KR101752757B1 - 상피 성장 인자를 포함하는 소포체 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents

상피 성장 인자를 포함하는 소포체 및 이를 포함하는 조성물 Download PDF

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에드워도 마르틴즈 디아즈
조르지 아마도르 베르란가 아코스타
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Abstract

본 발명은 상피 성장 인자 (EGF), 양이온성 계면활성제 및 콜레스테롤 또는 그 유도체를 포함하는 소포체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 압축 유체 기술 (CFs)에 기반한 그 제조방법을 개시한다. 본 발명의 소포체는 약물 및 화장품의 제조 및 조직 공학에 유용하다.

Description

상피 성장 인자를 포함하는 소포체 및 이를 포함하는 조성물 {Vesicles which include epidermal growth factor and compositions that contain same}
본 발명은 인간 및 수 의약, 화장품 및 조직 공학의 분야에 속하는 것으로서, 특히 그 조성물 중에 상피 성장 인자 (Epidermal Growth Factor, EGF)를 포함하는 소포체형 방출 시스템의 분야에 속하는 것이다. 본 발명에 따른 소포체는 유리 EGF에 비해서 향상된 치료 효율을 갖는다.
소포체 시스템 (vesicular system)에 기반한 약물 방출 시스템, 통상적으로 리포좀 (liposomes)은 치료적으로 활성인 물질을 통합하고 있는 양쪽친화성 분자들로 구성되며, 약학 분야에서 가장 널리 사용되는 것들 중 하나인데, 이는 이러한 시스템이 활성 물질에 대해서 증가된 안정성을 부여할 수 있고, 생물막들을 통과하는 투과성을 증가시키며, 반복된 투여의 필요성 없이 활성 성분의 서방출을 가능하게 하기 때문이다.
EGF는 세포 증식 및 조직 재생 과정에서 운동성을 촉진하는 주된 성장 인자들 중의 하나이다. 이는 또한 상피 세포 증식 및 이동의 조절을 통해서 조직 지혈 (tissue hemostasis)을 유지하는데 도움을 준다. 더 나아가, EGF는 혈관신생 (angiogenesis)을 유도하는데, 이는 조직에 영양 보조를 제공한다 ( Hudson and McCawley, Microsc . Res . Tech . 1998, 43: 444-455; Koivisto et al ., Exp . Cell Res . 2006, 312: 2791-2805; Liang et al., Wound Repair Regen . 2008, 16: 691-698). 이러한 성장 인자는 약학 (Wong et al ., Biotechnol . Genet . Eng . Rev . 2001, 18: 51-71; Girdler et al ., Am . J. Clin . Oncol . 1995, 18: 403-406; Haedo et al ., Rev . Esp. Enferm . Dig . 1996, 88: 409-413; Majima , Ophthalmologica 1998, 212:250-256); 화장품 (Hasegawa and Yamamoto , Mech . Ageing. Dev . 1992, 66:107-114, Patent No . US 5.618.544) 및 조직 공학 (Christopher et al ., Biomacromolecules 2011, 12: 3139-3146) 분야에서 다양한 응용도를 갖는다.
다양한 리포좀 시스템들을 사용한 EGF 제제가 개발된 바 있다. 일부 예들은 포스파티딜글리세롤 (PG), 포스파티딜콜린 (PC) 및 콜레스테롤을 포함하는 단일층 리포좀 중에 EGF를 통합시키는 것이다 (Brown et al ., Ann . Surg . 1988, 208: 788-794). EGF의 포함은 PC, 콜레스테롤 및 히알루론산 (Yerushalmi , et al ., Arch . Biochem. Biophys .　1994, 313: 267-273); 또는 콜레스테롤 및 디팔미토일포스파티딜콜린 (DPPC) (Alemdaroglu et al ., J. Biomed . Mater . Res . A 2008, 85A: 271-283; Degim et al ., Int . Wound . J. 2011, 8: 343-354)을 포함하는 다중층 리포좀들에서도 보고된 바 있다. 보고된 다른 부류의 리포좀들은 디올레일포스파티딜콜린 (DOPC), 디미리스토일 포스파티딜글리세롤 (DMPG), 콜레스테롤 및 트리올레인을 포함하는 다중소포체들이다 (Li et al ., Arch . Pharm . Res . 2005, 28: 988-994).
반면에, EGF에 접합된 양이온성 지질들을 포함하는 리포좀들도 보고된 바 있으며 (Kikuchi et al ., Biochem . Biophys . Res . Commun . 1996, 227: 666-671); 역시 PC 또는 DPPC와 조합된 콜레스테롤 및 디올레일포스파티딜에탄올아민 (DOPE)을 포함하는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 코팅된 리포좀들 (Li et al ., Int . J. Pharm . 2003, 258: 11-19)이 보고된 바 있다. DPPC 및 라이소포스파티딜콜린 (LPC)을 포함하는 리포좀들도 보고된 바 있다 (Saddi et al ., The Angle Orthodontist 2008, 78: 604-609; Alves et al ., Life Sci . 2009, 85: 693-699).
리포좀 시스템을 사용한 EGF 제제 역시 특허들로 보호받고 있으며, 예를 들어 중성 및 음-대전된 인지질들을 함유하는 리포좀들 내에 포획 EGF를 포함하는 EGF/리포좀 겔 조성물 및 방법을 개시하고 있는 것 (미국특허 제4944948호); 음-대전된 리포좀 및 EGF를 사용하는 리포좀 겔 조성물 및 방법으로서, PG, PC 및 콜레스테롤과 같은 음 대전된 지질들을 포함하는 것 (국제특허출원 제WO 9009782)과 같은 특허들이 있다. 다른 특허출원으로서, 당뇨성 족부 절단을 방지하기 위해서 리포좀 중의 EGF를 국부 적용하는 것, 및 PC 및 소듐 데옥시콜레이트를 포함하는 리포좀들을 사용하는 것이 있다. 이러한 특허출원은 당뇨성 족부의 IV급 및 V급 만성 허혈성 병변들을 국부적으로 치료하기 위해서 임의의 유형의 EGF 리포좀/니오좀을 사용하는 것에 한정된다 (국제특허출원 제WO 2007/073704호). 종래기술에 있어서, 콜레스테롤 및 양이온성 계면활성제로 구성되는 소포체 시스템에 EGF를 통합시키는 기술은 보고된 바가 없다.
리포좀을 제조하는 통상적인 방법들로는, 박막 증착 (Agrawal et al ., J. Liposome Res . 2005, 15: 141-155), 탈수-재수화 (Kirby and Gregoriadis , Nat . Biotechnol. 1984, 2: 979-984), 동결-해동 (Ristori et al ., Biophys . J. 2005, 88: 535-547) 및 사출 (MacDonald et al ., Biochim . Biophys . Acta 1991, 1061: 297-303) 등이 있으며, 이들은 소정 단점들을 갖는다. 이러한 단점들 중의 일부는 사후 제거가 어려운 과량의 용매를 사용하는 것과 관련되거나, 또는 이러한 방법들 중 일부에 요구되는 고온과 관련이 되며, 고온 공정의 경우 열적으로 안정한 물질들에만 적용가능하다. 반면에, 물질의 크기 및 나노구조를 조절하기가 어렵고, 이러한 방법들은 스케일-업 (다단계 공정) 동안 재현성이 낮다. 리포좀 제조와 관련된 또 다른 문제는 낮은 안정성이다.
액체 또는 초임계 상태의, 압축된 유체 (compressed fluids, CFs), 또는 밀집된 기체를 용매로서 사용하여 물질을 가공하는 것은, 입자상 물질들, 소포체 시스템들, 복합체 입자들, 구조화된 표면들 등과 같은 마이크로- 또는 나노구조의 물질들을 제조함에 있어서, 학술적 및 산업적 수준에서 상당한 기대감을 불러일으킨 바 있으며, 이러한 물질들은 통상적인 공정에 의해서 달성되는 것보다 더욱 큰 구조적 균질성을 갖는다 (Holmes et al ., Chem . Eur . J. 2003, 9: 2144-2150; Cooper, Adv . Mater . 2001, 13: 1111-1114; Cooper , Adv . Mater . 2003, 15: 1049-1059 and Woods et al ., J. Mater . Chem . 2004, 14: 1663-1678). CF 또는 밀집 기체는, 정상적인 압력 및 온도 조건에서는 기체로서 존재하지만, 온도가 증가하면 액체 또는 초임계 유체로 변환될 수 있는 물질이며, 화학 및 재료 공정을 위한 용매 매체로서 사용될 수 있다. 가장 흔하게 사용되는 CF는 이산화탄소 (CO2)로서, 이는 녹색 용매로 분류되는데, 이는 이산화탄소가 비독성, 비가연성이며, 제거가 용이하고, 입자 중에 잔류물을 남기지 않으며, 저렴하면서도 회수하기 용이하기 때문이다. 90년대 초반 이래로, 마이크로-, 서브-마이크로 및 나노 수준의 입자 크기들을 갖는 미세 분말 물질들을 제조하기 위해서 일련의 공정들이 개발되었다 (Jung and Perrut , J. Supercrit . Fluid , 2001, 20: 179-219). CFs의 용매화력 (solvating power)은, 통상적인 액체 용매들의 경우와 마찬가지로, 온도 및 조성 변화에 의해서, 또한 용액 내에서 더욱 빠르게 전달되는 압력 변화에 의해서, 변형될 수 있다. 그러므로, 이러한 입자화 방법들은 매우 짧은 시간 간격들로 매우 높은 정도의 과포화를 달성할 수 있고, 결정에 걸쳐서 핵형성을 촉진함으로써, 매우 좁은 크기 분포, 조절된 내부 구조 및 초분자 조직 (supramolecular organization)을 갖는 마이크로- 또는 나노입자들을 제조하는 것을 가능케 한다는 공통점을 갖는다.
CFs로 마이크로- 또는 나노구조 물질을 제조하는 공정들 중의 하나는 DELOS-SUSP-Depressurization of an Expanded Liquid Organic Solution-Suspension- (국제특허출원 WO 2006/079889호; 유럽특허 제1843836호; Cano - Sarabia et al ., Langmuir 2008, 24: 2433-2437)으로 명명된 방법이며, 이는 CF에 의해서 사전에 팽창된 유기 용액의 감압에 기반한 것으로서, 상기 감압에 의해서 마이크로- 또는 나노분산된 시스템을 생성시키는 방법이다. 이러한 공정에서, CF는 공용매 (co-solvent)로 기능하며, 소정 압력 및 온도 조건 하에서는, 마이크로- 또는 나노분산 시스템으로서 안정화되는 용질의 유기 용액과 완전히 혼합성을 갖는다. 상기 안정화는 일반적으로 수성인, 매체 중의 첨가제 존재 하에서 달성되며, 이에 대해서는 팽창된 용액의 감압화가 수행된다. 첨가제는 유화제, 이온성 및 비이온성 계면활성제, 표면 제제, 콜로이드성 안정화제 및 보호제일 수 있다. 이러한 방법을 사용하여, 리포좀, 에멀젼 또는 현탁액과 같은 마이크로- 및/또는 나노분산 시스템들이 얻어질 수 있다. 리포좀 또는 소포체는 콜레스테롤과, 인지질 및 계면활성제와 같은 다른 막 제제로 구성되며, 그 제조에는 콜레스테롤 및/또는 다른 지질을 팽창된 유기 용액 중에 용해시키고 수성 계면활성제 용액 중에서 이를 감압하는 과정이 필요하다.
DELOS-SUSP에 의해서 활성 성분들을 소포체 또는 리포좀에 도입하고, 상응하는 소포체를 제조하기 위해서는, 활성 성분을 초기 팽창된 용액 중, 또는 수성 용액 중에 용해시키는 것이 필요하며, 두 경우 모두에 있어서 상기 팽창된 용액의 감압화가 수행되고, 이러한 용해는 지질, 계면활성제 또는 표면 활성제의 존재 하에서 수행되어야 한다.
양이온성 계면활성제들 중에서, 4차 암모늄 타입의 것들은 (quaternary ammonium type, QUATs) 약학 및 화장품 분야에서 널리 사용되어 왔다. 약학 분야에서, 이들은 국부, 점안, 경구, 구강 및 비강 경로에 의해서 사용되어 왔다. 이전에, DELOS-SUSP 기술을 사용한 콜레스테롤:세틸트리메틸암모늄 브로마이드 (cetyltrimethylammonium bromide, CTAB) 나노소포체의 제조가 보고된 바 있다. 이러한 기술에 의해서 수용성 화합물을 도입하는 일예는 참고문헌 "Liposomes and other vesicular systems: structural characteristics, methods of preparation, and use in nanomedicine" (Progress in Molecular Biology and Translational Science, Elsevier , 2011, vol .104, pp . 1-52)에 서술되어 있는 바, 상기 문헌에서는 콜레스테롤:CTAB 소포체가 항생제 젠타마이신의 캡슐화 및 투여를 위해서 운반체로서 사용된다. 그러나, 보고된 젠타마이신 캡슐화는 매우 낮은 수준이라는 점을 강조할 필요성이 있다 (<2%). 이러한 유형의 소포체는 단백질을 통합하는데에는 결코 사용된 바가 없다. 관련하여, 이온성 계면활성제가 단백질 변성을 초래하는 성분이라는 사실이 공지된 바 있다 (Akin et al ., Anal . Biochem . 1985, 145: 170-176; Andersen et al ., J. Mol . Biol . 2009, 391: 207-226). 최근에, CTAB 첨가 이후 인간 혈청 알부민의 변성화가 라만 스펙트로스코피에 의해서 설명된 바 있다 ( Vlasova and Saletsky , Laser Phys . 2011, 21: 239-244). 변성화는, 일반적으로, 단백질의 기능적 특성 상실을 수반한다.
전술한 모든 이유들로 인해서, 표준화하기 용이하고, 구조적 수준 및 물리-화학적 특성 면에서 높은 균질성을 갖도록 함으로써, 약학적 및 약물동태학적 특성들을 향상 및/또는 EGF의 치료적 활성을 증가시킬 수 있는, 새로운 EGF 방출 시스템을 개발할 필요성이 있다.
본 발명은 약물 전달 시스템으로서의 소포체에 관한 것으로서, 상기 소포체는 EGF, 양이온성 계면활성제 및 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 유도체 중 하나를 포함하며, 이전에 서술된 것보다 더욱 큰 치료적 효율성을 갖는 소포체에 관한 것이다.
본 발명은 또한 EGF, 양이온성 계면활성제 및 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 유도체를 포함하는 상기 소포체의 제조방법에 관한 것으로서, 상기 방법은: a) EGF 및 양이온성 계면활성제의 수성 용액의 제조 단계, b) CF로 팽창된 유기 용매 중에 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 유도체 중 어느 하나를 용해시키는 단계, 및 c) 상기 a) 단계로부터 얻어진 상기 용액 상에서, 상기 b) 단계로부터 얻어진 상기 용액을 감압시킴으로써 상기 소포체를 합성하는 단계를 포함한다.
EGF, 양이온성 계면활성제 및 콜레스테롤, 또는 그 유도체를 포함하고, 또한 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 소포체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물을 제공하는 것이 또한 본 발명의 목적이다. 본 발명의 또 다른 목적은 약제 및 화장품을 생산하기 위해서 상기 소포체를 사용하는 것이다.
