CN104643057A - 含有对映体牛尿酚的组合物和产物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于制备商品食物和护肤品的组合物，所述组合物包含S-牛尿酚，或R-牛尿酚，或其混合物，包括S-牛尿酚和R-牛尿酚的非外消旋混合物和外消旋混合物，所述组合物可用于制备商品例如食品添加剂、药物和药剂。所述组合物可用于将S-牛尿酚递送到哺乳动物以预防或治疗疾病或相关病情的方法中，所述疾病或病情例如激素依赖的疾病或病情，例如心血管疾病，脂质疾病，骨质减少，骨质疏松，肝脏疾病和急性卵巢雌激素缺乏。所述S-牛尿酚对映体可由生物体对异黄酮的代谢在生物合成中产生。

Description

含有对映体牛尿酚的组合物和产物及其用途
本申请是中国发明申请(发明名称：含有对映体牛尿酚的组合物和产物及其用途；申请号：201010156015.9；申请日：2003.07.24)的分案申请。
技术领域
本发明涉及对映体牛尿酚(equol)化合物，即S-牛尿酚和R-牛尿酚的制备和分离，以及含有对映体牛尿酚化合物的食物和药物，所述食物和药物用于治疗哺乳动物和人类的疾病和病情。
背景技术
大豆和由纯化大豆蛋白制备的食物的营养价值是众所周知的，而再次对大豆食物产生兴趣主要是对异黄酮的潜在健康益处的证明研究的结果，其中异黄酮是大豆中富含的一类植物雌激素。尽管最近FDA许可大豆食物制造商可声称每份含至少6.25g大豆蛋白的大豆食物有利心脏健康(FDA，1999)，这还是没有认识到大豆中异黄酮组分的价值，现在的研究表明植物雌激素具有降低胆固醇的作用，同时还具有有助于降低心血管危险因子的重要非类固醇性质。经常食用大豆的亚洲国家的激素依赖性疾病的低发病率据称部分是由于大豆异黄酮的作用。
植物雌激素，尤其是来自大豆，三叶草和野葛(kudzu)的异黄酮，例如染料木素(genistein)、葛根黄豆苷元(daidzein)、黄豆黄素(glycitein)、peurarin及其糖苷衍生物、鸡豆黄素(biochanin)A和芒柄花黄素(formononetin)，及其糖苷衍生物，在一些哺乳动物和人组织中显示雌激素的性质，并在其它组织中通过在雌激素受体位点竞争性抑制雌激素结合而显示抗-雌激素的性质。和雌激素不同，这些异黄酮植物雌激素似乎与乳腺癌和子宫癌的危险增高无关，并实际上可抑制乳腺癌和前列腺癌的发病。
心血管疾病是发病率和死亡率的主要病因，特别在美国和西欧国家更是如此。数种致病因子参与心血管疾病的发病，包括对该疾病的遗传素因、性别、生活方式因子例如吸烟和饮食、年龄、高血压、高脂血症，包括高胆固醇血症。数种这些因子，尤其是高脂血症和高胆固醇血症，导致动脉硬化的发病，而动脉硬化是血管和心脏疾病的主要病因。
高血胆固醇浓度是人类血管疾病和冠心病的关键危险因子之一。升高的低密度脂蛋白胆固醇(下文称"LDL-胆固醇")和总胆固醇与冠心病危险增高直接相关(Cholesterol and Mortality:30Years of Follow-Up from theFramingham Study,Anderson,Castelli，&Levy，JAMA，Vol.257，pp.2176-80(1987))，而低水平的高密度脂蛋白胆固醇(下文称"HDL-胆固醇")也是诱病因子。数个临床实验支持HDL-胆固醇对动脉硬化的保护作用。研究还显示，妇女的血HDL-胆固醇每增加1-mg/dL，冠状血管疾病的危险性就降低3％(High-density Lipoprotein Cholesterol and Cardiovascular Disease:FourProspectiveAmerican Studies,Gordon,Probstfield,and Garrison et.al.,Circulation,Vol.79,pp.8-15(1989))。
雌激素在调节脂质代谢和保持血管健康方面起重要作用，正如绝经后血浆胆固醇增加，以及在美国和大多数西方国家中死于心血管疾病的妇女多于男子这一事实可证明。为此，一直相信HRT能通过预防CVD来使绝经后妇女受益。最近对16,608名以上绝经后坚持HRT 8年以上的妇女进行的妇女健康初步研究(Women's Health Initiative Study)没有显示这种益处，并且实际上发现由于血栓栓塞和心脏疾病导致的死亡危险增加，尤其是在联用雌激素和孕激素的第一年中，同时乳腺癌的危险性显著增加。由于这些报道的结果，HRT使用急剧减少，而且现在妇女不断地寻找雌激素的替代形式来改善绝经后雌激素缺乏。植物雌激素如异黄酮通过与雌激素受体的构象结合而起到天然选择性雌激素受体调节物的作用，是潜在有吸引力的替代物，并且虽然公开了很多大豆或三叶草异黄酮的用途，但是关于重要的代谢物质牛尿酚的潜在价值只有很少的数据。
最近研究表明，大豆异黄酮对于降低动物内血总胆固醇和LDL-胆固醇浓度有重要作用，从而抑制动脉硬化发病。异黄酮对人血胆固醇水平的作用更加有争议，但数项研究现在表明需要大豆中存在异黄酮来观察到胆固醇-降低作用。Crouse等人的重要研究显示，血清总胆固醇和LDL-胆固醇和大豆蛋白中的异黄酮量之间的剂量依赖关系。与异黄酮可具有胆固醇自身平衡的作用无关，有证据显示异黄酮对血管具有重要影响。研究已显示脂质过氧化减少，动脉活性、血流和血压的改善，以及血小板聚集的降低。我们最近发现，包含异黄酮的每日饮食可降低C-反应性蛋白的水平，所述蛋白是炎症的重要标志物，并被认为是心血管疾病的加速因子之一。所有上述内容都是重要的心血管疾病危险性降低因子。
异黄酮显示对减少骨质损失的作用(bone-sparing effect)。目前的17项体外培养骨细胞研究，24项绝经后骨质疏松动物模型的体内研究，以及17项饮食干预研究显示，异黄酮具有减少骨质损失的作用。在所有这些研究中都检验大豆异黄酮或三叶草异黄酮。我们首次表明，牛尿酚是重要的骨质营养因子，与雌激素不同，它对绝经后妇女不仅具有降低骨再吸收细胞的活性的能力，实际上还具有增加骨盐密度的作用。
尽管大量科学文献关注大豆或三叶草中的天然异黄酮，很少有报道关于它们的肠来源代谢物的作用和效果，并仍需要进一步发展能在哺乳动物和人中安全提供治疗或预防作用的化合物和方法。
1932年，非类固醇雌激素牛尿酚(7-羟基-3-(4'-羟基苯基)-苯并二氢呋喃(chroman))首次从怀孕的母牛尿液中分离并鉴定，并随后在食用大豆食物的人的尿中鉴定。牛尿酚的结构类似于类固醇雌激素雌二醇(estradiol)。牛尿酚在异黄酮类物质中是独特的，这是因为它具有手性中心，并因此以两种不同的对映体形式即R-和S-对映体形式而存在。以前对牛尿酚的所有研究似乎都利用牛尿酚的外消旋形式进行的。通常对两种形式的牛尿酚的存在缺乏认识，并且就我们的知识而言，对于单个对映体的具体作用或活性尚未有过报道。当牛尿酚最初在母牛的尿中鉴定时，据报道其是光学活性的，以R-对映体而存在。随后，发现这是错误的，并有证据表明从马尿中分离的牛尿酚形式实际上是S-对映体。我们第一次证明了人肠中产生的牛尿酚形式只是S-对映体，且我们合成并分离了独立的对映体，并显示了它们对雌激素受体(ER)即ERα和ERβ的亲合力有明显差异。
虽然最初发现将大剂量的牛尿酚注射到卵巢切除后的小鼠时，牛尿酚没有显示雌激素作用，后来的发现显示它是造成绵羊的不育综合症的原因。
最初也报道过(-)牛尿酚在卵巢切除后的小鼠中不具有雌激素活性，但随后证实牛尿酚的外消旋混合物作为弱雌激素起作用，而其前体，葛根黄豆苷元和芒柄花黄素没有或具有可忽略的雌激素活性。
牛尿酚不通常存在于大多数健康成人的尿中，除非他们吃了大豆。牛尿酚在体内的形成仅依赖于肠道微生物区系，这可从以下的发现证实：无细菌的动物不分泌牛尿酚，以及在从出生起就仅喂给大豆食物的新生婴儿的血浆和尿中没有发现牛尿酚。
牛尿酚完全是一种不天然存在于任何基于植物的产物中的非类固醇雌激素。
发明内容
本发明涉及用于制备商业产品的组合物，其包含S-牛尿酚。
优选地，所述组合物通过从S-牛尿酚和R-牛尿酚的外消旋混合物中分离S-牛尿酚制备。
优选地，所述组合物主要由S-牛尿酚组成，并且对映体纯度为90％最小对映体过量(EE)，更优选为96％最小EE，甚至更优选为98％最小EE。
本发明还涉及用于制备商业产品的组合物，其包含R-牛尿酚。
优选地，其中所述组合物主要由R-牛尿酚组成，并且对映体纯度为90％最小对映体过量(EE)，更优选为96％最小EE，甚至更优选为98％最小EE。
本发明还涉及商业制品，其包含S-牛尿酚和R-牛尿酚的非外消旋混合物。
优选地，其中所述非外消旋混合物包含比例为约1:99到约49:51的S-牛尿酚与R-牛尿酚，或约51:49到约99:1的S-牛尿酚与R-牛尿酚。
优选地，其中所述商业制品包括食品。
优选地，其中所述牛尿酚的非外消旋混合物是通过将选自S-牛尿酚和R-牛尿酚的第一牛尿酚组分和由S-牛尿酚和R-牛尿酚的外消旋混合物组成的第二牛尿酚组分混合制成的。
本发明还涉及食品组合物，其包含添加剂组分，所述添加剂组分选自S-牛尿酚，R-牛尿酚，以及S-牛尿酚和R-牛尿酚的非外消旋混合物。
优选地，其中所述食品每份包括至少约1mg，至多约300mg的S-牛尿酚，更优选至少约10mg，至多约200mg的S-牛尿酚，并甚至更优选至少约30mg，至多约50mg的S-牛尿酚。
本发明还涉及局部用于皮肤的组合物，其包含添加剂组分，所述添加剂组分选自S-牛尿酚，R-牛尿酚，以及S-牛尿酚和R-牛尿酚的非外消旋混合物。
优选地，所述局部用于皮肤的组合物，优选为油膏、液体或乳液的形式，所述组合物包含S-牛尿酚和赋形剂，其中S-牛尿酚为所述组合物重量的至少0.1％，至多10％。
