesterol 1 M:1 M e razão EGF:colesterol 5 μM:1 M, com uma concentração equivalente de EGF de 15 μg/mL.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0025] A presente invenção fornece vesículas que são caracterizadas compreendendo fator de crescimento epidérmico (EGF), um agente tensoativo catiônico e colesterol ou derivados destes. Em uma modalidade da invenção, o agente tensoativo catiônico é do tipo amônio quaternário.

[0026] No contexto desta invenção, o termo “EGF” refere-se a qualquer variante das moléculas de EGF que mantém sua atividade biológica; por exemplo, moléculas C-terminais truncadas (Calnan et al., Gut 2000, 47: 622-627); ou moléculas truncadas no N-terminal (Svodoca et. al., Biochim. Biophys. Acta 1994, 1206: 35-41; Shin et al., Peptides 1995, 16: 205-210). EGF pode ser obtido por tecnologia do DNA recombinante usando leveduras como Saccharomyces (Valdés et al., Biotecnol. Apl. 2009, 26: 1-9) ou Pichia pastoris (Research Journal of International Studies 2009, 10: 36-46); usando bactérias, tais como Escherichia coli (Yoon et al., Biotechnol. Bioprocess Eng. 1997, 2: 86-89; Abdull Razis et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 2008, 144: 249-261); ou por métodos de síntese química (Shin et al., Peptides 1995, 16: 205-210). O objetivo de EGF da invenção também compreende seja qual for o variante obtido pelos métodos previamente descritos, após ser modificado por qualquer procedimento da técnica anterior tal como: substituição de aminoácido (Shiah et al., J. Biol. Chem. 1992, 267: 2403424040; Lahti et al., FEBS Lett. 2011, 585: 1135-1139; Pedido de patente internacional WO 2007/065464), e conjugação de polietileno glicol (Thomas et al., Bioconjugate Chem. 2001, 12: 529-537; Lee et al., Pharm. Res. 2003, 20: 818-825), ou qualquer outro método de modificação química ou genética.

[0027] O termo “agente tensoativo catiônico” refere-se àqueles agentes tensoativos com pelo menos uma carga positiva na molécula e também inclui a combinação de um ou mais agentes tensoativos catiônicos. Por exemplo, de acordo com a presente invenção, agentes tensoativos catiônicos do tipo sal de amina terciária, sal de amônio quaternário e alquil amônio em heterociclos saturados e insaturados podem ser usados.

[0028] Na invenção, o termo “agente tensoativo catiônico tipo amônio quaternário (QUATs)” refere-se aos sais de amônio quaternário em que pelo menos um substituinte de nitrogênio é uma cadeia longa. Compostos tais como CTAB, cetrimida e BKC ou suas misturas são incluídos entre QUATs. Em uma modalidade preferida da presente invenção, o agente tensoativo catiônico usado é um agente tensoativo aceitável em produtos farmacêuticos. O QUATs, bem como o restante dos agentes tensoativos catiônicos, pode ser obtido de fontes disponíveis comercialmente, com qualidades farmacêuticas e cosméticas.

[0029] Na presente invenção, o termo “vesículas” refere-se a micropartículas e nanopartículas coloidais, as quais apresentam entre 25 nm e 5 μm e são formadas por uma ou mais bicamadas de moléculas anfifílicas que contêm uma fase aquosa.

[0030] Em uma modalidade da invenção, as vesículas apresentam uma razão molar de agente tensoativo catiônico para colesterol (ou derivados destes) na faixa de 10 M:1 M a 1 M:5 M e uma razão molar de EGF para colesterol (ou seus derivados destes) que está na faixa de 0,5 μM:1 M a 100 μM:1 M.

[0031] O termo “derivados” de colesterol, na presente invenção, refere-se às moléculas da família dos esteroides, em geral obtidas a partir da molécula precursora de colesterol e que apresentam característica lipofílica.

[0032] Em uma modalidade da invenção, as vesículas compreendendo EGF são caracterizadas por apresentar estrutura unilamelar e tamanho médio aproximado entre 25 e 500 nm, preferivelmente entre 50 e 300 nm. Em uma modalidade particular, a invenção refere-se às vesículas nas quais EGF é incorporado na bicamada da vesícula. O tamanho e morfologia aproximados das vesículas são avaliados por Cryo-TEM e a distribuição do tamanho de vesícula é caracterizada por DLS.

[0033] De maneira surpreendente, as vesículas da invenção apresentam aumento significativo no potencial biológico de EGF (mensurado in vitro) comparado à EGF livre e EGF em colesterol:lipossomos DPPC. Além disso, estas vesículas são capazes de proteger EGF contra o ataque à protease, uma característica muito importante para atingir a biodisponibilidade adequada de EGF no sítio de ação; portanto, aumentando sua eficiência terapêutica.

[0034] Na presente invenção, para o primeiro momento, vesículas com EGF que melhoram algumas das propriedades farmacêuticas e farmacológicas deste fator de crescimento, tais como sua eficiência e estabilidade, foram sintetizadas. Observa-se que o grau de incorporação de EGF na estrutura das vesículas permanece estável por pelo menos um ano. Adicionalmente, possibilitam o aumento de permeabilidade através de membranas biológicas.

[0035] As vesículas da invenção apresentam a vantagem adicional de efeito antimicrobiano e antifúngico, que é desejável em composições usadas no tratamento de feridas complexas e outras lesões susceptíveis de tratamento de EGF.

[0036] Em uma modalidade da invenção, as vesículas compreendendo EGF são obtidas por tecnologia FC. Em uma modalidade particular, a tecnologia FC que é usada para obter as vesículas inclui um processo compreendendo a) preparação de uma solução aquosa de EGF e um agente tensoativo catiônico, b) dissolução de colesterol ou derivados destes em um solvente orgânico expandido com um FC, e c) síntese de vesícula por despressurização da solução resultante do estágio b) nas soluções resultantes a partir do estágio a). Em uma modalidade preferida, o agente tensoativo catiônico usado no estágio a) é do tipo quaternário de amônio.

[0037] A invenção também fornece um processo para preparar vesículas que compreendem EGF, um agente tensoativo catiônico e colesterol ou seus derivados, caracterizado por compreender a) a preparação de uma solução aquosa de EGF e um agente tensoativo catiônico, b) dissolução de colesterol ou derivados destes em um solvente orgânico expandido com um FC, e c) síntese de vesícula por despressurização da solução resultante em estágio b) na solução resultante em estágio a). Em uma modalidade da invenção, o processo descrito anteriormente inclui um agente tensoativo catiônico do tipo amônio quaternário.

[0038] Em uma modalidade da invenção, o solvente orgânico no estágio b) do processo anteriormente mencionado é um solvente selecionado do grupo formado por álcoois monoídricos tais como: etanol, metanol, 1- propanolol, 2-propanolol, 1-butanol, 1-hexanol, 1-octanol e trifluoroetanol; álcoois poli-hídricos tais como: propileno glicol, PEG 400 e 1,3-propanediol; cetonas tais como acetona, metil etil cetona e metil isobutil cetona; etilenodiamine, acetonitrila, acetato de etila e misturas destes. Em qualquer caso, qualquer que seja a natureza do solvente orgânico, o componente lipídico tem que ser solúvel neste e, adicionalmente, o dito solvente tem que ser necessariamente miscível em FC e água. Além do mais, o solvente orgânico selecionado deve apresentar toxicidade relativamente baixa.

[0039] A concentração relativa de EGF e agente tensoativo na solução tampão inicial e a concentração de colesterol no solvente orgânico são determinadas pela razão desejada de colesterol:agente tensoativo catiônico:EGF na vesícula final. Em geral, a razão colesterol: agente tensoativo catiônico:EGF pode influenciar as propriedades físico-químicas e biológicas das diferentes vesículas obtidas.

[0040] Em uma outra modalidade da invenção, o FC usado no processo descrito anteriormente é um componente selecionado entre CO2, etano, propano, hidroclorofluorcarbonos (por exemplo, CFC-22), e hidrofluorcarbonos (por exemplo, HFC-134A). Preferivelmente, o FC no estágio b) é CO2, considerado um solvente ecológico, em decorrência de ser não tóxico, não inflamável, não corrosivo, não ser prejudicial para o ambiente e além do mais, é muito abundante na natureza.

[0041] Em uma modalidade da invenção, o processo para preparação de vesícula de EGF é realizado em um aparelho, da maneira mostrada na figura 1. Isso consiste em um reator de alta-pressão (R) no qual uma solução de colesterol em etanol em concentração (C1) é adicionada em pressão atmosférica e temperatura de funcionamento (T=Tw). Em um segundo estágio, CO2 comprimido é adicionado até a pressão de funcionamento (P=Pw) ser atingida, produzindo expansão volumétrica da solução em uma fração molar XCO2. A adição é realizada por meio da válvula V-1 usando bomba P1, mantendo o restante das válvulas fechadas. O sistema é mantido em pressão Pw e temperatura Tw, durante um período especificado, para garantir a homogeneização completa e equilíbrio térmico. Após este período, V-4 é aberta para conectar o reator R ao filtro FL, que foi previamente pressurizado com N2 em Pw mantendo o restante das válvulas fechadas. A abertura de V-6 permite a despressurização da solução volumetricamente expandida em uma solução aquosa de EGF em concentração (C2), e o agente tensoativo em concentração (C3) foi bombeado por meio de P2. Neste estágio final, ums fluxo de N2, adicionado por meio de V-2 em Pw, é usado como pistão para acionar a solução expandida e manter a pressão constante no reator durante o estágio de despressurização. A presença de filtro FL permite coletar qualquer precipitado que pode ser formado durante o processo. As vesículas formadas são coletadas em recipiente C e subsequentemente armazenadas em garrafas de vidro a 4°C. Uma vez que a despressurização é finalizada, V-6 e V-2 são fechadas e a despressurização do equipamento continua reabrindo V-6.