본 발명의 약학적 조성물은 EGF 소포체와 다른 성분들을 포함하며, 당뇨성 족부 궤양 및 다른 복합 상처들의 치료 과정을 가속화하기 위한 약물로서 유용하고, 이러한 다른 복합 상처들에는: 다른 것들 중에서도 정맥성 궤양, 욕창, 화상이 있으며; 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 손상된 눈에서 전안방 (anterior chamber)을 치료하고, 전신적 점막염을 치료하고, 또한 점막 및 점막하조직을 재생할 필요가 있는 모든 위장관계 질병들을 치료하는데 유용하다. 특히, 이러한 소포체들은 종래기술에 서술된 것들에 비해서 당뇨성 족부 궤양 및 정맥성 궤양을 치료하는데 있어서 현저하게 큰 치료적 효율성을 갖는다.
또한, 본 발명은 EGF, 양이온성 계면활성제 및 콜레스테롤 또는 그 유도체의 소포체를 포함하는 것을 특징으로 하는 화장품에 관한 것이다.
도 1은 EGF, 양이온성 계면활성제 및 콜레스테롤 또는 그 유도체를 포함하는 소포체를 제조하기 위한 장비의 개략도이고, 여기에서: C, 수집기; H, 열교환기; P, 펌프; R, 반응기; V, 밸브; RD, 파열 디스크; ST, 교반기; FL, 필터; TI, 온도 지시계; PI, 압력 지시계; PIC, 압력 지시 조절기; F, 유량계이다.
도 2는 소포체의 동적 광산란 (dynamic light scattering, DLS)에 의한 입자 크기 분포로서, CTAB:콜레스테롤 비율을 1 M:1 M로 일정하게 유지하면서, EGF:콜레스테롤 비율을 변화시킨 그래프이고 (0 μM:1 M (
Figure 112015020156644-pct00001
), 5 μM:1 M (
Figure 112015020156644-pct00002
), 15 μM:1 M (
Figure 112015020156644-pct00003
), 25 μM:1 M (
Figure 112015020156644-pct00004
) 및 40 μM:1 M (
Figure 112015020156644-pct00005
) (A); 테트라데실 메틸암모늄 브로마이드 (세트리마이드):콜레스테롤 비율을 1 M:1 M로 일정하게 유지하면서, EGF:콜레스테롤 비율을 변화시킨 그래프이다 (0 μM:1M (
Figure 112015020156644-pct00006
), 5 μM:1 M (
Figure 112015020156644-pct00007
), 15 μM:1 M (
Figure 112015020156644-pct00008
), 25 μM:1 M (
Figure 112015020156644-pct00009
) 및 40 μM:1 M (
Figure 112015020156644-pct00010
) (B).
도 3은 콜레스테롤:CTAB:EGF 조성을 갖는 EGF 소포체 (A), 콜레스테롤:세트리마이드:EGF (B), 콜레스테롤:벤즈알코늄 클로라이드 (BKC):EGF 조성 (C) 및 β-시토스테롤:CTAB:EGF (D)에 대한 극저온-투과 전자 현미경 (cryo-transmission electron microscopy, Cryo-TEM) 사진을 도시한 것으로서, QUATs:콜레스테롤 또는 β-시토스테롤 비율은 1M:1M이고, EGF:콜레스테롤 또는 β-시토스테롤 비율은 5 μM:1 M이다.
도 4는 세포 번식 분석 (cell proliferation assay)에 있어서, 다양한 EGF 제제의 비생물학적 활성 (specific biological activity)을 나타낸 그래프로서, QUATs:콜레스테롤을 1 M:1 M의 비율로 일정하게 유지하고, EGF:콜레스테롤 비율을 변화시키면서 (5 μM:1 M, 15 μM:1 M 및 25 μM:1 M), 유리 EGF, DPPC:콜레스테롤 리포좀 (DPPC:콜레스테롤 1 M:1 M 및 EGF:콜레스테롤 25 μM:1 M) 및 CTAB:콜레스테롤 소포체 (A) 및 세트리마이드:콜레스테롤 소포체 (B)의 결과를 도시한 그래프이다.
도 5는 유리 EGF 및 다양한 소포체 제제들을 37 ℃에서 다양한 시간 간격들 동안 트립신에 노출시킨 이후, 단백질분해성 열화 프로파일을 도시한 것으로서, 이때, CTAB:콜레스테롤 비율 (A) 및 세트리마이드:콜레스테롤 비율 (B)는 1 M:1 M로 일정하게 유지하면서, EGF:콜레스테롤 비율 (5 μM:1 M, 15 μM:1 M 및 25 μM:1 M)을 변화시켰다.
도 6은 CTAB:콜레스테롤 비율 1 M:1 M 및 EGF:콜레스테롤 비율 5 μM:1 M과, EGF 당량 농도 15　㎍/mL를 함유하는 소포체를 포함하는 국소 스프레이 제제로 처리하였을 때, 치료 개시 (A), 4주 경과 후 (B) 및 8주 경과 후 (C) 시점에서, 환자 JLG에 해당하는 당뇨성 족부 궤양의 치유 경과를 나타낸 사진들이다.
도 7은 치료 개시 (A), 4주 경과 후 (B) 및 8주 경과 후 (C) 시점에서, 환자 ZEM에 해당하는 당뇨성 족부 궤양의 치유 경과를 나타낸 사진들이다. 초기 4주 동안, 치료는 BKC:콜레스테롤 비율 1 M:1 M 및 EGF:콜레스테롤 비율 5 μM:1 M과, EGF 당량 농도 75　㎍/mL를 함유하는 소포체를 포함하는 비경구 제제를 사용하여 침윤에 의해서 수행하였다. 8주 과정을 완성하기 위한 나머지 4주 동안에는, CTAB:콜레스테롤 비율 1 M:1 M 및 EGF:콜레스테롤 비율 5 μM:1 M과, EGF 당량 농도 15　㎍/mL를 함유하는 소포체를 포함하는 국소 스프레이 제제를 사용하여 치료를 수행하였다.
본 발명은 상피 성장 인자 (EGF), 양이온성 계면활성제 및 콜레스테롤 또는 그 유도체를 포함하는 것을 특징으로 하는 소포체를 제공한다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 양이온성 계면활성제는 4차 암모늄 타입이다.
본 발명에서, "EGF"라는 용어는 EGF의 생물학적 활성을 유지하는 EGF 분자의 임이의 변이체를 의미하는 것이며; 예를 들어, C-말단 절단된 분자들 (Calnan et al., Gut 2000, 47: 622-627); 또는 N-말단 절단된 분자들 (Svodoca et . al ., Biochim. Biophys . Acta 1994, 1206: 35-41; Shin et al ., Peptides 1995, 16: 205-210)을 포함한다. EGF는 Saccharomyces (Valdes et al ., Biotecnol . Apl . 2009, 26: 1-9) 또는 Pichia pastoris (Research Journal of International Studies 2009, 10: 36-46)와 같은 효모를 사용하거나; Escherichia coli (Yoon et al., Biotechnol . Bioprocess Eng . 1997, 2: 86-89; Abdull Razis et al ., Appl . Biochem. Biotechnol . 2008, 144: 249-261)와 같은 박테리아를 사용하는 재조합 DNA 기술에 의해서 획득할 수 있으며; 또는 화학적 합성법에 의해서 획득할 수도 있다 (Shin et al ., Peptides 1995, 16: 205-210). 또한, 본 발명의 EGF는 기존에 서술된 방법들에 의해서 얻어진 어떠한 변형물도 포함할 수 있는 바, 종래기술의 임의의 방법에 의해서 변형될 수 있고, 예를 들어: 아미노산 치환 (Shiah et al ., J. Biol . Chem . 1992, 267: 24034-24040; Lahti et al ., FEBS Lett . 2011, 585: 1135-1139; 국제특허출원번호 WO 2007/065464), 및 폴리에틸렌 글리콜 접합 (Thomas et al ., Bioconjugate Chem . 2001, 12: 529-537; Lee et al ., Pharm . Res . 2003, 20: 818-825), 또는 다른 임의의 화학적 또는 유전적 변형에 의해서 변형될 수 있다.
"양이온성 계면활성제"라는 용어는 분자 내에 적어도 하나의 양전하를 갖는 계면활성제들을 의미하며, 하나 또는 그 이상의 양이온성 계면활성제들의 조합을 포함한다. 예를 들어, 본 발명에 따르면, 포화 및 불포화 헤테로사이클 형태의 3차 아민염 타입, 4차 암모늄 염 및 알킬 암모늄 형태의 양이온성 계면활성제들이 사용될 수 있다.
본 발명에서, "4차 암모늄 타입 (QUATs) 양이온성 계면활성제"는 적어도 하나의 질소 치환기가 장사슬인 4차 암모늄 염을 의미한다. CTAB, 세트리마이드 및 BKC 또는 그 혼합물이 QUATs에 포함된다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 사용되는 계면활성제는 약학 분야에서 허용가능한 것이다. QUATs 뿐만 아니라 나머지 양이온성 계면활성제들은 상업적으로 이용가능한 구입처로부터, 약학급 및 화장품급으로 얻어질 수 있다.
본 발명에서 "소포체 (vesicles)"라는 용어는 콜로이드성 마이크로입자 및 나노입자를 의미하며, 이는 25 nm 내지 5 mm의 크기로서, 수성상을 함유하는 양쪽친화성 분자들의 하나 이상의 이중층들에 의해서 형성된다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 소포체는 양이온성 계면활성제:콜레스테롤 (또는 그 유도체)의 몰 비율이 10 M:1 M 내지 1 M:5 M이며, EGF:콜레스테롤 (또는 그 유도체)의 몰 비율은 0.5 μM:1 M 내지 100 μM:1 M이다.
본 발명에서, 콜레스테롤의 "유도체"라는 용어는 일반적으로 콜레스테롤 전구체 분자로부터 얻어지며, 친지성 특성을 갖는 스테로이드계 분자들을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에서, EGF를 포함하는 소포체는 단일층 구조를 가지며, 대략 평균 크기 25 내지 500 nm, 바람직하게는 50 내지 300 nm를 갖는 것을 특징으로 한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 EGF가 소포체 이중층 내부로 통합된 소포체를 의미한다. 소포체의 대략의 크기 및 모폴로지는 극저온-투과 전자 현미경에 의해서 평가되며, 소포체 크기의 분포는 DLS에 의해서 특성화된다.
놀랍게도, 본 발명의 소포체는 유리 EGF 및 콜레스테롤:DPPC 리포좀 중의 EGF와 비교할 때, EGF의 생물학적 효능 면에서, 현저한 증가를 나타낸다 (인 비트로 측정). 더 나아가, 이러한 소포체들은 단백질분해효소 공격에 대해서 EGF를 보호할 수 있는 능력을 지니며, 이는 공격 부위에서 EGF의 적절한 생이용가능성을 달성하는데 있어서 매우 중요한 특성이고; 따라서, 그 치료적 효율을 증가시킬 수 있다.
본 발명에서는, 최초로, EGF의 일부 약물적 및 약물동태학적 특성들, 예를 들어 그 효능 및 안정성을 향상시킬 수 있는 EGF 소포체를 합성하였다. 소포체 구조 내에서의 EGF의 통합 정도는 적어도 1년 이상 안정하게 유지되는 것으로 나타났다. 부가적으로, 소포체들은 생물학적 막들을 통과하는 투과성을 증가시킬 수 있었다.
본 발명의 소포체는 항미생물 및 항진균 효과를 나타낸다는 점에서 부가적인 장점을 갖는데, 이러한 효과는 복합 상처 및 EGF 치료에 민감한 다른 병변들의 치료에 사용되는 조성물에서 바람직하다.
본 발명의 일 구현예에서, EGF를 포함하는 소포체들은 CF 기술에 의해서 얻어진다. 특정 구현예에서, 소포체를 얻기 위해서 사용되는 CF 기술은, a) EGF 및 양이온성 계면활성제의 수성 용액을 제조하는 단계, b) CF로 팽창된 유기 용매 중에 콜레스테롤 또는 그 유도체를 용해시키는 단계, 및 c) a) 단계로부터 얻어진 용액 상에서 b) 단계로부터 얻어진 용액을 감압시킴으로써 소포체를 합성하는 단계를 포함하는 공정을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 a) 단계에서 사용된 상기 양이온성 계면활성제는 4차 암모늄-타입이다.
또한, 본 발명은 EGF, 양이온성 계면활성제 및 콜레스테롤 또는 그 유도체를 포함하는 소포체를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은, a) EGF 및 양이온성 계면활성제의 수성 용액을 제조하는 단계, b) CF로 팽창된 유기 용매 중에 콜레스테롤 또는 그 유도체를 용해시키는 단계, 및 c) a) 단계로부터 얻어진 용액 상에서 b) 단계로부터 얻어진 용액을 감압시킴으로써 소포체를 합성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 서술된 공정은 4차 암모늄 타입의 양이온성 계면활성제를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 전술한 공정 중 상기 b) 단계의 유기 용매는, 에탄올, 메탄올, 1-프로판올, 2-프로판올, 1-부탄올, 1-헥산올, 1-옥탄올 및 트리플루오로에탄올과 같은 일가 알코올; 프로필렌 글리콜, PEG 400 및 1,3-프로판디올과 같은 다가 알코올; 아세톤, 메틸 에틸 케톤 및 메틸 이소부틸 케톤과 같은 케톤; 에틸렌디아민, 아세토니트릴, 에틸 아세테이트 및 그 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 용매이다. 어떠한 경우에도, 상기 유기 용매는 특성상, 지질 성분이 용해될 수 있는 것이어야 하며, 더 나아가, CF 및 물과 혼합가능한 것이어야 한다. 더 나아가, 선택된 유기 용매는 상대적으로 낮은 독성을 가져야 한다.
초기 완충 용액 중의 EGF 및 계면활성제의 상대적 농도와, 유기 용매 중의 콜레스테롤 농도는 최종 소포체 중의 콜레스테롤:양이온성 계면활성제:EGF의 비율이 원하는 정도가 되도록 결정되어야 한다. 일반적으로, 콜레스테롤:양이온성 계면활성제:EGF 비율은 얻어지는 다양한 소포체들의 물리-화학적 및 생물학적 특성들에 영향을 줄 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 전술한 공정에서 사용되는 CF는, CO2, 에탄, 프로판, 수소염화불화탄소 (예를 들어, CFC-22), 및 수소화불화탄소 (예를 들어, HFC-134A)로부터 선택된다. 바람직하게는, 상기 b) 단계의 CF는 생태학적 용매일 것을 고려하면 CO2인데, 이는 CO2가 비독성, 비가연성, 비부식성이며, 환경에 유해성을 나타내지 않고, 더 나아가 자연에 매우 풍부하기 때문이다.
본 발명의 일 구현예에서, EGF 소포체 제조를 위한 공정은 도 1에 도시된 바와 같은 장치 중에서 수행된다. 이러한 장치는 농도 (C1)의 에탄올 중 콜레스테롤 용액이 대기압 및 작업 온도 (T=Tw)에서 가해지는 고압 반응기 (R)로 구성된다. 두 번째 단계에서, 작업 압력 (P=Pw)에 도달할 때까지 압축된 CO2가 가해짐으로써, 몰 분획 XCO2가 될 때까지 용액의 부피 팽창이 야기된다. 첨가는 밸브 V-1을 통해서 펌프 P1을 사용하여 수행되며, 나머지 밸브들은 닫혀 있도록 유지된다. 시스템은 정해진 시간 동안 압력 Pw 및 온도 Tw로 유지됨으로써, 완전한 균질화 및 열적 균형이 보장된다. 이후, V-4가 개방되어 반응기 R을 필터 FL에 연결하며, 이때 필터 FL은 나머지 밸브들을 닫은 상태로, N2로 미리 Pw까지 가압된다. V-6를 개방함으로써, P2를 통해서 펌핑된, 농도 (C2)의 수성 EGF 용액 및 농도 (C3)의 계면활성제 상에서 부피적으로 팽창된 용액의 감압이 가능해진다. 이러한 최종 단계에서, Pw에서 V-2를 통해서 가해진 N2의 스트림이 팽창된 용액을 밀어 내리는 플런저 (plunger)로서 사용되며, 감압 단계 동안 반응기 내부를 일정한 압력으로 유지하는데 사용된다. 필터 FL의 존재는 공정 도중에 형성되었을 수 있는 임의의 침전물을 수집하는 것을 가능하게 한다. 형성된 소포체들은 컨테이너 C에 수집되며, 이어서 유리 병 중에서 4 ℃로 보관된다. 일단 감압이 종료되면, V-6 및 V-2가 닫히고, V-6를 재개방함으로써 장치의 감압화가 진행된다.