优选地，其中所述S-牛尿酚在C-4'或C-7位置偶联以形成选自下组的偶联物：葡糖苷酸、硫酸酯、乙酸酯、丙酸酯、葡糖苷、乙酰-葡糖苷、丙二酰-葡糖苷及其混合物。
本发明还涉及将牛尿酚的外消旋混合物分离成第一和第二对映体的方法，包括以下步骤：(1)提供包含牛尿酚的外消旋混合物的组合物；(2)提供包含手性相的HPLC柱；(3)使用流动相，使一定量的所述组合物通过所述HPLC柱的入口，所述流动相包含C3-C7烷烃(alkyl)和C2-C4醇；(4)自通过步骤起第一段时间后，从HPLC柱出口收集包含第一对映体的第一流出物；并(5)自通过步骤起第二段时间后，从柱出口收集包含第二对映体的第二流出物。
具体地，本发明涉及将牛尿酚的外消旋混合物分离成第一和第二对映体的方法，包括以下步骤：
(1)提供包含牛尿酚的外消旋混合物的组合物；
(2)提供包含手性相硅石基质的HPLC柱，优选其中所述硅石基质包含纤维素三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)和纤维素三(4-甲基苯甲酸酯)；
(3)使用流动相，使一定量的所述组合物通过所述HPLC柱的入口，所述流动相包含C3-C7烷烃和C2-C4醇，优选其中所述流动相包含比例为95:5-5:95，甚至更优选为50:50-90:10的己烷:丙醇；
(4)自通过步骤起第一段时间后，从HPLC柱出口收集包含第一对映体的第一流出物；以及
(5)自通过步骤起第二段时间后，从HPLC柱出口收集包含第二对映体的第二流出物。
本发明还涉及进行研究的方法，其中将异黄酮给药人类受试者，并测定该受试者的至少一种生理数据，其包含以下步骤：1)将一定剂量的异黄酮给药至少选定受试组中一个人类受试者2)检测所述受试者的尿中牛尿酚的水平，和3)鉴定所述受试者为牛尿酚产生者还是非-牛尿酚产生者。
具体地，本发明涉及进行研究的方法，其中将异黄酮给药人类受试者，并测定至少一种生理数据，其包含以下步骤：
1)将一定剂量的异黄酮给药至少选定受试组中一个人类受试者，所述异黄酮优选选自葛根黄豆苷元，大豆黄素，染料木素，染料木苷，芒柄花黄素，鸡豆黄素A和peurarin，及其混合物，
2)检测所述受试者的尿中牛尿酚的水平，和
3)鉴定所述受试者为牛尿酚产生者还是非-牛尿酚产生者。
具体地，其中所述生理数据受雌激素活性影响。
优选地，该研究方法还包括选自以下步骤的步骤：(a)区别分析鉴定为牛尿酚产生者的多个受试者的数据和鉴定为非-牛尿酚产生者的多个受试者的数据，和(b)从选定的受试组中排除非-牛尿酚产生者。
本发明还涉及制备包含S-牛尿酚的组合物的方法，包括以下步骤：1)提供第一组合物，其包含能够转化成S-牛尿酚的异黄酮；2)将第一组合物和能将异黄酮转化成S-牛尿酚的生物体一同培养，3)将所述培养组合物温育足够时间，以使部分异黄酮转化成S-牛尿酚。
具体地，本发明涉及制备包含S-牛尿酚的组合物的方法，所述组合物优选选自食品和局部用于皮肤的组合物，包括以下步骤：
1)提供第一组合物，其包含能够转化成S-牛尿酚的异黄酮，其优选选自葛根黄豆苷元、大豆黄素、染料木素、染料木苷、芒柄花黄素、鸡豆黄素A、二氢葛根黄豆苷元、peurarin，其偶联形式，及其混合物，
2)将第一组合物和能将异黄酮转化成S-牛尿酚的生物体一同培养，
3)将所述培养组合物温育足够时间，以使部分异黄酮转化成S-牛尿酚，和
4)任选失活所述生物体。
优选地，上述方法中，其中所述生物体选自粪肠球菌，植物乳杆菌菌株，威氏利斯特氏菌，从已知为“牛尿酚产生者”的哺乳动物的肠道分离的各种生物体的混合培养物、脆弱拟杆菌、乳酸双歧杆菌、粘液真杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、单核细胞增生利斯特氏菌、藤黄微球菌、费氏丙酸杆菌、Sacharomyces boulardii、乳酸乳球菌、屎肠球菌和唾液乳杆菌，及其混合物。
本发明还涉及制备包含S-牛尿酚的组合物，包括以下步骤：1)提供包含能转化成S-牛尿酚的异黄酮的第一组合物，2)将第一组合物和选自下组的酶结合：从能够将异黄酮转化为S-牛尿酚的细菌中提取的酶，α-葡糖苷酶，β-葡糖苷酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，或果胶酶，及其混合物；和3)将所述混合组合物温育足够的时间以将部分异黄酮转化成S-牛尿酚。
具体地，本发明涉及制备包含S-牛尿酚的组合物，包括以下步骤：
1)提供包含能转化成S-牛尿酚的异黄酮的第一组合物，优选选自葛根黄豆苷元、大豆黄素、染料木素、染料木苷、芒柄花黄素和鸡豆黄素A，
2)将第一组合物和选自下组的酶结合：从能够将异黄酮转化为S-牛尿酚的细菌中提取的酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶或果胶酶，以及
3)将所述混合组合物温育足够的时间以将部分异黄酮转化成S-牛尿酚。
本发明还涉及制备S-牛尿酚产品的方法，包括以下步骤：1)提供包含主要由S-牛尿酚组成的牛尿酚对映体的组合物，所述组合物通过生物体的异黄酮代谢在生物合成中产生；2)从所述组合物提取S-牛尿酚，以形成包含S-牛尿酚的产物，所述提取选自：a)溶剂提取，包括将所述组合物与低分子量醇混合以使得醇和水的比例为至少40:60且不超过95:5，和b)含水酸提取，包括在约4.0-约5.5的pH混合所述组合物；3)将所述提取物浓缩使得固体含量为约15％到约55％；4)将浓缩物稀释到固体含量为约6％到约13％；和5)将所述固体沉淀从稀释的溶液中分离，从而形成S-牛尿酚产物。
在一个优选实施方案中，该方法包括6)任选纯化和/或结晶所述固体沉淀，从而形成S-牛尿酚产物。
本发明还涉及将S-牛尿酚递送给哺乳动物以预防或治疗疾病或相关病情的方法，包括将包含S-牛尿酚或其偶联的类似物(conjugated analog)的组合物给药所述哺乳动物。
本发明还涉及将R-牛尿酚递送给哺乳动物以预防或治疗疾病或相关病情的方法，其包括将包含R-牛尿酚或其偶联的类似物的组合物给药所述哺乳动物。
本发明还涉及用酶水解葡糖苷的方法，包括将所述葡糖苷与来自Helixpomatia在一定条件下接触一段时间，所述条件和时间足以使该葡糖苷转化成相应的糖苷配基。
附图简述
图1显示R-牛尿酚和S-牛尿酚对映体的化学结构。
图2显示将芒柄花黄素和葛根黄豆苷元转化成牛尿酚的化学反应
图3显示通过与Helix pomatia消化液中存在的酶一同温育从大豆细菌水解异黄酮糖苷的速率。
图4显示来自食用大豆的成人的尿样的牛尿酚对映体洗出物与通过光学二向色性表征的纯对映体标准物的比较质谱图。
图5显示对合成牛尿酚的三甲基硅醚(trimethylsilyl ether)衍生物进行的GC-MS分析。
图6显示从外消旋混合物手性分离S-牛尿酚和R-牛尿酚的另一质谱图。
图7显示手性分离的质谱图，所述分离是从培养自“牛尿酚-产生者”的肠细菌对葛根黄豆苷元进行细菌转化产生的温育产物。
图8显示手性分离的质谱图，所述分离是从培养自“非牛尿酚-产生者”的肠细菌对葛根黄豆苷元进行细菌转化产生的温育产物。
图9显示从手性相柱分离并洗脱牛尿酚对映体。
图10显示健康成年妇女在口服给药后体内(±)牛尿酚的血浆出现/消失曲线。
图11显示染料木素和(±)牛尿酚对未成熟大鼠的子宫的雌激素活性。
发明详述
牛尿酚与大多数异黄酮的区别在于其由于缺乏杂环中的双键而具有手性中性。来自大豆、葛根黄豆苷元、黄豆黄素和染料木素、来自三叶草、芒柄花黄素和鸡豆黄素A，以及来自野葛，peurarin的植物雌激素异黄酮都不具有手性中心。图1R-牛尿酚和S-牛尿酚的化学结构。
R-和S-对映体的构象不同，并且预测这将影响牛尿酚如何恰好进入二聚体化ER复合物的腔中的结合位点。许多不同的体外实验系统已经用于比较异黄酮的动情力。与所用实验系统无关，牛尿酚，葛根黄豆苷元和雌二醇对子宫胞苷酸受体的相对摩尔结合亲合力的数据分别为0.4、0.1和1.0。然而这些数据在认识到存在不同的ER亚型以及ERβ的发现之前，因此相对结合亲合力反映对ERα的亲合力(这是由于ERα是子宫内最主要的受体)，并且没有将牛尿酚的对映体形式的可能的结构-活性差异考虑在内
数种植物雌激素包括牛尿酚由于其对ERβ蛋白的优先结合而在许多雌激素样物质中是独特的，并且这解释了大豆异黄酮在表达这种受体亚型的组织中的一些有益作用，所述组织例如骨、脑和血管内皮。最近，将牛尿酚对人ERα和ERβ的结合亲和力与多种其它异黄酮比较。牛尿酚与这两种受体的结合与染料木素类似，但牛尿酚诱导的基因转录比其它任何异黄酮都强，尤其是与ERα结合的时候。有趣的是，这些体外系统中的葛根黄豆苷元显示极低的亲合力和转录活性。
大约50％的牛尿酚以游离或未结合的形式循环，并认为它们比血浆中的游离葛根黄豆苷元(18.7％)或雌二醇(4.6％)的比例高得多。由于未结合的部分可用于进行受体占据，这可有效增强牛尿酚的总效力。此外，R-牛尿酚和S-牛尿酚都通过在体外和体内拮抗二氢睾酮的能力而具有独特的抗雄激素性质，由此扩大了R-牛尿酚作为雄激素相关疾病的潜在药剂的潜在治疗作用。我们预计R-牛尿酚也可作为新型雌激素受体ERβ2的配体，所述受体在调节雌激素受体ERα和ERβ的表达中起作用，并由此证明是治疗或预防乳腺癌以及与这些受体介导的信号途径相关的激素疾病的潜在药剂。R-牛尿酚也具有抗氧化活性。所以当R-牛尿酚不是在胃肠道中对异黄酮摄入而生理产生时，其是目前没有认识到的独特的异黄酮，并可能是重要的药剂。
如实验部分所示，确定牛尿酚的S-对映体仅在食用大豆食物的成年人即“牛尿酚产生者”的尿和血浆中发现。这提示牛尿酚的细菌产生在肠内可能是对映体特异性的，并如实验部分的实验(d)所示，S-牛尿酚是体外培养的人肠细菌所产生的唯一牛尿酚对映体。
