ES2613087T3

ES2613087T3 - Vesículas que comprenden factor de crecimiento epidérmico y composiciones que las contienen

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Publication number: ES2613087T3
Application number: ES13759116.0T
Authority: ES
Inventors: Héctor Jesús SANTANA MILIÁN; Leonor VENTOSA RULL; Eduardo Martínez Díaz; Jorge Amador Berlanga Acosta; Ingrid CABRERA PUIG; Jaume VECIANA MIRÓ
Original assignee: Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia CIGB; Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Current assignee: Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia CIGB; Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Priority date: 2012-08-02
Filing date: 2013-08-02
Publication date: 2017-05-22
Anticipated expiration: 2033-08-02
Also published as: RU2015106683A; CA2880404C; JP6251740B2; US20150182590A1; CN104684575B; EP2915541A1; AU2013299036A1; AR091951A1; JP2015527337A; AU2013299036B2; EP2915541B1; KR20150041795A; CL2015000254A1; HUE033286T2; RU2649781C2; CU20120112A7; SI2915541T1; US11510965B2; HK1210970A1; CU24121B1

Abstract

La invención se refiere a vesículas que comprenden el Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF), un surfactante catiónico, y colesterol o sus derivados. La invención también revela un procedimiento para su preparación, basado en la tecnología de fluidos comprimidos (FCs). Las vesículas de la invención tienen utilidad en la fabricación de medicamentos y productos cosméticos, y en la ingeniería tisular.

Description

Vesículas que comprenden factor de crecimiento epidérmico y composiciones que las contienen

Campo de la técnica

La presente invención se enmarca en los campos de la medicina humana y veterinaria, la cosmética y la ingeniería tisular, en particular en el campo de los sistemas de liberación de tipo vesicular que comprenden en su composición el Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF). Las vesículas de la invención presentan una eficacia terapéutica mejorada en relación al EGF libre.

Estado de la técnica anterior

Los sistemas de liberación de medicamentos basados en sistemas vesiculares, generalmente liposomas, compuestos por moléculas anfifílicas que incorporan una sustancia terapéuticamente activa, constituyen uno de los sistemas más utilizados en el sector farmacéutico, debido a que pueden proporcionar una mayor estabilidad del principio activo, aumentar su permeabilidad a través de membranas biológicas, y permitir una liberación lenta del ingrediente activo sin la necesidad de administraciones repetidas.

El EGF es uno de los principales factores de crecimiento que estimula la proliferación celular y la motilidad durante la regeneración tisular. También ayuda a mantener la hemostasis tisular, mediante la regulación de la proliferación de las células epiteliales y su migración. Además, el EGF induce angiogénesis, la cual proporciona el soporte nutricional para los tejidos (Hudson y McCawley, J., Microsc. Res. Tech. 1998, 43: 444-455; Koivisto y otros, Exp. Cell Res. 2006, 312: 2791-2805; Liang y otros, Wound Repair Regen. 2008, 16: 691-698). Este factor de crecimiento tiene múltiples aplicaciones en el campo farmacéutico (Wong y otros, Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 2001, 18: 51-71; Girdler y otros, Am. J. Clin. Oncol. 1995, 18: 403-406; Haedo y otros, Rev. Esp. Enferm. Dig. 1996, 88: 409-413; Majima, Ophthalmologica 1998, 212: 250-256); en la cosmética (Hasegawa y Yamamoto, Mech. Ageing Dev. 1992, 66: 107-114; patente No. US 5.618.544) y en la ingeniería tisular (Christopher y otros, Biomacromolecules 2011, 12: 3139-3146).

Se han desarrollado formulaciones de EGF empleando distintos sistemas liposomales. Como ejemplos tenemos la integración del EGF en liposomas unilamelares que comprenden fosfatidil glicerol (PG), fosfatidil colina (PC), y colesterol (Brown y otros, Ann. Surg. 1988, 208: 788-794). También se reporta la inclusión del EGF en liposomas multilamelares que comprenden PC, colesterol y ácido hialurónico (Yerushalmi y otros, Arch. Biochem. Biophys. 1994,

313: 267-273); o que comprenden colesterol y dipalmitoil fosfatidil colina (DPPC) (Alemdaroglu y otros, J. Biomed. Mater. Res. A 2008, 85A: 271-283; Degim y otros, Int. Wound. J. 2011, 8: 343-354). Otra clase de liposomas reportados han sido los multivesiculares, que comprenden dioleoil fosfatidil colina (DOPC), dimiristoil fosfatidil glicerol (DMPG), colesterol y trioleina (Li y otros, Arch. Pharm. Res. 2005, 28: 988-994).

Por otra parte, se han reportado liposomas que comprenden lípidos catiónicos conjugados a EGF (Kikuchi y otros, Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996, 227: 666-671); liposomas recubiertos con polietilenglicol (PEG), que además comprenden colesterol y dioleoil fosfatidil etanolamina (DOPE) en combinación con PC o con DPPC (Li y otros, Int. J. Pharm. 2003, 258: 11-19). También han sido reportados los liposomas que comprenden DPPC y lisofosfatidil colina (LPC) (Saddi y otros, The Angle Orthodontist 2008, 78: 604-609; Alves y otros, Life Sci. 2009, 85: 693-699).

Las formulaciones de EGF empleando sistemas liposomales también han sido protegidas por patentes, como la que revela la composición en gel de EGF/liposomas y los métodos que comprenden la inclusión del EGF en liposomas que contienen fosfolípidos neutros y negativamente cargados (Patente No. US 4944948); la composición en gel de liposomas y los métodos que emplean liposomas negativamente cargados y EGF, e incluyen lípidos negativamente cargados como PG, PC y colesterol (Solicitud Internacional de Patente No. WO 9009782). Otra solicitud de patente refiere el uso tópico del EGF en liposomas para prevenir la amputación del pie diabético, y se emplean liposomas que comprenden PC y desoxicolato de sodio. La misma se restringe al uso de cualquier tipo de liposomas/niosomas de EGF para el tratamiento de lesiones isquémicas crónicas grados IV y V de pie diabético, por vía tópica (Solicitud Internacional de Patente No. WO 2007/073704). No se ha encontrado en el estado de la técnica la integración de EGF en sistemas vesiculares constituidos por colesterol y surfactantes catiónicos.

Los métodos tradicionales de obtención de liposomas, tales como: evaporación de películas delgadas (Agrawal y otros,

J. Liposome Res. 2005, 15: 141-155), deshidratación-rehidratación (Kirby y Gregoriadis, Nat. Biotechnol. 1984, 2: 979984), congelación-descongelación (Ristori y otros, Biophys. J. 2005, 88: 535-547) y extrusión (MacDonald y otros, Biochim. Biophys. Acta 1991, 1061: 297-303) presentan ciertos inconvenientes. Algunos de estos inconvenientes están asociados con el uso de grandes cantidades de disolventes que luego son difíciles de eliminar, o con las altas temperaturas requeridas por algunos de estos métodos, las que limitan su uso a sustancias térmicamente estables. Por otra parte, el tamaño y la nanoestructuración del material resultan difíciles de controlar, y son métodos con baja reproducibilidad durante el escalado (procesos de múltiples etapas). Otro inconveniente de las preparaciones liposomales ha sido su poca estabilidad.

El procesado de materiales con fluidos comprimidos (FC), o gases densos, tanto en estado líquido como supercrítico, como medios disolventes, ha despertado grandes expectativas, a nivel académico e industrial, para preparar materiales micro-o nanoestructurados, como son los materiales particulados, sistemas vesiculares, partículas compuestas, superficies estructuradas, etcétera, con mayor homogeneidad estructural que la que se alcanza con el procesado convencional (Holmes y otros, Chem. Eur. J. 2003, 9: 2144-2150; Cooper, Adv. Mater. 2001, 13: 1111-1114; Cooper, Adv. Mater. 2003, 15: 1049-1059, Woods y otros, J. Mater. Chem. 2004, 14: 1663-1678). Un FC o un gas denso es una sustancia que en condiciones normales de presión y temperatura existe como un gas pero al aumentar la presión puede convertirse en líquido o fluidos supercríticos, y pueden usarse como medios disolventes para el procesamiento químico y de materiales. El FC más utilizado es el dióxido de carbono (CO2), clasificado como disolvente verde, ya que no es tóxico, no es inflamable, es fácil de eliminar, no deja residuos en las partículas, es barato y es fácil de recuperar. Desde principios de los años 90, se han desarrollado una serie de metodologías que utilizan los FC para la preparación de materiales finamente divididos, con tamaño de partícula microscópico, submicroscópico y nanoscópico (Jung y Perrut, J. Supercrit. Fluid, 2001, 20:179-219). El poder solvatante de los FC puede modificarse por cambios de temperatura y composición, como en el caso de los disolventes líquidos convencionales, y además mediante cambios de presión, que se transmiten mucho más rápidamente en el seno de las disoluciones. Así pues, estos métodos de precipitación tienen en común la posibilidad de alcanzar grados de supersaturación muy elevados en intervalos de tiempo muy cortos, lo cual favorece la nucleación frente al crecimiento cristalino, y por ello la obtención de micro-o nanopartículas con distribuciones de tamaño muy estrechas, estructura interna y organización supramolecular controladas.

Uno de los procesos para la obtención de materiales micro-o nanoestructurados con FC es el método denominado DELOS-SUSP "Depressurization of an Expanded Liquid Organic Solution-SUSPension" (Solicitud Internacional de Patente No. WO 2006/079889; Patente No. EP 1843836; Cano-Sarabia et al., Langmuir 2008, 24: 2433-2437) el cual se basa en la despresurización de una solución orgánica previamente expandida por un FC, generando un sistema micro

o nanodisperso mediante dicha despresurización. En este proceso el FC actúa como cosolvente siendo completamente miscible, a determinadas condiciones de presión y temperatura, con la disolución orgánica del soluto a estabilizar como sistema micro-o nanodisperso. Dicha estabilización se obtiene con la presencia de aditivos en el medio, generalmente acuoso, sobre el cual se realiza la despresurización de la disolución expandida., Los aditivos pueden ser emulsificantes, detergentes iónicos y no iónicos, agentes de superficie, estabilizadores de coloides y protectores. Mediante este método, se pueden obtener sistemas micro-y/o nanodispersos, tales como liposomas, emulsiones o suspensiones. Los liposomas o las vesículas están compuestos por colesterol y/u otros agentes de membrana, tales como fosfolípidos y surfactantes, y para su preparación se requiere la disolución del colesterol y/u otros lípidos en la disolución orgánica expandida, y su despresurización en una disolución acuosa surfactante.

Para la posible incorporación de ingredientes activos en vesículas o liposomas mediante DELOS-SUSP, y para generar las correspondientes vesículas, se requiere la disolución del ingrediente activo en la disolución orgánica expandida inicial, o en la disolución acuosa donde se realiza la despresurización de dicha disolución expandida, y en ambos casos dicha disolución debe realizarse en presencia de lípidos, detergentes o agentes tensioactivos.

Dentro de los surfactantes catiónicos, los de tipo amonio cuaternario (QUAT) han sido ampliamente utilizados en el campo farmacéutico y en la cosmética. En el campo farmacéutico han sido utilizados por vía tópica, oftálmica, oral, bucal y nasal. Previamente, se ha reportado la preparación de nanovesículas de colesterol: bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB), empleando la tecnología DELOS-SUSP. Un ejemplo de la incorporación de compuestos hidrosolubles, por esta tecnología, es el que se describe en la referencia "Liposomes and other vesicular Systems: structural characteristics, methods of preparation, and use in nanomedicine", Progress in molecular biology and translational science, Elsevier, 2011, vol. 104, pp. 1-52), donde las vesículas de colesterol:CTAB son utilizadas como vehículo para la encapsulación y administración del antibiótico gentamicina. Cabe destacar que las encapsulaciones de gentamicina que se divulgan son muy bajas (<2%). Este tipo de vehículo nunca se ha empleado para incorporar proteínas. Es conocido que los detergentes iónicos son agentes que provocan la desnaturalización de las proteínas (Akin y otros, Anal. Biochem. 1985, 145: 170-176; Andersen y otros, J. Mol. Biol. 2009, 391: 207-226). La desnaturalización de la albúmina sérica humana después de la adición del CTAB ha sido demostrada recientemente por espectroscopia Raman (Vlasova y Saletsky, Laser Phys. 2011, 21: 239-244). La desnaturalización, como regla, está acompañada de la pérdida de las propiedades funcionales de la proteína.

