CN104678016A - 一种采用高效液相色谱测定苯并芘在吸烟后大鼠肺部沉积量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种采用高效液相色谱测定苯并芘在吸烟后大鼠肺部沉积量的方法，包括以下五个步骤：1）大鼠吸烟、2）待测样品溶液的制备、3）标准工作溶液的制备、4）色谱条件和5）标准曲线绘制及结果计算。本发明建立了一种采用高效液相色谱测定苯并芘在吸烟后大鼠肺部沉积量的检测方法，具有以下优点：1.由吸烟机吸烟产生卷烟烟气，能检测不同卷烟不同抽吸模式下对苯并芘在大鼠肺部沉积，运用灵活。2.本实验相对传统的采用索氏提取法，采用环己烷萃取-二甲基亚砜反萃取-环己烷萃取的方式使样品处理时间大大缩短，且操作方便。3.本发明的方法灵敏度高，重复性及回收率好。

Description

一种采用高效液相色谱测定苯并芘在吸烟后大鼠肺部沉积量的方法

技术领域

本发明涉及烟气化合物生物检验技术领域，具体为一种采用高效液相色谱测定苯并芘在吸烟后大鼠肺部沉积量的方法。

背景技术

苯并芘(Benzo(a)pyrene，B(a)P)不但广泛存在于自然环境中，而且是卷烟烟气中最重要的有害物质。我国是世界上吸烟人数最多的国家，且出现年轻化的趋势，男性吸烟率已达63%，尽管我国女性吸烟率只有3.8%，但是一半以上有明显的被动吸烟史，因此探讨卷烟烟气中苯并芘对人类呼吸系统的影响具有重要的临床意义。研究显示多种肺部疾病与苯并芘的毒理作用密切相关，其毒理作用主要表现在以下两方面：一方面其终代谢产物二氢二醇环氧苯并芘(BPDE)能与DNA形成加合物引起DNA损伤：另一方面，B(a)P代谢过程中产生的大量活性氧，造成细胞的氧化损伤。既往对B(a)P在呼吸系统疾病影响的研究大多集中在BPDE-DNA的形成进而诱导肺癌发生的分子机制上，而对B(a)P在呼吸道上皮细胞造成氧化损伤后细胞抗氧化酶的变化规律方面研究较少。建立一种吸烟后B(a)P肺部沉积的检测方法将为深入研究吸烟与肺部危害提供良好的技术支持手段，目前尚无报道有关吸烟后B(a)P肺部沉积的检测方法的研究。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明的目的是在现有技术状况下提供一种采用高效液相色谱测定苯并芘在吸烟后大鼠肺部沉积量的方法。本方法提供的检测方法，具有模拟人吸烟，仅口鼻暴露，苯并芘萃取操作时间短等优点。

为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种采用高效液相色谱测定苯并芘在吸烟后大鼠肺部沉积量的方法，该方法包括以下步骤：

1）大鼠吸烟：SD大鼠置于慧荣和大鼠口鼻暴露系统中，维持载气流量8L/min，抽气流量9.5L/min，氧气浓度20±0.5%，温度24±2 oC，相对湿度60-80%；卷烟采用国际标准模式进行抽吸，连续吸烟20支，吸烟结束后1小时内处死大鼠，取肺组织冻存于-70 oC；

2）待测样品溶液的制备：取1g肺组织于4mL EP管中，同时加入1g无水硫酸钠；加入2mL环己烷，匀浆；将匀浆转移至10mL离心管中，并用环己烷洗涤EP管，合并环己烷至离心管中；，超声10min；离心，3500rpm，2min；收集上清液于50mL鸡心瓶中，残渣用10mL环己烷重提2次，合并环己烷提取液；旋蒸浓缩至1mL，备用；将上述浓缩液转移至分液漏斗中，用环己烷清洗鸡心瓶，合并环己烷，保持总体积5mL；分别用5、3、2mL DMSO萃取3次，取分液漏斗下层DMSO层，收集合并于另一个分液漏斗中，待进一步纯化处理；向上述DMSO萃取液中加入15mL 2.0g/L无水硫酸钠溶液，然后每次用5mL环己烷反萃取3次，保留上层的环己烷层，合并于20mL刻度试管中；氮气吹干，用甲醇溶解残渣，定容至1mL，过0.45μm滤膜，待测；

3）标准工作溶液的制备：准确称取2mg苯并芘溶于1ml甲醇中，配制成2000ng/ml标准品母液，待测前24小时内直接用甲醇稀释成浓度为10，5，2，1，0.8，0.4ng/ml的标准工作溶液，避光保存待用；