含有S-牛尿酚的组合物
本发明的组合物包含S-牛尿酚，并通常主要由S-牛尿酚组成。所述组合物用于制备商业和公共产品(institutional product)。所述组合物或由其制备的产品，可口服食用或局部应用。
所述产物通常包含出售的或实验食品、药物、OTC药物、油膏、液体、乳膏或其它适合局部应用的物质。每份食品组合物可包含至少1mg到200mg的S-牛尿酚。每剂口服给药的药物可包含至少1mg到200mg的S-牛尿酚。
局部应用的产品可包含至少0.1％到10％重量的S-牛尿酚。本发明的局部组合物可包括其它化妆品或药物活性物质和赋形剂。适宜的化妆品和药剂包括但不限于，抗真菌剂、维生素、抗炎剂、抗微生物剂、止痛剂、一氧化氮合酶抑制物、驱昆虫剂、自染色剂(self-tanning agents)、表面活性剂、湿润剂、稳定剂、防腐剂、杀菌剂、稠化剂、润滑剂、保湿剂、鳌合剂、皮肤渗透增强剂、润肤剂、香料和着色剂。
S-牛尿酚也可是牛尿酚偶联物，其在C-4'或C-7位置与以下偶联物偶联：葡糖苷酸、硫酸酯、乙酸酯、丙酸酯、葡糖苷、乙酰-葡糖苷、丙二酰-葡糖苷及其混合物。
用于给药受试者以治疗和/或预防与其相关的疾病，或降低对所述疾病的易患性的组合物或制剂，其也可含本领域抑制的一或多种可药用的佐剂，载体和/或赋形剂，例如Handbook of Pharmaceutical Excipients，secondedition，American Pharmaceutical Association，1994(在此引入作为参考)所述的那些。S-牛尿酚可以片剂、胶囊、用于溶解的粉末、糖浆、食物(例如棒、饼干、点心和其它本领域抑制的标准食品形式)或饮料配制物。饮料可含有调味剂、缓冲液等。
本发明的组合物可包括适合口服，经直肠，经眼，经颊(例如舌下)，经胃肠外(例如皮下，肌肉内，皮内和静脉内)以及透皮给药。在任何情况下最适合的途径取决于被治疗疾病的性质和严重性，以及患者的状态。
本发明还包括商业制品，其包含含有牛尿酚非外消旋混合物的组合物，并通常包含主要由S-牛尿酚组成的牛尿酚。所述商业制品可以是食物，包括软饮料，以及健康或个人护理产品。
通常所述组合物可通过从R-牛尿酚和S-牛尿酚的外消旋混合物(也称(±)牛尿酚)中分离S-牛尿酚对映体来制备。通常所述外消旋混合物是通过合成途径制备的合成外消旋混合物，例如本文所述的混合物。通常，S-牛尿酚组合物中S-牛尿酚的对映体纯度为90％最小对映体过量("EE")。通常，可制备其中的S-牛尿酚具有96％最小EE，甚至具有98％最小EE的更纯的所述组合物。
本发明的组合物也可包含S-牛尿酚和R-牛尿酚的非外消旋混合物，所述混合物具有S-牛尿酚的EE为至少0％到小于90％。具有0％的EE的组合物是两种对映体为50:50的外消旋混合物。所述组合物可直接从外消旋混合物通过从所述外消旋混合物不完全分离和去除R-牛尿酚对映体来制备。所述组合物也可通过将包含含有牛尿酚的非外消旋混合物和外消旋混合物的混合物的第一牛尿酸组分，和包含主要由S-牛尿酚组成的第二组分混合来制备。这样产生的非外消旋组合物具有过量的S-牛尿酚。相反，非外消旋混合物也可被制备成具有过量的R-牛尿酚对映体，所述混合物可通过将包含含有牛尿酚的非外消旋混合物和外消旋混合物的混合物第一牛尿酚组分，与包含主要由R-牛尿酚组成的第二组分混合来制备。根据组合物中S-牛尿酚和R-牛尿酚的具体益处或指示，可制备一种组合物，其中包含的S-牛尿酚和R-牛尿酚的比例为大于约50:50到约99.5:1，更优选约51:49到约99:1，以及从小于约50:50到约1:99.5，更优选约49:51到约1:99。
所述S-牛尿酚组合物可为食品组合物(其也包括软饮料)的添加剂成分。所述食品组合物可包括幼儿食品(probiotic food)、胎儿食品(prebiotic food)或饮食食品。通常所述食品将包含的S-牛尿酚水平为每份至少1mg到约100mg，但更优选为每份5-50mg的S-牛尿酚。
本发明的食品组合物也可包含作为本文所述的(±)牛尿酚的非外消旋混合物的组分的S-牛尿酚。
本发明的示例性组合物可包含一或多种可药用的或工业标准填充物(filler)。所述填充物必须对用所述组合物处理的受试者无害。所述填充物可以是固体和/或液体。所述填充物可和活性S-牛尿酚一起配制为单位剂量，例如片剂，其通常可含有约10％-80％重量的S-牛尿酚。组合物可通过任何已知的制药方法制备，例如混合各种成分，任选包括制药领域已知的赋形剂，稀释剂(例如水)和辅助剂。
适宜口服给药的组合物可存在于分离的单位中，例如胶囊、扁胶囊(cachet)、锭剂或片剂，每种都含有预定量的提取物；作为粉末或颗粒；作为溶液或水性或非水性液体中的悬浮液；或者作为水包油或油包水的乳液。这种组合物可通过任何适宜的制药方法制备，其包括将活性S-牛尿酚与一或多种适宜的载体(其可包含一或多种上述附加成分)接触的步骤。通常，本发明的组合物的制备可通过将S-牛尿酚与液体和/或微粒化的固体载体均匀且密切地混合，并随后如必要使产生的混合物成型来进行。例如，片剂可通过包含或模制(moulding)含有所述提取物的粉末或颗粒以及任选的一或多种附加成分来制备。压缩的片剂可通过将粉末或颗粒形式的提取物在适宜的机器中压制来制备，所述提取物任选与粘合剂，润滑剂，惰性稀释剂，和/或表面活性剂/分散剂混合。模制的片剂可通过在适宜的机器中对用惰性液体粘合剂湿润的粉末状化合物进行模制来制备。
适宜的填充剂包括，例如糖(如乳糖，蔗糖，甘露醇或山梨醇)，纤维素制备物和/或磷酸钙(例如磷酸三钙或磷酸氢钙)，粘合剂(例如淀粉浆糊，所述淀粉浆糊利用例如玉米，小麦，大米或马铃薯淀粉，明胶，西黄蓍胶，甲基纤维素和/或聚乙烯吡咯烷酮)，并且如需要可包含崩解物(例如上述淀粉，以及羧甲基淀粉，交联的聚乙烯吡咯烷酮，琼脂或褐藻酸或其盐，例如褐藻酸钠)。赋形剂可以是流动调节剂和润滑剂，例如硅酸，滑石，硬脂酸或其盐，例如硬脂酸镁或钙，和/或聚乙二醇。对糖丸核心可提供适宜并任选的肠溶性包衣，所述包衣可使用包含阿拉伯树胶(gum Arabic)、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇和/或二氧化钛的浓缩糖溶液，或者适当的有机溶剂或溶剂混合物中的包衣液，或者用于制备肠溶性包衣的适宜纤维素制备物(如乙酰纤维素邻苯二甲酸酯或者羟基丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯)的溶液。染料或色素可加入片剂或糖丸包衣中，例如用于鉴定的目的或表明活性成分的不同剂量。
其它可口服给药的药物组合物是由例如明胶制备的干充填(dry-filled)胶囊，以及由明胶和增塑剂如甘油或山梨醇制备成的密封软胶囊。干充填胶囊可包含颗粒形式的提取物，例如与填充物以及适当的稳定剂混合，所述填充物例如乳糖，粘合剂如淀粉和/或glicants(例如滑石或硬脂酸镁)。在软性胶囊中，所述提取物优选溶解或悬浮于适宜的液体中，例如脂肪油类，石蜡油，或液体聚乙二醇，所述液体中也可加入稳定剂。
为对食物进行营养强化(fortification)，将S-牛尿酚与多种食物或食物成分混合，所述食物包括谷类、酸奶、豆奶、汤、奶酪、面食、酱(spread)、糖棒(candy bar)、运动食物棒(sports bar)、饮料或饮食食物。
适宜经颊(舌下)给药的制剂包括：锭剂，其包含位于有味道的基质(通常为蔗糖和阿拉伯树胶或者西黄蓍胶)中的提取物；和软锭剂(pastille)，其包含位于惰性基质例如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯树胶中的化合物。
适宜直肠给药的配制剂优选为单位剂量的栓剂。这些可通过将异黄酮与一或多种常用固相载体如可可油(cocoa butter)混合，随后使产生的混合物成型来制备。
含有R-牛尿酚的组合物
本发明的组合物可包含R-牛尿酚，并通常主要由R-牛尿酚组成。所述组合物用于制备商业和公共产品。所述组合物，或者由其制成的产物或商业制品，可口服使用或局部应用。
所述产物可包含本发明上述的任何与S-牛尿酚相关的产品，其中R-牛尿酚的剂量水平和组合物水平与对S-牛尿酚所述的相同。
所述R-牛尿酚也可是牛尿酚偶联物，其在C-4'或C-7位置与选自葡糖苷酸、硫酸酯、乙酸酯、丙酸酯、葡糖苷、乙酰-葡糖苷、丙二酰-葡糖苷，或其混合物的偶联物偶联。
包含R-牛尿酚的组合物或制备物也可包含一或多种可药用的佐剂，载体和/或赋形剂，并且是如上述与S-牛尿酚相关的产物的形式，所述组合物或制备物给药受试者以治疗和/或预防疾病和相关病情，或者用于降低对所述疾病和相关病情的易患性。
所述组合物通常可通过从R-牛尿酚和S-牛尿酚的外消旋混合物分离R-牛尿酚对映体来制备，如上文对S-牛尿酚的相关叙述。
鉴定牛尿酚产生者和非-牛尿酚产生者
健康成人中利用[13C]葛根黄豆苷元和[13C]染料木素示踪物进行的研究明确表明，牛尿酚从葛根黄豆苷元而不是从染料木素形成。水解来自大豆的葛根黄豆苷元糖苷偶联物，以及甲氧基化的异黄酮芒柄花黄素或在三叶草中所发现的其糖苷偶联物以后，形成了牛尿酚。在所有情况下，所述反应通过二氢中间体继续，如图2所示。一旦形成，牛尿酚显示为代谢惰性，除了阶段Ⅱ代谢或肝中的较小程度的另外的羟基化作用，其不经过任何进一步的生物转化。对于葛根黄豆苷元和染料木素而言，最主要的阶段II反应是葡糖醛酸化(glucuronidation)，以及很小程度的硫酸盐化作用。最初发现牛尿酚存在于尿液是大豆食物消化的功能以后，观察到即使每天用大豆食物攻击，大约50-70％的成年人群的尿中也不分泌牛尿酚，而原因不明确。此外，即使给予纯异黄酮化合物，由此去除食物基质的任何影响，显示许多人不将葛根黄豆苷元转化成牛尿酚。这一现象导致将人定义为“牛尿酚-产生者”或“非-牛尿酚产生者”(或“牛尿酚-产生较少者”)来描述这两种不同的人群。