본 발명의 일 구현예에서, CF 및 유기 용매 사이의 함량 관계는 대략 CF 몰분율 0.3 내지 0.95에 해당하며; 바람직하게는 0.5 내지 0.8에 해당한다. 일 특정 구현예에서, CF 중 콜레스테롤 (또는 그 유도체)의 용해는 압력 Pw가 대략 1 내지 30 MPa, 온도 Tw가 대략 10 내지 70 ℃인 반응기 중에서 수행된다. 바람직하게는, 반응기의 대략의 온도는 10 내지 50 ℃이다.
본 발명의 방법에서, EGF는 양이온성 계면활성제를 함유하는 수성 용액 중에 용해되며, 그 농도는 그 임계 미셀 농도 (critical micellar concentration) 이상이다.
놀랍게도, 전술한 방법을 사용하여 합성된 콜레스테롤:QUATs:EGF 소포체는, EGF 소포체 도입이 100%에 매우 근접하는 수율을 나타내는데, 이는 어떠한 수용성 분자의 도입에 대해서 기대되는 수치보다 현저하게 높은 것이며, 이는 기존에 젠타마이신에 대해서 보고된 결과를 고려해도 그러하다. 또한, 콜레스테롤:QUATs:EGF 소포체에 있어서 이러한 수율은, 수용성 단백질 우혈청 알부민 (BSA)과 같이, EGF와 유사한 구조적 특성을 갖는 다른 단백질들의 도입에 대해서 얻어지는 결과들보다 주목할 만큼 높은 것이다. 이러한 점은 상기 BSA 도입을 위해서 전술한 DELOS-SUSP 공정을 사용하는 경우에도 마찬가지인데, 이 경우 단지 42% 정도의 도입 수율이 얻어진다.
더 나아가, 또한 놀랍게도, 이러한 콜레스테롤:QUATs 소포체 내로의 EGF 도입 수율은, 심지어 이를 제조하기 위해서 DELOS-SUSP 공정이 사용되는 경우에도, 콜레스테롤:DPPC:EGF 소포체에 대해서 얻어지는 것보다도 명백하게 큰 것이다.
본 발명의 또 다른 태양은 EGF, 양이온성 계면활성제 및 콜레스테롤 또는 그 유도체와, 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 소포체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 상기 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 부형제들은, 본 발명의 약학 조성물의 일부를 구성하며, 소포체 활성을 증가시킬 수 있다. 다른 한편으로, 이는 본 발명의 조성물에 대한 취급성 및 가공성 향상에 도움을 줄 수 있다. 본 발명의 EGF 소포체는 몇몇 약학적 형태들로 제형화될 수 있으며, 예를 들어: 주사형, 스프레이, 겔, 점성액, 크림, 연고, 경피 패치, 데포 (depots), 흡입형 제제 및 본 기술 분야에서 통상의 기술자에 공지된 다른 제형일 수 있다.
본 발명의 소포체의 합성 도중 또는 그러한 소포체가 전술한 투여 형태를 위해서 적당한 물질을 형성한 이후에, 다양한 부형제들이 혼합될 수 있다. 일반적으로, 예를 들어; 가용화제 또는 용매, 계면활성제, pH 조절제, 항산화제, 희석제, 매트릭스 시스템, 복합화제, 점성 강화제, 분산제, 습윤제, 착색제, 착향제, 방부제, 투과 강화제 및 다른 것들이 통상적인 목적을 위해서, 통상적인 함량으로, 본 발명의 조성물 특성에 영향을 주지 않으면서 사용될 수 있으며, 이는 본 기술 분야에서 통상의 기술자에 공지된 바 있다 (Remington's Pharmaceutical Sciences (1995)). EGF 소포체의 약학 제형에 있어서 사용가능한 추가적인 부형제의 예들은 Handbook of Pharmaceutical Excipients (6 th edition )에서 검색될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 약학 조성물은 조절형 또는 지속형 방출 형태이다. 지속형 또는 조절형 방출 형태들은 일반적으로 매트릭스 시스템, 이온 교환 수지, 또는 개별적 장벽들을 포함함으로써, EGF 소포체의 확산을 조절한다.
본 발명의 일 구현예에서, 약학 조성물의 제조를 위해서, 본 기술 분야에서 공지된 장치를 사용하여, 농도-디아필트레이션 (concentration-diafiltration) 공정에 의해서, EGF 소포체들이 컨디셔닝된다. 본 발명의 약학 조성물은 다양한 경로에 의해서 투여될 수 있는 바, 그 중에서도: 전신적, 병변내, 점막, 국소, 경피, 안과적, 또는 흡입형 제제로서 투여될 수 있다.
또 다른 태양에서, 본 발명은, 약제의 제조에 있어서, EGF, 양이온성 계면활성제, 및 콜레스테롤 또는 그 유도체를 포함하는 소포체의 용도를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 약제는 질병의 치료를 위한 것으로서 임의의 포유류 종들에서 치유 및 조직 재생 과정에 도움을 주는데 요구되고; 상기 소포체를 형성하는 양이온성 계면활성제, 콜레스테롤 및 EGF는 약학 분야에서 허용가능한 것이다. 바람직한 구현예에서, 상기 포유류는 인간이다.
상기 의료적 용도는 상기 소포체를 유효량으로 투여함으로써, 상피 세포의 번식, 성장 및 이동 과정을 조절하거나, 또는 혈관신생을 유도하기 위해서 외래 EGF 투여가 필요한 질병을 치료하는 것을 포함한다.
일반적으로, 본 발명의 EGF 소포체 (또는 이를 포함하는 조성물) 투여를 위해서 효과적인 농도는, 투여 당 1.0 내지 200 ㎍/mL EGF 당량, 바람직하게는 5.0 내지 100 ㎍/mL EGF 당량이다. 투여 부피 및 빈도는 병변의 유형, 그 크기 및 사용되는 투여 장치에 의존하며, 이는 당업계에서 통상의 기술자에 공지된 바 있다. 또한, 요구되는 투여량을 하루 중 적당한 간격으로 둘, 셋, 넷 또는 그 이상의 서브-투여로 투여하는 것이 적당할 수도 있다.
정확한 투여량 및 투여 빈도는 치료되는 특정 조건에 따라 달라지며, 그 중증도, 연령, 체중, 성별, 질병의 범위, 및 환자의 일반적 신체 조건, 더 나아가 환자에게 투여되는 다른 동시 처방 약제에 따라서 달라지고, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 기술자에 잘 알려져 있다. 더욱이, 환자가 약제에 반응하는 방식, 및/또는 본 발명에 따른 약물을 처방한 의사의 분석에 따라서, 유효 일일 투여량이 감소 또는 증가될 수 있다는 점은 명확하다. 따라서, 상기 열거된 일일 유효량은 가이드라인 또는 권고사항으로 고려되어야 한다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 소포체로 제조된 약제는 임의의 말초 연조직의 복합 상처를 치료하는데 사용된다. 특정 구현예에서, 상기 복합 상처는 당뇨성 족부 궤양이다. 또 다른 특정 구현예에서, 상기 약물은 정맥성 궤양, 욕창 또는 화상을 치료하는데 사용된다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 약제는 성인 호흡곤란 증후군과 같은 질병을 치료하는데 사용된다. 본 발명의 소포체로 제조된 상기 약제는 또한 궤양성 대장염, 십이지장 궤양 및 말단 대장염과 같은 소화관 병변들을 치료하는데 유용하다. 또 다른 구현예에서, 상기 약물은 안과 병변들을 치료하는데 유용하다.
EGF, 양이온성 계면활성제, 및 콜레스테롤 또는 그 유도체의 소포체, 및 화장품 또는 피부 약제용으로 허용가능한 적어도 하나의 부형제를 포함하는 것을 특징으로 하는 화장품 또한 본 발명의 일부이다. 본 발명의 이러한 태양에서, 양이온성 계면활성제, 콜레스테롤 (또는 그 유도체) 및 EGF는 약학 및 화장품 분야에서 허용가능한 것이다.
본 발명의 EGF 소포체는, 고체, 액체 및 반고체와 같은 다양한 화장품 또는 피부 약제 형태로 제형화될 수 있으며, 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니지만: 주사형, 스프레이 분자화 액체형 (spray atomized liquids), 겔, 크림, 다중 에멀젼, 수성 분산액, 밀크, 발삼, 로숀, 폼, 세라 (sera), 연고, 경피 패치, 와이프 (wipes), 데포, 밤 (balms), 분말, 막대, 흡입 제형 등을 들 수 있으며, 모든 경우에 있어서, 린스형 (rinse) 및 퍼머넌스형 (permanence) 제형을 포함한다.
일반적으로, 본 발명의 화장품 또는 피부 약학 조성물은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 가용화제 또는 용매, 계면활성제, pH 조절제, 항산화제, 희석제, 매트릭스 시스템, 복합화제, 점성 강화제, 분산제, 습윤제, 겔화 폴리머, 씨크너 (thickners), 연화제, 안정화제, 냄새 흡수제, 킬레이트화제, 식물 추출물, 필수 오일, 수중 생물 추출물, 생발효 공정으로부터 유래된 성분, 광물염, 세포 추출물 및 광차단제 (유기 또는 광물 특성을 갖는 광보호제, A 및/또는 B 자외선광에 대해서 활성), 염료 또는 안료, 착향제, 방부제, 투과 강화제 등, 및 그 혼합물과 같은 부형제를 포함할 수 있으며, 이들은 물리적 및 화학적으로 본 발명의 조성물 중 다른 성분들과 양립가능한 것들이다. 이러한 부형제들은 일반적인 목적을 위해서, 본 발명의 조성물의 특성에 영향을 주지 않는 한도에서 통상적인 함량으로 사용될 수 있으며, 이러한 사항은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 기술자에게 공지된 바 있다 (부가적인 예들은 CTFA Cosmetic Ingredient Handbook, Twelfth Edition (2008)의 서술 내용으로부터 참조할 수 있다). 상기 부가적인 아주반트들은 그 유래 면에서 합성 또는, 예를 들어, 식물 추출물 또는 생발효 공정으로부터 유래된 것과 같이 천연의 것일 수 있다.
따라서, 화장품을 제조하기 위해서 전술한 EGF 소포체의 용도 또한 본 발명의 일 목적이다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 화장품은 피부의 노화 및 에이징을 예방하기 위한 것이다.
실시예
하기 실시예들은 예시적인 목적의 것이며, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.
실시예 1. 압축 유체 기술을 사용한 콜레스테롤: DPPC : EGF 소포체의 합성
먼저, 대기압 및 온도 (Tw= 35 ℃)에서, 1.2 mL 에탄올 중의 12 mg의 콜레스테롤 및 24 mg의 DPPC를 6 mL 부피의 고압 반응기 내로 도입하였다. 압축된 CO2를 첨가함으로써, 용액의 부피 팽창을 야기하여, 몰 분율 XCO2 = 0.7 및 작업 압력 PW = 10　MPa이 되게 하였다. 10 MPa 및 35 ℃에서 반응계를 대략 60분 동안 교반하며 방치함으로써, 완전한 균질화 및 열적 균형을 달성하였다. 마지막으로, 팽창된 유기 용액을, 원하는 농도 (15 μM 내지 40 μM)의 EGF 수성 용액 24 mL 상에서, 작업 압력으로부터 대기압으로 감압하였다. 이러한 마지막 단계에서는, 10 MPa의 N2 스트림을 플런저로서 사용하여 부피 팽창된 용액을 밀어냄으로써 감압화 도중에 반응기 중의 일정 작업 압력을 유지하였다. 이어서, 소포체를 밀봉된 컨테이너로 옮기고, 사용 이전까지 5 ± 3 ℃에서 보관하였다.
결과적으로, DPPC:콜레스테롤 (1:1) 소포체를 수득하였으며, 이중 EGF는 15 μM 내지 40 μM의 농도로 도입되었다. 하기 표 1에는 물리적 외관, 평균 크기, 입자 크기 분포 및 Z-포텐셜을 도시하였다. 평균 크기, 입자 크기 분포 및 Z-포텐셜은 DLS로 측정하였다.
다양한 소포체 제제들은 단기 안정성 문제를 나타내지는 않고, 상대적으로 작은 평균 크기 및 다분산 지수 (polydispersity index, PDI)를 가짐으로써, 약학적 관점에서 볼 때 매력적인 물질임을 알 수 있다. 그러나, 절대 Z-포텐셜은 매우 작았으며 (< +10 mV), 이는 분산계의 콜로이드성 안정성을 가능케 하는 수치보다 매우 낮은 수치로서, 이러한 안정성이 가능해지는 보통의 절대 수치는 30　mV 이상이다 (Carrion et al ., J. Colloid . Interface Sci . 1994, 164: 78-87). 이러한 특성은, 이러한 소포체 시스템의 장기 안정성이 훼손될 수 있다는 점을 나타낸다.
다양한 조성물들을 위한 콜레스테롤: DPPC : EGF 소포체들의 다양한 변형물들에 대한 물리적 외관, 평균 입자 크기 및 Z- 포텐셜
조성물
(EGF:콜레스테롤)		 물리적 외관 평균 크기 (nm)
(PDI)* 		Z-포텐셜 (mV)
(±SD)*
0 μM: 1 M 분산된 오팔색 용액 143.2 (0.180) +4.8 (±2.43)
15 μM: 1 M 분산된 오팔색 용액 188.3 (0.180) +3.92 (±2.43)
25 μM: 1 M 분산된 오팔색 용액 226.4 (0.297) +5.12 (±3.99)
40 μM: 1 M 분산된 오팔색 용액 227.3 (0.243) +1.78 (±0.82)
* Nano-ZS (Malvern Instruments, United Kingdom), PDI-다분산 지수
실시예 2. 압축 유체 기술을 사용한 콜레스테롤: CTAB : EGF 소포체의 합성
먼저, 대기압 및 작업 온도 (Tw= 35 ℃)에서, 2.88 mL 에탄올 중의 76 mg의 콜레스테롤 용액을 6 mL 부피의 고압 반응기 내로 도입하였다. 압축된 CO2를 첨가함으로써, 용액의 부피 팽창을 야기하여, 몰 분율 XCO2 = 0.7 및 작업 압력 PW = 10　MPa이 되게 하였다. 10 MPa 및 35 ℃에서 반응계를 대략 60분 동안 방치함으로써, 완전한 균질화 및 열적 균형을 달성하였다. 마지막으로, 팽창된 유기 용액을, 원하는 농도 (1 μM 내지 40 μM)의 EGF를 함유하는, mQ 수 (C= 2.83 mg/mL) 중의 CTAB 용액 24 mL 상에서, 작업 압력으로부터 대기압으로 감압하였다. 이러한 마지막 단계에서는, 10 MPa의 N2 스트림을 플런저로서 사용하여 에탄올 용액 중의 콜레스테롤을 밀어냄으로써 감압화 도중에 반응기 중의 일정 작업 압력을 유지하였다. 이어서, 소포체를 밀봉된 컨테이너로 옮기고, 사용 이전까지 5 ± 3 ℃에서 보관하였다.