Por todo lo expresado anteriormente, sigue siendo de interés lograr nuevos sistemas de liberación de EGF, fácilmente estandarizables, con elevada homogeneidad a nivel estructural y en sus propiedades físico-químicas, que mejoren las propiedades farmacéuticas y farmacológicas y/o que incrementen la actividad terapéutica del EGF.

Descripción resumida de la invención

La presente invención se refiere a vesículas, como sistema de liberación de medicamentos, que comprenden el EGF, un surfactante catiónico, y colesterol o uno de sus derivados, y que presentan una efectividad terapéutica superior a las descritas previamente.

La presente invención también se refiere a un proceso para la preparación de dichas vesículas que comprenden el EGF, un surfactante catiónico, y colesterol o sus derivados; que se caracteriza porque incluye: a) la preparación de una disolución acuosa del EGF y un surfactante catiónico, b) la disolución de colesterol o uno de sus derivados en un

disolvente orgánico expandido con un FC, c) la síntesis de las vesículas mediante la despresurización de la disolución resultante de la etapa b) sobre la disolución resultante de la etapa a).

Es también objeto de la invención, una composición farmacéutica que se caracteriza porque comprende las vesículas que incluyen el EGF, un surfactante catiónico, y colesterol o sus derivados; y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Otro de los objetos de la invención es el uso de dichas vesículas para la fabricación de medicamentos y de productos cosméticos.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención, que contienen las vesículas de EGF junto a otros componentes, tienen utilidad como medicamento para acelerar el proceso de cicatrización de úlceras de pie diabético y otras heridas complejas, tales como: úlceras venosa, úlceras de decúbito, quemaduras, entre otras; la reparación de las estructuras de la cámara anterior de los ojos dañados, en la mucositis sistémica, y en todas las enfermedades del tracto gastrointestinal que involucren la necesidad de regenerar mucosa y submucosa. En particular, se ha encontrado que en la cicatrización de las úlceras del pie diabético y las úlceras venosas, estas vesículas tienen una efectividad terapéutica significativamente superior, con relación a los antecedentes de la invención.

La invención también se refiere a un producto cosmético que se caracteriza porque comprende las vesículas de EGF, un surfactante catiónico, y colesterol o sus derivados.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Representación esquemática de un aparato para la obtención de vesículas que comprenden EGF, un surfactante catiónico y colesterol o un derivado de colesterol donde: C: Colector; H: Intercambiador de calor; P: Bomba;

R: Reactor; V: Válvula; RD: Disco de ruptura; ST: Agitador; FL: Filtro; TI: Indicador de temperatura; PI: Indicador de presión; PIC: controlador del indicador de presión; F: Medidor de flujo.

Figura 2. Distribución del tamaño de partículas por dispersión de luz dinámica (DLS) de las vesículas manteniendo constante la relación CTAB:colesterol 1 M:1 M y variando la relación EGF:colesterol

25

y y manteniendo cosntante la relación bromuro de tetradecil metilamonio (cetrimida):colesterol en 1 M:1 M y variando la relación EGF:colesterol

Figura 3. Imágenes de crio-microscopía electrónica de transmisión (Crio-TEM) de las vesículas de EGF con composición colesterol:CTAB:EGF (A), colesterol:cetrimida:EGF (B), composición colesterol:cloruro de benzalconio (BKC):EGF (C) y β-Sitosterol:CTAB:EGF (D) con una relación QUAT:colesterol ó β-Sitosterol 1 M:1 M y una relación EGF:colesterol ó β-Sitosterol 5 μΜ:1 Μ.

Figura 4. Actividad biológica específica de diferentes preparaciones de EGF en un ensayo de proliferación celular donde se comparan el EGF libre, los liposomas de DPPC:colesterol (con relación DPPC:colesterol 1 M: 1 M y EGF:colesterol 25 μΜ:1 Μ) y las vesículas de CTAB:colesterol (A) y cetrimida:colesterol (B), manteniendo constante la relación QUAT:colesterol 1 M:1 M y variando la relación EGF:colesterol (5 μΜ:1 Μ, 15 μΜ: 1 Μ y 25 μΜ:1 Μ).

Figura 5. Perfil de degradación proteolítica, después de la exposición a tripsina a 37 °C, durante diferentes intervalos de tiempo, del EGF libre y de diferentes preparaciones de vesículas manteniendo constante la relación CTAB:colesterol (A) y cetrimida:colesterol (B) en 1 M: 1 M, y variando la relación EGF:colesterol (5 μΜ:1 Μ, 15 μΜ:1 Μ y 25 μΜ:1 Μ).

Figura 6. Fotografías de evolución de la cicatrización de la úlcera del pie diabético correspondientes al paciente JLG al inicio (A), después de 4 semanas (B) y 8 semanas (C) de tratamiento, con una formulación tópica en forma de atomizador que contiene vesículas con una relación CTAB:colesterol de 1 M:1 M y una relación EGF:colesterol de 5 μΜ:1 Μ con una concentración equivalente de EGF de 15 μg/ml.

Figura 7. Fotografías de evolución de la cicatrización de la úlcera del pie diabético correspondientes al paciente ZEM al inicio (A) después de 4 semanas (B) y 8 semanas (C) de tratamiento. Durante las primeras 4 semanas el tratamiento se llevo a cabo mediante infiltración con una formulación parenteral que contenía vesículas con relación BKC:colesterol 1

M:1 M y EGF:colesterol 5 μΜ: 1 Μ, con una concentración equivalente de EGF de 75 μg/ml. Las otras 4 semanas, hasta completar 8 semanas, el tratamiento se llevó a cabo con el uso de formulación tópica en forma de atomizador que contenía vesículas con relación CTAB:colesterol 1 M:1 M y EGF:colesterol 5 μΜ:1 Μ, con una concentración equivalente de EGF de 15 μg/ml.

Descripción detallada de la invención

La presente invención provee vesículas que se caracterizan porque comprenden el factor de crecimiento epidérmico (EGF), un surfactante catiónico, y colesterol o sus derivados. En una modalidad de la invención, el surfactante catiónico es de tipo amonio cuaternario.

En el contexto de esta invención el término "EGF" se refiere a cualquiera de las variantes de moléculas de EGF que mantengan su actividad biológica; por ejemplo moléculas truncadas por el extremo C-terminal (Calnan y otros, Gut 2000, 47: 622-627); o truncadas por el extremo N-terminal (Svodoca y otros, Biochim. Biophys. Acta 1994, 1206: 35-41; Shin y otros, Peptides 1995, 16: 205-210). El EGF puede obtenerse mediante tecnología de ADN recombinante empleando levaduras, como Saccharomyces (Valdés y otros, Biotecnol. Apl. 2009, 26: 1-9) o Pichia pastoris (Research Journal of International Studies 2009, 10: 36-46); empleando bacterias como Escherichia coli (Yoon y otros, Biotechnol. Bioprocess Eng. 1997, 2: 86-89; Abdull Razis y otros, Appl. Biochem. Biotechnol. 2008, 144: 249-261); o por métodos de síntesis química (Shin y otros, Peptides 1995, 16: 205-210). El EGF objeto de la invención también comprende cualquiera de las variantes obtenidas mediante los métodos descritos anteriormente, después de ser modificada a través de cualquier procedimiento del estado de la técnica, tales como: sustitución de aminoácidos (Shiah y otros, J. Biol. Chem. 1992, 267: 24034-24040; Lahti y otros, FEBS Lett. 2011, 585: 1135-1139; Solicitud Internacional de Patente No. WO 2007/065464), y conjugación a polietilenglicol (Thomas y otros, Bioconjugate Chem. 2001, 12: 529-37; Lee y otros, Pharm. Res. 2003, 20:818-25), u otro método de modificación química o genética.

El término "surfactante catiónico" se refiere a aquellos surfactantes con al menos una carga positiva en la molécula, e incluye también a la combinación de uno o más surfactantes catiónicos. Por ejemplo, pueden ser utilizados, de acuerdo a la presente invención, los surfactantes catiónicos de tipo sal de amina terciaria, sal de amonio cuaternario y alquil amonios en heterociclos insaturados y saturados. En la invención, el término "surfactante catiónico de tipo amonio cuaternario (QUAT)" se refiere a sales de amonio cuaternario en las que por lo menos uno de los sustituyentes del nitrógeno es de cadena larga. Dentro de los QUAT se incluyen compuestos tales como el CTAB, la cetrimida y el BKC o una mezcla de ellos. En una modalidad preferida de la presente invención, el surfactante catiónico es un surfactante aceptable en farmacia. Tanto los QUAT como los demás surfactantes catiónicos pueden obtenerse a partir de fuentes disponibles comercialmente con calidades farmacéutica y cosmética.

En la presente invención el término "vesículas" se refiere a micropartículas y nanopartículas coloidales, que tienen entre 25 nm y 5 μm, y están formadas por una o más bicapas de moléculas anfifílicas que contienen una fase acuosa. En una modalidad de la invención, las vesículas tienen una proporción molar entre el surfactante catiónico y el colesterol (o sus derivados) que se encuentra en el intervalo de 10 M:1 M a 1 M:5 M; y una proporción molar entre el EGF y el colesterol (o sus derivados) que se encuentra en el intervalo de 0,5 μΜ:1 Μ a 100 μΜ:1 Μ.

El término "derivados" del colesterol, en la presente invención, se refiere a moléculas de la familia de los esteroides, generalmente obtenidas a partir de la molécula precursora de colesterol y con carácter lipofílico.

En una modalidad de la invención, las vesículas que comprenden EGF se caracterizan por tener estructura unilamelar, y tamaño promedio aproximado entre 25 y 500 nm, preferentemente entre 50 y 300 nm. En una modalidad particular, la invención se refiere a vesículas donde el EGF está incorporado a la bicapa vesicular. El tamaño aproximado y la morfología de las vesículas se evalúan por Crio-TEM, y la distribución de tamaño de las vesículas se caracteriza por DLS.

Sorprendentemente, las vesículas de la invención muestran un incremento significativo de la potencia biológica del EGF (medida in vitro) en comparación con el EGF libre y con EGF en liposomas de colesterol:DPPC. Además, estas vesículas son capaces de proteger al EGF frente al ataque de proteasas, una característica muy importante para lograr una adecuada biodisponibilidad del EGF en el sitio de acción y por lo tanto aumentar su eficacia terapéutica.

En la presente invención se han sintetizado por primera vez vesículas de EGF que mejoran algunas de las propiedades farmacéuticas y farmacológicas de este factor de crecimiento, como son su potencia y estabilidad. Se ha comprobado que el grado de incorporación del EGF en la estructura de las vesículas se mantiene estable durante al menos un año. Adicionalmente, permiten incrementar la permeabilidad a través de membranas biológicas.

Las vesículas de la invención tienen como ventaja adicional un efecto antimicrobiano y antifúngico, el cual es deseable en las composiciones que se emplean en el tratamiento de heridas complejas y otras lesiones susceptibles de ser tratadas con el EGF.

En una modalidad de la invención, las vesículas que comprenden EGF se obtienen por tecnología de FC. En una modalidad particular, la tecnología de FC que se emplea para la obtención de las vesículas incluye un proceso que comprende a) la preparación de una disolución acuosa de EGF y un surfactante catiónico, b) la disolución de colesterol

o sus derivados en un disolvente orgánico expandido con un FC, y c) la síntesis de las vesículas mediante la despresurización de la disolución resultante de la etapa b) sobre la disolución resultante de la etapa a). En una modalidad preferida, el surfactante catiónico que se emplea en la etapa a) es de tipo amonio cuaternario.

La invención también provee un proceso para la preparación de vesículas que comprenden EGF, un surfactante catiónico, y colesterol o sus derivados, que se caracteriza porque comprende a) la preparación de una disolución

acuosa de EGF y un surfactante catiónico, b) la disolución de colesterol o sus derivados en un disolvente orgánico expandido con un FC, y c) la síntesis de las vesículas mediante la despresurización de la disolución resultante de la etapa b) sobre la disolución resultante de la etapa a). En una modalidad de la invención, el proceso antes descrito incluye un surfactante catiónico de tipo amonio cuaternario.