根据经验产生截断值，使得个体分配到这些种类之一中。血浆牛尿酚浓度低于10ng/mL(40nmol/L)的人可被分类为“非-牛尿酚产生者”，而血浆牛尿酚浓度高于10ng/mL(40nmol/L)的人称为“牛尿酚产生者”。这一区分也可从尿中的水平获得，牛尿酚产生者排尿的牛尿酚高于1000nmol/L。尽管牛尿酚的排出在个体中高度可变，可产生牛尿酚以及不能产生牛尿酚的人之间有很大差别，这与催化该反应的酶动力学中的前体-产物关系一致。因此尿中的葛根黄豆苷元和牛尿酚水平之间存在相反关系(reverse relationship)，并因此没有发现明显的性别差异。
作为牛尿酚产生者或非-牛尿酚产生者的个体的状态对于招募用于评估异黄酮(尤其是葛根黄豆苷元，染料木素，芒柄花黄素和鸡豆黄素A)给药的临床研究受试者很重要。例如，进行的许多骨和大豆饮食研究都有可变的结果。使用骨转化(bone-turnover)的替代型标志物进行的12周以下的短期研究表明，当饮食中包含含异黄酮的大豆食物时，骨转化降低，所述标志物例如尿吡啶啉和脱氧吡啶啉(deoxypyrodinoline)交联，血浆/血清骨钙蛋白，碱性磷酸酶，和IGF-1。据报道多个为期9个月以下的临床研究显示对减少骨质损失的作用(bone-sparing effect)。所有研究都在各个位点都测定到骨盐密度(BMD)改变，并且所述结果与四个中有两个没有显示任何影响相矛盾。在除一项研究以外的所有研究中，没有意图限定牛尿酚的状态。在所述的一项研究中，发现当牛尿酚产生者使用大豆食物两年以上时，其BMD明显增加。因此，基于我们的数据，牛尿酚是骨营养剂(bone-trophic agent)，并因此将个体鉴定为“牛尿酚产生者”具有治疗含义，而递送牛尿酚将对防止骨质损失和增加骨形成有益。
本发明包括进行研究的方法，其中将异黄酮给药人类受试者并测定至少一种生理数据，包括以下步骤：1)将一定剂量的牛尿酚前体异黄酮给药至少选定受试组中一个人类受试者；2)检测所述受试者的尿或血中牛尿酚的水平，和3)鉴定所述受试者为牛尿酚产生者或非-牛尿酚产生者。所述生理数据通常可被异黄酮的雌激素活性影响。将受试者鉴定为牛尿酚产生者或非-牛尿酚产生者后，可清楚地分析从研究收集的数据，从而获自一或多个鉴定为牛尿酚产生者的数据和来自一或多个鉴定为非牛尿酚产生者的数据可被收集，分离，分析或报道。鉴定为牛尿酚产生者或非-牛尿酚产生者的个体可从研究受试组中排除(或包括在内)。
牛尿酚的化学合成
在该过程中，使用标准化学处理氢化杂环的双键并用来去除位置C-3上的羰基。常用起始物质是异黄酮，例如葛根黄豆苷元、染料木素、黄豆黄素、peurarin、芒柄花黄素和鸡豆黄素A及其糖苷偶联物。任何偶联形式将通过上述定义的水解还原成其糖苷配基。该反应的适宜溶剂包括有机酸，例如冰醋酸，低级醇例如异丙醇，及其混合物。通常采用的还原催化剂包括钯，例如木炭上10％的Pd。反应温度可为环境温度到60℃，压力从略高于环境压力到200psig(14atm.gauge)，反应时间为达30小时以上。
反应完成后，去除催化剂和蒸发任何滤出物。纯化粗残余物，通常通过采用硅胶柱进行层析，使用的洗脱液包含C2-C4醇，C3-C7烷烃，及其混合物。纯化的残余物可从正己烷结晶以产生纯(+-)牛尿酚产物(通常99％)，其产率通常至少75％。牛尿酚结晶产物是无色的，不吸湿的，并在空气中是稳定的，而且在最后的过滤步骤中不分解。
所述牛尿酚产物可通过以下方法来证明：三甲基硅醚，或叔丁基二甲基硅醚，或合成产物的任何其它异挥发衍生物的GC-MS分析为单一的纯物质峰，且其质谱与可信牛尿酚的三甲基硅(TMS)醚衍生物的公开的电离谱一致。
从外消旋牛尿酚分离单独的R-和S-对映体的方法
本发明还涉及将牛尿酚的外消旋混合物分离成其两种单独的对映体的方法。所述方法利用通常获自如上述化学合成的外消旋牛尿酚混合物。使用流动相，将一定量的外消旋牛尿酚导入HPLC柱的入口，所述流动相包含C4-C8烷烃和C2-C4醇。从使消旋混合物进入所述入口第一段时间以后，从HPLC柱的出口收集第一流出物，所述时间取决于柱的类型，洗脱液的类型，洗脱液流速，温度，以及外消旋混合物质量。第一洗出物将包含第一对映体，通常是S-牛尿酚。从使消旋混合物进入所述入口第二段时间以后，从HPLC柱的出口收集第二流出物，所述时间取决于柱的类型，洗脱液的类型，洗脱液流速，温度，以及外消旋混合物质量。所述第二洗出物将包含第二对映体，通常为R-牛尿酚。
将牛尿酚分离成S-牛尿酚和R-牛尿酚可在手性相柱上进行。手性相柱的一个常见例子是Chiralcel OD柱或OJ柱，由Daicel Chemical Industries Ltd.提供。用于分离商业数量的各对映体的柱可在工业系统中制备，所述系统包括产品和流动相泵，工业化体积的柱，各种器械和控制系统。所述流动相包括C3-C7烷烃或类似的极性溶剂，C2-C4醇，及其混合物。所述流动相包含己烷与丙醇，其比例通常为95:5-5:95，更优选为50:50-90:10。所述流动相的常见实例包括70％的己烷和30％的乙醇。
牛尿酚对映体从柱的洗脱可通过在260-280nm处UV吸收来检测或通过更特定的检测系统例如质谱仪并监测对牛尿酚特异的离子来检测。可最优化所述条件以完全分离S-牛尿酚和R-牛尿酚对映体(通过分析性HPLC证实)。
手性相柱通常包括硅石基质，所述硅石基质可用来选择性分离牛尿酚对映体的物质。常见的选择物质包括纤维素三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)和纤维素三(4-甲基苯甲酸酯)。
S-牛尿酚的生物制备
S-牛尿酚可大批量(in bulk)制备，并可利用常规食物技术在多种食品中原位制备。可提供碱性溶液介质，食品或植物提取物，其包含葛根黄豆苷元或可衍生葛根黄豆苷元的另一种相关的异黄酮。所述葛根黄豆苷元或其它异黄酮可通过标准细菌或酶发酵法转化成S-牛尿酚，以提供包含S-牛尿酚的本体溶液(bulk solution)，食品或植物提取物。
食品中S-牛尿酚的产生可通过利用在食物中生长的细菌的代谢活性来实现，所述食品包含令人满意的起始物质，例如大豆黄素、葛根黄豆苷元、芒柄花黄素或peurarin，或其偶联物或混合物。如图2所示，葛根黄豆苷元转化为牛尿酚包括三个主要步骤：1)任何葡糖苷偶联基团的水解，2)将异黄酮糖苷配基转化成二氢中间体，和3)将所述二氢-中间体转化成牛尿酚。所述代谢途径和三个步骤中每一步所需的酶不必要存在于一个细菌中。来自对人的研究的证据提示可有一种或多种细菌，它们联合进行这些反应，如通常二氢葛根黄豆苷元可以大量存在于血浆和尿中而牛尿酚的量可较低或基本不能检测到这一事实可证明。尽管牛尿酚可通过单一生物体从葛根黄豆苷元制备，认为当使用各种细菌的混合物时可实现更好或更有效的转化，其中每种所述细菌都具有自己的代谢图谱。有效转化成S-牛尿酚的重要条件包括细菌生物体或生物体混合物的选择，温育的条件，以及所述生物体可利用的氧的量。这些条件可通过本领域技术人员已知的技术来优化。用于实现该转变的生物体可通过食品工业中所用的标准技术失活，或可选择地允许其以活性状态保留在所述产品中。
用于发酵过程中以将葛根黄豆苷元和/或其它结构相关的异黄酮，或中间化合物转化成S-牛尿酚的细菌，可包括在人，马，啮齿类或其它是“牛尿酚产生者”的哺乳动物的肠道内建群(colonize)的一或多种细菌菌株。由于哺乳动物体内的肠细菌见于粪便中，产牛尿酚的细菌也可在“牛尿酚产生者”哺乳动物的粪便中发现。
通常用于发酵过程中的细菌应显示优化的转化率和转化程度，使得牛尿酚的生物制备有效。
通常，需要一或多种细菌菌株将葛根黄豆苷元(或其它相关异黄酮)经中间产物转变成S-牛尿酚，这通常涉及三个主要反应中的一或多个：将异黄酮糖苷配糖基(glycone)转化成糖苷配基异黄酮；将糖苷配基异黄酮转化成二氢异黄酮；并将二氢异黄酮转化成产物牛尿酚。例如，从马粪便分离的生物体的混合培养物和来自已知是“牛尿酚产生者”人的胃肠道的生物体混合培养物可将糖苷配糖基葛根黄豆苷元转化成最终产物S-牛尿酚，这和它们在体内的表现一致。
可将糖苷配糖基转化成糖苷配基(例如将葛根黄豆苷元转化成葛根黄豆苷元)的常见细菌菌株包括粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、威氏利斯特氏菌(Listeria welshimeri)、分离自牛尿酚产生哺乳动物的肠道的生物体混合培养物、脆弱拟杆菌(Bacteriodesfragilis)、乳酸双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、粘液真杆菌(Eubactrialimosum)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilous)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、费氏丙酸杆菌(Proprionobacteriumfreudenreichii)和Sacharomyces boulardii，及其混合物。
可将糖苷配基转化为牛尿酚(例如将葛根黄豆苷元转化为S-牛尿酚)的常见的细菌菌株包括费氏丙酸杆菌；乳酸双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、乳酸乳球菌、屎肠球菌、干酪乳杆菌和唾液乳杆菌的混合培养物；和分离自牛尿酚产生哺乳动物肠道的生物体混合培养物。