소포체들의 모폴로지를 기존에 보고된 바 있는 공정에 따라서 극저온-투과 전자 현미경으로 관찰평가하였다 (Progress in Molecular Biology and Translational Science , Elsevier , 2011, vol .104, pp . 1-52).
EGF가 1 μM 내지 40 μM의 농도로 도입된 CTAB:콜레스테롤 (1:1) 소포체를 수득하였다. 물리적 외관, 평균 크기 및 Z-포텐셜에 대한 결과들을 하기 표 2에 도시하으며; 입자 크기 분포는 도 2A에, 극저온-투과 전자 현미경에 의한 크기 및 모폴로지는 도 3A에 도시하였다. 표 2로부터 알 수 있는 바와 같이, EGF:콜레스테롤 비율이 변화되는 다양한 제제들은 안정하였다. 모든 제제들의 Z-포텐셜들은 양의 값을 가졌으며, + 30 mV를 훨씬 초과하였고, 이는 장기 안정성이 향상될 것이라는 점을 예측하는 근거가 된다. EGF:콜레스테롤의 비율이 증가함에 따라서 평균 크기의 증가가 관찰되는 점 또한 주목할 만하다. 도 2A에서는, 매우 높은 정도로 균일한 입자 크기 분포가 관찰되었어며, 평균 직경은 200 nm를 초과하지 않았다. 도 3A는, 극저온-투과 전자 현미경으로 관찰한 소포체 모폴로지와 관련하여, 단일층상 구조가 지배적인 회전타원체 형태 (spheroidal shapes)를 보여준다. 다양한 소포체 제제의 언급된 특성들로 인해서, 이러한 소포체들이 약학적 관점에서 매우 매력적임을 알 수 있다.
다양한 조성물들을 위한 콜레스테롤: CTAB : EGF 소포체들의 다양한 변형물들에 대한 물리적 외관, 평균 입자 크기 및 Z- 포텐셜
조성물
(EGF:콜레스테롤)		 물리적 외관 평균 크기 (nm)
(PDI)* 		Z-포텐셜 (mV)
(±SD)*
0 μM: 1 M 분산된 오팔색 용액 117.7 (0.244) +73.1 (±11.0)
1 μM: 1 M 분산된 오팔색 용액 113.6 (0.299) +75.3 (±10.6)
2 μM: 1 M 분산된 오팔색 용액 113.7 (0.274) +72.1 (±5.2)
5 μM: 1 M 분산된 오팔색 용액 96.6 (0.257) +70.9 (±9.6)
15 μM: 1 M 분산된 오팔색 용액 128.4 (0.379) +74.2 (±10.3)
25 μM: 1 M 분산된 오팔색 용액 145.4 (0.391) +74.8 (±6.3)
40 μM: 1 M 분산된 오팔색 용액 180.6 (0.450) +68.40 (±5.8)
* Nano-ZS (Malvern Instruments, United Kingdom), PDI-다분산 지수
실시예 3. 압축 유체 기술을 사용한 콜레스테롤: 세트리마이드 : EGF 소포체의 합성
이러한 소포체들은 실시예 2에 서술된 것들과 유사한 방법에 의해서 합성하였지만, 본 실시예의 경우에는, 농도 2.61 mg/mL의 세트리마이드 수성 용액을 사용하였다. 세트리마이드:콜레스테롤 (1:1) 소포체들을 수득하였으며, 도입된 EGF의 농도는 1 μM 내지 40 μM이었다. 물리적 외관, 평균 크기 및 Z-포텐셜의 결과들을 표 3에 나타내었으며; 입자 크기 분포는 도 2B에, 극저온-투과 전자 현미경에 의한 크기 및 모폴로지는 도 3B에 도시하였다. 표 3으로부터 알 수 있는 바와 같이, 모든 제제들은 안정하였으며, 작은 평균 크기 및 PDI 수치를 나타내었다. 평균 크기, 입자 크기 분포 및 Z-포텐셜은 DLS에 의해서 측정하였다. 모든 제제들의 Z-포텐셜은 양의 값을 나타내었으며, + 30 mV를 훨씬 초과하는 값으로서, 높은 장기 안정성을 예측할 수 있었다. 도 2B는 입자 크기 분포는 매우 균일하며, 그 평균 직경이 200 nm를 초과하지 않았다. 도 3B는 극저온-투과 전자 현미경에 따를 경우, 단일층상 구조가 지배적인 회전타원체 형태 (spheroidal shapes)를 나타낸다. 다양한 소포체 제제들 또한 약학적 관점에서 매우 매력적인 특성들을 갖는다는 것을 알 수 있다.
다양한 조성물들을 위한 콜레스테롤: 세트리마이드 : EGF 소포체들의 다양한 변형물들에 대한 물리적 외관, 평균 입자 크기 및 Z- 포텐셜
조성물
(EGF:콜레스테롤)		 물리적 외관 평균 크기 (nm)
(PDI)* 		Z-포텐셜 (mV)
(±SD)*
0 μM: 1 M 분산된 오팔색 용액 118.6 (0.392) +78.1 (±16.1)
1 μM: 1 M 분산된 오팔색 용액 123.8 (0.381) +75.4 (±12.6)
2 μM: 1 M 분산된 오팔색 용액 127.3 (0.376) +77.3 (±9.3)
5 μM: 1 M 분산된 오팔색 용액 140.8 (0.375) +79.1 (±13.1)
15 μM: 1 M 분산된 오팔색 용액 124.0 (0.388) +71.1 (±11.6)
25 μM: 1 M 분산된 오팔색 용액 125.1 (0.436) +70.4 (±10.8)
40 μM: 1 M 분산된 오팔색 용액 152.1 (0.44) +72.7 (±11.2)
* Nano-ZS (Malvern Instruments, United Kingdom), PDI-다분산 지수
실시예 4. 압축 유체 기술을 사용한 콜레스테롤: BKC : EGF 소포체의 합성
이러한 소포체들은 실시예 2에 서술된 것들과 유사한 방법에 의해서 합성하였지만, 한편으로는, 2.88 mL 에탄올 중의 81.46 mg의 콜레스테롤 용액을 사용하고, 다른 한편으로는, 원하는 농도를 갖는 3.0 mg/mL의 BKC 및 EGF의 수성 용액을 사용하였다. BKC:콜레스테롤 (1:1) 소포체들을 수득하였으며, 도입된 EGF의 농도는 5 μM이었다. 물리적 외관, 평균 크기 및 Z-포텐셜의 결과들을 표 4에 나타내었다. 소포체 제제는 안정하였으며, 상대적으로 작은 평균 크기 및 PDI 수치를 나타내었다. 평균 크기, 입자 크기 분포 및 Z-포텐셜은 DLS에 의해서 측정하였다. 더 나아가, 전술한 소포체 제제와 유사하게, 조성물 중에 양이온성 계면활성제로서 4차 암모늄 타입을 포함하는 조성물의 경우, + 30 mV보다 훨씬 더 높은 양의 Z-포텐셜 수치들을 나타내었으며, 이는 높은 장기 안정성을 예측할 수 있게 한다. 도 3C는 극저온-투과 전자 현미경에 의해서 수행된 소포체 모폴로지 연구에 따를 경우, 단일층상 구조가 지배적인 회전타원체 형태 (spheroidal shapes)를 보여준다. 이러한 소포체들 또한 약학적 관점에서 매우 매력적인 특성들을 갖는다는 것을 알 수 있다.
작업 조성물에서, 콜레스테롤: BKC : EGF 소포체들의 물리적 외관, 평균 입자 크기 및 Z- 포텐셜
조성물
(EGF:콜레스테롤)		 물리적 외관 평균 크기 (nm)
(PDI)* 		Z-포텐셜 (mV)
(±SD)*
5 μM: 1 M 분산된 오팔색 용액 199.9 (0.335) +74.4 (±10.0)
* Nano-ZS (Malvern Instruments, United Kingdom), PDI-다분산 지수
실시예 5. 압축 유체 기술을 사용한 콜레스테롤: CTAB : BSA 소포체의 합성
이러한 소포체들은 실시예 2에 서술된 것들과 유사한 방법에 의해서 합성하였지만, 본 실시예의 경우에는 단백질 BSA를 수성 용액 중에 사용하였다. CTAB:콜레스테롤 (1:1) 소포체들을 수득하였으며, 도입된 BSA의 농도는 0.37 μM이었고, 이는 25 ㎍/mL에 해당한다. 물리적 외관, 평균 크기 및 Z-포텐셜의 결과들을 표 5에 나타내었다. 소포체 제제는 안정하였으며, 상대적으로 작은 평균 크기 및 PDI 수치를 나타내었다. 평균 크기, 입자 크기 분포 및 Z-포텐셜은 DLS에 의해서 측정하였다. 제제들은 양의 Z-포텐셜 수치들로서, + 30 mV보다 훨씬 더 높은 양의 Z-포텐셜 수치들을 나타내었으며, 이는 높은 장기 안정성을 예측할 수 있게 한다.
작업 조성물에서, 콜레스테롤: CTAB : BSA 소포체들의 물리적 외관, 평균 입자 크기 및 Z- 포텐셜
조성물
(BSA:콜레스테롤)		 물리적 외관 평균 크기 (nm)
(PDI)* 		Z-포텐셜 (mV)
(±SD)*
0 μM: 1 M 분산된 오팔색 용액 124.2 (0.283) +70.1 (±11.0)
0.37 μM: 1 M 분산된 오팔색 용액 119.9 (0.378) +76.5 (±10.6)
* Nano-ZS (Malvern Instruments, United Kingdom), PDI-다분산 지수
실시예 6. 소포체 중 단백질 도입 효율의 측정
소포체 중 EGF 도입 효율을 측정하기 위해서, 유리 EGF 소포체 분리를 위한 초원심분리 방법을 사용하였다. 평가된 다양한 소포체 현탁액들로부터, 1.0 mL를 취하고; 바이알에 넣은 다음 고속으로 (100,000 × g), 4 ℃에서 60분 동안 원심분리하였다. 이어서, 상등액 중의 단백질 함량 (유리 EGF)을 고상 면역효소 분석법 (solid-phase immunoenzymatic assay, ELISA)에 의해서 측정하였다 (Vazquez et al., Biotecnol . Apl . 1990, 7: 42-49). 소포체 중 EGF 도입 효율은 하기 식에 의해서 계산하였다:
도입 효율 (%) = [EGF 초기 중량 - 상등액 중 EGF 중량] * 100 / EGF 초기 중량
결과들은 표 6에 도시하였다. DPPC:콜레스테롤 조성물 (실시예 1로부터 수득), CTAB:콜레스테롤 조성물 (실시예 2로부터 수득) 및 세트리마이드:콜레스테롤 조성물 (실시예 3으로부터 수득)을 포함하는 소포체들 중 EGF 도입 효율에 대한 결과들을 도시하였다. EGF 농도 (EGF:콜레스테롤 비율)의 영향 또한 평가하였다. 넓은 범위의 EGF 농도 (EGF:콜레스테롤 비율)에 걸쳐서, QUATs:콜레스테롤 시스템 중 높은 EGF-도입 효율 수치 (거의 100%)가 측정되었다. 그러나, DPPC:콜레스테롤 시스템으로의 EGF 도입 효율 결과는 매우 낮았는 바, 최고 EGF 농도에 대해서 최대 도입 효율이 10%를 초과하지 않았다.
다양한 조성의 소포체들 내로의 EGF 도입 효율
조성물
(EGF:콜레스테롤)		 도입 효율 (%) (평균 ± STDEV, n=2)
DPPC-콜레스테롤 CTAB-콜레스테롤 세트리마이드-콜레스테롤
1 μM: 1 M ND 99.8 ± 1.3 99.9 ± 0.5
2 μM: 1 M ND 99.7 ± 0.9 99.3 ± 0.7
5 μM: 1 M ND 99.7 ± 0.7 99.0 ± 0.3
15 μM: 1 M 1.0 ± 0.2 99.9 ± 0.5 98.5 ± 2.6
25 μM: 1 M 2.7 ± 0.3 99.7 ± 0.2 98.0 ± 0.5
40 μM: 1 M 8.7 ± 0.6 99.9 ± 0.4 97.9 ± 1.8
ND-측정되지 않음
BSA를 포함하는 소포체들의 특정 경우에 있어서, EGF에 대해서 서술된 동일한 과정이 사용되었지만, 단백질 정량은 바이싱코니닉산 방법 (bicinchoninic acid method)에 의해서 수행하였다 (Micro-BCA) (Smith et al ., Anal . Biochem . 1985, 150: 76-85). 실시예 5에 서술된 바와 같이 제조된, CTAB:콜레스테롤 소포체 중 BSA 도입 효율은 단지 42 ± 5%였다. BSA 도입 효율을 EGF 도입 효율과 비교하였을 때 (표 6에 도시), 동일한 CTAB:콜레스테롤 조성을 갖는 소포체에서, EGF 도입이 현저하게 높다는 것을 관찰할 수 있다.
실시예 7. 압축 유체 기술에 의한 콜레스테롤: CTAB : EGF 소포체의 합성 재현 가능성
EGF 소포체의 합성에 사용된 방법의 견고성 및 재현가능성을 테스트하기 위해서, 평균 입자 크기, PDI, Z-포텐셜 및 EGF 도입의 효율성을, 다른 날짜들에 제조된 5 μM:1 M 및 15 μM:1 M의 여러 배치들 중에서 측정하였다. 표 7 및 8에는, 얻어진 결과들을 도시하였다. 평균 입자 크기, PDI 및 Z-포텐셜은 DLS에 의해서 측정하였다. EGF 도입의 효율성은 실시예 6에 서술된 바와 같이 측정하였다.
DELOS - SUSP 에 의한 제조 이후, EGF 가 5 μM의 농도로 도입된 CTAB :콜레스테롤 (1:1) 소포체들의 특성
코드 (날짜) 입경 (nm)* PDI Z-포텐셜 (mV)* EGF 도입 (%)
배치 1
(26/10/2010)		 103.3 0.363 69.5 98.1
배치 2
(29/10/2010)		 96.75 0.376 79.7 97.3
배치 4
(10/02/2011)		 101.4 0.311 77 97.2
배치 8
(18/11/2011)		 92.82 0.351 76 96.6
배치 10
(10/02/2012)		 113.6 0.281 75.9 95.8
배치 11
(10/02/2012)		 111.3 0.335 70.1 98.6
* Nano-ZS (Malvern Instruments, United Kingdom), PDI-다분산 지수
DELOS - SUSP 에 의한 제조 이후, EGF 가 15 μM의 농도로 도입된 CTAB :콜레스테롤 (1:1) 소포체들의 특성
코드 (날짜) 입경 (nm)* PDI Z-포텐셜 (mV)* EGF 도입 (%)
배치 3
(29/10/10)		 141.7 0.419 80.4 99.4
배치 5
(24/02/11)		 139.5 0.278 74 98.1
배치 6
(28/02/11)		 142.2 0.275 72.9 99.7
배치 7
(29/06/11)		 139 0.353 77 99.1
배치 9
(30/06/11)		 140.9 0.357 77.5 98.6
배치 8
(12/07/11)		 141.4 0.319 76.0 99.5
* Nano-ZS (Malvern Instruments, United Kingdom), PDI-다분산 지수
표 7 및 8에 표시된 수치들로부터, 제조 날짜와 무관하게 소포체들이 유사한 특성들을 지니며, 이는 DELOS-SUSP 방법이 EGF 소포체들을 제조함에 있어서 재현가능하고 견고하다는 것을 의미한다.