En una modalidad de la invención, el disolvente orgánico en la etapa b) del proceso antes descrito es un disolvente que se selecciona del grupo formado por los alcoholes monohídricos, tales como etanol, metanol, 1-propanolol, 2-propanolol, 1-butanol, 1-hexanol, 1-octanol y trifluoroetanol; los alcoholes polihídricos, tales como: propilenglicol, PEG 400, y 1,3propanodiol; las cetonas, tales como acetona, metil etil cetona, y metil isobutil cetona; etilendiamina, acetonitrilo, acetato de etilo y mezclas de ellos. En cualquier caso, sea cual sea la naturaleza del disolvente orgánico, el componente lipídico ha de ser soluble en él, y además dicho disolvente ha de ser necesariamente miscible en el FC y el agua. Además, el disolvente orgánico seleccionado debe tener una toxicidad relativamente baja.

La concentración relativa de EGF y surfactante en la disolución tampón inicial, y la concentración de colesterol en el disolvente orgánico se determinan por el cociente deseado de colesterol:surfactante catiónico:EGF en la vesícula final. En general, la relación colesterol:surfactante catiónico:EGF puede influir en las características físico-químicas y biológicas de las diferentes vesículas obtenidas.

En otra modalidad de la invención, el FC que se emplea en el proceso antes descrito es un compuesto que se selecciona entre el CO2, el etano, el propano, los hidroclorofluorocarbonos (por ejemplo, CFC-22), y los hidrofluorocarbonos (por ejemplo, HFC-134A). Preferiblemente, el FC en la etapa b) es el CO2, considerado como un disolvente ecológico, ya que no es tóxico, no es inflamable, no es corrosivo, no es dañino para el medio ambiente, y además es muy abundante en la naturaleza.

En una modalidad de la invención, el proceso para la preparación de vesículas de EGF se lleva a cabo en un montaje como el representado en la Figura 1. El montaje consiste en un reactor de alta presión (R) al que se adiciona una disolución de colesterol en etanol a concentración (C1), a presión atmosférica y a la temperatura de trabajo (T = Tw). En un segundo paso se adiciona CO2 comprimido hasta alcanzar la presión de trabajo (P = Pw), produciendo la expansión volumétrica de la disolución a una fracción molar Xco2. La adición se realiza utilizando la bomba P1 a través de la válvula V-1 , manteniendo el resto de las válvulas cerradas. El sistema se mantiene a una presión Pw y temperatura Tw, durante un tiempo determinado para garantizar la total homogeneización y el equilibrio térmico. Transcurrido este tiempo se abre V-4 con el objetivo de conectar el reactor R con el filtro FL, que ha sido previamente presurizado con N2 hasta Pw, manteniendo el resto de las válvulas cerradas. La apertura de V-6 permite la despresurización de la disolución volumétricamente expandida sobre una disolución acuosa de EGF a concentración (C2) y el surfactante a concentración (C3) bombeada a través de P2. En este paso final, una corriente de N2 adicionada a través de V-2 a Pw es utilizada como émbolo para empujar la disolución expandida, y para mantener constante la presión dentro del reactor durante el paso de despresurización. La presencia del filtro FL permite colectar cualquier precipitado que se haya podido formar durante el proceso. Las vesículas formadas son colectadas en el recipiente C, y posteriormente son almacenadas en botellas de vidrio a 4 °C. Una vez finalizada la despresurización, se cierran V-6 y V-2 y se procede a la despresurización del equipo abriendo nuevamente V-6.

En una modalidad de la invención la relación entre la cantidad de FC y de disolvente orgánico corresponde a una fracción molar de FC de aproximadamente 0,3 a 0,95; preferentemente de 0,5 a 0,8. En una modalidad particular, la disolución del colesterol (o sus derivados) en un FC se realiza en un reactor a una presión Pw de aproximadamente 1 a 30 MPa, y una temperatura Tw de aproximadamente 10 a 70 °C. Preferentemente, la temperatura aproximada del reactor está entre 10 y 50 °C.

En el proceso de la invención, el EGF se disuelve en una solución acuosa que contiene un surfactante catiónico cuya concentración se encuentra por encima de su concentración micelar crítica.

Sorprendentemente, las vesículas de colesterol:QUAT:EGF, sintetizadas empleando el proceso antes descrito, presentan rendimientos de incorporación del EGF en la vesícula muy cercanos al 100 %, los que son significativamente más elevados que los esperados para la incorporación de cualquier molécula hidrosoluble, teniendo en cuenta los resultados antes reportados para la gentamicina. Estos rendimientos en vesículas de colesterol-QUAT-EGF son también notablemente más elevados que los que se obtienen en la incorporación de otras proteínas con propiedades estructurales similares a EGF, como la proteína hidrosoluble albúmina de suero bovina (BSA). Esto ocurre, incluso, cuando se utiliza el procedimiento DELOS-SUSP antes descrito para dicha incorporación de BSA, ya que sólo se obtiene un rendimiento de incorporación del 42%.

Por otro lado, y también de forma sorprendente, estos rendimientos de incorporación del EGF en las vesículas de colesterol:QUAT son claramente superiores a los obtenidos en vesículas de colesterol:DPPC:EGF, incluso en el caso de que se utilice el proceso DELOS-SUSP para su preparación.

Otro aspecto de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende vesículas que comprenden EGF, un surfactante catiónico, y colesterol o sus derivados, y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. El excipiente o excipientes farmacéuticamente aceptables, que forman parte de la composición farmacéutica de la

presente invención, pueden mejorar la actividad de las vesículas. Alternativamente, pueden ayudar a la manipulación y procesamiento de la composición de la presente invención. Las vesículas de EGF de la presente invención se pueden formular en varias formas farmacéuticas, como son: inyectables, atomizadores en aerosol, geles, soluciones viscosas, cremas, ungüentos, parches transdérmicos, depósitos, formulaciones inhaladas, y otras conocidas por los expertos en esta rama de la técnica.

Diversos excipientes pueden mezclarse durante o después de la síntesis de las vesículas de esta invención con el objetivo de formar un material adecuado para las formas de dosificación antes mencionadas. Generalmente, los excipientes tales como los solubilizantes o disolventes, surfactantes, modificadores de pH, antioxidantes, diluyentes, sistemas matrices, agentes formadores de complejos, agentes que aumentan la viscosidad, dispersantes, humectantes, colorantes, saborizantes, conservantes, incrementadores de la permeabilidad y otros, se pueden utilizar para los propósitos habituales, y en cantidades típicas, sin afectar las características de las composiciones de la presente invención, tal como es conocido por los expertos en este campo de la técnica (Remington's Pharmaceutical Sciences (1995)). Otros ejemplos de excipientes a usar en formulaciones farmacéuticas de las vesículas de EGF pueden encontrarse en el Handbook of Pharmaceutical Excipients (6ta edición).

En una modalidad de la presente invención, la composición farmacéutica es una forma de liberación controlada o sostenida. Las formas de liberación controlada o sostenida incluyen habitualmente sistemas matriz, resinas de intercambio iónico, o barreras particulares que controlan la difusión de las vesículas de EGF.

En una modalidad de la invención, para la preparación de las composiciones farmacéuticas, las vesículas de EGF son acondicionadas mediante un proceso de concentración-diafiltración, empleando aparatos conocidos en esta rama de la técnica. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden ser administradas por diferentes vías, entre ellas la sistémica, la intralesional, la mucosal, la tópica, la transdérmica, la oftálmica, o como formulación inhalada.

En otro aspecto, la presente invención comprende el uso de las vesículas de EGF, un surfactante catiónico, y colesterol

o sus derivados como un medicamento. En una modalidad de la invención, dicho medicamento está destinado al tratamiento de enfermedades donde se requiera auxiliar los procesos de cicatrización y regeneración tisular en cualquier especie de mamífero; en donde los surfactantes catiónicos, el colesterol y el EGF que componen dichas vesículas son aceptables en farmacia. En una modalidad preferida, el mamífero es un ser humano.

Dicho uso médico comprende la administración de una cantidad eficaz de dichas vesículas para tratar una enfermedad que requiera la administración exógena de EGF, para regular los procesos de proliferación, crecimiento y migración de las células epiteliales o inducir la angiogénesis.

En general, se contempla que una concentración eficaz en la administración de las vesículas de EGF de la presente invención (o de la composición que las comprende) sería de 1 ,0 a 200 μg/ml equivalentes de EGF, preferentemente de 5,0 a 100 μg/ml equivalentes de EGF por administración. El volumen y la frecuencia de administración dependerán del tipo de lesión, su tamaño y el dispositivo de administración empleado, tal y como es bien sabido por los expertos en la materia. Puede ser también apropiado administrar la dosis requerida en dos, tres, cuatro o más subdosis en los intervalos apropiados durante el día.

La dosificación y la frecuencia exactas de la administración dependen de la condición particular a tratar y de su gravedad, edad, peso, sexo, grado de la enfermedad, y la condición física general del paciente, así como de cualquier otra medicación concomitante administrada al individuo, tal y como es bien sabido por los expertos en la materia. Además, es evidente que la cantidad eficaz diaria se puede disminuir o aumentar, dependiendo de cómo reacciona el paciente a dicha medicación, y/o dependiendo de la evaluación realizada por el médico que prescribe el medicamento de la presente invención. Así, las cantidades eficaces diarias mencionadas más arriba se tienen que considerar como pautas o recomendaciones.

En una modalidad de la invención, el medicamento que se fabrica con las vesículas de la invención se utiliza para el tratamiento de heridas complejas de todas las partes blandas periféricas. En una modalidad particular, la herida compleja es una úlcera de pie diabético. En otra modalidad particular, el medicamento se utiliza para el tratamiento de úlceras venosas, úlceras de decúbito o quemaduras.

En otra modalidad de la invención, el medicamento se utiliza para el tratamiento de una enfermedad tal como la dificultad respiratoria del adulto. El medicamento que se fabrica con las vesículas de la invención también es útil para el tratamiento de lesiones del tubo digestivo, como la colitis ulcerativa, las úlceras duodenales, y la colitis distal. En otra modalidad, el medicamento se utiliza para el tratamiento de lesiones oculares.

Es también parte de la presente invención un producto cosmético que se caracteriza porque comprende las vesículas de EGF, surfactante catiónico, y colesterol o sus derivados, y al menos un excipiente aceptable en cosmética o dermofarmacia. En este aspecto de la invención, los surfactantes catiónicos, el colesterol (o sus derivados) y el EGF son aceptables en farmacia y cosmética.

Las vesículas de EGF de la presente invención se pueden formular en varias formas cosméticas o dermofarmacéuticas, tanto sólidas, como líquidas y semisólidas, como son y sin sentido limitativo: inyecciones, líquidos atomizadores en aerosol, geles, cremas, emulsiones múltiples, dispersiones acuosas, leches, bálsamos, lociones, espumas, sueros, ungüentos, parches transdérmicos, toallitas, depósitos, pomadas, polvos, barras, formulaciones inhaladas y similares, en todos los casos incluyendo las formulaciones de permanencia y las de enjuagado.

Generalmente, la composición cosmética o dermofarmacéutica de la invención puede contener excipientes tales como, y sin sentido limitativo, los solubilizadores o disolventes, surfactantes, modificadores de pH, antioxidantes, diluyentes, sistemas matrices, agentes formadores de complejos, agentes que aumentan la viscosidad, dispersantes, humectantes, polímeros gelificantes, espesantes, suavizantes, agentes estabilizantes, absorbentes de olores, agentes quelantes, extractos vegetales, aceites esenciales, extractos marinos, agentes provenientes de un proceso de biofermentación, sales minerales, extractos celulares y filtros solares (agentes fotoprotectores de naturaleza orgánica o mineral, activos contra los rayos ultravioleta A y/o B), pigmentos o colorantes, saborizantes, conservantes, potenciadores de la permeabilidad y otros, así como sus mezclas siempre que sean física-y químicamente compatibles con el resto de los componentes de la composición de la presente invención. Estos excipientes se pueden utilizar para los propósitos habituales y en cantidades típicas, sin afectar las características de las composiciones de la presente invención, tal como es conocido por los expertos en este campo de la técnica (Ejemplos adicionales pueden encontrarse descritos en CTFA Cosmetic Ingredient Handbook, Duodécima edición (2008)). La naturaleza de dichos adyuvantes adicionales puede ser sintética o de origen natural, como por ejemplo extractos vegetales, o provenir de un procedimiento de biofermentación. Por tanto, es también un objeto de la presente invención el uso de las vesículas de EGF antes descritas para la fabricación de un producto cosmético. En una modalidad de la invención, el producto cosmético es un producto para prevenir la senescencia y el envejecimiento de la piel.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos son mostrados con propósito ilustrativo, y no deben ser considerados como limitantes de la invención.