葡糖苷到糖苷配基，或糖苷配基到牛尿酚产物的细菌转化所需的时间将取决于细菌相关因子，尤其是浓度，氧可利用度，以及温育系统的温度和pH。在大多数情况下，可在24小时内实现基本完全的转化。
异黄酮葡糖苷到糖苷配基异黄酮的细菌转化的pH范围是从约3到约9。最佳pH主要依赖于所用的细菌类型，并应相应选择。
葡糖苷到糖苷配基以及糖苷配基到牛尿酚产物的酶转化所需的时间取决于酶相关的因子，尤其是浓度，以及该系统的温度和pH。在大多数情况下，可在24小时内实现基本完全的转化，更优选在约2小时以内，且最优选在约1小时以内。
在生物制备牛尿酚的可选择的方法中，S-牛尿酚可通过葛根黄豆苷元或其它结构相关的异黄酮，酶转化为S-牛尿酚在食品或其它适宜的基质中原位产生。适宜的酶可利用分离和纯化这些酶的标准技术从细菌中分离并浓缩，所述细菌可有效地将葛根黄豆苷元或结构相关的异黄酮转化成牛尿酚。这些是已知的，并被本领域以及酶学和生物化学领域的技术人员使用。所述牛尿酚的制备可通过有效转化而无需细菌在食物本身中生长而获得。
用于将葛根黄豆苷元和/或其它相关异黄酮，或中间化合物转化成牛尿酚的酶，可包括从细菌或细菌混合物中分离的酶，所述酶显示出可将适宜的异黄酮转化成牛尿酚。这种细菌或细菌混合物的实例可包括，但不限于，在人，马，或其它是“牛尿酚产生者”的哺乳动物的肠道中建群的细菌。通常用于将葛根黄豆苷元或中间体化合物转化成牛尿酚的过程中的酶应显示优化的转化率和转化程度，以使得牛尿酚的生物制备效率较高。
可用的酶可从一或多种细菌或其混合物中分离，所述细菌为本文所述用于将葛根黄豆苷元或结构相关的异黄酮，或中间体化合物转化成牛尿酚的细菌。
在常用的方法中，细菌在营养性胰蛋白胨培养液中在无氧条件、约37℃培养约15小时到约72小时，更优选从约24小时到36小时。所述细菌随后通过常规技术从培养液中分离，最通常通过在约1500g到25000g以及25，000g以上的重力下进行离心。所述细胞在盐水溶液(从约0.1％到约5％，并优选约0.9％)中通过将它们悬浮于所述盐水溶液中，并再次离心悬液而得以洗涤。利用酶学和生物化学领域的技术人员已知的技术，用所述洗涤后的分离细胞制备活性酶提取物。酶粗提混合物可原样用作酶提取物，或者可通过常规酶制备技术进一步纯化。
制备的酶提取物可加入到食物中，所述食物含有适宜的异黄酮，例如葛根黄豆苷元、大豆黄素或芒柄花黄素。可加入其它分离的酶，其中一些是可购得的，以加快酶介导的反应途径中起始物质到中间体的转化。所述产物通常在约25℃到约45℃的温度，优选在约30℃至约40℃地温度下温育，所述温度优选从约30℃到约40℃，同时在正在生长的样品中保持适当的无氧条件。葛根黄豆苷元型化合物转化成牛尿酚的速率取决于加入食物基质中的活性酶的量。当转化迅速进行时获得最好的结果(在约2小时内基本完全)，但更长的转化时间在低酶活性时是必要的。食物中产生的牛尿酚的量可通过限制食物中含葛根黄豆苷元的化合物的量，或者通过在温育开始后适当的时间失活所述酶，例如将产生的食物产品加热到约95到100℃来控制。
S-牛尿酚的酶制备的第一步是将葡糖苷转化为糖苷配基。作为利用以上述方式分离的酶来实现该转化的替换，可使用可购得的酶。葡糖苷到糖苷配基的酶转化可通过在适宜的pH和温度使适宜的酶与异黄酮葡糖苷接触来进行。已经发现异黄酮葡糖苷到糖苷配基异黄酮的转化取决于多种类型的因子，包括所用酶的类型，酶的活性，以及转化过程中温育的溶液的pH和温度。实现所述转化所需的酶是能够断裂异黄酮葡糖苷的异黄酮部分和葡萄糖分子之间的糖苷键连的酶。在优选实施方案中，所述酶是能够断裂1,4-糖苷键的糖酶或葡糖淀粉酶。
这类酶是可购得的α-和β-葡糖苷酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，和果胶酶。这些酶的常见例子包括可得自Deltagen，Redwood City California的Biopectinase 200AL(其优选在约2.5到约6.5的pH范围使用)，Biolactase30,000(最佳pH范围从约3到约6)和中性乳糖酶(Neutral Lactase)(最佳pH范围从约6到约8)，均可得自Quest International，183357th Street，Post OfficeBox 3917，Sarasota，Fla.34243。其它具体优选的补充酶包括乳糖酶(Lactase)NL(最佳pH范围从约6到约8)和Enzeco真菌乳糖酶浓缩物(FungalLactase Concentrate)(最佳pH范围从约4.5到约6.5)，可得自EnzymeDevelopment Corporation，2Penn Plaza，Suite 1102,360West 31st Street，NewYork，NY 10001；来自大肠杆菌的β-半乳糖苷酶(最佳pH从约6.0到约8.0)，其由Worthington Biochemicals生产，并得自ScimaR，4Ruskin Close，Templestowe，Victoria.3106，Australia；Lactozyme 3000L(which优选在约6至约8地pH范围内使用)，和Α-Gal 600L(其优选在约4到约6.5的pH范围使用)，得自Novo Nordisk Bioindustrials,Inc.，33Turner Road，Danbury，Conn.06813；Maxilact L2000(其优选在约4到约6的pH范围使用)，得自DSM FoodSpecialties PO Box1，2600MA，Delft，The Netherlands。
异黄酮葡糖苷到糖苷配基异黄酮的转化的pH范围为约3到约9。所用pH主要取决于所用酶的类型，并应当相应选择。所述酶在其生产商说明的最佳pH范围内有活性，如上文对数种具体的酶的说明。通常所述酶在中性pH范围即从约6-8，或酸性pH范围即从约3-6有活性。
用于葡糖苷到糖苷配基的转化的富含异黄酮物质的温度范围是从约5℃到约75℃。该温度明显影响酶的活性，并由此影响转化率。所述酶可在70℃以上有活性，例如Α-Gal 600L在75℃有活性。然而，优选在低温下进行所述转化以避免酶失活。在优选实施方案中，所述转化在约35℃-45℃进行。
葡糖苷到糖苷配基的转化所需的时间取决于酶相关因子，尤其是浓度，以及系统的温度和pH。在大多数情况下，可在24小时内实现基本完全的转化，然而优选加入所述酶以急剧增加反应速率。选定的酶，酶浓度，pH和温度优选使转化在约2小时以内，并优选在1小时内基本完成。
将Helix Pomatia用作β-葡糖苷酶
本发明还涉及用酶水解葡糖苷，尤其是异黄酮葡糖苷的新方法，包括将葡糖苷与来自Helix pomatia的含酶提取物在一定条件下接触一段时间，使得足以将葡糖苷转化成相应的糖苷配基。含酶提取物通常是Helix Pomatia的消化液。
在从牛尿酚的异黄酮葡糖苷起始物质合成牛尿酚的过程中，发现Helixpomatia的消化液可有效地作为β-葡糖苷酶来将异黄酮葡糖苷转化为糖苷配基异黄酮。Helix pomatia消化液以β-葡糖醛酸糖苷酶和硫酸酯酶制备物在市场上购买，并且其作为用于水解类固醇和异黄酮偶联物的酶制剂选择已有30年。其用作β-葡糖苷酶是未知并且是意料之外的。β-葡糖苷酶活性足以能够在体外完全水解和糖苷配糖基偶联的异黄酮。
所述消化液可以原样形式，或者以纯化的形式使用。Helix pomatia消化液水解异黄酮糖苷的效率通过于37℃下，在体外，将各自100μg的大豆黄素(daizin)和100μg的染料木苷(genistin)与0.1mL的Helixpomatia消化液(悬于10mL的0.05M乙酸钠缓冲液中，pH 4.5)一同温育而确定。加入所述酶/缓冲液混合物之前，将所述混合物通过固相C18Bond Elut过滤管柱(cartridge)以去除我们过去发现存在于该酶制备物中的残余量的异黄酮。保存下来的大豆黄素和染料木苷，以及温育过程中形成的葛根黄豆苷元和染料木素的浓度通过对在随后的24小时内间隔取出的混合物的等分样品进行HPLC确定。
图3显示Helix pomatia对大豆黄素和染料木苷进行水解的时间过程，该过程是通过HPLC从保存在温育混合物中的糖苷对糖苷配基的比例来确定的。这些体外研究显示在采用的分析条件下，Helix pomatia在15分钟内完全水解成大豆黄素和染料木苷，并且这种酶制备物除了具有β-葡糖醛酸糖苷酶和硫酸酯酶活性以外，还是β-葡糖苷酶的有用来源。
从本体溶液分离S-牛尿酚
大批量生产的S-牛尿酚可从细菌或酶生成S-牛尿酚的本体溶液中通过本领域已知的方法分离，包括结晶，溶剂提取，蒸馏，和沉淀/过滤。产生的本体溶液可含有未反应的葛根黄豆苷元或使用的其它相关异黄酮，副产物，以及任何反应物。这种方法可包括反相(reverse phase)或正相(straightphase)液相层析柱，并且这些方法可以和手性相层析结合。
从本体溶液或固相中去除S-牛尿酚的常用方法是提取。将提取剂溶液加入含有S-牛尿酚的溶液或固相中。通常，所述提取剂是低分子量醇，例如甲醇、乙醇、异丙醇或丙醇，或pH范围为3.5到5.5的水溶液。通常如果使用含水醇(aqueous alcohol)法，加入足量的醇以使得醇/水比例在最小为40:60到最大为95:5的范围之内。更常见，所述比例至少60:40，或更常见为65:35到90:10。
如果使用含水酸提取法，制备含水酸溶液，将其pH调节到约3.5到约5.5，甚至更优选pH范围在约4.0-5.0的范围内。将足量的水加入以产生具有足够低粘度的稀释液，以使得可通过离心或过滤从液体中分离固体。