[0042] Em uma modalidade da invenção, a relação entre a quantidade de FC e solvente orgânico corresponde a uma fração molar de FC de aproximadamente 0,3 a 0,95; preferivelmente de 0,5 a 0,8. Em uma modalidade particular, a dissolução de colesterol (ou derivados destes) em um FC é realizada em um reator em uma pressão Pw de aproximadamente 1 a 30 MPa, e uma Tw de aproximadamente 10 a 70°C. Preferivelmente, a temperatura aproximada do reator é entre 10 e 50°C.

[0043] No processo da invenção, EGF é dissolvido em uma solução aquosa contendo um agente tensoativo catiônico, cuja concentração é abaixo de concentração mucelar crítica.

[0044] De maneira surpreendente, as vesículas de colesterol:QUATs: EGF, sintetizadas usando o processo descrito anteriormente, apresentam rendimentos de incorporação de vesícula de EGF muito próximo de 100 %, que são significativamente maiores do que aqueles esperados para a incorporação de qualquer molécula solúvel em água, levando-se em consideração os resultados anteriormente relatados para gentamicina. Estes rendimentos em vesículas de colesterol:QUATs:EGF são também notavelmente maiores que aqueles obtidos para a incorporação de outras proteínas com propriedades estruturais similares à EGF, como a proteína albumina bovina sérica (BSA) solúvel em água. Isto ocorre quando o procedimento anteriormente descrito DELOS-SUSP é usado pela dita incorporação de BSA, uma vez que apenas um rendimento de incorporação de 42 % é obtido.

[0045] Além do mais, e também de uma maneira surpreendente, estes rendimentos de incorporação de EGF em vesículas de colesterol:QUATs são evidentemente melhores que aqueles obtidos para vesículas de colesterol:DPPC:EGF, mesmo se o processo de DELOS-SUSP for usado para prepará-las.

[0046] Um outro aspecto da presente invenção é uma composição farmacêutica compreendendo as vesículas que compreendem EGF, um agente tensoativo catiônico e colesterol ou derivados destes e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável. O excipiente ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis, que formam parte da composição farmacêutica da presente invenção, podem melhorar a atividade da vesícula. Alternativamente, podem auxiliar na cicatrização e processamento da composição da presente invenção. As vesículas com EGF da presente invenção podem ser formuladas em formas farmacêuticas graves, tais como: injetáveis, aspersão, géis, soluções viscosas, cremes, emplastros, adesivos transdérmicos, depósitos, formulações inaladas e outros conhecidos pelos versados na técnica.

[0047] Vários excipientes podem ser misturados durante a síntese das vesículas desta invenção ou após para formar um material adequado para as formas de dosagem anteriormente mencionadas. Em geral, excipientes; tais como solubilizantes ou solventes, agentes tensoativos, modificadores de pH, antioxidantes, diluentes, sistemas de matriz, agentes de complexação, melhoradores de viscosidade, dispersantes, umectantes, colorantes, flavorizantes, conservantes, melhoradores de permeabilidade e outros; podem ser usados para propósitos comuns e em quantidades típicas sem afetar as características das composições da presente invenção, da maneira conhecida pelos versados na técnica (Remington’s Pharmaceutical Sciences (1995)). Exemplos adicionais de excipientes que podem ser usados nas formulações farmacêuticas de vesículas com EGF podem ser encontrados no Handbook of Pharmaceutical Excipients (6a edição).

[0048] Em uma modalidade da presente invenção, a composição farmacêutica é uma forma de liberação controlada ou de liberação contínua.As formas de liberação controlada ou contínua em geral incluem sistemas de matriz, resinas de troca iônica, ou barreiras individuais para controlar a difusão das vesículas com EGF.

[0049] Em uma modalidade da invenção, para a preparação de composições farmacêuticas, as vesículas com EGF são condicionadas por um processo de concentração-diafiltração usando aparelho conhecido neste campo técnico. As composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas por várias vias, entre estas: sistêmica, intralesional, mucosa, tópial, transdérmica, oftálmica, ou como formulação inalada.

[0050] Em um outro aspecto, a presente invenção compreende o uso de vesículas de EGF, um agente tensoativo catiônico, e colesterol ou derivados destes na fabricação de um medicamento. Em uma modalidade da invenção, o dito medicamento é pretendido para o tratamento de doenças nas quais é exigido para auxiliar nos processos de cicatrização e regeneração tecidual em qualquer espécie de mamífero; em que os agentes tensoativos catiônicos, colesterol e EGF que formam as ditas vesículas são aceitáveis em produtos farmacêuticos. Em uma modalidade preferida, o mamífero é um humano.

[0051] O dito uso médico compreende administrar uma quantidade eficiente das ditas vesículas para tratar uma doença que exige a administração exógena de EGF para regular os processos de proliferação, crescimento e migração de células epiteliais ou para induzir a angiogênese.

[0052] Em geral, considera-se que uma concentração eficiente para a administração de vesículas com EGF da presente invenção (ou a composição compreendendo as mesmas) pode ser 1,0 a 200 μg/mL de equivalentes de EGF, preferivelmente 5,0 a 100 μg/mL de equivalentes de EGF por administração. O volume e frequência de administração depende do tipo de lesão, do tamanho e do dispositivo de administração usado, assim como é bem conhecido pelos versados na técnica. Também pode ser apropriado administrar a dose exigida em duas, três, quatro ou mais sub-doses nos intervalos apropriados durante o dia.

[0053] A dose e frequência exata de administração depende da condição particular que é tratada e sua gravidade, idade, peso, sexo, extensão de doença, e a condição física geral do paciente, bem como em qualquer de outras medicações concomitantes administradas ao indivíduo, como isso é bem conhecido pelos versados na técnica. Adicionalmente, é evidente que a quantidade diária eficiente pode diminuir ou aumentar, dependendo de como o paciente responde à medicação, e/ou o modo de avaliação realizado pelo médico qe prescreveu o medicamento da presente invenção. Assim, as quantidades diárias eficientes listadas anteriormente devem ser consideradas como diretrizes ou recomendações.

[0054] Em uma modalidade da invenção, o medicamento sintetizado com as vesículas da invenção é usado para tratar feridas complexas de qualquer tecido macio periférico. Em uma modalidade particular, a ferida complexa é uma úlcera de pé diabético. Em uma outra modalidade particular, o medicamento é usado para o tratamento de úlceras venosas, úlceras venosas de decúbito ou queimaduras.

[0055] Em uma outra modalidade da invenção, o medicamento é usado para tratar uma doença tal como síndrome do estresse respiratório no adulto. O medicamento sintetizado com as vesículas da invenção é também usado para o tratamento de lesões do trato digestivo tais como colite ulcerativa, úlceras duodenais e colite distal. Em uma outra modalidade, o medicamento é usado para o tratamento de lesões oculares.

[0056] Um produto cosmético caracterizado por compreender vesículas de EGF, um agente tensoativo catiônico, e colesterol ou derivados destes, e pelo menos um excipiente aceitável para cosméticos ou produtos farmacêuticos dérmicos é também parte da presente invenção. Neste aspecto da invenção, agentes tensoativos catiônicos, colesterol (ou derivados destes) e EGF são aceitáveis em produtos farmacêuticos e cosméticos.

[0057] As vesículas com EGF da presente invenção podem ser formuladas em várias formas cosméticas ou produtos farmacêuticos dérmicos, como sólidos, líquidos e semi-sólidos, tal como e não restrito a: injeções, líquidos atomizados por aspersão, géis, cremes, emulsões múltiplas, dispersões aquosas, leites, bálsamos, loções, espumas, soros, emplastros, adesivos transdérmicos, lenços, depósitos, bálsamos, pós, barras, formulações inaladas e similares, em todos os casos, incluindo as formulações de lavagem e de permanência.

[0058] Em geral, a composição farmacêutica cosmética ou dérmica da invenção pode conter excipientes tais como, mas sem limitação, solubilizantes ou solventes, agentes tensoativos, modificadores de pH, antioxidantes, diluentes, sistemas de matriz, agentes de complexação, melhoradores de viscosidade, dispersantes, umectantes, polímeros de gelificação, espessantes, amaciantes, estabilizantes, absorvedores de odor, agentes de quelação, extratos de planta, óleos essenciais, extratos marinhos, agentes obtidos de um processo de biofermentação, sais minerais, extratos celulares e filtros solares (agentes fotoprotetores de natureza orgânica ou mineral, ativos contra raios ultravioleta A e/ou B), pigmentos ou corantes, flavorizantes, conservantes, melhoradores de permeabilidade e outros, e misturas destes, contanto que sejam fisicamente e quimicamente compatíveis com os outros componentes da composição da presente invenção. Estes excipientes podem ser usados para os propósitos comuns e em quantidades típicas sem afetar as características das composições da presente invenção, da maneira conhecida pelos versados na técnica neste campo técnico (Exemplos adicionais podem ser encontrados descritos no CTFA Cosmetic Ingredient Handbook, 12a Edição (2008)). A natureza de tais adjuvantes adicionais pode ser sintética ou natural em origem, por exemplo, como extratos de planta, ou obtida de um processo de biofermentatção.

[0059] Portanto, o uso das vesículas com EGF previamente descritas para a fabricação de um produto cosmético também é um objetivo da presente invenção. Em uma modalidade da invenção, o produto cosmético é para prevenir a senescência e envelhecimento da pele.

Exemplos

[0060] Os exemplos a seguir são mostrados com propósitos ilustrativos e não devem ser considerados como limitações para a invenção.