Ejemplo 1. Síntesis de vesículas de colesterol:DPPC:EGF mediante la tecnología de fluidos comprimidos

Primeramente una disolución de 12 mg de colesterol y 24 mg de DPPC en 1,2 ml de etanol se introduce en un reactor de alta presión, de 6 ml de volumen, a presión atmosférica y temperatura de trabajo (Tw= 35 °C). Se adiciona CO2 comprimido, produciendo la expansión volumétrica de la disolución hasta alcanzar una fracción molar XCO2 = 0,7 y una presión de trabajo Pw = 10 MPa. Para lograr la total homogenización y el equilibrio térmico, el sistema se deja en agitación durante aproximadamente 60 minutos a 10 MPa y 35 °C. Finalmente, se despresuriza la disolución orgánica expandida desde la presión de trabajo hasta la presión atmosférica, en 24 ml de una disolución acuosa de EGF a la concentración deseada (entre 15 μΜ y 40 μΜ). En este último paso, una corriente de N2 a 10 MPa es utilizada como émbolo para empujar la solución volumétricamente expandida con el objetivo de mantener constante la presión de trabajo dentro del reactor durante la despresurización. A continuación, las vesículas son transferidas a un recipiente que, herméticamente cerrado, es almacenado hasta su uso a 5 ± 3 °C.

Como resultado, se obtuvieron vesículas de DPPC:colesterol (1:1) con EGF incorporado a una concentración entre 15 μΜ y 40 μΜ. Los resultados de apariencia física, tamaño medio, distribución del tamaño de partículas y potencial Z se muestran en la Tabla 1 . El tamaño medio, la distribución de tamaño de partículas y el potencial Z fueron determinados por DLS. Se puede observar que las diferentes preparaciones de vesículas no presentan problemas de estabilidad a corto plazo, y que presentan tamaño medio e índice de polidispersión (IPD) relativamente pequeños, lo cual las hace atractivas desde el punto de vista farmacéutico. Sin embargo, el potencial Z absoluto es muy pequeño (< +10 mV), encontrándose muy por debajo de los valores que se considera que permiten la estabilidad coloidal de sistemas dispersos, que son normalmente valores absolutos por encima de 30 mV (Carrion y otros, J. Colloid. Interface Sci. 1994,

164: 78-87). Esta característica indica que la estabilidad a largo plazo de este sistema de vesículas puede estar comprometida.

Ejemplo 2. Síntesis de vesículas de colesterol:CTAB:EGF mediante la tecnología de fluidos comprimidos

Primeramente, una disolución de 76 mg de colesterol en 2,88 ml de etanol se introduce en un reactor de alta presión de 6 ml de volumen, a presión atmosférica y temperatura de trabajo (Tw= 35 °C). Se adiciona CO2 comprimido produciendo la expansión volumétrica de la disolución hasta alcanzar una fracción molar Xco2 = 0,7 y una presión de trabajo Pw = 10 MPa. Para lograr la total homogenización y el equilibrio térmico, el sistema se deja en reposo durante aproximadamente

15 60 minutos a 10 MPa y 35 °C. Finalmente, se despresuriza la disolución orgánica expandida desde la presión de trabajo hasta la presión atmosférica en 24 ml de una disolución de CTAB en agua mQ (C= 2,83 mg/ml) que contiene EGF a la concentración deseada (entre 1 y 40 μΜ). En este último paso, una corriente de N2 a 10 MPa es utilizada como émbolo para empujar la solución de colesterol en etanol con el objetivo de mantener constante la presión de trabajo dentro del reactor durante la despresurización. A continuación, las vesículas son transferidas a un recipiente que, herméticamente cerrado, es almacenado hasta su uso a 5 ± 3 °C.

La morfología de las vesículas fue evaluada mediante crio-TEM, según una técnica que ha sido descrita previamente (Progress in Molecular Biology and Translational Science, Elsevier, 2011, vol. 104, págs. 1-52).

25 Se obtuvieron vesículas de CTAB:colesterol (1:1) con EGF incorporado a una concentración entre 1 μΜ y 40 μΜ. Los resultados de apariencia física, tamaño medio y potencial Z se muestran en la Tabla 2; la distribución del tamaño de partículas en la Figura 2A y el tamaño y la morfología por crio-TEM en la Figura 3A. Como se observa en la Tabla 2, las diferentes preparaciones variando la proporción EGF :colesterol fueron estables. Los potenciales Z de todas las preparaciones fueron positivos, y muy superiores a + 30 mV, lo cual predice una elevada estabilidad a largo plazo. También se puede notar un incremento en el tamaño medio y el IPD con el incremento de la proporción de EGF:colesterol. En la Figura 2A se observan distribuciones de tamaños de las partículas que son altamente homogéneas, cuyo diámetro promedio no sobrepasa los 200 nm. En la Figura 3A se observa que, en relación con la morfología de las vesículas estudiadas por crio-TEM, predominan las formas esferoidales con estructura unilamelar. Las características enunciadas de las diferentes preparaciones vesiculares las hacen muy atractivas desde el punto de vista

35 farmacéutico.

Ejemplo 3. Síntesis de vesículas de colesterol:cetrimida:EGF mediante la tecnología de fluidos comprimidos

Estas vesículas se sintetizaron de igual forma a la utilizada en el Ejemplo 2, pero en este caso se utilizó una disolución acuosa de cetrimida con una concentración de 2,61 mg/ml. Se obtuvieron vesículas de cetrimida:colesterol (1:1) con

5 EGF incorporado a una concentración entre 1 μΜ y 40 μΜ. Los resultados de apariencia física, tamaño medio y potencial Z se muestran en la Tabla 3; la distribución de tamaño de partículas se muestran en la Figura 2B y el tamaño y la morfología por crio-TEM se muestran en la Figura 3B. Como se observa en la Tabla 3, todas las preparaciones fueron estables y presentan pequeños valores de tamaño medio e IPD. El tamaño medio, la distribución de tamaño de partículas y el potencial Z fueron determinados por DLS. El potencial Z de todas las preparaciones es positivo, y muy superior a + 30 mV, lo cual predice una elevada estabilidad a largo plazo. En la Figura 2B se observa que las distribuciones de tamaños de las partículas son altamente uniformes, y que el diámetro promedio de las mismas no sobrepasa los 200 nm. En la Figura 3B se observa que predominan las formas esferoidales con estructura unilamelar, según crio-TEM. Las diferentes preparaciones vesiculares también presentan características que las hacen muy atractivas desde el punto de vista farmacéutico.

Ejemplo 4. Síntesis de vesículas de colesterol:BKC:EGF mediante la tecnología de fluidos comprimidos

Estas vesículas se sintetizaron de igual forma a la utilizada en el Ejemplo 2, pero en este ejemplo se utilizó por una parte una disolución de 81 ,46 mg de colesterol en 2,88 ml de etanol; y por otra parte, una disolución acuosa de BKC a 3,0 mg/ml y EGF a la concentración deseada. Se obtuvieron vesículas de BKC:colesterol (1:1) con EGF incorporado a una concentración de 5 μΜ. Los resultados de apariencia física, tamaño medio y potencial Z se muestran en la Tabla 4.

45 Se observa que la preparación de vesículas es estable y presentan tamaño medio e IPD relativamente pequeños. El tamaño medio, la distribución de tamaño de partículas y el potencial Z fueron determinados por DLS. Además, de manera similar a las preparaciones de vesículas antes mencionadas, que comprenden en su composición un surfactante catiónico de tipo amonio cuaternario, éstas presentan valores de potencial Z positivo y muy superior a + 30 mV, lo cual les predice una elevada estabilidad a largo plazo. En la Figura 3C se observa que predominan las formas esferoidales con estructura unilamelar, según el estudio de morfología de las vesículas realizado por crio-TEM. Estas vesículas también presentan características que las hacen muy atractivas desde el punto de vista farmacéutico.

Ejemplo 5. Síntesis de vesículas de colesterol:CTAB:BSA mediante la tecnología de fluidos comprimidos

Estas vesículas se sintetizaron de igual forma a la utilizada en el Ejemplo 2, pero en este caso se utilizó la proteína BSA en disolución acuosa. Se obtuvieron vesículas de CTAB.colesterol (1:1) con BSA incorporada a una concentración de 0,37 μΜ, correspondiente a 25 μg/ml. Los resultados de apariencia física, tamaño medio y potencial Z se muestran en la Tabla 5. Se observa que la preparación de vesículas es estable y presentan tamaño medio e IPD relativamente pequeños. El tamaño medio, la distribución de tamaño de partículas y el potencial Z fueron determinados por DLS. También presentan valores de potencial Z positivo, y muy superior a + 30 mV, lo cual predice una elevada estabilidad a largo plazo.

25 Ejemplo 6. Determinación de la eficiencia de incorporación de las proteínas en las vesículas.

Para determinar la eficiencia de incorporación del EGF en las vesículas se empleó el método de ultracentrifugación, para la separación de las vesículas sin EGF. Se tomó 1,0 ml de las diferentes suspensiones de vesículas a evaluar, se colocaron en frascos pequeños y se centrifugaron a alta velocidad (100 000 x g), durante 60 min a 4 °C. A continuación, el contenido de proteínas en el sobrenadante (EGF libre) fue determinado por un ensayo inmunoenzimático en fase sólida (ELISA) (Vázquez y otros, Biotecnol. Apl. 1990, 7: 42-49). La eficiencia de incorporación del EGF en las vesículas fue determinada por la siguiente expresión:

Los resultados se muestran en la Tabla 6. Se presentan resultados de la eficiencia de incorporación del EGF en vesículas con las composiciones DPPC:colesterol (obtenidas en el Ejemplo 1), CTAB.colesterol (obtenidas en el Ejemplo 2) y cetrimida:colesterol (obtenidas en el Ejemplo 3). También se evaluó el efecto de la concentración de EGF (relación EGF:colesterol). Se pueden observar valores elevados de la eficiencia de incorporación del EGF (cercanos al 100 %) en los sistemas QUAT:colesterol, para un amplio rango de cargas de EGF (relaciones EGF:colesterol). Sin embargo, los resultados de eficiencia de incorporación del EGF en el sistema DPPC:colesterol fueron muy bajos, la máxima eficiencia de incorporación no sobrepasó el 10 % para la mayor carga de EGF.

ND-No determinado

En el caso particular de las vesículas que comprenden la BSA, se siguió el mismo procedimiento descrito para el EGF, excepto que la cuantificación de la proteína se realizó mediante el método del ácido bicinconínico (micro-BCA) (Smith y otros, Anal. Biochem. 1985, 150: 76-85). La eficiencia de incorporación de la BSA en las vesículas de CTAB:colesterol preparadas como se describe en el Ejemplo 5 fue de solo el 42 ± 5 %. Al comparar la eficiencia de incorporación de la

5 BSA con la del EGF (que se muestra en la Tabla 6), en vesículas con la misma composición CTAB:colesterol, se puede apreciar una incorporación significativamente mayor para el EGF en comparación con la BSA.

Ejemplo 7. Reproducibilidad de la síntesis de vesículas de colesterol:CTAB:EGF mediante la tecnología de fluidos comprimidos

Con el objetivo de comprobar la robustez y reproducibilidad de la metodología utilizada para la síntesis de vesículas de EGF, se midieron el tamaño medio de partícula, el IPD, el potencial Z y la eficiencia de incorporación del EGF en varios lotes de composición 5 μΜ:1 M y 15 μΜ:1 M de EGF:colesterol, preparados en fechas diferentes. En las Tablas 7 y 8 se muestran los resultados obtenidos. El tamaño medio de partículas, el IPD y el potencial Z fueron determinados por DLS.

15 La eficiencia de incorporación del EGF fue determinada según se describe en el Ejemplo 6.

De los valores reportados en las Tablas 7 y 8, puede concluirse que las vesículas presentan características similares, independientemente de su fecha de preparación, lo que permite afirmar que la metodología DELOS-SUP es reproducible y robusta para la preparación de las vesículas de EGF.