从其中去除了不溶性固体物质的液体可通过常规去除液体的方法浓缩。常用方法包括，但不限于，通过蒸发去除溶剂，优选在减压下。残余的液体浓缩到含至少约15％的固体到约55％的固体，更常见浓缩到含30％到50％的固体。所述浓缩物随后用水稀释以降低固体含量并增加水和醇的比例。加入的水的量可在大范围内变化，但最终固体含量为6％-15％，且更优选为约13％。将混合物的pH调节到约pH 3.0-pH 6.5，优选为约pH 4.0-pH 5.0。通常所述温度在约2℃-10℃，更常见为约5℃-7℃。
随后通过标准分离技术(离心或过滤)从液体中分离所述固体物质，并产生富含牛尿酚的固体物质。
所述富含牛尿酚的物质可任选纯化，通常通过利用硅胶柱进行层析，并采用包含C2-C4醇、C3-C7烷烃、及其混合物的洗脱液。纯化的残留物可从正己烷中结晶以产生纯S-牛尿酚产物，其纯度通常为至少99％，产率通常为至少75％。所述牛尿酚结晶产物是无色、不吸湿的并在空气中是稳定的，而且不在最终的过滤步骤中分解。
所述S-牛尿酚产物可如下证实：三甲基硅醚或叔丁基二甲基硅醚，或合成产物的任何其它易挥发性衍生物的GC-MS分析为单一的纯物质峰，且其质谱与可信牛尿酚的三甲基硅(TMS)醚衍生物的公开的电离谱一致。产物的确认还可通过在将样品通过HPLC手性相柱导入仪器后利用电喷射电离进行直接质谱法来进行。
通过给药S-牛尿酚治疗疾病
本发明提供使受试个体克服不能在体内产生牛尿酚的问题的方法，所述方法通过直接递送牛尿酚对映体，具体为S-牛尿酚或S-牛尿酚和R-牛尿酚混合物，避开需要肠细菌来产生牛尿酚的需要。S-牛尿酚的递送也可补充“牛尿酚-产生者”和“非-牛尿酚产生者”体内的S-牛尿酚产量。
本发明提供了递送足够量的S-牛尿酚以对健康产生益处的方法。所述活性S-牛尿酚物质可通过直接摄入或给药纯S-牛尿酚化合物或S-牛尿酚的任何偶联的类似物来递送。通常，可给药足量的含S-牛尿酚组合物以在哺乳动物中产生至少5纳克每毫升(nanogram per milliliter,ng/mL)，或更常见为至少10ng/mL以上的血浆S-牛尿酚瞬时水平，或者大于1000nmol/L的尿S-牛尿酚瞬时水平。所述S-牛尿酚也可是S-牛尿酚偶联物，在C-4'或C-7位置与选自葡糖苷酸、硫酸酯、乙酸酯、丙酸酯、葡糖苷、乙酰-葡糖苷、丙二酰-葡糖苷，或其混合物的偶联物偶联。通常，所述组合物以至少约1mg(更常见为至少5mg)到至多100mg(或更常见为至多50mg)的剂量给药。
认为递送足量S-牛尿酚的能力在数个方面优于递送牛尿酚的外消旋混合物。首先，预测S-牛尿酚的效力是外消旋混合物的至少两倍。其次，人体仅产S-牛尿酚，并因此仅包含S-牛尿酚的组合物代表具有机体所熟悉的S-牛尿酚成分的“天然”产物。第三，由于认为人体不产生R-牛尿酚对映体，仅包含或基本仅包含S-对映体的治疗组合物不会引入机体不熟悉的物质。
本发明的组合物可用于治疗各种激素依赖性疾病和与其相关病情。
本发明包括S-牛尿酚在治疗和预防疾病或病情中的用途，所述疾病或病情包括脑疾病，阿尔茨海默型痴呆，以及其它与年龄增长和短期及长期记忆丧失相关的认知功能降低或障碍。S-牛尿酚的雌激素活性通过增强神经传递和恢复突触密度从而在脑内起作用。认为S-牛尿酚在脑内起作用的位点和雌激素的相同，显示雌激素反应。
本发明包括S-牛尿酚在治疗和预防骨质减少和骨质疏松中的用途。
在两年的随机研究中，绝经后妇女每天喝两杯有或没有异黄酮的豆奶。数据显示，在食用有可忽略量的异黄酮的组中，两年中腰椎BMD和BMC分别降低4.0％和4.3％(p<0.01)。这些水平与自然绝经第一个两年中正常预期的5-7％的骨质损失接近。反之，食用含有50mg异黄酮的豆奶的妇女显示腰椎BMD和BMC分别增加1.1％和2％(相对于基线值)。这项研究显示：与缺乏异黄酮的大豆蛋白相反，含异黄酮的大豆蛋白在两年的时间中可保持骨质稳定。所述数据表明，通过腰椎BMD中的变化测定的骨质损失可在异黄酮存在下得以预防。
应提到该差异不是仅在一年之后才观察到。由于骨转化率较慢，前一项骨研究的数据的变异率很可能是大豆食物短期饮食介入的结果。
最引人注目的观察是血浆牛尿酚浓度大于10ng/mL(队列的45％)的“牛尿酚-产生者”妇女，其显示腰椎骨盐密度(BMD，p＝0.02)和骨盐含量(BMC，p＝0.009)分别平均增加了2.4％和2.8％，而“非-牛尿酚产生者”组中BMD和BMC分别增加仅0.6％和0.3％。给予对照物质的妇女显示BMD和BMC分别平均降低4.0和4.3％(与基线相比p<0.01)。该数据显示代谢异黄酮以产生牛尿酚的能力以及牛尿酚在机体中的存在与BMD和BMC的增加有直接联系。这些数据提示，牛尿酚是重要的骨营养剂。给药足量的含牛尿酚组合物以减少骨转化的替代标志物，或者防止通过骨盐密度测定的骨质流失。也可给药足量的含S-牛尿酚组合物以增加骨形成或防止骨质疏松并减少骨折。
本发明包括S-牛尿酚在治疗和预防脂质疾病例如高胆固醇(高胆固醇血症)、脂血症(lipidemia)、脂血(lipemia)和血脂异常(dyslipidemia)(脂质紊乱)中的用途。上述研究还包括对受试者体内胆固醇浓度的研究。结果显示牛尿酚产生者中的血浆总胆固醇浓度与基线水平相比降低7.2％(p＝0.04)，而非-牛尿酚产生者的血浆总胆固醇浓度与基线水平相比降低3.0％(p＝NS)。大豆蛋白不能在血胆固醇水平正常的成人中显示明显的胆固醇-降低效应(几乎很少有例外)，这很可能是由于研究人群在大豆异黄酮代谢以及不能认识到牛尿酚形成的关联性方面的异质性。这些数据提示牛尿酚以有利的方式影响脂类。给药足量的含S-牛尿酚组合物以降低血流中脂质的水平。
本发明还包括S-牛尿酚在治疗和预防急性和慢性卵巢雌激素缺乏状态(包括血管收缩障碍和盗汗，通常称为“热潮红(hot flush)”或热潮红(hot flash))中的用途。这也包括用于乳癌治疗的伴有热潮红的抗雌激素治疗。
本发明还包括S-牛尿酚在治疗和预防心血管疾病和肝脏疾病中的用途。
本发明还包括S-牛尿酚通过增加对血压急性改变的反应性或适应性，改善血流，和降低血压用来改善降低的血管质量的用途。
本发明包括S-牛尿酚在降低脂质过氧化和作为抗氧化物清除体内自由基中的用途。
本发明还包括S-牛尿酚在减轻炎症中的用途，这可由其降低炎症标记物例如C反应性蛋白的效果证实。
本发明还包括S-牛尿酚在治疗和预防癌症中的用途，所述癌症包括良性乳腺癌，乳腺癌，良性前列腺癌，前列腺癌，皮肤癌和结肠癌。
本发明还包括S-牛尿酚在治疗和预防腺瘤性息肉(adenomatous polyps)和家族性息肉病(familial polyposis)中的用途，所述两种疾病都有很高的结肠癌变危险。由于雌激素在降低妇女结肠癌危险性中的重要性，有理由预期牛尿酚对映体具有类似的预防或治疗作用，尤其是结肠是牛尿酚前体产生牛尿酚的主要位置。
本发明的组合物可用于治疗各种非激素依赖性疾病和相关病情，包括胃肠道，前列腺，乳腺，皮肤和骨的炎性疾病。
牛尿酚分子中手性中心的存在可能与其生物效能相关。对映体的效力大于消旋体，尤其是对ERβ而言。
本发明的方法中，钙或维生素D可共同给药(在给药牛尿酚前，同时，或以后)，例如作为分离的药片，或者作为适当剂型的一部分。
牛尿酚具有与细胞功能相关的其它性质。作为多酚，其与类黄酮都具有作为氢/电子供体的能力，并由此可清除自由基。在体内在FRAP，TEAC和Cu(II)–诱导的或铁(III)–诱导的脂质体过氧化实验中，牛尿酚的抗氧化能力在所有检测的异黄酮中最大。尽管异黄酮在体外检测时被认为是弱抗氧化剂，它们的体内作用可足以造成回体脂质过氧化降低，当成人使用大豆蛋白食物时，上述现象在除了一项临床研究以外的所有研究中均可观察到。由于牛尿酚的抗氧化活性比其它异黄酮好，对“牛尿酚-产生者“或不能产生牛尿酚的那些人直接递送牛尿酚可有以下情况：作为药剂，补充剂，或递送到食品中。在所有情况下，增加的循环牛尿酚水平可提供对脂质过氧化更强的抑制，并由此更大程度地降低心血管疾病的危险性。
认为非-牛尿酚产生者通常比牛尿酚产生者患特定疾病的危险更高，所述疾病通常是激素依赖性疾病或病情，包括乳腺癌。对于产生牛尿酚较少或不产生的人而言，可通过口服，局部，经鼻，经皮下，或静脉内给药牛尿酚对映体或其混合物获得相当的益处。
在牛尿酚产生者的饮食中补充牛尿酚，具体为S-牛尿酚，可在牛尿酚产生者产生的S-牛尿酚正常水平不足的情况下产生有益效果，这是由于1)摄入的用于产生牛尿酚的异黄酮不足，2)应用的抗生素消除了肠细菌从前体异黄酮产生牛尿酚的活性，或3)其它影响牛尿酚产生水平的健康因子。此外，认为牛尿酚尤其是S-牛尿酚的补充水平(supplemental level)对人的健康状况提供了增强效果。
通过给药R-牛尿酚治疗疾病
本发明还提供了使个体受试者克服不能在体内产生牛尿酚的问题的方法，其是通过直接递送牛尿酚对映体，具体为R-牛尿酚或R-牛尿酚和S-牛尿酚的混合物，来回避产生牛尿酚对所需肠细菌。
本发明提供了递送足量R-牛尿酚以产生对健康的益处的方法。所述R-牛尿酚物质可通过直接摄入或给药纯R-牛尿酚化合物或R-牛尿酚的任何偶联的类似物来递送。通常，可给药足量的含R-牛尿酚组合物以在哺乳动物中产生至少5纳克每毫升(ng/mL)，或更常见为至少10ng/mL以上的血浆R-牛尿酚瞬时水平，或者大于1000nmol/L的尿S-牛尿酚瞬时水平。所述R-牛尿酚也可是R-牛尿酚偶联物，在C-4'或C-7位置与选自葡糖苷酸、硫酸酯、乙酸酯、丙酸酯、葡糖苷、乙酰-葡糖苷、丙二酰-葡糖苷，或其混合物的偶联物偶联。通常，所述组合物以至少约1mg(更常见为至少5mg)到100mg(或更常见为到50mg)的剂量口服给药。