Exemplo 1. Síntese de vesículas de colesterol:DPPC:EGF usando tecnologia de fluido comprimido

[0061] Em primeiro lugar, uma solução de 12 mg de colesterol e 24 mg de DPPC em 1,2 mL de etanol é introduzida em um reator de alta pressão de volume de 6 mL, em pressão atmosférica e temperatura (Tw= 35 °C). CO2 comprimido é adicionado, causando expansão volumétrica da solução para atingir uma fração molar XCO2 = 0,7 e uma pressão de funcionamento PW = 10 MPa. O sistema é deixado em agitação durante aproximadamente 60 minutos a 10 MPa e 35 °C, para atingir homogeneização completa e equilíbrio térmico. Finalmente, a solução orgânica expandida é despressurizada a partir da pressão de funcionamento até pressão atmosférica, em 24 mL de uma solução aquosa de EGF na concentração desejada (entre 15 μM e 40 μM). Nesta última etapa, um fluxo de N2 em 10 MPa é usado como pistão para acionar a solução volumétrica expandida para manter uma pressão de funcionamento constante no reator durante despressurização. Subsequentemente, as vesículas são transferidas para um recipiente hermeticamente fechado e armazenadas até o uso a 5 ± 3 °C

[0062] Em função disso, vesículas DPPC:colesterol (1:1) foram obtidas com EGF incorporado em uma concentração entre 15 μM e 40 μM. A aparência física, tamanho médio, distribuição por tamanho de partícula e potencial Z são mostrados na tabela 1. O tamanho médio, distribuição por tamanho de partícula e potencial Z foram determinados por DLS.

[0063] Pode-se observar que as várias preparações de vesícula não apresentam problemas de estabilidade a curto prazo, e apresentam índice de polidispersibilidade de tamanho relativamente pequeno a médio (PDI), o que as torna atraentes no ponto de vista farmacêutico. Entretanto, o potencial Z absoluto é muito pequeno (< +10 mV), bem abaixo dos valores que são considerados para permitir a estabilidade coloidal de sistemas dispersos, os quais são em geral valores absolutos acima de 30 mV (Carrion et al., J. Colloid. Interface Sci. 1994, 164: 78-87). Esta característica indica que a estabilidade a lomgo prazo deste sistema de vesícula pode ser comprometido.Tabela 1. Aparência física, tamanho médio de partícula e potencial Z dos diferentes variantes de vesículas de colesterol:DPPC:EGF para diferentes composições.

Exemplo 2. Síntese de vesículas de colesterol:CTAB:EGF usando tecnologia de fluido comprimido

[0064] Em primeiro lugar, uma solução de 76 mg de colesterol em 2,88 mL de etanol é introduzida em um reator de alta pressão que apresenta um volume de 6 mL, em pressão atmosférica e temperatura de funcionamento (Tw= 35 °C). CO2 comprimido é adicionado, produzindo expansão volumétrica da solução para atingir uma fração molar XCO2 = 0,7 e uma pressão de funcionamento PW = 10 MPa. Para atingir homogeneização completa e equilíbrio térmico, o sistema descansa naturalmente por cerca de 60 minutos em 10 MPa e 35 °C. Finalmente, a solução orgânica expandida é despressurizada a partir da pressão de funcionamento até pressão atmosférica, em 24 mL de uma solução de CTAB em mQ água (C= 2,83 mg/mL) contendo EGF na concentração desejada (entre 1 e 40 μM). Nesta última etapa, um fluxo de N2 at 10 MPa é usado como pistão para empurrar o colesterol em uma solução de etanol para manter uma pressão de funcionamento constante no reator durante despressurização. A seguir, as vesículas são transferidas para um recipiente hermeticamente fechado e armazenadas até o uso a 5 ± 3°C.

[0065] A morfologia das vesículas foi avaliada por cryo-TEM, de acordo com um procedimento que foi previamente descrito (Progress in Molecular Biology and Translational Science, Elsevier, 2011, vol.104, pp. 152).

[0066] Vesículas de CTAB:colesterol (1:1), com EGF incorporado em uma concentração entre 1 μM e 40 μM, foram obtidas. Os resultados para aparência física, tamanho médio e potencial Z são mostrados na tabela 2; a distribuição por tamanho de partícula, na figura 2A e o tamanho e morfologia, por cryo-TEM, na figura 3A. Como pode ser observado na tabela 2, as diferentes preparações, com proporções variadas de EGF:colesterol, ficaram estáveis. Os potenciais Z de todas as preparações foram positivas, e muito acima de + 30 mV, o que prevê elevada estabilidade a longo prazo. Um aumento no tamanho médio e PDI com um aumento na proporção de EGF:colesterol também pode ser observado. Na figura 2A, a distribuição por tamanho de partículas muito homogênea é observada, apresentando um diâmetro médio que não excede 200 nm. A figura 3A mostra que, em relação à morfologia da vesícula estudada por cryo-TEM, as formas esféricas com estrutura unilamelar predominam. As características mencionadas das diferentes preparações de vesícula tornam as mesmas muito atraentes a partir do ponto de vista farmacêutico.Tabela 2. Aparência física, tamanho médio de partícula e potencial Z dos diferentes variantes de vesículas de colesterol:CTAB:EGF para diferentes composições

Exemplo 3. Síntese de vesículas de colesterol:cetrimida:EGF usando tecnologia de fluido comprimido

[0067] Estas vesículas foram sintetizadas de uma maneira similar àquela do exemplo 2, mas neste caso, uma solução aquosa de cetrimida com uma concentração de 2.61 mg/mL foi usada. Vesículas de cetrimida:colesterol (1:1) foram obtidas, com EGF incorporado em uma concentração entre 1 μM e 40 μM. Os resultados de aparência física, tamanho médio e potencial Z são mostrados na tabela 3; a distribuição por tamanho de partícula pode ser observada na figura 2B, e o tamanho e morfologia, por cryo-TEM são mostrados na figura 3B. Como pode ser observado na tabela 3, todas as preparações ficaram estáveis com pequenos valores de tamanho médio e PDI. O tamanho médio, distribuição por tamanho de partícula e o potencial Z foram determinados por DLS. O potencial Z de todas as preparações é positivo, e bem acima de + 30 mV, o que prevê boa estabilidade a longo prazo. Figura 2B mostra que as distribuições dos tamanhos de partícula são muito uniformes, e seu diâmetro médio não excede 200 nm. A figura 3B mostra que as formas esferoidais com estrutura unilamelar predominam, de acordo com cryo-TEM. As diferentes preparações de vesícula que apresentam características que tornam as mesmas atraentes a partir do ponto de vista farmacêutico.Tabela 3. Aparência física, tamanho médio de partícula e potencial Z de diferentes variantes de vesículas de colesterol:cetrimida:EGF para diferentes composições

Exemplo 4. Síntese de vesículas de colesterol:BKC:EGF usando tecnologia de fluido comprimido

[0068] Estas vesículas foram sintetizadas de uma maneira similar àquela do exemplo 2, mas neste exemplo, por outro lado, foi usada uma solução de 81,46 mg de colesterol em 2,88 mL de etanol e, por outro lado, uma solução aquosa de 3,0 mg/mL de BKC e EGF na concentração desejada foi usada. As vesículas de BKC:colesterol (1:1) foram obtidas, com EGF incorporado em uma concentração de 5 μM. Os resultados em relação a aparência física, tamanho médio e potencial Z são mostrados na tabela 4. Pode ser observado que a preparação da vesícula é estável e apresenta um tamanho e PDI relativamente pequeno a médio. O tamanho médio, distribuição por tamanho de partícula e o potencial Z foram determinados por DLS. Além do mais, similar às preparações de vesícula mencionadas anteriormente, que compreendem em sua composição um agente tensoativo catiônico do tipo amônio quaternário, apresentaram valores positivos de potencial Z muito maiores que + 30 mV, o que prevê ótima estabilidade a longo prazo para as mesmas. Figura 3C mostra que formas esferoidais com estrutura unilamelar predominam, de acordo com o estudo de morfologia de vesícula realizado por cryo-TEM. Estas vesículas também apresentam características que as tornam muito atraentes a partir do ponto de vista farmacêutico.Tabela 4. Aparência física, tamanho médio de partícula e potencial Z das vesículas de colesterol:BKC:EGF na composição do trabalho.

Exemplo 5. Síntese de vesículas de colesterol:CTAB:BSA usando tecnologia de fluido comprimido

[0069] Estas vesículas foram sintetizadas de uma maneira similar àquela do exemplo 2, mas neste caso a proteína BSA foi usada em uma solução aquosa. As vesículas de CTAB:colesterol (1:1) foram obtidas, com BSA incorporado em uma concentração de 0,37 μM, correspondendo a 25 μg/mL. Os resultados em relação a aparência física, tamanho médio e potencial Z são mostrados na tabela 5. Pode-se observar que a preparação da vesícula é estável e apresenta tamanho e PDI relativamente pequeno a médio. O tamanho médio, distribuição por tamanho de partícula e o potencial Z foram determinados por DLS. Estes também exibem os valores positivos de potencial Z, bem abaixo de + 30 mV, que prevê ótima estabilidade a longo prazo.Tabela 5. Aparência física, tamanho médio de partícula e potencial Z de vesículas de colesterol:CTAB:BSA na composição de funcionamento

Exemplo 6. Determinação da eficiência de incorporação de proteína nas vesículas

[0070] Para determinar a eficiência da incorporação de EGF nas vesículas, o método de ultracentrifugação foi usado para separar vesículas livre de EGF. A partir de diferentes suspensões de vesícula avaliadas, 1,0 mL foi obtido; colocado em frascos e centrifugado em alta velocidade (100.000 × g) por 60 minutos a 4 ° C. Subsequentemente, o teor de proteína no sobrenadante (sem EGF) foi determinado por um ensaio imunoenzimático de fase sólida (ELISA) (Vázquez et al., Biotecnol. Apl. 1990, 7: 42-49). A eficiência da incorporação de EGF nas vesículas foi determinada pela seguinte expressão:

[0071] Os resultados são mostrados na tabela 6. Os resultados da eficiência de incorporação de EGF em vesículas com a composição DPPC:colesterol (obtida no exemplo 1), a composição CTAB:colesterol (obtida no exemplo 2) e a composição cetrimida:colesterol (obtida no exemplo 3) são mostradas. O efeito da concentração de EGF (razão EGF:colesterol) também foi avaliado. Os valores de alta eficiência de incorporação de EGF (próximo de 100 %) podem ser observados em sistemas QUATs:colesterol, para uma ampla faixa de concentrações de EGF (razão EGF:colesterol). Entretanto, os resultados da eficiência de incorporação de EGF no sistema DPPC:colesterol foram muito baixos, uma vez que a eficiência máxima de incorporação não excedeu 10 %, para a concentração mais elevada de EGF.Tabela 6. Eficiência de incorporação de EGF nas vesículas de diferentes composições

[0072] No caso particular das vesículas compreendendo BSA, o mesmo procedimento descrito para EGF foi seguido, exceto que a quantificação da proteína foi realizada pelo método de ácido bicinconínico (Micro-BCA) (Smith et al., Anal. Biochem. 1985, 150: 76-85). A eficiência de incorporação de BSA nas vesículas de CTAB:colesterol, preparadas como descrito no exemplo 5, foi apenas 42 ± 5 %. Quando a eficiência de incorporação de BSA foi comparada com a incorporação de EGF (mostrada na tabela 6), em vesículas com a mesma composição de CTAB:colesterol, pode ser observado que a incorporação de EGF foi significativamente maior.