실시예 8. 압축 유체 기술을 사용한 콜레스테롤: CTAB : EGF 소포체 합성의 스케일 업
소포체들을 실시예 2에서와 같이 합성하였지만, 50배 더 큰 스케일로 합성하였다. 먼저, 144 mL의 에탄올 중 3.8 g의 콜레스테롤 용액을 대기압 및 작업 온도에서 (Tw = 35 ℃), 300 mL 부피의 고압 반응기 내로 도입하였다. 압축된 CO2를 첨가하여 용액의 부피 팽창을 야기함으로써, 몰 분율 XCO2 = 0.7 및 작업 압력 PW = 10 MPa에 이르게 하였다. 완전한 균질화 및 열적 균형을 달성하기 위해서, 반응계를 10 MPa 및 35 ℃에서 약 60분 동안 방치하였다. 마지막으로, 팽창된 액체 용액을, 원하는 농도 (5 및 12 μM)의 EGF를 함유하는, mQ 수 (C= 2.83 mg/mL) 중의 CTAB 용액 1200 mL 상에서, 작업 압력으로부터 대기압으로 감압하였다. 이러한 마지막 단계에서는, 10 MPa의 N2 스트림을 플런저로서 사용하여 에탄올 용액 중의 콜레스테롤을 밀어냄으로써 감압화 도중에 반응기 중의 일정 작업 압력을 유지하였다. 이어서, 소포체를 밀봉된 컨테이너로 옮기고, 사용 이전까지 5 ± 3 ℃에서 보관하였다.
EGF가 5 μM 및 12 μM의 농도로 도입된 CTAB:콜레스테롤 (1:1) 소포체들을 수득하였다. 물리적 외관, 평균 크기, PDI 및 Z-포텐셜에 대한 결과들을 표 9에 나타내었다. 평균 입자 크기, PDI 및 Z-포텐셜은 DLS에 의해서 측정하였다.
DELOS - SUSP 에 의해서, 파일럿 스케일로 제조한 이후, 콜레스테롤: CTAB : EGF 소포체들의 변형물들에 대한 물리적 외관, 평균 입자 크기, PDI 및 Z- 포텐셜
조성물
(EGF:콜레스테롤)		 물리적 외관 평균 크기
(nm) (PDI)* 		Z-포텐셜
(mV) (±SD)*
0 μM: 1 M 분산된 오팔색 용액 132.7 (0.224) +63.1 (±2.0)
5 μM: 1 M 분산된 오팔색 용액 127 (0.211) +61.3 (±2.2)
12 μM: 1 M 분산된 오팔색 용액 160.7 (0.234) +60.1 (±2.6)
* Nano-ZS (Malvern Instruments, United Kingdom), PDI-다분산 지수
표 9는 EGF:CTAB:콜레스테롤 소포체들이 5 μM: 1 M 및 12 μM: 1 M 비율들에서 안정하다는 것을 보여준다. 스케일 업 과정 중에서 얻어진 입자들이 6 mL 스케일 (실시예 2)에서 얻어진 것들에 필적하는 물리-화학적 특성들을 갖는다는 것을 알 수 있다. 두 경우 모두에서, 얻어진 입자들의 평균 크기는 200 nm 미만이었다.
실시예 9. 쥐과 A31 3 T3 섬유아세포에서 세포 번식 분석법에 의해서 평가한, 소포체들의 생물학적 활성
실시예 1 내지 3에 서술된 바와 같이 제조된 EGF 소포체들의 생물학적 활성을 세포 번식 분석법을 사용하여 측정하였다 (Mire - Sluis and Page , J. Immunol . Methods 1995, 187: 191-199). 이 경우, 유리 EGF, EGF 리포좀 및 EGF를 포함하는 다양한 소포체들이 쥐과 섬유아세포의 A31 3T3 세포주의 세포 번식을 증가시키는 능력을 평가하였다. 다양한 소포체 현탁액들의 생물학적 활성을, 테스트 세포들 상에 현탁액의 적당한 희석액을 직접 도포함으로써 평가하였으며, 샘플들의 흡광도는 작업 참조 물질의 곡선 범위 내에 속하도록 하였고, 상기 작업 참조 물질은 National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC, 영국)에 의해서 제공된 국제 참조 물질 EGF 91/550에 대해서 미리 보정되었다.
다양한 EGF 소포체 제제들의 효능을 유리 EGF와 비교하기 위해서, 다양한 제제들의 비활성 (specific activity)을 하기 식에 의해서 생물학적 활성 결과들로부터 계산하였다:
EGF 비활성 (IU/mg) = EGF 생물학적 활성 (IU/mL)/EGF 농도 (mg/mL)
생물학적 활성은 서술된 분석법에 의해서 측정하였고, 단백질 농도는 다양한 소포체 제제들 중 당량 EGF 농도의 명목 수치 (mg/mL)로 주어졌다.
세포 번식 분석법에 있어서의 대조군으로서, 빈 소포체 (EGF가 첨가되지 않은)를, 다양한 변형물들에 대응되게 사용하였다. 이러한 샘플들에서, EGF를 포함하는 소포체들에 대해서 사용된 것보다 더 낮은 희석물들에서, 세포독성 효과 또는 번식의 증가 모두 관찰되지 않았다.
도 4A는 CTAB:콜레스테롤 조성물을 포함하는 EGF 소포체들이 유리 EGF 및 DPPC:콜레스테롤 조성을 갖는 소포체 중의 EGF와 비교할 때에, 증가된 비활성을 나타낸다는 점을 보여준다. 도 4B에서, CTAB 대신에, 세트리마이드가 동일한 방법에 의해서 제조된 소포체들의 조성 중에 사용되는 경우에도 전자와 유사한 결과가 얻어진다는 점을 알 수 있다. 이러한 평가의 목적은 EGF 생물학적 기능이 상기 소포체의 성분 또는 합성 방법에 의해서 영향을 받는지를 결정하기 위한 것이다. 그러나, QUATs:콜레스테롤 조성을 갖는 소포체들의 경우, EGF의 예기치 않은 생물학적 비활성 증가가 관찰되었다.
실시예 10. QUATs :콜레스테롤 소포체 내로 도입된 EGF 의 단백질분해효소 내성
본 발명의 실시예 2 및 3에서 제조된 QUATs:콜레스테롤 (1:1) 조성을 갖는 EGF 소포체들을 사용하였다. 본 실시예는 도입된 EGF가 단백질분해효소에 대해서 갖는 안정성을 보존하기 위한, QUATs:콜레스테롤 소포체들의 능력을 평가하기 위해서 수행하였다. 당뇨성 족부 궤양과 같은 만성 상처들은 이들을 치료하기 위해서 사용되는 약물들의 생이용가능성에 영향을 줄 수 있는 단백질분해성 환경들을 보유하는 것으로 알려진 바 있다 (Bennett and Schultz , Am . J. Surg . 1993, 166: 74-81).
이러한 평가를 위해서, 모델 단백질분해효소로서 트립신을 사용하였다. 효소 반응물은 pH 8.5 및 20 mM 농도를 갖는 Tris-HCl 완충용액 중에서 제조하였으며, 상기 완충 용액은 최종 농도 0.5 ㎍/mL의 트립신을 함유한다. 유리 EGF 또는 다양한 소포체 제제들 중 EGF 균등물의 최종 농도는 125 ㎍/mL였다. 샘플들의 배양은 37 ℃에서 4, 8, 16 또는 24 시간 동안 수행되었다. 최종 농도 0.1% (v/v)의 트리플루오로아세트산 (TFA)을 사용하여 효소 반응을 정지시켰다.
반응 정지 이후에, 샘플들을 절대 메탄올 중에서 희석시킴으로써, 최종 메탄올 농도가 80% (v/v)가 되게 하였으며, 테이블 원심분리기 중에서 10,000 rpm으로 5 분 동안 교반 및 원심분리하였다. 최종적으로, 원심분리 상등액을 0.2 ㎛ 기공 크기를 갖는 폴리카보네이트 필터를 통하여 여과시키고, HPLC 시스템 (Merck, 독일)에 가하였다. EGF 표준 및 소포체 샘플들은 C18 역상 컬럼 (Vydac, Hesperia, CA, 미국)을 사용하여 분석하였으며, 226 nm에서 검출하였다. 이를 위해서, 28분 동안 선형 구배를 갖는 20% 내지 40%의 B를 사용하였다. 이동상 A는 0.1% TFA/물로 구성되며, 이동상 B는 0.05% TFA/아세토니트릴로 구성된다. 분석되는 주입 부피는 5.0 mL로서, 약 20　㎍의 EGF에 해당된다. 사용된 흐름 속도는 1.0 mL/분이었다. 샘플들 중의 EGF 농도는, 226 nm에서 얻어진 크로마토그램으로부터, 메인 피크 및 공지된 샘플의 EGF 농도 아래의 영역 중 EGF의 보정 곡선을 사용한 내삽법 (interpolation)에 의해서 정량화하였다. 트립신과 함께 배양한 이후에, 각 샘플에 잔류하는 EGF의 백분율을 하기 식을 사용하여 계산하였다:
잔류 EGF (%) = 트립신 배양 이후의 EGF 농도 (㎍/mL)*100/트립신 배양 이전의 EGF 농도 (㎍/mL)
도 5A는 CTAB:콜레스테롤 조성을 갖는 EGF 소포체들이, 24 시간 동안, 유리 EGF에 비해서 트립신에 대한 증가된 안정성을 나타낸다는 점을 보여준다. 유사하게, 도 5B는, 세트리마이드:콜레스테롤 조성을 갖는 EGF 소포체들이 이전에 서술된 것과 비슷한 양상을 나타낸다는 점을 보여준다. 평가된 EGF 로딩량 (EGF:콜레스테롤 비율) 사이에서는 별다른 차이점이 관찰되지 않았다.
QUATs:콜레스테롤 소포체 중에 도입된 EGF의 단백질분해효소에 대한 안정성 결과들은, EGF 소포체들이 유리 EGF보다 훨씬 높은 안정성을 갖는다는 점을 보여준다.
실시예 11. QUATs :콜레스테롤 소포체들의 항미생물 활성 실험
QUATs:콜레스테롤을 포함하는 소포체 현탁액이 항미생물 활성을 나타내는지 결정하기 위해서 평가하였다. 이러한 활성은 아가 확산 방법을 사용하여 측정하였다 (Manual of Clinical Microbiology . 6 th ed . Washington , DC : ASM ; 1995). 다양한 현탁액들의 효율성을, 영양 아가 플레이트 중 웰들의 기술을 사용하여, 그램 양성 박테리아 (Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus), 그램 음성 박테리아 (E. coli, Proteus mirabilis), 및 균류 (Candida albicans, Aspergillus niger)에 대해서 분석하였다. 이러한 미생물들은 미생물 컬렉션 BCCM/LMG (벨기에)에 의해서 동정 및 제공되었다. 박테리아는 트립톤 소이 브로쓰 (Oxoid) 중, 37 ℃에서 밤새도록 배양하였으며, 균류는 사보라우드 덱스트로스 브로쓰 (Sabouraud Dextrose Broth) (Oxoid) 중 28 ℃에서 72 시간 동안 배양하였다. 이러한 현탁액들을 접종물로서 사용하였다. 108 콜로니 형성 유닛/ml의 박테리아, 또는 104 포자/ml의 균류를 함유하는 100 ㎕의 현탁액을 사용하여, 최종 접종물을 트립톤 소이 아가 및 사보라우드 덱스트로스 아가 (Oxoid) 플레이트 상에 각각 도말하였다. 디스크 (직경 6 mm)를 테스트될 각각의 다른 소포체 현탁액들로 함침시켰다. 시프로플록사신 (ciprofloxacin) 및 플루코나졸 (fluconazole) (100 ㎍/ml)을 각각 박테리아 및 균류에 대한 양성 대조군으로서 사용하였다. 분석 플레이트들을 박테리아에 대해서 37℃에서 24 시간 동안, 균류에 대해서 28 ℃에서 72 시간 동안, 가시적인 성장에 필요한 배양 시간에 따라서, 배양하였다.
표 10은 다양한 소포체 현탁액들이 그램 양성 박테리아 및 균류에 대해서 항미생물 효과를 갖는다는 점을 보여준다. 일반적으로, 미생물들은 CTAB:콜레스테롤 조성물의 소포체 현탁액보다는 세트리마이드:콜레스테롤 조성물의 현탁액에 대해서 더욱 민감하였다. 일부 소포체 현탁액들은 소정 미생물들에 대해서 시프로플록사신 및 플루코나졸 각각에 필적하는 항미생물 및 항균류 활성을 나타내었다.
박테리아 및 균류에 대한 다양한 QUATs :콜레스테롤 소포체 현탁액들의 항미 생물 및 항균류 활성
소포체
현탁액		 항미생물 활성 (억제 영역, mm) 항균류 활성 (억제 영역, mm)
B. subtilis S. aureus E. coli P. mirabilis A. niger C. albicans
CTAB:콜레스테롤 (1:1) 22 18 R 10 16 16
EGF가 5 μM 농도로 도입된 CTAB:콜레스테롤 (1:1) 12 6 R 4 6 6
세트리마이드:콜레스테롤 (1:1) 26 16 4 14 18 18
EGF가 5 μM 농도로 도입된 세트리마이드:콜레스테롤 (1:1) 24 18 4 10 18 18
대조군 - - - - - -
시프로플록사신 22 20 18 18 - -
플루코나졸 - - - - 21 22
R-내성
실시예 12. EGF 소포체를 함유하는 액체 스프레이 아토마이저 제제의 제조
실시예 2에서 얻어진 바와 같은 5 μM: 1 M의 EGF:콜레스테롤 조성을 포함하는 CTAB:콜레스테롤 (1:1) 소포체 현탁액으로서, EGF 당량 농도가 25　㎍/mL인 현탁액을, pH 7.2의 10 mM 소듐 포스페이트 완충용액 중에서 15　㎍/mL의 EGF 당량 농도로 희석하였다. 이러한 최종 용액은 또한 17% (v/v) 글리세롤, 10% (v/v) 에탄올, 0.02% (w/v) 부틸 히드록시톨루엔 (BHT), 0.18% (w/v) 메틸 파라벤 및 0.02% (w/v) 프로필 파라벤을 포함한다. 결과물인 분산액을 0.2 ㎛ 셀룰로오스 아세테이트 멸균 필터를 통해서 여과하였으며, 질소 분위기 하에서 유리 바이알 중에 방출하였다.
실시예 13. EGF 소포체를 함유하는 겔 제제의 제조
실시예 3에서 얻어진 바와 같은 5 μM: 1 M의 EGF:콜레스테롤 조성을 포함하는 세트리마이드:콜레스테롤 (1:1) 소포체 현탁액으로서, EGF 당량 농도가 25　㎍/mL인 현탁액을, 15　㎍/mL의 EGF 당량 농도로 희석하였다. 이러한 최종 용액은 또한 pH 7.2의 10 mM Tris-HCl 완충용액, 및 1.25% (w/v) 최종 농도의 Carbomer (Carbopol 940); 3% (v/v) 글리세롤 및 20 mM L-메티오닌을 포함한다. 더 나아가, 제제는 0.02% (w/v) BHT를 포함하며, 항미생물 방부제로서 0.18% (w/v) 메틸 파라벤 및 0.02% (w/v) 프로필 파라벤을 포함한다.