认为递送足量R-牛尿酚的能力在一些情况下，例如乳腺癌预防，或用于拮抗配体与特异性ER例如ERβ1或ERβ2的结合，在一定程度上优于递送牛尿酚的外消旋混合物。
本发明的含R-牛尿酚组合物可用于治疗各种激素依赖的疾病和相关病情。
本发明包括R-牛尿酚在治疗和预防疾病或病情中的用途，所述疾病或病情包括脑疾病，阿尔茨海默型痴呆，以及其它与年龄增长和短期及长期记忆丧失相关的认知功能降低或障碍。认为R-牛尿酚在脑内起作用的位点和雌激素的相同，显示通过在脑内特定区域内富集的特异性雌激素受体介导的雌激素反应，同时也具有防止神经元受到氧化应激的抗氧化作用。
本发明包括R-牛尿酚在治疗骨质减少和骨质疏松中的用途，这是由于抗氧化剂对破骨活性具有保护性作用。
给药足量的含R-牛尿酚组合物以减少骨转化的替代标志物，或者防止通过骨盐密度测定的骨质流失。也可给药足量的含R-牛尿酚组合物以增加骨形成，或防止骨质疏松并减少骨折。
本发明包括R-牛尿酚在治疗和预防脂质疾病例如高胆固醇(高胆固醇血症)、脂血症、脂血和血脂异常(脂质紊乱)中的用途。大豆蛋白不能在血胆固醇水平正常的成人中显示明显的胆固醇-降低效应(几乎很少有例外)，这很可能是由于研究人群在大豆异黄酮代谢以及不能认识到牛尿酚形成的关联性方面的异质性。这些数据提示牛尿酚以有利的方式影响脂类。给药足量的含S-牛尿酚组合物以降低血流中脂质的水平并减少脂质过氧化。
本发明还包括R-牛尿酚在治疗和预防急性和慢性卵巢激素缺乏状态(包括血管收缩障碍和盗汗，通常称为“热潮红(hot flush)”或热潮红(hot flash))中的用途。这也包括用于乳癌治疗的伴有热潮红的抗雌激素治疗。
本发明还包括R-牛尿酚在治疗和预防心血管疾病和肝脏疾病中的用途。
本发明还包括R-牛尿酚通过增加对血压急性改变的反应性或适应性，改善血流，和降低血压用来改善降低的血管质量。
本发明包括R-牛尿酚在作为抗氧化物清除体内自由基中的用途。
本发明还包括R-牛尿酚在减轻炎症中的用途，这可由其降低炎症标记物例如C反应性蛋白和细胞因子的效果证实。
本发明还包括R-牛尿酚在治疗和预防癌症中的用途，所述癌症包括良性乳腺癌，乳腺癌，良性前列腺癌，前列腺癌，皮肤癌和结肠癌。
本发明还包括R-牛尿酚在治疗和预防腺瘤性息肉(adenomatous polyps)和家族性息肉病(familial polyposis)中的用途，所述两种疾病都有很高的结肠癌变危险。由于雌激素在降低妇女结肠癌危险性中的重要性，有理由预期牛尿酚对映体具有类似的预防或治疗作用，尤其是结肠是牛尿酚前体产生牛尿酚的主要位置。
实验
(a)测定“牛尿酚产生”的成年人中的牛尿酚对映体
分析来自食用大豆食物的成人的尿样品。所述成人以前鉴定为“牛尿酚产生者”。通过使样品通过固相Bond Elut C18管柱从尿(25mL)中分离牛尿酚。用水洗涤该管柱后，用乙醇(5mL)洗脱回收异黄酮，并在氮气流下干燥甲醇相。用Helix pomatia对样品进行酶水解，并在Bond Elut C18管柱上再提取。所述甲醇提取物在氮气下干燥，并溶解于HPLC流动相(100μl)。利用Chiralcel OJ手性相柱利用实施例2中的方法通过HPLC鉴定牛尿酚对映体。牛尿酚的检测通过选定离子监控型电喷射电离质谱(ESI-MS)实现。图4显示S-牛尿酚纯标准物和来自食用大豆食品的成人的尿的质谱图。
由于没有检测到牛尿酚的R-对映体保留指数和质谱确定人尿中仅分泌牛尿酚的S-对映体。分析来自相同“牛尿酚-产生者”也显示仅有牛尿酚S-对映体。
(b)外消旋牛尿酚的化学合成
葛根黄豆苷元(200mg，0.8mmol)溶解于冰醋酸(20mL)和异丙醇(20mL)的混合物中，并用木炭(150mg)上的10％Pd在55p.s.i.g.(3.7atm gauge)还原。在反应最后(2小时，TLC:异丙醇/正己烷1/4)，将催化剂滤到，并蒸发滤出物。粗残余物通过在硅胶柱上利用异丙醇和正己烷(1:4v/v)混合物作为洗脱液通过层析纯化，以产生从正己烷结晶的纯(±)牛尿酚产物(160mg，产率：82％)。所述无色晶体的产物，是不可吸湿的，并在空气中稳定，并在最后的过滤步骤中不分解。化学合成产物在各方面都与(±)牛尿酚(外消旋牛尿酚)的可信样品相同。图5显示合成产物的三甲基硅醚衍生物的GC-MS分析是单个纯峰，并且其质谱和可信牛尿酚的三甲基硅(TMS)醚衍生物的公开的电离谱一致。所述分子离子和预期的一样为m/z 470且基峰值在m/z 234处。纯化的牛尿酚产物的纯度大于99％，如HPLC和质谱所确定的。
(c)通过光学二向色性的S-和R-对映体的洗脱顺序
S-牛尿酚和R-牛尿酚的外消旋混合物通过在Chiralcel OJ柱上进行如下手性层析：采用1.0mL/min的流率，并使用梯度洗脱，其初始流动相是己烷中的10％乙醇，然后将己烷中的乙醇在15分钟的时间内根据表A的方案增加到90％：
表A
图6显示S-和R-牛尿酚外消旋混合物的离子记录(m/z 241的质谱。
分别收集第一洗脱物质，命名为对映体-1，和第二洗脱物质，命名为对映体-2。称重每种对映体并将称重后的样品溶于1mL的光谱级乙醇中。每种对映体旋光度的测定在20℃利用波长为钠的D线的光进行。
对映体-1物质(1.6mg提取重量)第一次和第二次测定值分别为-0.023和-0.022，产生的旋光度为-14[-0.0225×1000/1.6]，这对应于牛尿酚的S-对映体。对映体-2物质(1.7mg提取重量)第一次和第二次测定值分别为+0.023和+0.023，产生的旋光度为+13.5[+0.023×1000/1.7]，这对应于牛尿酚的R-对映体。
(d)通过人肠细菌产生S-牛尿酚
来自牛尿酚-产生者和非-牛尿酚产生者的新鲜排出粪便(1g)分别和9mL无菌蒸馏水，胰胨豆胨培养液和加入有葛根黄豆苷元(10mg/L)的脑-心浸出培养液一同温育。所述培养液在无氧条件下在37℃温育24小时。所述温育混合物随后被离心并使其通过Bond Elut C18固相管柱(Varian Inc，Harbor City，CA)分离异黄酮，并用甲醇洗脱。甲醇提取物随后在氮气条件下干燥并再溶解于100μL的流动相，以便通过高压液相色谱和连接的电喷射电离质谱(ESI-MS)进行分析。
将样品提取物(20μL)注入柱中，使用的是手性相柱和上述实验(c)中的洗脱参数。通过两种牛尿酚对映体特异性的、m/z 241处离子的负离子模式中的选定离子记录实现。将温育提取物的质谱与含约等比例的S-牛尿酚和R-牛尿酚的外消旋牛尿酚纯标准物进行对比。鉴定是基于两种对映体的保留差异，其中S-牛尿酚对映体在R-牛尿酚对映体之前洗脱。
图7显示温育产物的离子记录(m/z 241)的质谱。所述产物是通过培养自“牛尿酚-产生者”的肠细菌将葛根黄豆苷元转化为牛尿酚所产生的。图7显示对应于S-牛尿酚对映体的明显的峰。反之，图8显示温育产物的离子记录(m/z 241)的质谱。所述产物是通过培养自“非-牛尿酚-产生者”的肠细菌将葛根黄豆苷元转化为牛尿酚所产生的，表明在对应S-牛尿酚保留时间处的较小峰值检测到为零或微量水平的S-牛尿酚。
根据ESI-MS分析，肠细菌将葛根黄豆苷元转化为牛尿酚形成的产物是单峰(对映体-1)，其仅对应S-牛尿酚对映体。
这些研究确定了人肠细菌只产生S-牛尿酚对映体，并且这于S-牛尿酚出现在人血浆和尿中一致。
e)测定S-和R-对映体的受体结合能力
进行体外结合研究来检测S-和R-对映体牛尿酚与雌激素受体ERα和ERβ的相对亲合力。
激素受体蛋白的合成：全长大鼠ERα表达载体(pcDNA-ERα；RH PriceUCSF)和ERβ表达载体(pcDNA-ERp；TA Brown，Pfizer，Groton，CT)用于在体外利用TnT-偶联的网状细胞溶解物系统(Promega，Madison，WI)和T7-RNA聚合酶，在30℃反应90分钟合成激素受体。将翻译反应混合物保存在-80℃备用。
饱和等温线：为计算并确定S-牛尿酚和R-牛尿酚对映体对ERα和ERβ的结合亲合力，将l00μL的网状细胞溶解物等分试样在浓度渐增(0.01-100nM)的[3H]17β-雌二醇(E2)的情况下在适宜的时间和温度温育，即室温90分钟(ERβ)和4℃18小时(ERα)。这些时间通过经验测定，并代表受体与雌激素的最佳结合。非特异性结合通过使用300倍过量的ER拮抗剂乙烯雌酚在平行试管内进行评估。温育后，通过将温育的反应物通过1mL的亲脂性SephadexLH-20(Sigma-Aldrich Co.，Saint Louis，MO)柱分离结合和未结合的[3H]E2。根据以前公开的方案(Handa等，1986；O’Keefe and Handa,1990)，通过将一次性吸液管头(lmL，Labcraft；Curtin Matheson Scientific，Inc，Houston，TX)和TEGMD(10mM Tris-Cl，1.5mM EDTA,10％甘油，25mM钼酸盐，和1mM二硫苏糖醇，pH7.4)-饱和的Sephadex组装在一起构建。为进行层析，用TEGMD(100μl)重新平衡柱子，并将温育反应物分别加入各柱中，并在柱上再温育30分钟。这次温育后，将600μL的TEGMD加入到各柱中，收集流出物，加入4mL闪烁液，并在2900TR Packard闪烁计数仪(PackardBioscience，Meriden，CT)中计数样品。
使用竞争结合实验评估牛尿酚的S-牛尿酚和R-牛尿酚对映体的雌激素性质。根据S和R与[3H]E2竞争ER结合的能力，显示两种对映体对体外翻译的ER的亲合力有很大区别。S-牛尿酚对映体显示对ERβ的亲合力最大[Kd(nm)＝0.73±0.2]，而其对ERα的亲合力经比较相对较低[Kd(nM)＝6.41±1.0]。所述R-牛尿酚对映体对ERβ的亲合力[Kd(nm)＝15.4±1.3]和对ERα的亲合力[Kd(nM)＝27.38±3.8]更低。作为对照，在该系统中17β-雌二醇与Erα以Kd(nM)＝0.13结合且与Erβ以Kd(nM)＝0.15结合。