Exemplo 7. Reprodutibilidade da síntese de vesículas de colesterol:CTAB:EGF por tecnologia de fluido comprimido

[0073] Com o objetivo de testar a robustez e reprodutibilidade da metodologia usada para a síntese de vesículas com EGF, o tamanho médio de partícula, PDI, potencial Z e eficiência de incorporação de EGF foram determinados em vários lotes de composição de EGF:colesterol 5 μM:1 M e 15 μM:1 M, preparadas em diferentes datas. Nas tabelas 7 e 8, os resultados obtidos são mostrados. O tamanho médio de partícula, PDI e potencial Z foram determinados por DLS. A eficiência da incorporação de EGF foi determinada da maneira descrita no exemplo 6.Tabela 7. Características de vesículas de CTAB:colesterol (1:1) com EGF incorporado em uma concentração de 5 μM, após preparação por DELOS-SUSP

Tabela 8. Características de vesículas de CTAB:colesterol (1:1) com EGF incorporado em uma concentração de 15 μM após preparação por DELOS-SUSP

[0074] A partir dos valores relatados nas tabelas 7 e 8, pode-se concluir que as vesículas apresentam características similares, independentemente da data de preparação, que permite declarar que o método DELOS-SUSP é reprodutível e robusto para a preparação das vesículas com EGF.

Exemplo 8. Aumento em escala da síntese de vesículas de colesterol:CTAB:EGF usando tecnologia de fluido comprimido

[0075] As vesículas foram sintetizadas como no exemplo 2, mas em uma escala 50 vezes maior. Primeiro, uma solução de 3,8 g de colesterol em 144 mL de etanol é introduzida no reator de alta pressão com volume de 300 mL em pressão atmosférica e temperatura de funcionamento (Tw = 35 °C). CO2 comprimido é adicionado produzindo expansão volumétrica da solução para atingir uma fração molar XCO2 = 0,7 e uma pressão de funcionamento PW = 10 MPa. Para atingir homogeneização completa e equilíbrio térmico, o sistema é deixado por cerca de 60 minutos em 10 MPa e 35 °C. Finalmente, a solução líquida expandida é despressurizada a partir da pressão de funcionamento até pressão atmosférica, em 1.200 mL de uma solução de CTAB em água mQ (C = 2,83 mg/mL) contendo EGF na concentração desejada (5 e 12 μM). Nesta última etapa, um fluxo de N2 em 10 MPa é usado como um pistão para empurrar o colesterol em solução de etanol para manter constante a pressão de funcionamento dentro do reator durante despressurização. A seguir, as vesículas são transferidas para um recipiente hermeticamente fechado e armazenadas até o uso a 5 ± 3 °C.

[0076] Vesículas de CTAB:colesterol (1:1) com EGF incorporado em uma concentração de 5 μM e 12 μM foram obtidas. Os resultados de aparência física, tamanho médio, PDI e potencial Z são mostrados na tabela 9. O tamanho médio de partícula, PDI e potencial Z foram determinados por DLS.Tabela 9. Aparência física, tamanho médio de partícula, PDI e potencial Z dos variantes de vesículas de colesterol:CTAB:EGF, para diferentes composições, após preparação por DELOS-SUSP, em uma escala piloto

[0077] A tabela 9 mostra que as vesículas de EGF:CTAB:colesterol são estáveis em proporções de 5 μM:1 M e 12 μM:1 M. Pode-se observar que no processo em escala de aumento as partículas obtidas apresentam características físico-quimicas comparáveis àquelas obtidas na escala de 6 mL (Exemplo 2). Em ambos os casos, os tamanhos médios das partículas obtidas são abaixo de 200 nm.

Exemplo 9. Atividade biológica das vesículas, avaliada pelo ensaio de proliferação celular em fibroblastos A31 3T3 de murino

[0078] A atividade biológica das vesículas com EGF, preparadas da maneira descrita nos exemplos 1 a 3, foi determinada usando um ensaio de proliferação celular (Mire-Sluis and Page, J. Immunol. Methods 1995, 187: 191-199). Neste caso, a capacidade de EGF livre, lipossomos com EGF e as diferentes vesículas compreendendo EGF para aumentar a proliferação celular da linhagem A31 3T3 de fibroblastos de murino foi avaliada. A atividade biológica das diferentes suspensões vesiculares foi avaliada aplicando uma diluição apropriada da suspensão diretamente nas células de teste, de maneira que a absorbância das amostras esteja na faixa da curva do material de trabalho de referência, que foi previamente calibrado contra o material de referência internacional EGF 91/550, fornecido pelo National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC, Reino Unido).

[0079] Com o objetivo de comparar a eficácia das várias preparações de vesícula de EGF com EGF livre, a atividade específica das diferentes preparações foi calculada a partir dos resultados da atividade biológica, pela expressão a seguir:

[0080] A atividade biológica é mensurada pelo ensaio descrito e a concentração de proteína é fornecida pelo valor nominal (em mg/mL) da concentração equivalente de EGF nas diferentes preparações de vesícula.

[0081] Como um controle no ensaio de proliferação celular, vesículas brancas (sem a adição de EGF) foram usadas, em correspondência com os diferentes variantes testados. Nestas amostras, em diluições menores que aquelas usadas para as vesículas com EGF, nem um efeito citotóxico e nem um aumento na proliferação foram testados.

[0082] A figura 4A mostra que vesículas com EGF com composição de CTAB:colesterol exibem melhor atividade específica comparada ao EGF livre e EGF em vesículas com a composição DPPC:colesterol. Na figura 4B, um resultado similar ao primeiro é também observado quando cetrimida, em vez de CTAB, foi usada na composição das vesículas preparada pelo mesmo procedimento. O propósito desta avaliação foi determinar se a função biológica de EGF é afetada pelos componentes ou pelo processo de síntese das ditas vesículas. Entretanto, em relação às vesículas com composição de QUATs:colesterol, um aumento inesperado na atividade biológica específica de EGF foi encontrado.

Exemplo 10. Resistência à protease de EGF integrado nas vesículas de QUATs:colesterol

[0083] As vesículas com EGF com composições de QUATs:colesterol (1:1), preparadas como nos exemplos 2 e 3 da presente invenção, foram usadas. Este experimento foi realizado para avaliar a capacidade de vesículas de QUATs:colesterol para conservar a estabilidade de EGF integrado contra proteases. Sabe-se que feridas crônicas, tais como úlceras de pé diabético, apresentam ambientes proteolíticos que podem afetar a biodisponibilidade dos medicamentos usado para tratar as mesmas (Bennett e Schultz, Am. J. Surg. 1993, 166: 74-81).

[0084] Para esta avaliação, a tripsina foi usada como uma protease modelo. A reação enzimática foi preparada em tampão Tris-HCl com pH 8,5 e concentração de 20 mM, contendo uma concentração final de 0,5 μg/mL de tripsina. A concentração final de EGF livre ou o equivalente de EGF nas diferentes preparações de vesícula foi 125 μg /mL. Incubação das amostras foi realizada por períodos de 4, 8, 16 ou 24 horas a 37 °C. Ácido trifluoroacético (TFA), em uma concentração final de 0,1 % (v/v) foi usado para parar a reação enzimática.

[0085] Após parar a reação, as amostras foram diluídas em metanol absoluto, em uma concentração final de metanol de 80 % (v/v), agitadas e centrifugadas em uma centrífuga de mesa a 10.000 rpm por 5 minutos. Finalmente, os sobrenadantes da centrifugação foram filtrados através de filtros de policarbonatos de 0,2 μm de tamanho de poro, e a seguir foram aplicados em um sistema HPLC (Merck, Alemanha). As amostras de vesículas e EGF padrão foram analisadas usando uma coluna de fase reversa C18 (Vydac, Hesperia, CA, USA) e detectadas em 226 nm. Para tal realização, foi usado um gradiente linear de 20 % a 40 % de B por 28 minutos. A fase móvel A consiste em 0,1 % de TFA/água e a fase móvel B consiste em 0,05 % de TFA/acetonitrila. O volume de injeção analisado foi 5,0 mL, correspondendo a cerca de 20 μg de EGF. A vazão usada foi 1,0 mL/minuto. A concentração de EGF nas amostras foi quantificada por interpolação usando uma curva de calibração do EGF na área abaixo do pico principal e concentrações de EGF de amostras conhecidas, a partir dos cromatogramas obtidos em 226 nm. O percentual de EGF restante em cada amostra, após incubação com tripsina, foi calculado usando a seguinte expressão:

[0086] Figura 5A mostra que vesículas com EGF com composição de CTAB:colesterol exibem melhor estabilidade contra tripsina, comparado ao EGF livre, durante um período de 24 horas. Similarmente, a figura 5B, mostra que vesículas com EGF com composição de cetrimida:colesterol exibem um comportamento similar àquele descrito anteriormente. As diferenças significativas não foram observadas entre as cargas diferentes de EGF avaliadas (razão EGF:colesterol).

[0087] Os resultados da estabilidade com proteases, de EGF incorporado em vesículas de QUATs:colesterol, mostram que as vesículas com EGF apresentam estabilidade muito maior que EGF livre.