실시예 14. EGF 소포체를 포함하는 비경구 제제의 제조
실시예 4에서 얻어진 바와 같은 5 μM: 1 M의 EGF:콜레스테롤 조성을 포함하는 BKC:콜레스테롤 (1:1) 소포체 현탁액으로서, EGF 당량 농도가 25　㎍/mL인 현탁액을, 접선 유동 한외여과 장치인 Sartocon Slice 200의 셀 내로 도입하였다. 소포체의 한외여과를 위해서, 30 kDa의 기공 크기를 갖는 Hydrostat
Figure 112015020156644-pct00011
멤브레인을 구비한 카세트들을 사용하였다. 농도-디아필트레이션 과정은 25 ± 3 ℃의 온도에서 수행하였으며, 카세트 입구에서의 최대 압력 강하는 4 bar 미만으로 유지되었다. 이러한 과정 동안, 현탁액은 5배 농축되었다 (EGF의 최종 당량 농도는 125 ㎍/mL). 농축 단계 이후에, 소포체들을 pH 7.2의 10 mM 소듐 포스페이트 완충용액 중에서 희석하여 75 ㎍/mL의 EGF 당량 농도가 되게 하였다. 이러한 제제는 또한 20 mM의 L-메티오닌 및 0.02% (w/v)의 BHT를 포함한다. 결과물인 현탁액을 0.2 ㎛ 멸균 필터를 통해서 여과하였으며, 질소 분위기 하에서 유리 바이알 중에 방출하였다.
실시예 15. 상처 치유 동물 모델에서, EGF 를 포함하는 리포좀 및 소포체의 약물동력학적 효과 비교
실험 방법
하기 열거된 제제들의 약학적 효능을 평가하기 위해서, 총 두께의 만성 궤양을 갖는 실험 모델을 래트의 등에 진행시켰다. 각 10마리의 7개 실험군들로 무작위로 할당된 체중 250-270 그램의 Sprague Dawley 래트들을 사용하였다. 래트들을 케타민/자일라진의 조합을 사용하여 복강내 마취하여 그 등 부분에서 광범위하게 제모하였다. 두 개의 대칭인 양쪽 역견갑골 (retroscapular) 궤양들을 8 mm 직경으로, 상부 근막까지 총 두께로 제조하였으며, 상부 근막은 남겨 두었다. 압축물로서, 트리암시놀론 아세토나이드 (triamcinolone acetonide)를 곧 바로 도포하였으며, 이는 치유를 중단시키고 만성의 특성 변화를 유도하기 위해서 최초 3일 동안 1일 1회 수행하였다. 7일 경과 후에, 치유 중단 및 궤양의 만성도는 육아 조직의 부존재 및 상피 가장자리의 비대화에 의해서 확인하였다. 이 순간부터, 연구 대상 치료들을 하기 서술한 바와 같이 개시하였다:
그룹 1: 치료-없음 (식염수). 본 그룹에 대해서는 나머지 그룹들에 대한 취급 및 조작과 동일한 조건을 처리해 주었다. 멸균 생리 식염수 용액을 분무 형태로 도포하였다.
그룹 2: 빈 DPPC-콜레스테롤 리포좀,
그룹 3: 빈 CTAB-콜레스테롤 소포체,
그룹 4: 빈 세트리마이드 콜레스테롤 소포체,
그룹 5: EGF가 25 ㎍/ml 농도로 로딩된 DPPC-콜레스테롤 리포좀,
그룹 6: EGF가 25 ㎍/ml 농도로 로딩된 CTAB-콜레스테롤 소포체,
그룹 7: EGF가 25 ㎍/ml 농도로 로딩된 세트리마이드-콜레스테롤 소포체.
상처들은 매일 세척하였다. 상처들을 살균한 이후에, 각각의 그룹에 대해서 각 경우에 표시된 현탁액을 투여하였다. 현탁액 투여는 매일 2회, 14일 동안 수행하였다. 실험계들에 대해서는 소포체, 또는 리포좀의 현탁액을 분무로 국부 적용하였다.
모든 동물들에 대해서, 각 그룹에 할당된 치료 개시 14일 이후에 부검 및 샘플링을 수행하였다. 샘플들은 10% 중성 포르말린 중에서 고정시켰고, 72시간 이후에 추후 파라핀 주입을 위해서 균등하게 반으로 분할하였다. 사용된 염색은: 헤마톡실린-에오신, Mallory's 트리크롬 반응 (trichrome reaction), Verhoeff's 및 Gomori's 망상조직 방법 (reticulum method)이었다. 샘플들에 대해서는 두 명의 독립적인 연구자들에 의해서 맹인 분석을 수행하였다.
결과:
오염된 궤양을 배제할 필요는 없었으며; 따라서, 6개 실험군 각각에 대해서 20개의 부위들을 사용하였다. 요약하면, EGF 소포체의 모든 약학 제제들이, EGF가 없는 소포체들 (빈), 25 ㎍/ml의 EGF가 로딩된 리포좀들, 및 식염수로 처리된 실험 대조군과 비교할 때, 전반적인 치유 과정을 현저하게 촉진하였다. 보고된 데이터는 다른 시간대에 수행된 두 가지 독립적인 연구들의 평균에 관한 것이다. 비교를 위해서, Mann-Whitney U 및 Student's t-테스트를 사용하였다. 모든 패러미터들은 정규 분포 기준을 만족하였다. 연구된 패러미터들 및 결과들을 표 11에 나타내었다.
래트의 만성 상처 모델에서 평가된 현탁액들의 약물동력학적 효과
실험군 염증 침윤
(1- 5 등급 ) 		섬유아세포성 반응
(1-5 점) 		상피성 이동
(미크론) 		가장자리 수축의 %
그룹 1: 식염수 4.61 ± 1.03 2.87 ± 0.65 3.0 ± 1.1x103 23.6 ± 5.11
그룹 2: 빈 DPPC-콜레스테롤 리포좀 4.27 ± 0.02 3.2 ± 0.96 2.5 ± 0.7x103 18.55 ± 3.21
그룹 3: empty CTAB-콜레스테롤 소포체 3.8 ± 1.00 2.56 ± 0.93 2.97 ± 1.6x103 21.9 ± 4.63
그룹 4: 빈 세트리마이드-콜레스테롤 소포체 4.51 ± 0.95 2.64 ± 0.55 2.8 ± 1.5x103 31.02 ± 1.81
그룹 5: EGF로 로딩된 DPPC-콜레스테롤 리포좀 2.9 ± 0.88* 3.81 ± 0.87* 4.6 ± 1.04x103 * 63.7 ± 6.75*
그룹 6: EGF로 로딩된 CTAB-콜레스테롤 소포체 1.18 ± 0.04** 4.2 ± 0.18** 6.27 ± 0.27x103 ** 88.7 ± 6.26**
그룹 7: EGF로 로딩된 세트리마이드-콜레스테롤 소포체 1.12 ± 0.07** 4.17 ± 0.25** 7.02 ± 0.53x103 ** 85.3 ± 7.01**
*는 p = 0.05를 나타내고; **는 p = 0.01을 나타낸다.
실험 결과는 EGF로 로딩된 CTAB-콜레스테롤 및 세트리마이드-콜레스테롤 소포체들이 치유 효과를 나타낸다는 것을 보여준다. 그룹 6 및 7에 대해서 관측된 항-염증 효과는 다른 치료군들에 비해서 주목할 만한 것이었다. 섬유아혈관신생 (fibroangiogenesis) 및 수축을 촉진하는 효과는 신생피부 (neodermis)에 침윤되는 면역-염증성 세포들의 균형 감소와 연결되는 것일 수도 있다. 유사하게, 상피성 이동을 촉진하는 두드러진 효과가 관찰된 바, 현미경으로 층상 상피의 존재가 확인되었다. EGF-로딩된 리포좀으로 처리된 그룹에 대해서 얻어진 반응은 그룹 6 및 7에서 검출된 것들보다 작은 정도였다. 또한, 그룹 6 및 7에 적용한 경우, EGF가 로딩된 소포체 현탁액을 포함하는 치료법의 우월성을 유사한 실험으로 입증하였으며, 이때 상처 중의 만성도는 메틸글리옥살의 국소 적용에 의해서 유도하였다.
실시예 16. 당뇨성 족부 궤양을 지닌 환자에서 EGF 를 포함하는 소포체의 국소 적용에 기반한 치료
임상 결과, University of Texas 관측 자료에 따르면, 치료된 병변의 대부분의 경우에서 절단을 요하는 가능성이 90%를 초과하였다. 치료는 국소적으로 투여되었다.
치료된 환자들의 일반적 특성들은 하기와 같다:
환자들은 오랜 병력의 진성 당뇨병 I형 또는 II형 환자들이었으며, 경구 저혈당증 시약으로서 인슐린, 술포닐우레아, 또는 비구아나이드 (biguanides) 약제 처방을 받았다. 환자들은 개인적으로 열악한 흉터 병력이 있는 반면에, 일부는 사전 대측성 절단 (prior contralateral amputation)을 경험이 있었다. 모든 처리된 하지 부상들은 허혈성 또는 신경성 당뇨 족부에 해당하였다. 병변들은, 전체적으로, 만성, 복합 및 난치성으로 분류되는 것들이었다. 병변의 진전 기간은 1달 미만에서부터 7년에 이르기까지 다양하였다. 치료된 병변의 크기는 20 내지 80 제곱 센티미터의 범위였다. 일부 병변에서의 깊이는 심지어 골막 (periosteum)까지 도달하였다. 해부학적 관점에서 볼 때, 치료된 병변들은 측면 (lateral), 종골 (calcaneus) 및/또는 중족골 (metatarsal) 영역들에 존재하였다. 첫 번째 치료를 받은 모든 환자들은, 마취 하에서 절제술이 필요하고, 비경구적 항생제 치료법을 필요로 하는 이상, 입원시켰다. 치유시, 또는 상피 이동을 수반한 총 상처 과립화 (total wound granulation)가 나타나는 경우, 환자들에 대해서 외래진료법을 수행하였으며, 치료 및 약 처방을 위해서 격일로 후속 관찰하였다. 완전한 상피화 (epithelialization) 이후에, 각 환자들에 대해서 치유 이후 12 개월 동안 후속 관찰하였다. 병의 재발, 부작용 발생에 대한 평가, 및 환자의 일반적 상태에 대한 분석을 수행하였다.
표 12는 국소 치료를 받은 환자들의 집단에 대한 인구학적 및 유행병학적 특성들을 나타낸 것이다.
국소 치료를 받은 환자들의 집단에 대한 인구학적 및 유행병학적 특성들
식별 표시 연령 성별 DM* 타입 DM 진전 기간 병변의 분류 병변의 진전 병변의 유형
JLG 56y** 남 II 15y 허혈 성분을 동반한 신경성 2년 전방 연장, 중족골 절단 이후 잔여 부위
OFS 65y 여 II 17y 근부 석회화 패턴을 동반한 신경성 21일 Wagner III. 족의 전외측부. 우하방 손발
AVL 52y 남 II 9y 순수 신경성 7년 발바닥, 수축/상피화 없이 7년 동안 과립화
PAT 47y 남 II 12y 발목 상완 지수 (ABI) 0.532를 동반한 허혈성 32일 Wagner IV. 중족골 절단 잔여 기저
GMA 69y 남 II 10y 순수 신경성 6개월 중족골 절단 이후 전방, 잔여 부위
* DM: 진성 당뇨, ** y: 년
각각의 환자들에 대해서 수행한 치료는 하기와 같다:
환자 JLG. 남성, 56세로서, 인슐린으로 조절되었으며, 다른 어떠한 임상적으로 뚜렷한 당뇨병 합병증을 수반하지 않음. 허혈성 성분을 동반하는 광범위한 전방 병변을 가지며, 이러한 병변은 중족골 절단 후 2년 동안 지속됨. 항미생물성 및 오존 치료법을 2년 동안 확립한 이후에 어떠한 과립화 및 상피화 과정들도 없었다. 외과적 세척 수행 및 가장자리 자극 이후에, 실시예 12에 서술된 EGF:CTAB:콜레스테롤 소포체를 포함하는 국소 스프레이 제제를 사용하여 격일로 치료를 개시하였다. 8주 동안의 치료 중, 병변의 완전한 상피화가 달성되었다. 결과는 도 6에 도시하였다.
환자 OFS. 남성, 흡연자, 비만, 고혈압 병력이 있고, 경구 저혈당 제제로 조절. 지방 벌레 물림으로 인한 연조직 및 힘줄의 급속 진전 괴사. 괴사 물질의 외과적 절제술이 수행됨. 항미생물성 치료법을 개시하였으며, 병변은 격일로 치료하였다. 개입 후 14일 경과 후에도, 과립화 과정에 진전이 없고 느렸기 때문에, EGF:CTAB:콜레스테롤 소포체를 포함하는 실시예 12에 서술된 국소 스프레이 제제를 사용하여 격일로 치료를 시작하였다. 치료 8주 경과 후에, 병변의 완전한 상피화가 달성되었다.
환자 AVL. 남성, 52세, 글리벤클라마이드 (glibenclamide)로 조절, 수축/상피화의 징후 없이, 7년 동안 과립화된 샤르코 신경성 발바닥 족부 병변 (charcot neuropathic plantar foot lesion). 외과적 세척 및 가장자리 자극 이후에, 실시예 13에서 서술된 EGF:세트리마이드:콜레스테롤 소포체를 포함하는 겔 형태로 된 국소 제제를 사용하여 격일로 치료를 개시하였다. 8주 동안의 치료 중, 병변의 완전한 상피화가 달성되었다.
환자 PAT. 남성, 47세, 말초 동맥 질환이 발견된 이후임에도 불구하고, 다른 공동-만성질환 또는 임상적으로 뚜렷한 당뇨병 합병증은 없음. 국부적 트라우마로 인해서, 중족골 농양이 진전되었으며, 이는 뚜렷한 염증 징후를 수반하는 거의 모든 전방 족부의 액화성 괴사로 이어졌다. 중족골 절단을 수행하였으며, 항생제 치료법을 시작하였다. 30일 이후에도 잔류 기저부 절단이 만족스럽지 못하게 진전되었기 때문에, 허혈성 마이크로플라크 (microplaques)의 존재로 인해서 광범위한 괴사조직 제거를 수행하여야 했으며; 치료 개입은 실시예 13에서 서술된 EGF:세트리마이드:콜레스테롤 소포체를 함유하는 겔 형태의 국소 제제로 개시하였다. 제제는 가장자리 및 상처 표면 상에 도포하였다. 치료는 격일로 수행하였으며, 4 주 동안 지속하였다. 최초 투여 이래로, 허혈성 플라크가 제거되었으며, 생산성 및 출혈성 과립화 조직이 형성되기 시작하였고, 이는 이후에 부분-두께 무-피부 그라프트 (partial-thickness skin-free graft)를 적용하기 용이하게 하였다.
환자 GMA. 남성, 69세, 임상적으로 뚜렷한 당뇨병 합병증 없이 인슐린으로 조절됨. 환자는 중족골 절단 이후에 6개월 동안 지속되는 전방 잔류 병변을 보유하고 있음. 항미생물성 및 오존 치료법을 3개월 수행한 이후에도 과립화 및 상피화 과정은 없었다. 외과적 세척을 수행한 이후에, 실시예 12에서 서술된 EGF:CTAB:콜레스테롤 소포체를 함유하는 국소 스프레이 제제를 사용하여 격일로 치료를 수행하였다. 치료 6주 후, 병변의 완전한 상피화가 달성되었다.
실시예 17. 당뇨성 족부 궤양을 보유한 환자에서 EGF 소포체의 침윤에 기반한 치료
임상 결과, University of Texas 관측 자료에 따르면, 치료된 병변의 대부분의 경우에서 절단을 요하는 가능성이 90%를 초과하였다. 치료제는 침윤 (infiltration)에 의해서 투여되었다. 치료된 환자들의 일반적 특징들은 실시예 16에 서술된 것과 대응된다.