该研究表明，仅S-牛尿酚对映体与ER以足够的亲合力结合，从而可能与人体中报道的循环牛尿酚水平相关。与17β-雌二醇的相比，S-牛尿酚和R-牛尿酚对映体与ERα的相对结合亲合力分别低49倍和211倍。但S-牛尿酚对映体似乎大多为ERβ选择性的，其对ERβ的亲合力相对较高；而R-牛尿酚对映体与ERβ结合的亲合力大约低100倍。仅S-牛尿酚见于人血浆和尿中的分离和结合的测定，就两种对映体的结合特异性方面而言是显著的。
实施例
实施例1：通过HPLC将外消旋牛尿酚分离成分离的对映体
合成的S-和R-牛尿酚外消旋混合物根据实验部分的实验(b)所述的化学合成法制备，并通过Chiralcel OJ(0.46cm直径×25cm长)，由Daicel ChemicalIndustries Ltd提供。所述柱使用10μm硅胶底物上的纤维素三(4-甲基苯甲酸酯)。使用的流动相是梯度洗脱液，其开始是己烷90％/乙醇10％并在15分钟内根据表A以1毫升每分的流速(mL/min)线性增加到最终组合物即己烷10％/乙醇90％。牛尿酚从柱的洗脱通过260nm的UV吸收来检测。图9显示使用手性相柱洗脱牛尿酚对映体。R-牛尿酚的保留时间为7.05min，而S-牛尿酚对映体的保留时间为7.75min。对映体的鉴定通过它们的保留指数与通过光学二向色性确定的纯对映体标准物的比较来确定。
实施例2：牛尿酚的吸收和生物利用度
将25-mg剂量的牛尿酚以单次口服丸的形式给药健康成年女性受试者，并检测牛尿酚血浆浓度。通过肠道吸收快速进行，在4-6小时后，达到最大血浆浓度，并随后从循环中消失，其终消除(terminal elimination)半衰期为8.8小时。如表B所示，(±)牛尿酚的药代动力学与其它异黄酮的相似，但与其前体葛根黄豆苷元(Cl/F＝17.5L/h)相比，(±)牛尿酚的血浆清除率较慢(Cl/F＝6.85L/h)并显示相对高剂量调节的生物利用度(AUC inf/F＝145.8ng/Ml/hr/mg牛尿酚)。图10显示(±)牛尿酚的血浆出现/消失曲线，其表示为对数/线性图，显示对健康成年女性口服给药(±)牛尿酚以后，牛尿酚的药代动力学。表B还显示以前公开的健康妇女中葛根黄豆苷元的比较值。
表B
实施例3：牛尿酚的雌激素活性
将化学合成牛尿酚的外消旋混合物皮下注入(100mg和500mg剂量)幼年22天大的Sprague-Dawley大鼠以比较牛尿酚对未成熟大鼠子宫的雌激素活性。还检验了(500mg剂量)和DMSO(对照)。在第17,19和21天测定子宫重量。图11显示该模型中外消旋牛尿酚的雌激素活性是染料木素的两倍以上，从而使得注入剂量的一半是无活性的R-牛尿酚对映体。
实施例4：大豆食物中葡糖苷到糖苷配基的细菌转化
在食物中将葛根黄豆苷元转化为牛尿酚的第一步是将异黄酮的葡糖苷形式转化为糖苷配基形式，为将糖苷配基酶还原到牛尿酚作准备。检测大量生物体实现所述转化的能力。用实验生物体接种含约3.5％的蛋白，8％的碳水化合物和大约l6mg/L的大豆黄素的无菌大豆饮料，并在适宜温度温育。温育温度为20-40℃认为是适宜的，对于大多数实验生物体而言，优选30-37℃。对于大多数细菌菌株在无氧条件下进行温育。大豆黄素转化成葛根黄豆苷元的步骤以后，分析样品中未反应的葛根黄豆苷元，所述样品是在温育开始后10小时到72小时的时间内间隔取样的。结果显示于表C中。在54种/菌株实验细菌种，26种不能将大豆黄素转化为葛根黄豆苷元。在能够将大豆黄素转化为葛根黄豆苷元的28中生物体中，4种能快速转化，需要10小时到24小时来实现基本上100％的转化。有12种类型的转化是中等速率的，需要25到72小时来实现基本上完全的转化。剩下的生物体提供的转化较慢，在72小时的温育期内低于50％的转化完成。显示快速转化的生物体包括粪肠球菌，植物乳杆菌，威氏利斯特氏菌(Listeria welshimeri)，以及从马粪便中分离的生物体的混合培养物。在7种实验植物乳杆菌菌株中，一种较快，四种为中等速率，而两种为较慢的转化者。其它能够将葡糖苷有效转化为糖苷配基的其它生物体包括脆弱拟杆菌,乳酸双歧杆菌，粘液真杆菌，干酪乳杆菌，嗜酸乳杆菌，德氏乳杆菌，副干酪乳杆菌，单核细胞增生利斯特氏菌，藤黄微球菌，费氏丙酸杆菌和Sacharomyces boulardii。
表C
食物基质中各种微生物将大豆黄素转化为葛根黄豆苷元的速率(在37℃无氧条件下温育)
“ND”不能估计时间
“>”接近分类阈值的值，但在阈值达到前停止温育
实施例5：食物中葛根黄豆苷元到牛尿酚的细菌转化
在发现在还原环境中谢葛根黄豆苷元的细菌或细菌混合物的实验中，富含葛根黄豆苷元的豆奶样品(含约20mg/L的葛根黄豆苷元)用不同细菌的纯培养或多种生物体的混合物接种。接种后的豆奶在37℃无氧条件下温育42小时。整个实验期间间隔取样样品，并分析其异黄酮含量，尤其是葛根黄豆苷元含量。葛根黄豆苷元到牛尿酚的转化可伴有产物中的葛根黄豆苷元水平随时间降低，而以氢化产物牛尿酚出现。除了葛根黄豆苷元水平以外，在任何接种产物中没有发现异黄酮含量有很大变化，这有效证明异黄酮(当适宜的代谢细菌缺失或无活性时包括葛根黄豆苷元)的稳定性。所述结果显示于图D中。在研究的7种不同的接种体中，四种显示葛根黄豆苷元含量在整个温育期间没有变化。三种接种后样品显示葛根黄豆苷元水平的实质性降低，其相应地转化成氢化的化合物。影响所述改变的生物体是费氏丙酸杆菌，含有乳酸双歧杆菌，嗜酸乳杆菌，乳酸乳球菌，屎肠球菌，干酪乳杆菌和唾液乳杆菌的混合培养物；以及从马粪中分离的混合培养物。在马粪混合培养物中，达约初始水平50％的葛根黄豆苷元损失在15小时以内出现，而在另外两种培养物中直到25小时出现。
表D
食物基质中各种微生物生长过程中葛根黄豆苷元的转化(无氧条件下在37℃温育)
实施例6：食品中S-牛尿酚的细菌生产
制备含有水解植物和乳蛋白以及盐和糖的简单，清培养液。将大约2mg/L水平的葛根黄豆苷元加入到培养液中。将所述培养液在压力锅中煮大约15分钟，冷却到室温后用来自已知产生牛尿酚的人胃肠道的生物体混合培养物进行接种，所述的人每天常规使用豆奶。培养液在37℃保持24小时，随后分析。活着的生物体可随后任选通过常用于失活食品中生物体的方法来破坏。来自葛根黄豆苷元的牛尿酚(推定为S-牛尿酚)的存在通过培养液提取物的电喷射质谱确定。
实施例7：在食品中通过酶产生S-牛尿酚
将含有乳酸双歧杆菌，嗜酸乳杆菌，乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)，屎肠球菌(Enterococcus faecium)，干酪乳杆菌和唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)的细菌混合培养物在营养性胰蛋白胨培养液中无氧条件下于37℃培养24-36小时。所述细菌通过在约10.000重力离心从培养液中分离，并将细胞悬于约0.9％的盐水溶液中，并随后再离心。洗涤后的分离细胞用于利用酶学和生化领域技术人员已知的技术来制备活性酶提取物。所述粗酶混合物可用作，或通过常规酶制备技术进一步纯化成纯化的酶提取物。
将纯化的酶混合物加入含有10mg/L葛根黄豆苷元的食品中，所述组合物在温和的无氧条件下、约30-40℃温育约2小时。所述酶随后通过将所述组合物加热到约95-100℃而失活，产生含S-牛尿酚的食品。

Claims (10)

1.食品组合物，其基本上由食品组分和活性剂组成，其中所述活性剂基本上由对映体纯度为90％最小对映体过量(EE)的S-牛尿酚组成，且基本上不含葛根黄豆苷元和染料木素，且其中所述S-牛尿酚以足以对哺乳动物产生健康益处的量存在。
2.权利要求1的食品组合物，其中所述食品组合物每份食品包含约1mg至约300mg的S-牛尿酚。
3.食品组合物，其基本上由食品组分和活性剂组成，其中所述活性剂基本上由对映体纯度为90％最小对映体过量(EE)的R-牛尿酚组成，且基本上不含葛根黄豆苷元和染料木素，且其中所述R-牛尿酚以足以对哺乳动物产生健康益处的量存在。
4.权利要求3的食品组合物，其中所述食品组合物每份食品包含约1mg至约300mg的R-牛尿酚。
5.权利要求1-4中任一项的食品组合物，其中所述食品组合物包括幼儿食品、胎儿食品或饮食食品。
6.口服药物组合物，其基本上由活性剂和可药用助剂、载体、稀释剂、填充剂和/或赋形剂组成，其中所述活性剂基本上由对映体纯度为90％最小对映体过量(EE)的S-牛尿酚组成，且基本上不含葛根黄豆苷元和染料木素，且其中所述S-牛尿酚以足以对哺乳动物产生健康益处的量存在。
7.口服药物组合物，其基本上由活性剂和可药用助剂、载体、稀释剂、填充剂和/或赋形剂组成，其中所述活性剂基本上由对映体纯度为90％最小对映体过量(EE)的R-牛尿酚组成，且基本上不含葛根黄豆苷元和染料木素，且其中所述R-牛尿酚以足以对哺乳动物产生健康益处的量存在。
8.权利要求6或7所述的口服药物组合物，其中所述口服药物组合物为药物、非处方(OTC)药物或食品添加剂。
9.S-牛尿酚在制备用于预防或治疗哺乳动物疾病或病症的药物中的用途，其中所述疾病或病症选自骨质疏松、良性前列腺癌、血管舒缩障碍、盗汗、热潮红和前列腺疾病或病症。
10.R-牛尿酚在制备用于预防或治疗哺乳动物疾病或病症的药物中的用途，其中所述疾病或病症选自骨质疏松、良性前列腺癌、血管舒缩障碍、盗汗、热潮红和前列腺疾病或病症。
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