Ejemplo 8. Escalado de la síntesis de vesículas de colesterol:CTAB:EGF mediante la tecnología de fluidos comprimidos

Las vesículas se sintetizaron como en el Ejemplo 2, pero a una escala 50 veces superior. Primeramente, una disolución

35 de 3,8 g de colesterol en 144 ml de etanol se introduce en el reactor de alta presión de 300 ml de volumen, a presión atmosférica y temperatura de trabajo (Tw= 35 °C). Se adiciona CO2 comprimido produciendo la expansión volumétrica de la disolución hasta alcanzar una fracción molar Xco2 = 0,7 y una presión de trabajo Pw = 10 MPa. Para alcanzar la total homogenización y el equilibrio térmico, el sistema se deja durante aproximadamente 60 minutos a 10 MPa y 35 °C. Finalmente, se despresuriza la disolución líquida expandida desde la presión de trabajo hasta la presión atmosférica, sobre 1200 ml de una disolución de CTAB en agua mQ (C= 2,83 mg/ml) que contiene EGF a la concentración deseada (5 y 12 μΜ). En este último paso, una corriente de N2 a 10 MPa es utilizada como émbolo para empujar la solución de colesterol en etanol con el objetivo de mantener constante la presión de trabajo dentro del reactor, durante la despresurización. A continuación las vesículas son transferidas a un recipiente que, herméticamente cerrado, es almacenado hasta su uso a 5 ± 3 °C.

45 Se obtuvieron vesículas de CTAB.colesterol (1:1) con EGF incorporado a una concentración de 5 μΜ y de 12 μΜ. Los resultados de apariencia física, tamaño medio, IPD y potencial Z se muestran en la Tabla 9. El tamaño medio de partículas, el IPD y el potencial Z se determinaron por DLS.

En la Tabla 9 se puede observar que las vesículas EGF:CTAB:colesterol son estables para las proporciones de 5 μΜ: 1 M y 12 μΜ: 1 M. Se observa que en el proceso de escalado se obtienen partículas con características físico-químicas comparables a las obtenidas en la escala de 6 ml (Ejemplo 2). En ambos casos se obtienen tamaños medios de partícula por debajo de 200 nm.

Ejemplo 9. Actividad biológica de las vesículas, evaluada mediante ensayo de proliferación celular en fibroblastos murinos A31 3T3

La actividad biológica de las vesículas de EGF, preparadas como se describe en los Ejemplos del 1 al 3, se determinó mediante un ensayo de proliferación celular (Mire-Sluis y Page, J. Immunol. Methods 1995, 187: 191-199). En este caso, se evaluó la capacidad del EGF libre, de los liposomas con EGF y de las diferentes vesículas que comprenden EGF para incrementar la proliferación celular de la línea A31 3T3 de fibroblastos murinos. La actividad biológica de las diferentes suspensiones vesiculares se evaluó aplicando una dilución apropiada de la suspensión directamente sobre las células del ensayo, de modo que las absorbancias de las muestras cayeran dentro del intervalo de la curva del material de referencia de trabajo, que fue previamente calibrado contra el material de referencia internacional de EGF 91/550, suministrado por el Instituto Nacional para Control y Estándares Biológicos (NIBSC, Reino Unido).

Con el objetivo de comparar la potencia de las diferentes preparaciones vesiculares de EGF con la del EGF libre, fue calculada la actividad específica de las diferentes preparaciones, a partir de los resultados de actividad biológica mediante la siguiente expresión:

La actividad biológica es medida por el ensayo descrito, y la concentración de proteínas dada por el valor nominal (en mg/ml) de la concentración equivalente de EGF en las diferentes preparaciones vesiculares.

Como control en el ensayo de proliferación celular se utilizaron vesículas vacías (sin la adición de EGF), en correspondencia con las diferentes variantes ensayadas. En estas muestras, a diluciones menores que las utilizadas para las vesículas con EGF, no se detectó ningún efecto citotóxico ni de incremento de la proliferación.

En la Figura 4A se observa que las vesículas de EGF con composición CTAB:colesterol presentan una actividad específica incrementada, en comparación con el EGF libre, y con las vesículas de EGF con composición DPPC:colesterol. En la Figura 4B, también se observa un resultado similar al anterior, cuando se empleó cetrimida en lugar del CTAB en la composición de vesículas preparadas por el mismo procedimiento. El propósito de esta evaluación fue determinar si la función biológica del EGF se afectó por los componentes o por el proceso de síntesis de dichas vesículas. Sin embargo, para las vesículas con composición QUAT:colesterol se encontró un incremento inesperado en la actividad biológica específica del EGF.

Ejemplo 10. Resistencia a las proteasas del EGF integrado a vesículas de QUAT:colesterol

Se emplearon vesículas de EGF con composiciones QUAT:colesterol (1:1), preparadas según los Ejemplos 2 y 3 de la presente invención. Este experimento se realizó para evaluar la capacidad de las vesículas de QUAT:colesterol para preservar la estabilidad del EGF integrado frente a las proteasas. Es conocido que las heridas crónicas, como las úlceras del pie diabético, presentan un ambiente proteolítico que puede afectar la biodisponibilidad de los medicamentos utilizados para su tratamiento (Bennett y Schultz, Am. J. Surg. 1993, 166: 74-81).

Para realizar esta evaluación se utilizó la tripsina como proteasa modelo. La reacción enzimática fue preparada en tampón Tris-HCl pH 8,5 y concentración de 20 mM, conteniendo una concentración final de tripsina de 0,5 μg/ml. La concentración final de EGF libre o el equivalente de EGF en las diferentes preparaciones vesiculares fue de 125 μg/ml. La incubación de las muestras se realizó por períodos de 4, 8, 16 o 24 horas a 37 °C. Para detener la reacción enzimática se utilizó ácido trifluoroacético (TFA), a una concentración final de 0,1 % (v/v).

Después de detener la reacción, las muestras se diluyeron en metanol absoluto, hasta una concentración final del 80 % (v/v) de metanol, se agitaron y se centrifugaron en centrífuga de mesa a 10 000 rpm, durante 5 minutos. Finalmente, los sobrenadantes de la centrifugación se filtraron a través de filtros de policarbonato con 0,2 μm de tamaño de poro; y a continuación se aplicaron a un sistema HPLC (Merck, Alemania). Las muestras del patrón de EGF y de las vesículas fueron analizadas empleando una columna de fase inversa C18 (Vydac, Hesperia, CA, Estados Unidos) y detectadas a 226 nm. Para ello, se empleó un gradiente lineal del 20 % al 40 % de B, durante 28 minutos. La fase móvil A consiste de 0,1 % de TFA/agua, y la fase móvil B consiste de una solución al 0,05 % de TFA/Acetonitrilo. El volumen de inyección analizado fue de 5,0 ml, correspondiente a aproximadamente 20 μg de EGF. La velocidad de flujo utilizada fue de 1,0 ml/minuto. La concentración de EGF en las muestras se cuantificó, por interpolación con una curva de calibración del EGF en el área bajo el pico principal, y las concentraciones de EGF de muestras conocidas, a partir de los cromatogramas obtenidos a 226 nm. El porciento remanente de EGF en cada muestra, después de la incubación con tripsina, fue calculado a partir de la siguiente expresión:

En la Figura 5A se observa que las vesículas de EGF con composición CTAB:colesterol presentan una estabilidad incrementada frente a tripsina, con respecto al EGF libre, durante un período de 24 horas. De forma similar, en la Figura 5B, se observa que las vesículas de EGF con composición cetrimida:colesterol presentan un comportamiento similar al anteriormente descrito. Entre las diferentes cargas de EGF evaluadas (relación EGF:colesterol) no se encontraron diferencias significativas.

Los resultados obtenidos para la estabilidad frente a proteasas, del EGF incorporado a las vesículas de QUAT:colesterol, mostraron que, de forma sostenida, las vesículas de EGF presentan una estabilidad mucho mayor que

15 la del EGF libre.

Ejemplo 11. Demostración de la actividad antimicrobiana de las vesículas de QUAT :colesterol

Suspensiones de vesículas que comprenden QUAT:colesterol fueron evaluadas para determinar si presentaban actividad antimicrobiana. Esta actividad fue determinada mediante el método de difusión en agar (Manual of Clinical Microbiology. 6ta ed. Washington, DC: ASM; 1995). La efectividad de las diferentes suspensiones a evaluar fue ensayada contra bacterias Gram positivas (Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus); Gram negativas (E. coli, Proteus mirabilis), y contra hongos (Candida albicans, Aspergillus niger); mediante la técnica de los pocillos en placas de agar nutritivo. Estos microorganismos fueron identificados y suministrados por la colección de microorganismos BCCM/LMG

25 (Bélgica). Las bacterias fueron cultivadas toda la noche a 37 °C en Caldo de Triptona Soya (Oxoid), y los hongos se incubaron durante 72 horas a 28 °C, en Caldo de Sabouraud Dextrosa (Oxoid). Estas suspensiones se utilizaron como inóculos. Un inóculo final, usando 100 μΙ de una suspensión que contiene 108 unidades formadoras de colonias/ml de bacterias, o 104 esporas/ml de hongo, fue esparcido en las placas de Agar Triptona Soya y de Agar Sabouraud Dextrosa (Oxoid), respectivamente. El disco (6 mm de diámetro) fue impregnado con cada una de las diferentes suspensiones de vesículas a ensayar. Ciprofloxacina y Fluconazol (100 μg/ml) fueron usados como controles positivos para bacterias y hongos, respectivamente. Las placas de ensayo fueron incubadas a 37 °C por 24 horas para bacterias, y a 28 °C por 72 horas para hongos, dependiendo del tiempo de incubación requerido para un crecimiento visible.

En la Tabla 10 se observa que las diferentes suspensiones de vesículas mostraron un efecto antimicrobiano frente a las

35 bacterias Gram positivas y a los hongos. En general, los microorganismos fueron más sensibles a las suspensiones vesiculares con composición cetrimida:colesterol que a las de CTAB:colesterol. Frente a ciertos microorganismos, algunas suspensiones vesiculares mostraron actividades antibacteriana y antifungicida comparable con la ciprofloxacina y el fluconazol, respectivamente.

Ejemplo 12. Manufactura de una formulación líquida en forma de atomizador en aerosol que contiene las vesículas de EGF.

Una suspensión de vesículas de CTAB.colesterol (1:1) con composición EGF:colesterol 5 μΜ:1 M, obtenidas según el Ejemplo 2, con concentración equivalente de EGF de 25 μg/ml, se diluyó hasta la concentración equivalente de 15 μg/ml, en solución tampón fosfato de sodio 10 mM pH 7,2. Esta solución final también contiene 17% (v/v) de glicerol, 10 % (v/v) de etanol, 0,02 % (p/v) de butil-hidroxitolueno (BHT), 0, 18 % (p/v) de metilparabeno y 0,02 % (p/v) de propilparabeno. La dispersión resultante se filtró, a través de filtros esterilizantes de 0,2 μm de acetato de celulosa, y dispensó en bulbos de vidrio bajo atmósfera de nitrógeno.

Ejemplo 13. Manufactura de una formulación en gel que contiene las vesículas de EGF.

Una suspensión de vesículas de cetrimida :colesterol (1:1) con composición EGF:colesterol 5 μΜ:1 M, obtenidas según el Ejemplo 3, con concentración equivalente de EGF de 25 μg/ml, se diluyó hasta la concentración equivalente de 15 μg/ml. Esta formulación contiene tampón Tris-HCl 10 mM pH 7,2; y Carbomer (Carbopol 940), a una concentración final de 1 ,25 % (p/v); glicerol al 3 % (p/v); y 20 mM de L-metionina. Además, la formulación contiene 0,02% (p/v) de BHT, y como conservante antimicrobiano 0,18 % (p/v) de metilparabeno y 0,02 % (p/v) de propilparabeno.

Ejemplo 14. Manufactura de una formulación parenteral que contiene las vesículas de EGF.