Exemplo 11. Demonstração da atividade antimicrobiana de vesículas de QUATs:colesterol

[0088] Suspensões de vesícula compreendendo QUATs:colesterol foram avaliadas para determinar se estas apresentam atividade antimicrobiana. Esta atividade foi determinada usando o método de difusão em ágar (Manual of Clinical Microbiology. 6a ed. Washington, DC: ASM; 1995). A eficiência das diferentes suspensões foi ensaiada contra bactérias Gram positivas (Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus), bactérias Gram negativas (E. coli, Proteus mirabilis), e contra fungos (Candida albicans, Aspergillus niger) usando a técnica de poços em placas de ágar nutriente. Estes micro-organismos foram identificados e fornecidos pela coleção de micro-organismo BCCM/LMG (Bélgica). As bactérias foram crescidas por toda a noite a 37 °C em caldo de solja e triptona (Oxoid), e os fungos foram incubados por 72 horas a 28 °C em caldo Sabouraud dextrose (Oxoid). Estas suspensões foram usadas como inóculos. Um inóculo final, usando 100 μL de uma suspensão contendo 108 unidades formadoras de colônia/mL de bactérias, ou 104 esporos/mL de fungos, foi aspergido em placas de ágar de soja e triptona e ágar Sabouraud dextrose (Oxoid), respectivamente. O disco (6 mm em diâmetro) foi impregnado com cada uma das diferentes suspensões de vesícula a serem testadas. Ciprofloxacina e fluconazol (100 μg/mL) foram usados como controles positivos para bactérias e fungos, respectivamente. As placas de ensaio foram incubadas a 37 °C por 24 horas para bactérias, e 28 °C durante 72 horas para fungos, dependendo do tempo de incubação exigido para crescimento visível.

[0089] A tabela 10 mostra que as diferentes suspensões de vesícula apresentavam efeito antimicrobiano contra bactérias Gram positivas e fungos. Em geral, os micro-organismos foram mais sensíveis às suspensões vesiculares de composição de cetrimida:colesterol do que aquelas de CTAB:colesterol. Algumas suspensões vesiculares mostraram atividade antibacteriana e antifúngica contra certos micro-organismos comparáveis à ciprofloxacina e fluconazol, respectivamente.Tabela 10. Atividade antimicrobiana e antifúngica de diferentes suspensões de vesícula de QUATs:colesterol contra bactérias e fungos.

Exemplo 12. Fabricação de uma formulação atomizadora de aspersão líquida contendo vesículas com EGF

[0090] Uma suspensão com vesícula de CTAB:colesterol (1:1) com composição de EGF:colesterol de 5 μM: 1 M, obtida como no exemplo 2, com concentração equivalente de EGF de 25 μg/mL, foi diluída na concentração equivalente de EGF de 15 μg/mL em tampão fosfato de sódio 10 mM pH 7,2. Esta solução final também contém 17 % (v/v) de glicerol, 10 % (v/v) de etanol, 0,02 % (p/v) de hidroxitolueno de butila (BHT), 0,18 % (p/v) de de metil parabeno e 0,02 % (p/v) de propil parabeno. A dispersão resultante foi filtrada por meio de filtros de esterilização de acetato de celulose 0,2 μm, e dispensada em frascos de cidro em atmosfera de nitrogênio.

Exemplo 13. Fabricação de uma formulação em gel contendo vesículas de EGF

[0091] Uma suspensão de vesícula de cetrimida:colesterol (1:1) com composição de EGF:colesterol 5 μM: 1 M, obtida como no exemplo 3, com concentração equivalente de EGF 25 μg/mL, foi diluída na concentração equivalente de 15 μg/mL. Esta formulação contém tampão Tris-HCl 10 mM pH 7,2, e carbômero (Carbopol 940), em uma concentração final de 1,25 % (p/v); glicerol 3 % (p/v) e 20 mM de L-metionina. Além do mais, a formulação contém 0,02 % (p/v) de BHT, e como conservantes antimicrobianos 0,18 % (p/v) de metil parabeno e 0,02 % (p/v) de propil parabeno.

Exemplo 14. Fabricação de uma formulação parenteral contendo vesículas com EGF

[0092] Uma suspensão de vesícula de BKC:colesterol (1:1), com composição de EGF:colesterol 5 μM:1M, obtida como no exemplo 4, com concentração equivalente de EGF de 25 μg/ mL, foi introduzida na célula do dispositivo de ultrafiltração de fluxo tangencial Sartocon Slice 200. Para ultrafiltração das vesículas, cassetes com membranas Hydrosart® com tamanho de poro de 30 kDa foram usados. O processo concentração- diafiltração é conduzido em uma temperatura de 25 ± 3 °C e queda da pressão máxima na entrada do cassete foi mantida menor que 4 bar (0,4 mPa). Durante o processo, a suspensão foi concentrada 5 vezes (concentração equivalente final de EGF de 125 μg/mL). Após a etapa de concentração, as vesículas foram diluídas em tampão fosfato de sódio 10 mM pH 7,2, em uma concentração equivalente de 75 μg/mL de EGF. Esta formulação também contém 20 mM de L-metionina e 0,02 % (p/v) de BHT. A suspensão resultante foi filtrada por meio de um filtro de esterilização de 0,2 μm e dispensada em frascos de vidro em atmosfera de nitrogênio.

Exemplo 15. Comparação do efeito farmacodinâmico de lipossomos e vesículas compreendendo EGF em modelos animais de cicatrização de feridas Metodologia experimental

[0093] Para avaliar a eficiência farmacológica das formulações listadas a seguir, um modelo experimental de úlcera crônica de espessura total foi desenvolvido no dorso dos ratos. Foram usados ratos Sprague Dawley de 250-270 gramas, os quais foram escolhidos aleatoriamente para formar 7 grupos experimentais de 10 animais cada. Os ratos foram anestesiados intraperitoneamente com uma combinação de cetamina/xilazina para depilar extensivamente sua região dorsal. Duas úlceras retroescapular bilaterais simétricas foram desenvolvidas com diâmetro de 8 mm e espessura total até a fáscia superior, que foi poupada. A aplicação imediata de triamcinolona acetonida, como comprimido, começou uma vez ao dia durante os primeiros três dias, para parar a cicatrização e induzir as alterações de características de cronicidade. Após 7 dias, a interrupção do processo de cicatrização e cronicidade das úlceras foram corroboradas pela ausência de tecido de granulação e hipertrofia das extremidades epiteliais. A partir deste momento, a aplicação dos tratamentos estudados começou da maneira descrita: Grupo 1: sem tratamento (salina). Foram submetidos às mesmas condições de manuseio e manipulação do restante dos grupos. Solução de salina fisiológica estéril foi aplicada na forma nebulizada. Grupo 2: lipossomos sem DPPC-colesterol, Grupo 3: Vesículas sem CTAB-colesterol, Grupo 4: Vesículas sem cetrimida colesterol, Grupo 5: Lipossomos com DPPC-colesterol carregados com EGF em uma concentração de 25 μg/mL, Grupo 6. Vesículas de CTAB-colesterol carregadas com EGF em 25 μg/mL, Grupo 7. Vesículas de cetrimida-colesterol carregadas com EGF em 25 μg/mL.

[0094] As feridas foram limpas diariamente. Após sanitizá-los, cada grupo foi administrado com a suspensão indicada em cada caso. A aplicação das suspensões foi realizada duas vezes ao dia, por 14 dias. Os sistemas experimentais foram tratados por aplicação tópica das suspensões de vesículas, ou lipossomos, por nebulização. Todos os animais foram submetidos à autópsia e amostragem 14 dias após o início do tratamento determinado para cada grupo. Amostras foram fixas em 10 % de formalina neutra, e 72 horas após foram hemisseccionada de maneira uniforme, para inclusão posterior em parafina. Os corantes usados foram: hematoxilina- eosina, reação tricromática de Mallory método de retículo de Verhoeff e Gomori. As amostras foram analisadas de maneira cega por dois pesquisadores independentes.

Resultados:

[0095] Não foi necessário excluir úlceras contaminadas; assim, 20 lesões foram usadas para cada um dos 6 grupos experimentais. Resumidamente, corrobora-se que todas as apresentações farmacêuticas das vesículas com EGF estimularam significativamente o processo completo de cicatrização, quando comparado aos grupos com vesículas sem EGF (branco), lipossomos carregados com EGF a 25 μg/mL, e o grupo controle experimental tratado com salina. Os dados relatados estão relacionados à média de dois estudos independentes realizados em momentos diferentes. Os testes de Mann-Whitney U e de Student foram usados para realizar as comparações. Todos os parâmetros ajustam os critérios de distribuição normal. Os parâmetros estudados e os resultados são mostrados na tabela 11.Tabela 11. Efeito farmacodinâmico das suspensões avaliadas em um modelo de ferida crônica em ratos

[0096] O experimento mostra que vesículas de CTAB-colesterol e cetrimida-colesterol carregadas com EGF apresentam um potente efeito de cicatrização. O efeito anti-inflamatório observado para os grupos 6 e 7 é notavelmente comparado com os outros tratamentos. É possível que o efeito de promover fibroangiogênese e contração esteja relacionado à redução de equilíbrio de células imuno-inflamatórias que infiltram a neoderme. Similarmente, um efeito acentuado que promove a migração epitelial foi evidenciado, demonstrando microscopicamente a presença de uma epiderme extratificada. A resposta obtida para o grupo tratado com lipossomos carregados com foi menor que aquela detectada nos grupos 6 e 7. A superioridade dos tratamentos, incluindo suspensões de vesículas carregadas com EGF, aplicados aos grupos 6 e 7, também foi revelada em um experimento similar onde a cronicidade nas feridas foi induzida por aplicação tópica de metilglioxal.

Exemplo 16. Tratamentos baseados na aplicação tópica de vesículas compreendendo EGF em pacientes com úlceras de pé diabético

[0097] Nos casos clínicos, a maioria das lesões tratadas excedeu 90 % da probabilidade de requerer amputação, de acordo com a escala da University of Texas. Os tratamentos foram administrados topicamente.