4）色谱条件：色谱柱：BP-C18柱，250mm*4.6mm；流动相：乙腈：水=88:12；流速：1.2mL/min；荧光检测激发波长：384nm，发射波长：406nm，柱温：30℃，进样量：50μL；

5）标准曲线绘制及结果计算：将配制好的不同浓度的苯并芘标准工作溶液引入高效液相色谱仪，以外标法进行定量分析，标准品的苯并芘的色谱峰面积与其相应的浓度进行线性回归分析，得到标准曲线线性回归方程，相关系数需大于等于0.999；对制备的样品进行测定，测得样品中苯并芘的峰面积，代入一元线性回归方程，计算得到待测样品中苯并芘的含量。

本发明建立了一种采用高效液相色谱测定苯并芘在吸烟后大鼠肺部沉积量的的检测方法，具有以下优点：

1.大鼠仅口鼻吸烟，避免卷烟有害物质经粘膜或大鼠舔毛等方式进入，更加准确。

2.由吸烟机吸烟产生卷烟烟气，能检测不同卷烟不同抽吸模式下对苯并芘在大鼠肺部沉积，运用灵活。

3.卷烟烟气经载气进行暴露，能更好的模拟人吸烟过程中的吸烟和吐烟的实际过程。

4. 本实验相对传统的采用索氏提取法，采用环己烷萃取-二甲基亚砜反萃取-环己烷萃取的方式使样品处理时间大大缩短，且操作方便。

5. 本发明方法的检测限和定量限分别为0.064ng/g和0.213ng/g，3个加标水平的平均回收率在93-103%，RSD为3-7%，这表明该方法灵敏度高，重复性及回收率好。

附图说明

图1为苯并芘标准工作溶液的色谱图。

图2为吸烟大鼠肺萃取后样本的色谱图。

具体实施方式

建立高效液相色谱检测吸烟后大鼠肺部苯并芘含量的方法。大鼠口鼻吸烟，卷烟样品为市售某焦油含量为11mg卷烟，采用国际标准模式抽吸，分别吸烟10支及20支。吸烟结束后，处死大鼠，取肺组织匀浆，用二甲基亚砜和环己烷萃取方式萃取，浓缩，采用C18反向柱，乙腈和水为流动相，荧光检测器检测苯并芘含量。

1.    主要仪器与试剂

主要仪器：电子天平：上海天平仪器厂，FA1104型 ；高效液相色谱仪：岛津LC-20；色谱柱：BP-C18柱（250mm*4.6mm）；冷冻离心机：Thermo，ST16R；旋蒸仪：南京科尔，G2100。

试剂：SUPELCO，批号：LB95135V；待测卷烟：浙江中烟工业有限责任公司提供；环己烷，二甲基亚砜，甲醇均为Sigma色谱纯。

实验动物：SD 260g-300g，雌性，购于上海斯莱克，合格证号：2011001613866。

2. 柱子型号及色谱条件

色谱柱：BP-C18柱（250mm*4.6mm）；流动相：乙腈：水=88:12；流速：1.2mL/min；荧光检测激发波长：384nm，发射波长：406nm，柱温：30oC，进样量：50μL

3. 标准工作溶液的制备

准确称取2mg苯并芘溶于1ml甲醇中，配制成2000ng/ml标准品母液，待测前24小时内直接用甲醇稀释成浓度为10，5，2，1，0.8，0.4ng/ml的标准工作溶液，避光保存待用。

4. 标准工作曲线及结果计算

将配制好的不同浓度的苯并芘标准工作溶液进样离子色谱，以外标法进行定量分析，将目标样本苯并芘的色谱峰面积与其相应的浓度进行线性回归分析，得到标准曲线线性回归方程，相关系数需大于等于0.999。对制备的待测样品进行测定，测得样品中苯并芘的峰面积，代入一元线性回归方程，计算得到待测样品中氨的含量。每进行20次样品测定后，需加入一个中等浓度的标准溶液控制样，如测定值与原值相对偏差超过5%，则应重新进行标准曲线的制作。

5. 大鼠吸烟：SD大鼠置于慧荣和大鼠口鼻暴露系统中，维持载气流量8L/min，抽气流量9.5L/min，氧气浓度20±0.5%，温度24±2 oC，相对湿度60-80%。卷烟采用国际标准模式进行抽吸，连续吸烟20支，吸烟结束后1小时内处死大鼠，取肺组织冻存于-70 oC。