침윤적 치료를 위해서 실시예 14에 서술된 EGF:BKC:콜레스테롤 소포체를 사용하는 비경구 제제를 사용하였다. 본 치료의 핵심은 등거리 지점들에서, 병변의 가장자리 및 바닥에 병변내 및 병변주변으로 내부 주사를 수행하는 것에 있다. 주사 바늘을 궤양의 기저부 또는 쐐기부 (wedge)의 깊이로 15-45도 각도로 향하게 하여 물질을 주입하되, 가장자리의 수축을 자극하기 위해서 항상 피부-상피 접합을 포함시켰다. 조직의 임상적 외관 및 그 특성들에 따라서, 각 지점에 100 내지 1000 μL를 주입하였다. 이는 일주일에 2 내지 3회 수행하였다. 치료된 병변들 및 치료된 집단의 인구학적 특성들을 표 13에 나타내었다. 모든 치료된 경우에 있어서, 소규모 또는 대규모 절단이 예방되었다.
침윤 치료를 받은 환자들의 집단에 대한 인구학적 및 유행병학적 특성들
식별 표시 연령 성별 DM* 타입 DM 진전 기간 병변의 분류 병변의 진전 병변의 유형
HCJQ 65y** 여 II 13y 허혈성, 말단 박동 (distal pulses)은 없음.
0.05 ABI		 33일 Wagner IV. 5번째 발가락 잔여 기저의 절단
OFW 53y 남 II 21y 석회화된 대혈관증을 수반한신경성. BI 1.2 81일 Wagner IV. 잔여 기저의 중족부 절단
JIFM 61y 여 II 16y 무박동을 수반한 허혈성. 0.5 ABI 21일 Wagner V.
좌측 하지의 발바닥 및 중족골 영역에서 괴사성 근막염
* DM: 진성 당뇨, ** y: 년
각 환자들에 대해서 수행된 치료를 하기에 서술하였다:
환자 HCJQ. 허혈성, 말단 박동은 없었으며, 슬와 부위 (popliteal sector)로부터 폐색됨. 병변은 다섯 번째 발가락의 측면 절단 잔류 기저였으며, 허혈성 괴사에 있어서 피낭 및 건을 명백히 노출하는 것으로 나타났다. 병변은 Wagner 스케일에 따라서 IV급으로 분류되었다. 그 크기는 10 x 4 센티미터였다. 치료는, 모든 전신적 및 국소적 약학 수단들에도 불구하고, 절단 6일째에, 절단 잔류 기저에서 임상적 이완 (atony) 및 청색증 (cyanosis)이 나타나고, 이러한 방식으로 5일 동안 진전되는 경우에 개시하였다. 침윤은, 국소 미세환경의 개선 및 과립화 조직 진행의 촉진을 기대하며, 괴사 물질의 외과적 제거 이후에 개시하였다. 이러한 사항은 5번째 침윤 세션 이후에 관찰되었다. 환자는 동 12 세션의 침윤을 받았다. 치료에 의해서 생산적 및 출혈성 과립화 조직의 존재가 관찰되었다. 비록 가장자리의 수축이 두드러지지는 않았지만, 집중적인 구심성의 상피성 이동이 관찰되었다. 치료 개시 후 38일 경과 후에, 병변은 그래프트 필요 없이 완전히 상피화되었다. 어떠한 급성 또는 지연성 부작용도 없었다. 12개월 시점에서, 병변에는 국소적 재발이 전혀 없었다.
환자 OFW. 신경성, 입원시 Wagner IV로 분류가능한 트랜스-중족골 절단 잔여 기저를 보유하며 81일 동안 진전. 병변의 크기는 14 x 7 제곱 센티미터였다. 감각 장애의 징후를 보임에도 불구하고, 말단 박동은 0.9의 ABI로 감지되었다. 치료는, 42일 동안의 지역 치료 및 생리적 식염수 압축물 도포 동안, 병변이 매우 열악한 과립화 반응을 보이는 경우에 개시되었다. 국소 세포들을 소생시키기 위해서, 치료 첫 주 동안 침윤을 개시하였으며, 매일 수행하였다. 이어서, 스케쥴을 3주 동안, 주 2회 지속하였다. 이러한 스케쥴로, 완전한 생산성 및 출혈성 과립화가 달성되었다. 조직을 대측성 전방 허벅지로부터 얻어진 부분-두께 피부 그라프트로 덮었다. 이전에 서술된 환자와 유사하게, 치료는 잘 감내되었으며, 1년 경과 후 병변이 여전히 상피화되었다.
환자 JIFM. 여성, 이전 흡연자, 61세, 좌측 하지에 0.4의 ABI, 중족골 및 발바닥 영역에 괴사성 근막염을 보임. 병변은 V급 Wagner 스케일로 분류됨. 환자는 외과적으로 치료되었으며; 모든 괴사성 조직 및/또는 오염된 연조직 및 뼈의 절개가 수행되었다. 전신적 다가 항생 치료법이 확립되었다. 수술 48시간 경과 후에, 병변의 첫 번째 검사를 수행하였으며, 국소 세척을 행하고, 소포체를 사용한 침윤적 치료를 개시하였다. 초기 10일 동안, EGF 공격 투여량의 치료 요법을 도입하였으며, 이는 후에 5주 동안 2회의 침윤 세션으로 감소될 수 있었다. 치료에 의해서 어떠한 다른 치료적 대안 없이도 족부를 구제할 수 있었다. 환자는 정상 걸음걸이를 회복하였으며, 사지 말단부의 운동 명령이 만족스러웠다.
실시예 18. 당뇨성 족부 궤양을 보유한 환자들에서 EGF 소포체의 침윤성 및 국소적 조합 도포에 기초한 치료
임상 결과, University of Texas에 의해서 확립된 스케일에 따르면, 치료된 병변의 대부분의 경우에서 절단을 요하는 가능성이 90%를 초과하였다. 치료제는 국소 및 침윤의 조합에 의해서 투여되었다. 치료된 환자들의 일반적 특징들은 실시예 16에 서술된 것과 대응된다.
조합 치료를 위해서, EGF 소포체를 포함하는 비경구 제제 (실시예 14에 언급)로 먼저 침윤을 사용하였다. 이후, 국소적 적용을 위해서, 실시예 12에 서술된 스프레이 및 실시예 13에 서술된 겔을 교대로 사용하였다.
치료된 병변들 및 치료된 집단의 인구학적 특성들을 표 14에 나타내었다. 모든 치료된 경우에 있어서, 소규모 또는 대규모 절단이 예방되었다.
침윤 및 국소 치료를 포함하는 조합 요법 치료를 받은 환자들의 집단에 대한 인구학적 및 유행병학적 특성들
식별 표시 연령 성별 DM* 타입 DM 진전 기간 병변의 분류 병변의 진전 병변의 유형
AFG 74y** 남 II 22y 허혈성, 슬와 폐색 패턴,
0.5 ABI		 20일 Wagner V. 종골 연조직의 괴사 및 뼈 관여
LATR 61y 여 II 18y 허혈성 -
대혈관증을 동반한 대동맥 비페모랄 (bifemoral)		 50일 Wagner IV. 허혈성 플라크를 동반한 과상부 절단 잔여 기저
ZEM 57y 여 II 22y 순수 신경성 7년 Wagner V.
광범위 발바닥, 수축/상피화 징후 없이 7년 동안 과립화
JLHB 63y 남 II 18y 신경-허혈성 7년 Wagner IV. 단독 및 우하지의 내-중 측면 영역에서의 연조직 농양
* DM: 진성 당뇨, ** y: 년
하기에는, 각 환자들에 대해서 수행된 치료를 서술하였다.
환자 AFG. 오랜 당뇨병력 및 치료에 충실하지 않은 이력을 갖는 남성. 환자는 말단 박동 없이 슬와 폐색 패턴을 나타내었다. 병변은 플릭텐 (phlyctena)으로 나타났으며, 오염 및 빠르게 진전되어 종골 영역의 모든 연조직을 괴사시켰다. 첫 번째 외과적 치유 동안, 연조직들이 제거되었다. 5일 후, 또 다른 수술이 필요하였으며, 이는 뼈 물질의 황폐화로 이어졌다. 집중적인 다가 항생제 치료법이 확립되었으며, 첫 번째 수술 이후 20일 되는 때에, EGF 소포체로 침윤 치료를 개시하였다. 일일 치료 세션 및 국소 치유를 처음 2주 동안 확립하였다. 이어서, 실시예 3에 따라서 제조된 EGF:세트리마이드:콜레스테롤 소포체를 함유하는 실시예 13에 서술된 국소 겔 제제를 사용하여 격일로 치유 및 치료를 수행하였으며, 이는 후속 8주 동안 가장자리 및 상처 표면 상에 수행하였다. 치료 10주 후에, 병변을 완전히 상피화하였다.
환자 LATR. 허혈성, 말단 박동이 없으며 양쪽 하지 모두에 대혈관 질병을 수반함. ABI는 0.6이고, 석회화로 인해서 혈관재생 수술의 가능성이 없음. 사전 대측성 절단을 3년 전에 수행하였다. 4번째 및 5번째 발가락들에 미세 동맥 혈전증을 보유하며, 이는 모두 광범위한 깊은 외측 쐐기 (extensive deep lateral wedge)로 절단되었다. 수술 2주 후에, 절단 잔류 기저는 이완증 (atony)의 징후를 나타내었으며, 과립화에 대해서 난치성을 보였다. 따라서, 3주 차에는, 소포체를 이용한 치료를 개시하였는 바, 초기에는 주사 지점 당 25 내지 125 ㎍의 EGF 투여량으로 침윤 치료를 수행하여 수술 부위의 가장자리 및 바닥에 주입하였다. 이러한 ㅊ치료 모드는 모든 공동 및 터널들이 과립화 조직으로 채워질 때까지 사용되었으며, 이러한 현상은 대략 3주 후에 발생하였다. 이어서, EGF:세트리마이드:콜레스테롤 소포체를 포함하는 실시예 13에 서술된 조성을 갖는 겔을 사용하여 치료를 국소적으로 지속하기로 결정하였다. 치료는 가장자리 및 상처 표면에 대해서 수행하였으며, 특히 재상피화를 촉진하기 위해서, 상처의 피부-상피 경계에 집중적으로 수행하였다. 치료는 5주 차에 완전한 상피화가 이루어질 때까지 격일로 수행하였다.
환자 ZEM. 여성, 57세, Wagner III 급 병변 및 신경병증의 징후를 보이고, 발바닥 병변은 7년 동안 과립화되었지만, 수축/상피화의 징후는 보이지 않음. 가장자리를 외과적으로 세척 및 자극한 이후에, 침윤 치료를 주사 지점 당 75 ㎍의 당량 EGF의 투여량으로 수행하였는 바, 이는 EGF:BKC:콜레스테롤 소포체를 포함하는 실시예 14에 서술된 제제를 사용하여 수행하였고, 수술 영역의 가장자리들에 주입하였다. 이러한 치료 모드는 격일로 처음 4주 동안 수행하였다. 이어서, EGF:CTAB:콜레스테롤 소포체를 포함하는 실시예 12에 서술된 국소 스프레이 제제로 치료를 격일로 지속하기로 결정하였다. 치료는 가장자리 및 상처 표면에 대해서 수행하였으며, 특히 재상피화를 촉진하기 위해서, 상처의 피부-상피 경계에 집중적으로 수행하였다. 치료는 5주 차에 완전한 상피화가 이루어질 때까지 격일로 수행하였다. EGF 소포체들을 병변의 가장자리 및 표면 상에 분자화 (atomize)하였으며; 특히 재상피화를 촉진하기 위해서, 상처의 피부-상피 경계에 집중적으로 수행하였다. 치료는 8주 차에 완전한 상피화가 이루어질 때까지 격일로 수행하였다. 치유 과정의 진전을 도 7에 도시하였다.
환자 JLHB. 신경병성, 우측 하지 족부 상의 건화상 (dry burn)의 결과로 인해서 광범위한 감염 병변이 진전됨. 이는 최종적으로 중족골 절단으로 이어졌으며, 여기에 10 센티미터 외측 쐐기를 부가하였다. 치료는 정맥 항생제 및 전신적 지역 치료로 매 48시간 마다 수행하였다. 병변은 매우 느리게 과립화되는 경향을 나타내었으며, 수술 20일 경과후 가장자리의 이완증이 나타났다. 침윤 처리는 잔여 기저 및 웨지 (wedge)에서 격일로 75 ㎍의 EGF가 로딩된 소포체로 개시하였다. 격일로 EGF:CTAB:콜레스테롤 소포체를 포함하는 실시예 12에 서술된 국소 스프레이 제제를 사용하여 치료 개시 3주 경과시까지, 측면 웨지의 깊은 영역까지 도달하였다. 치료 조합은 60 제곱 센티미터 이상의 영역에 걸쳐서 총 과립화 및 자발적인 상피화를 가속화하였다.
실시예 19. 래트에서 , 급성 폐 장애 ( ALI ) 또는 성인 호흡곤란 증후군 (ARDS)의 치사 모델 중, EGF 소포체 사용의 치료적 효율성 입증
체중 250 내지 280 그램의 수컷 Sprague Dawley 래트들을 사용하였다. 폐 장애는 리포폴리사카라이드 (LPS)-자이모산 (zymosan)의 조합을 기관내 점적 (intratracheal instillation)시킴으로써 일반적 마취 조건 (케타민/자일라진) 하에서 유도하였다. 직후에, 동물들을 각 실험군 당 12 마리의 3개의 실험군으로 무작위 할당하였다.
그룹 A: 생리 식염수로 처리.
그룹 B: 생리 식염수 중의 25 ㎍/ml/kg 농도로 EGF의 스프레이로 처리
그룹 C: 실시예 4에 서술된 콜레스테롤:BKC:EGF 소포체로서, 25 ㎍/ml의 EGF 당량 농도를 갖는 소포체로 처리하였으며, 그룹 B와 같이 투여.
동물들은 첫 번째 증상이 나타나기 전까지는 어떠한 처리도 하지 않고 성장하게 두었다. LPS/자이모산 적용 6시간 이후에, 래트들은 강제된 호기 (forced exhalation)과 관련된 빈호흡 (tachypnea) 증상을 보였다. 이때, 동물들은 65%의 동맥 PO2 포화도 및 를 나타내었으며, 명백한 호흡성 산증 (respiratory acidosis)을 나타내었다.
따라서, 치료는 독소가 주입된지 대략 8시간 경과 후에 개시하였다. 실험은 두 가지 EGF 제제들이 단지 급성 증상의 ARDS만에 대해서 나타내는 치료 효과를 평가하기 위한 것이었다. 치료는 휘발성 마취 기계로부터 개조된 입과 얼굴에 영향을 주는 마스크에 의해서 수행되었다. 치료는 하루에 2회 수행하였다. 또한, 동물들에 대해서는 하루에 한번 공동아주반트 처리법으로서 히드로코르티손 아세테이트 (10 mg/kg) 처리를 수행하였다.
치료 개시 72시간 경과 후, 실험을 중단하였다. 생존 동물들을 마취하고, 세포학적 및 생화학적 연구를 위해서, 5 ml 중 멸균 식염수 중에서 폐포 세척술 (bronchoalveolar lavage)을 수행하였으며, 혈중 기체 패러미터들을 측정하기 위해서 동맥혈 샘플링을 수행하였다. 이어서, 폐에 10 ml의 10% 중성 포르말린을 불어넣고, 조직학 연구를 위해서 처리하였다.