[0098] Características gerais dos pacientes tratados:

[0099] Apresentavam diabetes mellitus tipos I ou II de evolução longa e foram medicados com insulina, sulfoniluréias, ou biguanidas, como agentes hipoglicêmicos orais. Apresentavam um histórico pessoal de cicatrização pobre, embora alguns destes tenham apresentado experiência anterior de amputação contralateral. Todas as lesões tratadas de membro inferior correspondiam ao pé diabético isquêmico ou neuropático. Lesões, como um todo, foram classificadas como crônicas, complexas e persistentes. O período de evolução das lesões variou entre menos de um mês e sete anos. O tamanho das lesões tratadas variou entre 20 e 80 centímetros quadrados. A profundidade em algumas lesões ainda envolveu o periósteo. A partir de um ponto de vista anatômico, as lesões tratadas foram nas regiões laterais, calcâneas e/ou metatarsais. Todos os pacientes receberam os primeiros tratamentos hospitalizados, bem como os procedimentos de excisão foram com anestesia, bem como a terapia parenteral com antibiótico foi necessária. Mediante cicatrização, ou granulação total da ferida com evidência de migração epitelial, os pacientes foram submetidos a um regime ambulatorial e uma continuação em dias alternados para cura e medicação. Após completar a epitelização, cada paciente continuou o tratamento por 12 meses após a cicatrização. A avaliação da ocorrência de recaídas, registro de reações adversas, e avaliação do estado geral do paciente foram realizadas com este propósito.

[00100] A tabela 12 mostra as características demográficas e epidemiológicas do coorte de pacientes que recebem tratamentos tópicos.Tabela 12. Características demográficas e epidemiológicas do coorte de pacientes que receberam tratamento tópico

[00101] O tratamento seguido com cada um dos pacientes é descrito a seguir:

[00102] Paciente JLG. Masculino, 56 anos, controlado com insulina e sem nenhum das outras complicações de diabetes com manifestação clínica. Apresenta lesão frontal extensa com componente isquêmico, que persiste dois anos após amputação transmetatarsal. Não houve nenhum processo de granulação e epitelização após o estabelecimento de terapias antimicrobianas e com ozônio por dois anos. Após realizar a limpeza cirúrgica e estimulação das extremidades, o tratamento começou em dias alternados usando a formulação em aspersão tópica descrita no exemplo 12 contendo vesículas de EGF:CTAB:colesterol. Em oito semanas de tratamento, a epitelização completa da lesão foi atingida. Os resultados são mostrados na figura 6.

[00103] Paciente OFS. Feminino, fumante, obesa, com histórico de hipertensão arterial, controlado com agentes hipoglicêmicos orais. Desenvolvimento de necrose avançando rapidamente no tecido mole e tendões a partir de um local de picada de inseto. Excisão cirúrgica do material necrótico é realizada. A terapia antimicrobiana é iniciada e a lesão é tratada em dias alternados. Em decorrência de 14 dias após a intervenção, o processo de granulação é diminuído e desacelerado, a aplicação do tratamento é iniciada em dias alternados usando a formulação em aspersão tópica descrita no exemplo 12, contendo vesículas de EGF:CTAB:colesterol. Em oito semanas de tratamento, a epitelização completa das lesões foi atingida.

[00104] Paciente AVL. Masculino, 52 anos, controlado com glibenclamida, lesão plantar neuropática do pé de Charcot que foi granulada por 7 anos, sem evidência de contração/epitelização. Após limpeza cirúrgica e estímulo de extremidade, o tratamento iniciou em dias alternados usando a formulação tópica em forma de gel descrita no exemplo 13, contendo vesículas de EGF:cetrimida:colesterol. Em oito semanas de tratamento, a epitelização completa da lesão foi atingida.

[00105] Paciente PAT. Masculino, 47 anos, sem outras co-morbidades ou complicações de manifestação clínica de diabetes, mesmo após a doença arterial periférica ser detectada. Em função do trauma local, foi desenvolvido um abscesso transmetatarsal que levou à necrose que se dissolve em quase todo o peito do pé com notáveis sinais flogísticos. Amputação transmetatarsal foi realizada e a terapia com antibiótico foi iniciada. Em função do progresso insatisfatório da base residual da amputação após 30 dias, com a realização de debridamentos extensivos em virtude da presença de microplacas isquêmicas; a intervenção iniciou com a formulação tópica na forma de gel descrita no exemplo 13, contendo vesículas de EGF:cetrimida:colesterol. A formulação foi aplicada nas extremidades e superfície da ferida. Os tratamentos foram realizados em dias alternados e foram estendidos durante 4 semanas. Desde a primeira administração, a presença de placas isquêmicas foi eliminada e uma granulação de tecido produtiva e sangria começou a se desenvolver, o que posteriormente facilitou a aplicação de um enxerto sem pele de espessura parcial.

[00106] Paciente GMA. Masculino, 69 anos, controlado com insulina e sem complicações de diabetes com manifestação clínica. O paciente apresenta uma lesão residual frontal que persiste seis meses após amputação transmetatarsal. Não existe nenhum processo de granulação e epitelização após 3 meses de terapias com antimicrobiano e ozônio. Após realizar limpeza cirúrgica, o tratamento foi realizado em dias alternados com a formulação em aspersão tópica descrita no exemplo 12, contendo vesículas de EGF:CTAB:colesterol. Em seis semanas de tratamento, a epitelização completa da lesão foi atingida.

Exemplo 17. Tratamentos baseados na infiltração de vesículas com EGF em pacientes com úlceras de pé diabético

[00107] Nos casos clínicos, a maioria das lesões tratadas excedeu 90 % de probabilidade de requerer a amputação de acordo com a escala da University of Texas. Os tratamentos foram administrados por infiltração. As características gerais dos pacientes tratados correspondem àquelas descritas no exemplo 16.

[00108] A formulação parenteral referida no exemplo 14, que usa vesículas de EGF:BKC:colesterol foi usada para o tratamento de infiltração. A essência deste tratamento consiste em injeção intra- e perilesional interna nas extremidades e na parte inferior da lesão, em pontos equidistantes. O material é depositado direcionando a agulha na base da úlcera ou na profundidade da cunha em um ângulo de 15-45 graus, geralmente incluindo a junção dermo-epidérmico para estimular a contração das extremidades. Foram depositados em cada ponto entre 100 e 1000 μL, dependendo da aparência clínica do tecido e suas características. Isto é realizado duas a três vezes por semana. As lesões tratadas e características demográficas da população tratada são descritas na tabela 13. Em todos os casos tratados, as amputações menires ou maiores foram prevenidas.Tabela 13. Características demográficas e epidemiológicas do coorte de pacientes que receberam tratamento com infiltração

[00109] O tratamento seguido com cada um dos pacientes é descrito a seguir:

[00110] Paciente HCJQ. Isquêmico, sem pulsação distal e ocluído a partir do setor de poplítea. A lesão é uma base residual de amputação lateral do quinto dedo do pé, mostrando cápsulas expostas e tendão evidentemente em necrose isquêmica. A lesão foi classificada como grau IV de acordo com escala de Wagner. Seu tamanho foi de 10 x 4 centímetros. O tratamento é estabelecido quando, no sexto dia de amputação, observa-se a base residual de amputação em atonia e cianose clínica, continuando assim por cinco dias, independente de todas as medidas farmacológicas sistêmicas e locais. As infiltrações iniciaram após debridamento cirúrgico de material necrótico, proporcionando a melhoria do microambiente local e promoção do desenvolvimento de tecido de granulação. Isto foi observado primeiro após a quinta seção de infiltração. O paciente recebeu um total de 12 seções de infiltração. O tratamento favoreceu a presença do tecido de granulação produtivo e de sangria. A migração epitelial centrípeta intensiva foi observada, embora não tenha ocorrido nenhuma contração notável das extremidades. Após 38 dias do início do tratamento, a lesão foi completamente epitelizada sem necessitar de um enxerto. Não houve nenhuma reação adversa aguda ou de demora. Em 12 meses, a lesão estava livre de recorrências locais.

[00111] Paciente OFW. Neuropática, 81 dias de evolução com base residual de amputação trans-metatarsal classificável como Wagner IV no período de admissão. O tamanho da lesão é de 14 x 7 centímetros quadrados. Os pulsos distais são percebidos com um ABI de 0,9, apesar de mostrar sinais de disestesia. O tratamento é estabelecido quando, durante 42 dias de tratamento local e aplicação de compressas de salina fisiológica, a lesão exibe resposta de granulação muito pobre. As infiltrações começam e são realizadas diariamente durante a primeira semana de tratamento para recuperar as células locais. Subsequentemente, o esquema continua 2 vezes por semana, por três semanas. Com este esquema, a granulação com sangramento e produtiva completa foi atingida. O tecido foi coberto com um enxerto de pele de espessura parcial obtido a partir da coxa contralateral anterior. Similar ao paciente previamente descrito, o tratamento foi bem tolerado e um ano depois a lesão ainda estava epitelizada.

[00112] Paciente JIFM. Feminino, ex-fumante, 61 anos, ABI de 0,4 na extremidade inferior esquerda, exibe faciite necrozante nas áreas metatarsal e plantar do pé. A lesão é classificada como grau V na escala Wagner. O paciente foi tratado cirurgicamente; excisão de todo o tecido necrótico e/ou tecido mole contaminado e osso foi realizada. A terapia com antibiótico polivalente e sistêmica é estabelecida. Após 48 horas da cirurgia, a primeira inspeção da lesão foi realizada, a limpeza local foi realizada, e o tratamento com infiltração com as vesículas é iniciado. Durante os primeiros 10 dias, um regime de tratamento de doses de ataque de vesículas com EGF foi instalado, o que posteriormente pode ser reduzido a duas seções de infiltração durante 5 semanas. O tratamento ajudou a salvar um pé sem nenhuma outra alternativa terapêutica. O paciente apresenta marcha normal e comando motor satisfatório da porção distal do membro.