Una suspensión de vesículas de BKC:colesterol (1:1), con composición EGF:colesterol 5 μΜ:1 M, obtenidas según el Ejemplo 4 con concentración equivalente de EGF de 25 μg/ml, fue introducida en la celda del dispositivo de ultrafiltración de flujo tangencial Sarto con Sílice 200. Para la ultrafiltración de las vesículas, se utilizaron casetes con membrana Hydrosart®, con tamaño de poro de 30 kDa. El proceso de concentración-diafiltración se realizó a temperatura de 25 ± 3 °C, y la caída de presión máxima a la entrada del casete se mantuvo por debajo de 4 bar. Durante el proceso, la suspensión se concentró 5 veces (concentración final equivalente de EGF de 125 μg/ml). Después de concentradas, las vesículas se diluyeron en tampón fosfato de sodio 10 mM pH 7,2; hasta una concentración equivalente de 75 μg/ml de EGF. Esta formulación contiene, además, 20 mM de L-metionina y 0,02 % (p/v) de BHT. La suspensión resultante se filtró a través de filtros esterilizantes de 0,2 μm y se dispensó en bulbos de vidrio bajo atmósfera de nitrógeno.

Ejemplo 15. Comparación del efecto farmacodinámico de liposomas y vesículas que comprenden EGF en modelos animales de cicatrización

Metodología experimental:

Para evaluar la eficacia farmacológica de las formulaciones que se mencionan a continuación, se desarrolló un modelo experimental de úlcera crónica de grosor total en el lomo de las ratas. Se emplearon ratas Sprague Dawley de 250-270 gramos de peso, las cuales fueron aleatoriamente asignadas para constituir 7 grupos experimentales, con 10 animales cada uno. Las ratas fueron anestesiadas con una combinación de ketamina/xilazina, por vía intraperitoneal, para depilar su región dorsal extensamente. Se produjeron dos úlceras retroescapulares, bilaterales simétricas, de 8 mm de diámetro, y de grosor total hasta la fascia superior que fue respetada. De inmediato, se comenzó a aplicar acetónido de triamcinolona, en forma de compresa, una vez al día durante los tres primeros días, para detener la cicatrización e inducir los cambios propios de la cronicidad. Transcurridos 7 días, se constató el arresto del proceso de cicatrización y la cronicidad de las úlceras, por la ausencia de tejido de granulación y la hipertrofia de los bordes epiteliales. A partir de este momento se comenzó a realizar la aplicación de los tratamientos a estudiar, como se describe a continuación:

Grupo 1: sin tratamiento (salina). Los animales se sometieron a las mismas condiciones de manejo y manipulación que el resto de los grupos. Se aplicó solución salina fisiológica estéril de forma nebulizada.

Grupo 2: liposomas vacíos de DPPC-colesterol. Grupo 3: vesículas vacías de CTAB-colesterol. Grupo 4: vesículas vacías de cetrimida-colesterol. Grupo 5: liposomas de DPPC-colesterol cargados con EGF, a una concentración de 25 μg/ml. Grupo 6: vesículas de CTAB-colesterol cargadas con EGF a 25 μg/ml. Grupo 7: vesículas de cetrimida-colesterol cargadas con EGF a 25 μg/ml.

Las heridas se higienizaron diariamente. Después de la higienización de las mismas, a cada grupo se aplicó la suspensión que se indica en cada caso. La aplicación de las suspensiones se realizó dos veces al día, durante 14 días. Los sistemas experimentales fueron tratados mediante la aplicación tópica de las suspensiones de vesículas o liposomas mediante nebulización.

Todos los animales fueron sometidos a autopsia y toma de muestras, transcurridos 14 días después de haber comenzado el tratamiento asignado para cada grupo. Las muestras se fijaron en formalina neutra al 10 %, y 72 horas más tarde se hemiseccionaron uniformemente, para su posterior inclusión en parafina. Las tinciones empleadas fueron

las siguientes: Hematoxilina-Eosina, reacción tricrómica de Mallory, método del retículo de Verhoeff y de Gomori. Las muestras fueron analizadas a ciegas por dos investigadores independientes.

Resultados:

No resultó necesario excluir úlceras contaminadas, por lo tanto se emplearon 20 lesiones en total para cada uno de los 6 grupos experimentales. Resumidamente, se pudo constatar que todas las formas de presentación farmacéutica de las vesículas de EGF estimularon significativamente el proceso de curación total, al compararse con grupos de vesículas sin EGF (vacías), los liposomas cargados con EGF a 25 μg/ml, y el grupo control experimental tratado con solución salina. Los datos registrados se refieren al promedio de dos estudios independientes realizados en diferentes momentos. Se utilizaron la U-de Mann Whitney y la prueba t de Student para efectuar las comparaciones. Todos los parámetros cumplieron con los criterios de distribución normal. Los parámetros estudiados y los resultados se muestran a continuación en la Tabla 11.

55 El experimento evidencia que las vesículas de CTAB-colesterol y de cetrimida-colesterol cargadas con EGF tuvieron un potente efecto cicatrizante. Es notorio el efecto anti-inflamatorio constatado para los grupos 6 y 7, en comparación con el resto de los tratamientos. Es posible que el efecto promotor de la fibroangiogénesis y la contracción se relacione con la reducción del balance de células inmunoinflamatorias infiltradas en la neodermis. Similarmente, se constató un marcado efecto promotor de la migración epitelial, evidenciándose al microscopio la presencia de una epidermis estratificada. La respuesta obtenida para el grupo tratado con los liposomas cargados con EGF fue menor que la detectada en los grupos 6 y 7. La superioridad de los tratamientos que incluyeron las suspensiones de vesículas cargadas con EGF, aplicados a los grupos 6 y 7, se puso también de manifiesto en otro experimento semejante, donde se indujo la cronicidad de las heridas mediante la aplicación tópica de metilglioxal.

Ejemplo 16. Tratamientos basados en la aplicación tópica de las vesículas que comprenden EGF a pacientes con úlceras de pie diabético

Para los casos clínicos, la mayoría de las lesiones tratadas superaban el 90 % de probabilidad de amputación, de 5 acuerdo a la escala establecida por la Universidad de Texas. Los tratamientos fueron administrados por vía tópica.

Características generales de los pacientes tratados:

Los pacientes tenían diabetes mellitus tipo I o II de larga evolución, y estaban medicados con insulina, sulfonilureas o biguanidas como agentes hipoglicemiantes orales. Tenían antecedentes personales de mala cicatrización, en tanto que algunos de ellos ya habían experimentado una amputación contralateral previa. Todas las lesiones de los miembros inferiores abordadas con los tratamientos correspondieron a pie diabético isquémico o neuropático. Las lesiones, en su conjunto, fueron clasificadas como crónicas, complejas y recalcitrantes. El período evolutivo de las lesiones estuvo en el intervalo de entre menos de un mes y 7 años. El tamaño de las lesiones tratadas se encontraba en el intervalo entre 20

15 y 80 centímetros cuadrados. La profundidad en algunas lesiones llegó a comprometer el periostio. Desde el punto de vista anatómico las lesiones tratadas se encontraban en las regiones lateral, calcánea y/o metatarsiana. Todos los pacientes recibieron los primeros tratamientos bajo régimen de ingreso intrahospitalario, en tanto que fue necesario realizar procedimientos de excéresis bajo anestesia, así como terapia con antibióticos por vía parenteral. Ante la cicatrización o granulación total de la herida con evidencias de migración epitelial, los pacientes fueron sometidos a régimen ambulatorio y seguimiento en días alternos para su cura y medicación. Luego de la epitelización total, cada paciente fue seguido hasta 12 meses de cicatrizado. Con este propósito se realizó la evaluación de la ocurrencia de recidivas, registro de reacciones adversas y evaluación del estado general del paciente.

En la Tabla 12 se muestran las características demográficas y epidemiológicas de la cohorte de pacientes que 25 recibieron los tratamientos por vía tópica.

Más abajo se describe la conducta terapéutica seguida con cada uno de los pacientes:

Paciente JLG. Masculino de 56 años, controlado con insulina y sin otras complicaciones clínicamente manifestadas de diabetes. Presenta lesión frontal extensa con componente isquémico, que persiste después de dos años de amputación transmetatarsiana. Sin resultados en los procesos de granulación y epitelización después del establecimiento de terapias antimicrobianas y con ozono durante dos años. Después de realizada la limpieza quirúrgica y la reanimación de los bordes se procedió al tratamiento, en días alternos, con la formulación tópica en forma de atomizador en aerosol que se describe en el Ejemplo 12, que contiene vesículas de EGF:CTAB:colesterol. En ocho semanas de tratamiento se logró la total epitelización de la lesión. Los resultados se muestran en la Figura 6.

Paciente OFS. Femenina, fumadora, obesa y con antecedentes de hipertensión arterial. Controlada con hipoglicemiantes orales. A punto de partida de una picadura local de insecto, se presenta necrosis galopante de partes blandas y tendones. Se procede a la cirugía excerética del material necrótico. Se instituye terapia antimicrobiana y la lesión es curada en días alternos. Debido a que transcurridos 14 días de la intervención el proceso de granulación es tórpido y lento se comienza a aplicar el tratamiento, en días alternos, con la formulación tópica en forma de atomizador en aerosol que se describe en el Ejemplo 12 que contiene vesículas de EGF:CTAB:colesterol. En ocho semanas de tratamiento se logró la total epitelización de la lesión.

Paciente AVL. Masculino de 52 años, controlado con glibenclamida, lesión plantar en pie de Charcot neuropático que ha granulado desde hace 7 años, pero sin evidencias de contracción / epitelización. Luego de realizada la limpieza quirúrgica y la reanimación de los bordes se procedió al tratamiento, en días alternos, con la formulación tópica en forma de gel que se describe en el Ejemplo 13, que contiene vesículas de EGF:cetrimida:colesterol. En ocho semanas de tratamiento se logró la total epitelización de la lesión.

Paciente PAT. Masculino de 47 años, sin otras comorbilidades o complicaciones clínicamente manifiestas de la diabetes, aun cuando se detectó una enfermedad arterial periférica. Como consecuencia de un trauma local, desarrolla un absceso transmetatarsiano que le conduce a necrosis licuefactiva de casi todo el antepié con marcados signos flogísticos. Se practica una amputación transmetatarsiana y se comienza con terapia de antibióticos de antibióticos. Como consecuencia de que la base residual de amputación no evolucionó satisfactoriamente luego de 30 días, teniendo que practicarse extensas debridaciones por la presencia de microplacas isquémicas; se decide intervenir al paciente con la formulación tópica en forma de gel que se describe en el Ejemplo 13, que contiene vesículas de EGF:cetrimida:colesterol. La formulación se aplicó en los bordes y superficie de la herida. Los tratamientos se practicaron en días alternos y se extendieron por 4 semanas. Desde la primera administración se eliminó la presencia de las placas isquémicas y se comenzó a desarrollar un tejido de granulación productivo y sangrante, que posteriormente facilitó la aplicación de un injerto de grosor parcial libre de piel.

Paciente GMA. Masculino de 69 años, controlado con insulina y sin otras complicaciones clínicamente manifestadas de diabetes. Presenta lesión frontal residual que persiste después de 6 meses de amputación transmetatarsiana. Sin resultados en los procesos de granulación y epitelización después de la institución de terapias antimicrobiana y con ozono durante 3 meses. Después de realizada la limpieza quirúrgica se procedió al tratamiento, en días alternos, con la formulación tópica en forma de atomizador en aerosol que se describe en el Ejemplo 12, que contiene vesículas de EGF:CTAB:colesterol. En seis semanas de tratamiento se logró la total epitelización de la lesión.

Ejemplo 17. Tratamientos basados en la infiltración de vesículas de EGF a pacientes con úlceras de pie diabético Para los casos clínicos; la mayoría de las lesiones tratadas superaban el 90 % de probabilidad de amputación de acuerdo a la escala establecida por la Universidad de Texas. Los tratamientos fueron administrados por la vía infiltrativa. Las características generales de los pacientes tratados coinciden con las descritas en el Ejemplo 16.

Para el tratamiento infiltrativo se utilizó la formulación parenteral referida en el Ejemplo 14, que utiliza vesículas de EGF:BKC:colesterol. Este tratamiento tiene su esencia en la inyección intra-y perilesional interna en los bordes y fondos de la lesión en puntos equidistantes. El material se deposita dirigiendo la aguja en un ángulo de 15-45 grados hacia la base de la úlcera o hacia lo profundo de los bordes, incluyendo siempre la unión dermo-epidérmica para estimular la contracción de los bordes. En cada punto se depositaron entre 100 y 1000 μl, en dependencia del aspecto clínico del tejido y de sus características. Esto se realiza de dos a tres veces por semana. Las lesiones tratadas y las características demográficas de la población tratada se describen en la Tabla 13. En todos los casos tratados se previno la práctica de amputación menor o mayor.