표 15는 그룹 당 일일 치사율 결과를 나타낸 것이다. 표 15에서 볼 수 있는 바와 같이, EGF 분무를 사용한 처리에 의해서 급성 폐 장애의 진전이 조절되었다. 주목할 만하게, 생존에 있어서 최상의 효과는 소포체로 도입된 EGF가 처리된 그룹에서 관찰되었다. 생리적 식염수 중 단순 액체 에어로졸 중 입자로서의 EGF 보다는 다중 EGF 수용체들의 장기적 점유가 더욱 일관된 약학적 효과를 발휘한다는 점을 의미한다.
각 그룹에 있어서 치사율
그룹 24 시간 48 시간 72 시간 치사율
A 3 6 1 10 (83.3%)
B - 5 - 5 (41.6%)
C 2 - - 2 (16.6%)
폐포 세척술의 결과는 폐포벽 및 격벽 혈관 내피세포에 미치는 EGF의 보호 효과를 확인해준다. 더 나아가, 소포체 내로 도입된 EGF를 사용한 치료에 의해서 부여되는 보호가 향상된 폐활량으로 이어지며, 이는 증가된 동맥 PO2 속도 및 동맥 pH가 정상에 매우 근접하게 유지되는 것으로 표현된다. 이러한 데이터들을 표 16에 나타내었다.
폐포 세척술의 결과 및 폐 기능
그룹 ml 당 염증 세포 ml 당 적혈구 폐 조직 g 당 총 인지질 동맥 포화도 동맥 pH
A 3.0 ×104 2.0 ×103 188.6 ㎍ 51.8 ± 2.2 6.58 ± 0.4
B 2.2 ×103 5.0 ×102 241.0 ㎍ 76 ± 8.3 7.12 ± 0.1
C 0.5 ×103 - 1.32 mg 91.7 ± 5.6 7.33 ± 0.2
각 군으로부터 폐의 조직학적 분석은, EGF 처리, 특히 소포체 제제가 투여된 군에서의 EGF 처리가 폐 유조직을 보호한다는 것을 보여준다. 이는 폐포/격막 비율의 상대적 보존, 격벽 투과 부종의 감소 및 폐포 내강 중 출혈성 병소 및 호산성 물질의 존재에 의해서 입증된다. 생리적 식염수로 처리된 동물들과 비교할 때에, 소포체-도입된 EGF 제제로 처리된 동물들에서 염증성 반응이 덜 관찰된다. 이러한 실험으로부터, 실시예 4에 서술된 콜레스테롤:BKC:EGF 소포체로 처리하는 경우, ALI의 알려진 유도 물질에 노출된 폐 유조직에 대해서 더욱 강력/지속되는 약학적 효과가 발휘된다는 점을 유추할 수 있게 한다. 부여된 보호 효과는 폐의 구조적 온점함을 개선할 뿐만 아니라, 기능적 패러미터들을 실질적으로 교정한다.
실시예 20. 성인 호흡곤란 증후군 ( ARDS )을 갖는 위독 환자를 EGF 소포체로 연민 치료 ( compassionate treatment )
케이스 서술: 환자 AGJ, 남성, 75세, 병리적 의학 이력은 없으며, 패혈성 쇼크로 진전되는 복부 트라우마를 겪음. ARDS는 진행성 합병증으로서 발생하였으며, 이는 산소 요법이 듣지 않는 호흡 곤란 및 청색증을 수반하는 호흡곤란증, 낮은 포화도 (11 mm Hg) 및 혈액 pH 변화로 이어짐. 방사성 영상은 양쪽 폐 모두의 폐포에서 탈지면 반점들 (cotton wool spots)을 보여줌. 양성 말단-호기압 (positive end-expiratory pressure) 및 다른 일반적 약물들로 치료를 개시하기로 결정하였다. 급성 삼출상 (acute exudative phase)에서 폐의 폐포를 보호하기 위해서, 실시예 4에 서술된 콜레스테롤:BKC:EGF 소포체를, 1일 2회, 의학적 산소 1 리터 당 200 ㎍ 당량의 EGF 투여량으로 투여하였다. 치료에 의해서 환자가 정상으로 우호적 및 점진적으로 개선되었으며, 섬유성 폐렴 단계가 방지되었다. 치료 3일째에, 양압 호흡이 중단되었으며, 5일째에 탈지면과 같은 영상이 완전히 제거되었다.
실시예 21. 말단 좌측 궤양성 대장염 ( distal left ulcerative colitis )을 갖는 환자를 EGF -소포체를 사용하여 치료하는 경우 치료 효율 입증
본 실험은 복수의 대장내시경 및 조직검사를 수행한 이후에, 말단 좌측 궤양성 대장염을 앓는 것으로 진단된 8명의 환자 집단에 대해서 수행하였다. 환자들에 대해서는 특수 의학 식이요법을 수행하였으며, 아줄피딘 (azulfidine) 또는 술파살라진 (sulfasalazine)으로 약학적 치료를 수행하였다. 이러한 환자군은 12개월 이상 임상적 활동성을 유지하였으며, 코르티코이드 (corticoids)를 포함하는 모든 약학적 치료를 거부하였기 때문에, 실시예 3에서 서술된 콜레스테롤:세트리마이드:EGF 소포체를 저용량으로 관장 투여하는 연민 치료에 대해서 평가하였다. 이를 위해서, 생리적 식염수 중의 콜레스테롤:세트리마이드:EGF 소포체를, 50 ㎍/ml의 당량 EGF 농도로, 20 ml 부피로 투여하였다. 관장은 환자가 좌측 와위 자세를 취하도록 수행하였으며, 매일 밤 잠들기 전에 수행하였다. 다른 이전의 의학적 수단들과 연관된 관장 개시 후 7일 경과 시점에서, 혈변, 통증 및 일반적인 전신적 문제들이 제거되었다. 치료 10일 경과 후, 대장 내시경을 수행하였으며, 점막 염증이 실질적으로 감소하고, 대부분의 병변이 치유되었으며, St. Mark's 지수가 현저하게 감소하였음을 알 수 있었다. 치료는 개시 후 21일 시점에서 중단하였으며, 대장 내시경을 반복하였고, 콜레스테롤:세트리마이드:EGF 소포체를 포함하는 관장 치료에 의해서 치유 효과 및 염증 감소가 야기됨을 확인할 수 있었다. 치료 개시 후 21일 시점에서 8명의 환자들로부터 조직검사를 수행한 결과, 음와염 (cryptitis)이 사라진 것을 알 수 있었다.
실시예 22. 암 화학요법에 의해서 야기된 점막 병변을 되돌리기 위한 EGF 소포체의 연민 사용
환자 QED, 남성, 32세, 골수 이식술 이후에, 시클로포스파미드 (cyclophosphamide) 및 부술판 (busulfan) 치료의 결과로, 방광 및 비뇨관의 하부에 출혈성 점막염을 앓음. 혈뇨 및 상당량의 단백뇨 (400 mg/24 시간)가 있은지 72시간 후에, 환자에 대해서, 일반적인 의약 보조 수단과 더불어, 시스토클라이시스 (cystoclysis)를 통해서, 실시예 2에서 제조된 것과 같은 콜레스테롤:CTAB:EGF 소포체를 함유하는 생리적 식염수 용액을, 150 ㎍/mL의 EGF 당량 농도로 혈액 주입하였다. 최초 24 시간 경과 후, 소변 중에서 오직 미량의 적혈구가 검출되었으며, 단백뇨는 170 mg/24 시간이었다.
환자 IRT, 여성, 27세, 비호지킨 림프종의 치료를 위한 다중화학치료요법의 과정에서 위장관 상부에 점막염이 진전됨. 혓바늘 돌출, 타액분비 과다, 심지어 토혈, 복부 팽만, 일반적 불편함, 열 및 다른 징후들이 나타나는 것을 포함하는 완전히 발달한 임상적 현상들이 나타났다. 징후들은 약학적 수단들에 의해서 처리개시되었는 바, 이러한 수단들은 양성자 펌프 억제제, 점막보호제, 볼레미아 (volemia) 및 비경구 진통제의 복구를 포함하였다. 임상적 영상촬영 개시 후 24시간 경과시점에서, 환자에게 실시예 3에서와 같이 제조되며, EGF 당량 농도 50 ㎍/mL의 콜레스테롤:세트리마이드:EGF 소포체를 포함하는 식염수를 경구 투여하였다. 비위 카테터 (nasogastric catheter)를 사용해서, 이러한 용액 250 ml를 매 4시간 마다 흡입시켰다. 위세척 중단 24시간 이후에 토혈이 멈추었으며, 팽창 및 급성 마비도 멈추었다. 유사하게, 부피 보조 및 다른 관리 수단의 필요성도 점진적으로 감소하였다.
실시예 23. 압축 유체 기술을 사용한 β- 시토스테롤 : CTAB : EGF 소포체의 합성
이러한 소포체들은 실시예 2와 유사하게 합성하였지만, 본 실시예의 경우에는, 한편으로 에탈올 2.88 mL 중의 β-시토스테롤 77.71 mg 용액을, 또한; 다른 한편으로, 2.83 mg/mL의 CTAB 및 EGF의 수성 용액을, 원하는 농도로 사용하였다. CTAB:β-시토스테롤 (1:1) 소포체를 EGF를 5 μM 농도로 도입하여 수득하였다. 물리적 외관, 평균 크기 및 Z-포텐셜을 표 17에 나타내었다. 소포체 제제가 안정하며, 상대적으로 작은 평균 크기 및 PDI를 갖는 것을 관찰할 수 있었다. 평균 크기, 입자 크기 분포 및 Z-포텐셜은 DLS에 의해서 측정하였다. 더 나아가, 그 조성 중에 4차 암모늄 타입의 양이온성 계면활성제를 포함하는 이전 실시예들에서 서술된 소포체 제조와 유사하게, 본 실시예의 소포체도 + 30 mV보다 훨씬 높은 양성 Z-포텐셜 수치를 나타내었고, 이는 장기적 안정성을 가짐을 예측하게 한다. 도 3D는 극저온-TEM으로 수행된 소포체 모폴로지 연구에 따를 경우, 단일층 구조의 회전타원체 형태가 지배적임을 보여준다. 이러한 소포체들은 약학적 관점에서 매우 매력적인 특징들을 갖는다.
주어진 조성에서 β- 시토스테롤 : CTAB : EGF 소포체의 물리적 외관, 평균 입자 크기 및 Z- 포텐셜
조성물
(EGF:β-시토스테롤)		 물리적 외관 평균 크기
(nm)(PDI)* 		Z-포텐셜
(mV)(±SD)*
5 μM: 1 M 분산된 오팔색 용액 218.8 (0.277) +78.6 (±12.0)
* Nano-ZS (Malvern Instruments, United Kingdom), PDI-다분산 지수

Claims (29)

  1. 상피 성장 인자 (EGF), 양이온성 계면활성제, 및 콜레스테롤 또는 그 유도체를 포함하는 소포체로서,
    상기 양이온성 계면활성제는 4차 암모늄 타입의 양이온성 계면활성제이며,
    상기 콜레스테롤 유도체는 콜레스테롤 전구체 분자로부터 얻어지는 친지성 특성의 스테로이드 분자이고,
    상기 소포체는 막 구성재료로 인지질을 포함하지 않는 비-리포좀 형태인 것을 특징으로 하는 소포체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 콜레스테롤 유도체는 β-시토스테롤인 것을 특징으로 하는 소포체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 4차 암모늄 타입의 양이온성 계면활성제는 세틸트리메틸암모늄 (CTAB), 세트리마이드 및 벤즈알코늄 클로라이드 (BKC)로 이루어진 군으로부터 선택된 계면활성제인 것을 특징으로 하는 소포체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 양이온성 계면활성제, 및 콜레스테롤 또는 그 유도체의 몰 비율은 10 M:1 M 내지 1 M:5 M이고, 상기 EGF, 및 상기 콜레스테롤 또는 그 유도체의 몰 비율은 0.5 μM:1 M to 100 μM:1 M인 것을 특징으로 하는 소포체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 소포체는 단일층 구조를 가지며, 평균 크기가 25 내지 500 nm인 것을 특징으로 하는 소포체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 EGF가 상기 소포체의 이중층 내로 도입된 것을 특징으로 하는 소포체.
  7. 제1항에 있어서, 압축 유체 (compressed fluid, CF) 기술에 의해서 제조되는 것을 특징으로 하는 소포체.
  8. 제7항에 있어서, 상기 CF 기술은,
    a) EGF 및 양이온성 계면활성제의 수성 용액을 제조하는 단계;
    b) 콜레스테롤, 또는 그 유도체를 CF로 팽창된 유기 용매 중에 용해시키는 단계; 및
    c) 상기 b) 단계로부터 제조된 용액을 상기 a) 단계로부터 제조된 용액 상에서 감압시킴으로써 소포체를 제조하는 단계;
    를 포함하는 방법을 포함하는 것을 특징으로 하는 소포체.
  9. 삭제
  10. EGF, 양이온성 계면활성제, 및 콜레스테롤 또는 그 유도체를 포함하는 소포체를 제조하는 방법으로서,
    a) EGF 및 양이온성 계면활성제의 수성 용액을 제조하는 단계;
    b) 콜레스테롤, 또는 그 유도체를 CF로 팽창된 유기 용매 중에 용해시키는 단계; 및
    c) 상기 b) 단계로부터 제조된 용액을 상기 a) 단계로부터 제조된 용액 상에서 감압시킴으로써 소포체를 제조하는 단계;
    를 포함하고,
    상기 양이온성 계면활성제는 4차 암모늄 타입의 양이온성 계면활성제이며,
    상기 콜레스테롤 유도체는 콜레스테롤 전구체 분자로부터 얻어지는 친지성 특성의 스테로이드 분자이고,
    상기 소포체는 막 구성재료로 인지질을 포함하지 않는 비-리포좀 형태인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 콜레스테롤 유도체는 β-시토스테롤인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 b) 단계의 유기 용매는 일가 알코올, 다가 알코올, 케톤, 에틸렌 디아민, 아세토니트릴, 에틸 아세테이트 및 그 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 용매인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제10항에 있어서, 상기 CF는 이산화탄소, 에탄, 프로판, 수소염화불화탄소, 및 수소화불화탄소 중에서 선택된 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CF와 상기 유기 용매 사이의 함량 비율은 CF의 몰분율로서 0.3 내지 0.95에 해당하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, CF 중의 콜레스테롤 또는 그 유도체의 용해는 1 내지 30 MPa의 압력 및 10 내지 70 ℃의 온도의 반응기 내에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 EGF는 그 임계 미셀 농도를 초과하는 농도의 양이온성 계면활성제를 포함하는 수성 용액 중에 용해되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 소포체, 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 말초 연조직의 복합 상처 치료용 약학 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 전신적, 병변내, 점막, 국소, 경피, 안과적 경로 또는 흡입형 제제로 투여될 수 있는 것을 특징으로 하는 말초 연조직의 복합 상처 치료용 약학 조성물.
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 제17항에 있어서, 상기 복합 상처는 당뇨성 족부 궤양인 것을 특징으로 하는 말초 연조직의 복합 상처 치료용 약학 조성물.
  22. 제17항에 있어서, 상기 복합 상처는 정맥성 궤양, 욕창 또는 화상인 것을 특징으로 하는 말초 연조직의 복합 상처 치료용 약학 조성물.
  23. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 소포체, 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 성인 호흡곤란증 치료용 약학 조성물.
  24. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 소포체, 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는, 점막염, 궤양성 대장염, 십이지장 궤양 및 말단 대장염 중에서 선택되는 어느 하나의 소화관 병변 치료용 약학 조성물.
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 소포체, 및 적어도 하나의 부형제를 포함하는 화장품.
  28. 삭제
  29. 제27항에 있어서, 상기 화장품은 피부의 노화 방지용 화장품인 것을 특징으로 하는 화장품.
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