Exemplo 18. Tratamentos baseados na aplicação combinada de vesículas com EGF infiltrativa e tópica em pacientes com úlceras de pé diabético

[00113] Nos casos clínicos, a maioria das lesões tratadas excedeu 90 % de probabilidade de exigir amputação, de acordo com a escala estabelecida pela University of Texas. Tratamentos foram administrados combinando as vias tópicas e infiltrativas. As características gerais dos pacientes tratados correspondem àquelas descritas no exemplo 16.

[00114] Em relação ao tratamento combinado, a infiltração foi usada primeiro, usando a formulação parenteral compreendendo vesículas com EGF (referida no exemplo 14). Posteriormente, para a aplicação tópica, a aspersão descrita no exemplo 12 e o gel descrito no exemplo 13 foram alternativamente usados.

[00115] As características demográficas da população tratada e as lesões são descritas na tabela 14. Em todos os casos tratados as amputações maiores e menores foram prevenidas.Tabela 14. Características demográficas e epidemiológicas do coorte de pacientes que receberam uma terapia de combinação, incluindo infiltração e tratamento tópico

[00116] A seguir, o tratamento realizado com cada um dos pacientes é descrito.

[00117] Paciente AFG. Masculino com um longo histórico de diabetes e histórico de pouca aderência aos tratamentos. O paciente exibe padrão de oclusão popliteal com ausência de pulsos distais. A lesão inicia como uma vesícula que é contaminada e rapidamente avança para a necrose de todos os tecidos moles da região calcânea. Durante um primeiro tratamento cirúrgico, os tecidos moles são removidos. Cinco dias depois, uma outra cirurgia é necessária, o que leva à devastação do material ósseo. A terapia com antibiótico polivalente intensiva é estabelecida, e 20 dias após a primeira cirurgia o tratamento com infiltração com vesículas com EGF é iniciado. Uma seção diária de tratamento e cura local é estabelecida para as primeiras duas semanas. Isto é seguido por curas e tratamento em dias alternados usando a formulação tópica em gel descrita no exemplo 13, contendo vesículas de EGF:cetrimida:colesterol preparadas de acordo com o exemplo 3, nas extremidades e superfície da ferida, durante as próximas 8 semanas. Após 10 semanas de tratamento, a lesão estava completamente epitelizada.

[00118] Paciente LATR. Isquêmico, sem pulsos distais e com doença macrovascular de ambos os membros inferiores. ABI é 0,6, sem nenhuma possibilidade de cirurgia de revascularização, em virtude de calcificações. Anteriormente, a amputação contralateral foi realizada três anos atrás. Apresenta trombose de artéria fina no quarto e quinto dedos dos pés, os quais foram amputados com cunha lateral profunda extensiva. Duas semanas após a cirurgia, a amputação residual base mostrou sinais de atonia e foi refratária à granulação. Portanto, na terceira semanas, o tratamento com as vesículas foi iniciado, começando pelo tratamento com infiltração com uma dose entre 25 e 125 μg de EGF por ponto de injeção, depositada nas extremidades e parte inferior da área da cirurgia. Esta modalidade de tratamento é usada até que todas as cavidades e galerias sejam preenchidas com tecido de granulação, o que ocorre aproximadamente após três semanas. Subsequentemente, foi decidido continuar o tratamento topicamente, usando gel com a composição descrita no exemplo 13, contendo vesículas de EGF:cetrimida:colesterol. O tratamento é realizado nas extremidades e superfície da ferida, especialmente focando na borda dermo-epitelial das feridas para estimular a re-epitelização. O tratamento foi realizado em dias alternados até completar a epitelização em 5 semanas.

[00119] Paciente ZEM. Feminino, 57 anos, com lesão Wagner grau III e evidência de neuropatia, a lesão plantar foi granulada por 7 anos, mas não existe evidência de contração/epitelização. Após limpeza cirúrgica e estimulação das extremidades, o tratamento com infiltração foi realizado com uma dose de 75 μg de EGF equivalente por ponto de injeção, usando a formulação descrita no exemplo 14 contendo vesículas de EGF:BKC:colesterol, depositadas nas extremidades da área cirúrgica. Esta modalidade de tratamento foi aplicada durante as primeiras quatro semanas em dias alternados. Subsequentemente, foi decidido continuar usando o tratamento em dias alternados com a formulação em aspersão tópica descrita no exemplo 12 contendo vesículas de EGF:CTAB:colesterol. As vesículas de EGF são atomizadas nas extremidades e superfície da lesão; com foco especial na borda dermo-epitelial das feridas para estimular a re-epitelização, o tratamento é realizado em dias alternados até completar epitelização em 8 semanas. A evolução do processo de cicatrização é mostrada na figura 7.

[00120] Paciente JLHB. Neuropático, desenvolveu uma lesão infecciosa extensiva como consequência de uma queimadura no pé na extremidade inferior direita. Finalmente, leva à amputação transmetatarsal, na qual uma cunha lateral de 10 centímetros é adicionada. O tratamento é iniciado com antibióticos intravenosos e tratamentos locais sistemáticos a cada 48 horas. A lesão mostrou tendência a granular muito lentamente e com atonia das extremidades 20 dias após cirurgia. Tratamento com infiltração é iniciado com vesículas localizadas com 75 μg de EGF em dias alternados na base residual, bem como a cunha. Pela terceira semana de tratamento a aplicação iniciou, em dias alternados, com a formulação em aspersão tópica descrita no exemplo 12 contendo vesículas de EGF:CTAB:colesterol, atingindo a zona profunda da cunha lateral. A combinação de tratamento acelerou a granulação total e epitelização espontânea em uma área de mais de 60 centímetros quadrados.

Exemplo 19. Demonstração da eficiência terapêutica do uso de vesículas com EGF em um modelo letal de lesão pulmonar aguda (ALI) ou síndrome do estresse respiratório no adulto (ARDS) em ratos

[00121] Ratos masculinos Sprague Dawley com peso corporal entre 250 e 280 gramas foram usados. A lesão pulmonar foi induzida em anestesia geral (cetamina/xilazina) por instilação intratraqueal de uma combinação de lipopolissacarídeo (LPS)-zimosan. Imediatamente após, os animais foram determinados aleatoriamente para os três grupos experimentais de 12 animais cada. Grupo A: tratados com salina fisiológica. Grupo B: tratados com uma aspersão de EGF em salina fisiológica em uma concentração de 25 μg/mL/kg. Grupo C: tratados com vesículas de colesterol:BKC:EGF descritas no exemplo 4, com concentração equivalente de 25 μg/mL de EGF, e administrados como no grupo B.

[00122] Os animais desenvolveram naturalmente sem nenhum tratamento até o início dos primeiros sintomas. Seis horas após a aplicação de LPS/zimosan, os ratos mostraram taquipnéia associada com exalação forçada. Neste momento, os animais exibiram saturação de PO2 arterial de 65 % e acidose respiratória clara.

[00123] Portanto, os tratamentos começaram aproximadamente 8 horas após as toxinas terem sido instiladas. O experimento auxiliou na avaliação do efeito de tratamento com ambas as formulações de EGF apenas na fase aguda de ARDS. Os tratamentos foram realizados por máscara orofacial adaptada a partir de uma máquina de anestesia volátil. Os tratamentos foram realizados duas vezes ao dia. Os animais também foram tratados uma vez ao dia com acetato de hidrocortisona (10 mg/kg) como tratamento coadjuvante.

[00124] Após 72 horas do início do tratamento, o estudo parou. Os animais que sobreviveram foram anestesiados e submetidos à lavagem broncoalveolar profunda em 5 mL de salina estéril para estudo citológico e bioquímico, bem como à amostragem de sangue arterial para determinação de parâmetros de gasometria. A seguir, os pulmões foram insuflados com 10 mL de formalina neutra 10 % e processados para histologia.

[00125] Tabela 15 mostra os resultados de mortalidade diária por grupo. Como pode ser observado, o tratamento com nebulização com EGF controlou a progressão de lesão pulmonar aguda. De maneira notável, o melhor efeito em termos de sobrevivência foi no grupo que recebeu EGF incorporado nas vesículas. Isto sugere que a ocupação prolongada de receptores múltiplo de EGF exerce um efeito farmacológico mais consistente que EGF como partículas em um aerossol líquido simples em salina fisiológica.Tabela 15. Mortalidade em cada grupo

[00126] Os resultados da lavagem broncoalveolar confirmaram a proteção exercida por EGF à parede alveolar e endotélio capilar do septo. Além do mais, observa-se que a proteção oferecida pelo tratamento com EGF incorporado nas vesículas inclui melhor capacidade de ventilação expressa em melhor taxa de PO2 arterial, e manter o pH arterial muito próximo do normal. Estes dados são mostrados na tabela 16.Tabela 16. Os resultados de lavagem broncoalveolar e função pulmonary

[00127] A análise histológica dos pulmões de cada grupo mostrou que o tratamento de EGF, particularmente no grupo que recebe a formulação com vesícula, protege o parênquima pulmonar. Isto é demonstrado pela presença da conservação relativa da razão alvéolo/septo, redução da permeabilidade de edema da parede do septo, bem como a presença de focos hemorrágicos e material eosinofílico no lúmen alveolar. Menos reação inflamatória foi observada nos animais tratados com a formulação de EGF incorporado na vesícula, comparado àqueles que receberam solução de salina fisiológica. O experimento permite a suposição de que a intervenção com vesículas de colesterol:BKC:EGF, descritas no exemplo 4, exerce efeito farmacológico mais intenso/prolongado no parênquima pulmonar exposto aos indutores de ALI conhecidos. A proteção possibilitou incluir não apenas melhoria da integridade estrutural do pulmão, mas também apresentou correção substancial dos parâmetros funcionais.