Más abajo se describe la conducta terapéutica seguida con cada uno de los pacientes.

Paciente HCJQ. Isquémico, sin pulso distal y ocluido desde el sector poplíteo. La lesión consiste en una base residual

45 de amputación lateral del quinto dedo, que muestra cápsulas y tendones expuestos en franca necrosis isquémica. La lesión fue clasificada como grado IV de la escala de Wagner. El tamaño fue de 10 x 4 centímetros. El tratamiento se instituye cuando, al sexto día de la amputación, la base residual de amputación se apreciaba clínicamente atónica y cianótica, progresando de esta forma por 5 días, a pesar de todas las acciones farmacológicas sistémicas y locales. Se inician las infiltraciones luego de desbridación quirúrgica del material necrótico; con la expectativa de mejorar el microambiente local y favorecer la aparición del tejido de granulación. Este se comenzó a observar a partir de la quinta sesión de infiltración. La paciente recibió un total de 12 sesiones de infiltración. El tratamiento favoreció la presencia de un tejido de granulación productivo y sangrante. Se observó intensa migración epitelial centrípeta, aunque no marcada contracción de los bordes. Transcurridos 38 días de iniciado el tratamiento la lesión había epitelizado totalmente sin necesidad de injerto. No se observaron reacciones adversas agudas o tardías. A los 12 meses la lesión se encontraba

55 libre de recurrencias locales.

Paciente OFW. Neuropático de 81 días de evolución con una base residual de amputación trans-metatarsiana clasificable como Wagner IV al momento de ingreso en el servicio. El tamaño de la lesión es de 14 x 7 centímetros cuadrados. Se perciben los pulsos distales con un ITB de 0,9, aunque con signos de disestesia. El tratamiento se instituye cuando, por espacio de 42 días de curas locales y aplicación de compresas de solución salina fisiológica, la lesión evidencia muy pobre respuesta granulativa. Se comienzan las infiltraciones y se realizan con frecuencia diaria durante la primera semana de tratamiento para rescatar las células locales. Posteriormente, se continúa a un régimen de dos veces a la semana, por tres semanas. Con este esquema se logró granulación productiva y sangrante total. El tejido fue cubierto con un injerto de grosor parcial de piel obtenida de la región anterior del muslo contralateral. De forma

65 similar a la paciente anteriormente descrita, el tratamiento fue bien tolerado y al año la lesión se mantuvo epitelizada.

Paciente JIFM. Femenino, exfumador de 61 años de edad. ITB de 0,4 en la extremidad inferior izquierda que muestra una fascitis necrotizante en la zona del metatarso y la planta del pie. La lesión se clasifica como grado V de la escala de Wagner. La paciente es tratada quirúrgicamente, practicándose la exéresis de todo el tejido necrótico y/o el tejido contaminado blando y óseo. Se establece un régimen de terapia polivalente de antibióticos por vía sistémica.

5 Transcurridas 48 horas de la intervención quirúrgica se practica la primera inspección de la lesión, se realiza su higienización local y se comienza el tratamiento infiltrativo con las vesículas. Se instauró durante los primeros 10 días un régimen de tratamiento en dosis de ataque con las vesículas de EGF, que posteriormente permitió reducirse a dos sesiones de infiltración por 5 semanas. El tratamiento permitió salvar un pie sin alternativa terapéutica. La paciente tiene marcha normal y un dominio motor satisfactorio de la porción distal de la extremidad.

Ejemplo 18. Tratamientos basados en la aplicación combinada infiltrable y tópica empleando vesículas de EGF a pacientes con úlceras de pie diabético

Para los casos clínicos; la mayoría de las lesiones tratadas superaban el 90 % de probabilidad de amputación, de

15 acuerdo a la escala establecida por la Universidad de Texas. Los tratamientos fueron administrados combinando las vías infiltrativa y tópica. Las características generales de los pacientes tratados coinciden con las descritas en el Ejemplo 16.

Para el tratamiento combinado se utilizó primeramente la vía infiltrativa, empleando la formulación parenteral que comprende vesículas de EGF (referida en el Ejemplo 14). Después, para la vía tópica, se utilizaron alternativamente la formulación en forma de atomizador descrita en el Ejemplo 12 y la formulación en gel descrita en el Ejemplo 13. Las características demográficas de la población tratada, y de las lesiones, y se describen en la Tabla 14. En todos los casos tratados se previno la práctica de amputación menor o mayor.

Paciente AFG. Masculino con diabetes de larga data e historia de mala adherencia a los tratamientos. El paciente manifiesta patrón de oclusión poplítea con ausencia de pulsos distales. La lesión debuta en forma de una flictena que se contamina y galopa rápidamente hasta necrosar todas las partes blandas de la región del calcáneo. En una primera cura quirúrgica se eliminan las partes blandas. Cinco días más tarde se hace necesaria otra intervención quirúrgica que conduce a la devastación del material óseo. Se establece una intensa terapia polivalente con antibióticos y al término de 20 días de la primera intervención quirúrgica se comienza el tratamiento con las vesículas de EGF en forma infiltrativa. Se establece una sesión de tratamiento y cura local diaria en las dos primeras semanas. A continuación se procede mediante curas y tratamientos en días alternos con la formulación tópica en forma de gel que se describe en el Ejemplo 13, que contiene vesículas de EGF:cetrimida:colesterol preparadas según el Ejemplo 3 en los bordes y la superficie de la herida, durante las 8 semanas posteriores. Transcurridas 10 semanas de tratamiento la lesión había epitelizado totalmente.

Paciente LATR. Isquémico carente de pulsos distales y enfermedad macrovascular de ambos miembros inferiores. Existencia de un ITB de 0,6; sin posibilidades de cirugía revascularizadora debido a las calcificaciones. Amputación contralateral previa tres años atrás. Presenta trombosis de las arterias finas del cuarto y quinto dedos realizándose amputación de estos con borde lateral extenso y profundo. Transcurridas dos semanas de la cirugía, la base residual de amputación evidenciaba signos de atonía y refractario a la granulación. Por lo tanto, a la tercera semana se inicia el tratamiento con las vesículas, empleándose inicialmente el tratamiento infiltrativo con una dosis entre 25 y 125 μg de EGF por punto de inyección, siendo depositado en los bordes y fondos de la zona quirúrgica. Esta modalidad de tratamiento se empleó hasta lograr cubrir todas las cavidades y túneles con tejido de granulación, lo cual aconteció aproximadamente a las tres semanas. Posteriormente se decidió continuar empleando el tratamiento por la vía tópica, en forma de gel, con la composición que se describe en el Ejemplo 13, y que contiene vesículas de EGF:cetrimida:colesterol. El tratamiento se realiza en los bordes y superficie de la herida, haciendo énfasis especialmente en el borde dermo-epitelial de las heridas para estimular la re-epitelización. El tratamiento se realizó en días alternos, hasta la epitelización total en 5 semanas.

Paciente ZEM. Femenino de 57 años, con lesión grado III de Wagner y evidencias de neuropatía, lesión plantar que ha granulado durante 7 años, pero sin evidencias de contracción / epitelización. Luego de realizada la limpieza quirúrgica y la reanimación de los bordes se procedió al tratamiento infiltrativo con una dosis de 75 μg equivalentes de EGF por punto de inyección, con la formulación que se describe en el Ejemplo 14, que contiene vesículas de EGF:BKC:colesterol, siendo depositada en los bordes de la zona quirúrgica. Esta modalidad de tratamiento se aplicó durante las cuatro primeras semanas en días alternos. Posteriormente, se decidió continuar empleando el tratamiento, en días alternos, con la formulación tópica en forma de atomizador en aerosol que se describe en el Ejemplo 12, que contiene vesículas de EGF:CTAB:colesterol. Para el tratamiento se atomizan las vesículas de EGF en los bordes y superficie de la lesión; haciendo énfasis especialmente en el borde dermo-epitelial de las heridas para estimular la reepitelización, el tratamiento se realizó en días alternos y hasta la epitelización total en 8 semanas. La evolución del proceso de cicatrización se muestra en la Figura 7.

Paciente JLHB. Neuropático que desarrolla una lesión infecciosa extensa a punto de partida de una quemadura seca en el pie de la extremidad inferior derecha. Finalmente, desemboca en una amputación transmetatarsiana, a la que se le añade un borde lateral de 10 centímetros de longitud. Se instaura tratamiento con antibióticos por vía endovenosa y curas locales sistemáticas cada 48 horas. La lesión mostró tendencia a granular muy lentamente y a la atonía de los bordes, transcurridos 20 días de la intervención. Se instituye el tratamiento infiltrativo de las vesículas con una carga de 75 μg de EGF en días alternos, en la base residual, así como en el borde. A la tercera semana de tratamiento se inicia la aplicación, en días alternos, con la formulación tópica en forma de atomizador en aerosol que se describe en el

Ejemplo 12, que contiene vesículas de EGF:CTAB:colesterol, hasta llegar a la zona profunda del borde lateral. La combinación de los tratamientos aceleró la granulación total, así como la epitelización espontánea de un área de más de 60 centímetros cuadrados.

Ejemplo 19. Demostración de la eficacia terapéutica del uso de las vesículas de EGF en un modelo letal de lesión pulmonar aguda (LPA) o síndrome de dificultad respiratoria de adultos (SDRA) en ratas.

Se utilizaron ratas Sprague Dawley machos, con peso corporal entre 250 y 280 gramos. La lesión pulmonar fue inducida bajo anestesia general (ketamina/xilazina), mediante instilación endotraqueal de una combinación basada en lipopolisacárido (LPS)-cimosano. Inmediatamente después, los animales fueron aleatorizados y asignados a tres grupos experimentales de 12 animales cada uno.

Grupo A: tratado con solución salina fisiológica.

Grupo B: tratado con aerosol de EGF en solución salina fisiológica, a una concentración de 25 μg/ml/kg.

Grupo C: tratado con las vesículas de colesterol:BKC:EGF descritas en el Ejemplo 4, con concentración equivalente de 25 μg/ml de EGF, y administradas como en el Grupo B.

Los animales se dejaron evolucionar sin tratamiento alguno hasta la instauración de los primeros síntomas. Seis horas después de la aplicación del LPS/cimosano, las ratas mostraron taquipnea asociada a espiración forzada. En este punto los animales mostraron un patrón de saturación de PO2 arterial de 65 % y franca acidosis respiratoria.

Los tratamientos comenzaron, por tanto, aproximadamente a las 8 horas de instilarse las toxinas. El experimento estuvo encaminado a evaluar el efecto del tratamiento con las dos formulaciones de EGF exclusivamente sobre la fase aguda del SDRA. Los tratamientos se realizaron mediante una mascarilla oro-facial adaptada de una máquina de anestesia volátil. Los tratamientos se realizaron dos veces al día. De forma coadyuvante los animales fueron tratados también con acetato de hidrocortisona (10 mg/kg) una vez al día.

Transcurridas 72 horas de iniciados los tratamientos el estudio fue detenido. Los animales sobrevivientes fueron anestesiados y sometidos a lavado bronco-alveolar profundo, en 5 ml de solución salina estéril, para estudio citológico y bioquímico, así como a extracción de sangre arterial, para la determinación de los parámetros gasométricos. Seguidamente los pulmones fueron insuflados con 10 ml de formalina neutra al 10 % y procesados para estudio histológico.

La Tabla 15 muestra los resultados de la mortalidad diaria por grupo. Como puede observarse, el tratamiento con la nebulización de EGF controló la progresión del daño pulmonar agudo. Notoriamente, el mejor efecto en términos de supervivencia corresponde al grupo que recibió el EGF incorporado a vesículas. Esto sugiere que la ocupación prolongada de múltiples receptores del EGF ejerce un efecto farmacológico más consistente que el EGF en forma de partículas de aerosol líquido simple vehiculizado en suero fisiológico.

Los resultados del lavado broncoalveolar confirmaron la protección ejercida por el EGF a la pared alveolar y al endotelio del capilar septal. Se observó, además, que la protección conferida por el tratamiento con el EGF incorporado a las vesículas incluye una mejoría en la capacidad ventilatoria expresada en mayor índice de PO2 arterial, y en la conservación de un pH arterial muy cercano al normal. Estos datos se exponen en la Tabla 16.