6.待测样品溶液的制备：取1g肺组织于4mL EP管中，同时加入1g无水硫酸钠；加入2mL环己烷，匀浆；将匀浆转移至10mL离心管中，并用环己烷洗涤EP管，合并环己烷至离心管中；（环己烷总体积控制在10mL以内），超声10min；离心，3500rpm，2min；收集上清液于50mL鸡心瓶中，残渣用10mL环己烷重提2次，合并环己烷提取液；旋蒸浓缩至1mL左右，备用；将上述浓缩液转移至分液漏斗中，用环己烷清洗鸡心瓶，合并环己烷，保持总体积5mL左右；分别用5、3、2mL DMSO萃取3次，取分液漏斗下层DMSO层，收集合并于另一个分液漏斗中，待进一步纯化处理；向上述DMSO萃取液中加入15mL 2.0g/L无水硫酸钠溶液，然后每次用5mL环己烷反萃取3次，保留上层的环己烷层，合并于20mL刻度试管中；氮气吹干，用甲醇溶解残渣，定容至1mL，过0.45μm滤膜，待测。

7. 样品测定

取吸烟后大鼠肺，经前处理后进高效液相色谱仪检测，吸烟10支和20支的含量分别为2.188ng/g和1.453ng/g。

8. 线性范围及方法检测限，定量限及回收率。

苯并芘的标准工作溶液浓度范围为：0.4-10 ng/mL。在线性范围内标准工作曲线方程为：y=2×10^-6x + 0.2808，相关系数大于0.999，表明该方法线性关系良好。

将本方法所配苯并芘标准工作溶液最低浓度平行测定5次，取信噪比的3倍和10倍分别作为检测限和定量限，分别为0.064ng/g和0.213ng/g，3个加标水平的平均回收率在93.3-103.4%，RSD为3-7%，这表明该方法灵敏度高，重复性及回收率好。表明本发明方法灵敏度高，具有较好的检测限和定量限，可完全满足吸烟后苯并芘在大鼠肺部沉积量的测定要求。本发明能有效检测吸烟大鼠肺组织中苯并芘沉积量，操作方便、简单易行，解决了吸烟大鼠肺组织中苯并芘的快速测定，填补了目前吸烟大鼠肺组织中苯并芘测定的空白。

Claims (1)

1.一种采用高效液相色谱测定苯并芘在吸烟后大鼠肺部沉积量的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

1）大鼠吸烟：SD大鼠置于慧荣和大鼠口鼻暴露系统中，维持载气流量8L/min，抽气流量9.5L/min，氧气浓度20±0.5%，温度24±2 oC，相对湿度60-80%；卷烟采用国际标准模式进行抽吸，连续吸烟20支，吸烟结束后1小时内处死大鼠，取肺组织冻存于-70 oC； 

2）待测样品溶液的制备：取1g肺组织于4mL EP管中，同时加入1g无水硫酸钠；加入2mL环己烷，匀浆；将匀浆转移至10mL离心管中，并用环己烷洗涤EP管，合并环己烷至离心管中；，超声10min；离心，3500rpm，2min；收集上清液于50mL鸡心瓶中，残渣用10mL环己烷重提2次，合并环己烷提取液；旋蒸浓缩至1mL，备用；将上述浓缩液转移至分液漏斗中，用环己烷清洗鸡心瓶，合并环己烷，保持总体积5mL；分别用5、3、2mL DMSO萃取3次，取分液漏斗下层DMSO层，收集合并于另一个分液漏斗中，待进一步纯化处理；向上述DMSO萃取液中加入15mL 2.0g/L无水硫酸钠溶液，然后每次用5mL环己烷反萃取3次，保留上层的环己烷层，合并于20mL刻度试管中；氮气吹干，用甲醇溶解残渣，定容至1mL，过0.45μm滤膜，待测；

3）标准工作溶液的制备：准确称取2mg苯并芘溶于1ml甲醇中，配制成2000ng/ml标准品母液，待测前24小时内直接用甲醇稀释成浓度为10，5，2，1，0.8，0.4ng/ml的标准工作溶液，避光保存待用；

4）色谱条件：色谱柱：BP-C18柱，250mm*4.6mm；流动相：乙腈：水=88:12；流速：1.2mL/min；荧光检测激发波长：384nm，发射波长：406nm，柱温：30℃，进样量：50μL；

5）标准曲线绘制及结果计算：将配制好的不同浓度的苯并芘标准工作溶液引入高效液相色谱仪，以外标法进行定量分析，标准品的苯并芘的色谱峰面积与其相应的浓度进行线性回归分析，得到标准曲线线性回归方程，相关系数需大于等于0.999；对制备的样品进行测定，测得样品中苯并芘的峰面积，代入一元线性回归方程，计算得到待测样品中苯并芘的含量。