Exemplo 20. Tratamento compassivo com vesículas com EGF de um paciente gravemente doente com síndrome do estresse respiratório no adulto (ARDS)

[00128] Descrição do caso: Paciente AGJ, masculino, 75 anos, sem histórico médico patológico, que sofre de trauma abdominal que progredindo para choque séptico. ARDS ocorre como uma complicação evolutiva, levando à dificuldade de ventilação com dispnéia e cianose refratária à terapia com oxigênio, pouca saturação (11 mm Hg) e alterações de pH do sangue. Uma imagem radiológica exibe manchas semelhante a algodão no parênquima de ambos os pulmões. Decidiu-se iniciar o tratamento com pressão expiratória final positiva e outros medicamentos de rotina. A fim de proteger o parênquima pulmonar na fase exudativa aguda, vesículas de colesterol:BKC:EGF descritas no exemplo 4 são administradas em uma dose de 200 μg equivalentes de EGF por litro de oxigênio médico, duas vezes ao dia. As medições permitiram uma evolução favorável e progressiva do paciente para normal, prevenindo a fase de alveolite fibrosante. No terceiro dia de tratamento, a ventilação de pressão positiva pode ser suspensa, e no quinto dia a imagem semelhante a algodão estava completamente limpa.

Exemplo 21. Demonstração da eficiência terapêutica do uso de vesícula com EGF em pacientes com colite ulcerativa esquerda distal

[00129] Este é um coorte de 8 pacientes com diagnóstico de colite ulcerativa distal, após colonoscopis e biópsias importantes serem realizadas. Os pacientes receberam uma dieta médica especial, bem como tratamento farmacológico com azulfidina ou sulfasalazina. Em decorrência deste coorte ter se mantido clinicamente ativo por mais de 12 meses e ser refratário a todas as intervenções farmacológicas, incluindo corticoides, este foi avaliado por tratamento compassivo por administração de pouco enema de colesterol:cetrimida:EGF, vesículas descritas no exemplo 3. Para isto, as vesículas de colesterol:cetrimida:EGF são administradas em salina fisiológica, em uma concentração equivalente de EGF de 50 μg/mL, em um volume de 20 mL. Os enemas foram aplicadas em decubito lateral esquerdo, a cada noite antes do período de sono. Em 7 dias após o início dos enemas associados com outras medidas médicas prévias, melenas, dor e mal estar sistêmico geral foram erradicados. Após 10 dias de tratamento, uma colonoscopia é realizada, detectando redução substancial de inflamação de mucosa, cicatrização da maioria das lesões e redução significativa no índice de St. Mark. O tratamento foi interrompido 21 dias após o início, quando as colonoscopias são repetidas, confirmando o efeito de cicatrização e redução de inflamação resultante do tratamento com enemas contendo as vesículas de colesterol:cetrimida:EGF. As biópsias obtidas dos 8 pacientes, em 21 dias de início de tratamento, mostraram o desaparecimento de criptite.

Exemplo 22. Uso compassivo de vesículas com EGF para reverter lesões de mucosa causadas por quimioterapia contra câncer

[00130] Paciente QED, masculino, 32 anos, que desenvolveu mucosite hemorrágica na bexiga e partes inferiores do trato urinário, como consequência da terapia com ciclofosfamida e tebusulfan, após transplante de medula óssea. Após 72 horas com hematuria e proteinúria substancial (400 mg/24 horas) o paciente recebeu, junto com medidas de suporte médico gerais, uma cistoclise por meio de uma infusão de solução de salina fisiológica contendo vesículas de colesterol:CTAB:EGF, preparada como no exemplo 2 em concentração equivalente de 150 μg/mL de EGF. No final das primeiras 24 horas, apenas traços de células vermelhas do sangue foram detectadas na urina e proteinuria de 170 mg/24 horas.

[00131] Paciente IRT, feminino, 27 anos, desenvolve mucosite das partes superiores do trato gastrointestinal, durante a poliquimioterapia para tratamento de linfoma não Hodgkin. Um quadro clínico completo, incluindo manifestações aftosas, sialorréia, a seguir hematêmese, distensão abdominal, mal estar geral, febre e outros sintomas aparentes. O processo começa a ser adiminstrado por medidas farmacológicas, que incluiu inibidores de bomba de próton, mucoprotetores, retorno de volemia e opióides parenterais analgésicos. Vinte e quatro horas após o início do quadro clínico, o paciente recebe aplicações orais de uma solução salina contendo vesículas de colesterol:cetrimida:EGF, preparada como no exemplo 3 em uma concentração equivalente de EGF de 50 μg/mL. Usando um cateter nasogástrico, um volume de 250 mL desta solução foi instilado a cada quatro horas. Hematêmese cessou após 24 horas do início da irrigação gástrica, bem como a distensão e paresia aguda. Similarmente, a necessidade de suporte de volume e outras medidas de administração foram progressivamente reduzidas. Exemplo 23. Síntese de vesículas de μ-Sitosterol:CTAB:EGF usando tecnologia de fluido comprimido

[00132] Estas vesículas foram similarmente sintetizadas com aquelas do exemplo 2, mas neste caso, por outro lado, uma solução de 77,71 mg de μ- Sitosterol em 2,88 mL de etanol e; sob outra ótica, uma solução aquosa de 2,83 mg/mL de CTAB e EGF, na concentração desejada, foi usada. Vesículas de CTAB:μ-Sitosterol (1:1) foram obtidas com EGF incorporado em uma concentração de 5 μM. Os resultados em relação a aparência física, tamanho médio e potencial Z são mostrados na tabela 17. Pode ser observado que a preparação da vesícula é estável e apresenta um tamanho e PDI relativamente pequeno a médio. Tamanho médio, distribuição por tamanho de partícula e o potencial Z foram determinados por DLS. Além disso, similar às preparações de vesícula mostradas nos exemplos prévios, que compreendem em sua composição um agente tensoativo catiônico do tipo amônio quaternário, apresentam valores positivos de potencial Z muito maiores que + 30 mV, o que prevê sua elevada estabilidade a longo prazo. A figura 3D mostra que as formas esferoidais com estrutura unilamelar predominam, de acordo com o estudo de morfologia de vesícula realizado por crio-TEM. Estas vesículas também apresentam características que as tornam muito atraentes do ponto de vista farmacêutico.Tabela 17. Aparência física, tamanho médio de partícula e potencial Z das vesículas μ-Sitosterol:CTAB:EGF em uma dada composição.

Claims

1. Vesícula, caracterizada pelo fato de que compreende o fator de crescimento epidérmico (EGF), um tensoativo catiônico e colesterol ou seus derivados.

2. Vesícula de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o tensoativo catiônico é de tipo amônio quaternário, preferivelmente em que o tensoativo catiônico de tipo amônio quaternário é um tensoativo selecionado do grupo composto por brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB), cetrimida e cloreto de benzalcônio (BKC).

3. Vesícula de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a razão molar entre o tensoativo catiônico e o colesterol, ou seus derivados, se encontra na faixa de 10M:1M a 1M:5M, e a razão molar entre o EGF e o colesterol, ou seus derivados, se encontra na faixa de 0,5μM:1M a 100μM:1M.

4. Vesícula de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que apresentam estrutura unilamelar e tamanho médio aproximado entre 25 e 500 nm, preferivelmente entre 50 e 300 nm.

5. Vesícula de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o EGF está incorporado à bicamada vesicular.

6. Vesícula de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que é obtida por tecnologia de fluidos comprimidos (FCs), preferivelmente em que a tecnologia de FCs inclui um processo que compreende: a) a preparação de uma solução aquosa de EGF e um tensoativo catiônico, preferivelmente em que o tensoativo catiônico é de tipo amônio quaternário, b) a dissolução de colesterol, ou seus derivados, em um solvente orgânico expandido com um FC, c) a síntese das vesículas mediante a despressurização da dissolução resultante da etapa b) sobre a solução resultante da etapa a).

7. Processo para a preparação de vesículas que compreendem o EGF, um tensoativo catiônico e colesterol, ou seus derivados, caracterizado pelo fato de que compreende: a) a preparação de uma solução aquosa de EGF e um tensoativo catiônico, preferivelmente em que o tensoativo catiônico é de tipo amônio quaternário, b) a dissolução de colesterol ou seus derivados em um solvente orgânico expandido com um FC, preferivelmente em que o solvente é selecionado do grupo composto pelos álcoois mono-hídricos, álcoois poli- hídricos, cetonas, etilenodiamina, acetonitrila, acetato de etila e misturas dos mesmos, preferivelmente em que o FC é um composto selecionado dentre dióxido de carbono, etano, propano, hidroclorofluorocarbonos e hidrofluorocarbonos, c) a síntese das vesículas mediante a despressurização da dissolução resultante da etapa b) sobre a solução resultante da etapa a).

8. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a relação entre a quantidade de FC e de solvente orgânico corresponde a uma fração molar aproximada de 0,3 a 0,95, preferivelmente de 0,5 a 0,8.

9. Processo de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que a dissolução do colesterol, ou de seus derivados, em um FC é realizada em um reator a uma pressão aproximada de 1 a 30 mPa, e uma temperatura aproximada de 10 a 70°C, preferivelmente entre 10 e 50°C.

10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de que o EGF se dissolve em uma solução aquosa que contém um tensoativo catiônico cuja concentração se encontra acima de sua concentração micelar crítica.

11. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma vesícula como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.

12. Composição de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que pode ser administrada por via sistêmica, intralesional, mucosal, tópica, transdérmica, oftálmica, ou como formulação inalada.

13. Vesícula de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que é para uso como um medicamento.

14. Vesícula de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento de feridas complexas de todos os tecidos moles periféricos.

15. Vesícula de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a ferida complexa é uma úlcera de pé diabético, uma úlcera venosa, uma úlcera de decúbito ou uma queimadura.

16. Vesícula de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento do desconforto respiratório do adulto.

17. Vesícula de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento de lesões do tubo digestivo, preferivelmente para uso no tratamento da mucosite, colite ulcerativa, úlceras duodenais, ou colite distal.

18. Vesícula de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento de lesões oculares.

19. Produto cosmético, caracterizado pelo fato de que compreende uma vesícula como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, e pelo menos um excipiente.

20. Uso de uma vesícula como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que é para fabricação de um produto cosmético, preferivelmente em que o produto cosmético é um produto para prevenir a senescência e o envelhecimento da pele.