El análisis histológico de los pulmones de cada grupo demostró que el tratamiento con EGF, particularmente en el grupo que recibió la formulación de las vesículas, protegió el parénquima pulmonar. Esto se demuestra por la presencia de conservación de la relación alveolo/septum, reducción del edema por permeabilidad de la pared septal, así como de la presencia de focos hemorrágicos y de material eosinofílico en el lumen alveolar. Se demostró menor reacción inflamatoria en los animales tratados con la formulación de EGF incorporado a las vesículas, en comparación con aquellos que recibieron solución salina fisiológica. El experimento nos permite inferir que la intervención con las vesículas de colesterol:BKC:EGF, descritas en el Ejemplo 4, ejerce un efecto farmacológico más intenso / prolongado sobre el parénquima pulmonar expuesto a conocidos inductores de LPA. La protección conferida no solo cubre la mejoría de la integridad estructural del pulmón, sino que también cursa con sustancial corrección de parámetros funcionales.

Ejemplo 20. Tratamiento compasivo con las vesículas de EGF a un paciente crítico con síndrome de dificultad respiratoria del adulto (SDRA)

Descripción del caso clínico: Paciente AGJ, masculino de 75 años, sin antecedentes patológicos, que sufre un trauma abdominal que evoluciona hacia un shock séptico. Como complicación evolutiva se instaura un SDRA que lo lleva a dificultad ventilatoria con disnea y cianosis refractaria a oxigenoterapia; baja saturación (11 mm Hg) y alteraciones del pH sanguíneo. En la imagen radiológica aparecen manchas algodonosas en el parénquima de ambos pulmones. Se decide iniciar el tratamiento con presión positiva a la expiración final y otros medicamentos de rutina. Con vistas a proteger el parénquima pulmonar en la fase aguda exudativa, se administran las vesículas de colesterol:BKG:EGF descritas en el Ejemplo 4, a una dosis de 200 μg equivalentes de EGF por litro de oxígeno medicinal, dos veces al día. Las medidas permitieron una evolución favorable y progresiva del paciente a la normalidad, previniendo la llegada a la fase de alveolitis fibrosante. Al tercer día de tratamiento se pudo suspender la ventilación con presión positiva, y al quinto día la imagen algodonosa había desaparecido totalmente.

Ejemplo 21. Demostración de la eficacia terapéutica del uso de vesículas de EGF en pacientes con colitis ulcerativa distal izquierda

Se trata de una cohorte de 8 pacientes con diagnóstico de colitis ulcerativa distal, después de varias colonoscopías y biopsias realizadas. Los pacientes recibían una dieta médica especializada, así como el tratamiento farmacológico con azulfidina o sulfasalacina. Conforme a que esta cohorte se había mantenido clínicamente activa por más de 12 meses, y refractaria a toda intervención farmacológica, incluyendo corticoides; se evalúan para un tratamiento compasivo con las vesículas de colesterol:cetrimida:EGF descritas en el Ejemplo 3, mediante administración por un enema bajo. Para ello, las vesículas de colesterol:cetrimida:EGF se administraron en solución salina fisiológica, a una concentración equivalente de EGF de 50 μg/ml, para un volumen de 20 mi. Los enemas se aplicaron en decúbito lateral izquierdo, cada noche antes del horario de sueño. A los 7 días de iniciados los enemas asociados al resto de las medidas médicas previas, las melenas, el dolor, y la toma sistémica general fueron erradicados. Transcurridos 10 días de tratamiento, se practica una colonoscopía, detectándose una sustancial desinflamación de la mucosa, cicatrización de la mayoría de las lesiones y una significativa reducción del índice de St. Mark. El tratamiento se suspendió a los 21 días de iniciado, término al cual se repiten las colonoscopías; confirmándose el efecto de cicatrización y desinflamación causados por el tratamiento con los enemas que contienen las vesículas de colesterol:cetrimida:EGF. Las biopsias tomadas de los 8 pacientes, a los 21 días de comenzado el tratamiento, evidenciaron la desaparición de la criptitis.

Ejemplo 22. Utilización compasiva de las vesículas de EGF para revertir las lesiones mucosales provocadas por la quimioterapia oncológica

Paciente QED, masculino de 32 años, que desarrolla mucositis hemorrágica de vejiga y partes bajas del tracto urinario, a punto de partida del tratamiento con ciclofosfamida y busulfan, tras un trasplante medular. Transcurridas 72 horas con hematuria y abundante proteinuria (400 mg/24 horas), conjuntamente con las medidas de apoyo médico general, el paciente recibe una cistoclisis por la que se pasa una infusión de solución salina fisiológica, conteniendo las vesículas de colesterol:CTAB:EGF, preparadas según el Ejemplo 2, a una concentración equivalente de 150 μg/ml de EGF. Al

término de las primeras 24 horas, solo se detectaron trazas de hematíes en la orina y una proteinuria de 170 mg/24 horas.

Paciente IRT, femenino, de 27 años que desarrolla mucositis de partes altas del tubo gastrointestinal, en el curso de

5 poliquimioterapia para tratamiento de un linfoma no Hodgkin. Se instaura un cuadro clínico florido, que incluye desde manifestaciones aftosas, sialorrea, hasta hematemesis, distensión abdominal, toma sistémica, fiebre y otros síntomas. El proceso comienza a ser manejado con medidas farmacológicas de apoyo, que incluyeron inhibidores de bomba de protones, mucoprotectores, restitución de volemia y analgésicos opiáceos parenterales. Transcurridas 24 horas de implantado el cuadro, la paciente recibe aplicaciones orales de una solución salina conteniendo las vesículas de

10 colesterol:cetrimida:EGF, preparadas según el Ejemplo 3, a una concentración equivalente de EGF de 50 μg/ml. Mediante una sonda nasogástrica se instila, cada cuatro horas, un volumen de 250 ml de dicha solución. La hematemesis cedió a las 24 horas de iniciar las irrigaciones gástricas, así como el cuadro de distensión y paresis aguda. Igualmente, se redujo progresivamente la necesidad de apoyo en volumen y otras medidas de manejo.

15 Ejemplo 23. Síntesis de vesículas de ß-Sitosterol:CTAB:EGF mediante la tecnología de fluidos comprimidos

Estas vesículas se sintetizaron de igual forma a la utilizada en el Ejemplo 2, pero en este caso se utilizó, por una parte una disolución de 77,71 mg de β-Sitosterol en 2,88 ml de etanol, y por otra parte una disolución acuosa de 2,83 mg/ml de CTAB y EGF a la concentración deseada. Se obtuvieron vesículas de CTAB:ß-Sitosterol (1:1) con EGF incorporado a 20 una concentración de 5 μΜ. Los resultados de apariencia física, tamaño medio y potencial Z se muestran en la Tabla

17. Se observa que la preparación de vesículas es estable y presentan tamaño medio e IPD relativamente pequeños. El tamaño medio, la distribución de tamaño de partículas y el potencial Z fueron determinados por DLS. Además, de manera similar a las preparaciones de vesículas mencionadas en ejemplos anteriores, que comprenden en su composición un surfactante catiónico de tipo amonio cuaternario, presentan valores de potencial-Z positivo y muy

25 superior a + 30 mV, lo cual les predice una elevada estabilidad a largo plazo. En la Figura 3D se observa que predominan las formas esferoidales con estructura unilamelar, según el estudio de morfología de las vesículas realizado por crio-TEM. Estas vesículas también presentan características que las hacen muy atractivas desde el punto de vista farmacéutico.

Claims

Reivindicaciones

1. Vesículas que comprenden factor de crecimiento epidérmico (EGF), un surfactante catiónico y colesterol o sus

derivados. 5
2.

Las vesículas de conformidad con la reivindicación 1, en donde el surfactante catiónico es de tipo amonio cuaternario, preferentemente en donde el surfactante catiónico de tipo amonio cuaternario es un surfactante que se selecciona del grupo que consiste en bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB), cetrimida y cloruro de benzalconio (BKC).
3.

Las vesículas de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, en donde la proporción molar entre el surfactante catiónico y el colesterol, o sus derivados, se encuentra en el intervalo de 10 M:1 M a 1 M:5 M; y la proporción molar entre el EGF y el colesterol, o sus derivados, se encuentra en el intervalo de 0,5 μΜ:1 Μ a 100 μΜ:1 Μ.

15 4. Las vesículas de conformidad con las reivindicaciones 1-3, que se caracterizan porque tienen estructura unilamelar y tamaño medio aproximado entre 25 y 500 nm, preferentemente entre 50 y 300 nm.
5.

Las vesículas de conformidad con las reivindicaciones 1-4, en donde el EGF está incorporado a la bicapa vesicular.
6.

Las vesículas de conformidad con las reivindicaciones 1-5, que se caracterizan porque se obtienen por tecnología de fluidos comprimidos (FC), preferentemente en donde la tecnología de FC incluye un proceso que comprende: a) la preparación de una disolución acuosa de EGF y un surfactante catiónico, preferentemente en donde el

25 surfactante catiónico es de tipo amonio cuaternario, b) la disolución de colesterol, o sus derivados, en un disolvente orgánico expandido con un FC, c) la síntesis de las vesículas mediante la despresurización de la disolución resultante de la etapa b) sobre la disolución resultante de la etapa a).
7. Proceso para la preparación de vesículas que comprenden EGF, un surfactante catiónico y colesterol, o sus derivados, que se caracteriza porque comprende: a) la preparación de una disolución acuosa de EGF y un surfactante catiónico, preferentemente en donde el surfactante catiónico es de tipo amonio cuaternario, b) la disolución de colesterol o sus derivados en un disolvente orgánico expandido con un FC, preferentemente

35 en donde el disolvente se selecciona del grupo que consiste en alcoholes monohídricos, alcoholes polihídricos, cetonas, etilendiamina, acetonitrilo, acetato de etilo y mezclas de estos, preferentemente en donde el FC es un compuesto seleccionado de dióxido de carbono, etano, propano, hidroclorofluorocarbonos e hidrofluorocarbonos, c) la síntesis de las vesículas mediante la despresurización de la disolución resultante de la etapa b) sobre la disolución resultante de la etapa a).
8. El proceso de conformidad con la reivindicación 7, en donde la relación entre la cantidad del FC y el disolvente orgánico corresponde a una proporción molar aproximada de FC de 0,3 a 0,95, preferentemente 0,5 a 0,8.

45 9. El proceso de conformidad con la reivindicación 7 u 8, en donde la disolución del colesterol, o sus derivados, en un FC se realiza en un reactor a una presión aproximada de 1 a 30 MPa, y una temperatura aproximada de 10 a 70 °C, preferentemente entre 10 y 50 °C.
10.

El proceso de conformidad con las reivindicaciones 7-9, en donde el EGF se disuelve en una solución acuosa que contiene un surfactante catiónico cuya concentración se encuentra por encima de su concentración micelar crítica.
11.

Composición farmacéutica que se caracteriza porque comprende las vesículas de conformidad con cualquiera

de las reivindicaciones 1-6, y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. 55
12.

La composición de conformidad con la reivindicación 11, para su administración por vía sistémica, intralesional, mucosal, tópica, transdérmica, oftálmica, o como una formulación inhalada.
13.

Las vesículas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para usar como un medicamento.
14.

Las vesículas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, para usar en el tratamiento de heridas complejas de tejidos blandos periféricos.
15. Las vesículas para usar de conformidad con la reivindicación 14, en donde la herida compleja es una úlcera de 65 pie diabético, una úlcera venosa, una úlcera de decúbito o una quemadura.
16.

Las vesículas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para usar en el tratamiento de la dificultad respiratoria del adulto.
17.

Las vesículas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, para usar en el tratamiento de

5 lesiones del tubo digestivo, preferentemente para usar en el tratamiento de mucositis, colitis ulcerativa, úlceras duodenales, o colitis distal.
18. Las vesículas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, para usar en el tratamiento de

lesiones oculares. 10
19.

Producto cosmético que comprende las vesículas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, y al menos un excipiente.
20.

El uso de las vesículas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, para la fabricación de un

15 producto cosmético, preferentemente en donde el producto cosmético es un producto para prevenir la senescencia y el envejecimiento de la piel.