CN104593813B - 一种分离5(6)‑羧基罗丹明异构体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种分离5(6)‑羧基罗丹明异构体的方法，包括如下步骤：将5‑羧基罗丹明和6‑羧基罗丹明的混合物溶于溶剂中，配制成一定浓度的溶液，一定温度下超声分散后获得样品溶液；制备一定浓度的琼脂糖凝胶液，将其冷却到65℃后小心地倒入电泳槽内的有机玻璃内槽中，添加Tris碱缓冲溶液至没过凝胶板为止；将步骤（1）的样品溶液加到样品孔中，控制一定的电场强度，对凝胶板通电进行电泳，当凝胶上原有的一条样品谱带在移动中分裂为两条紫红色谱带后，结束电泳。取出凝胶板后，用小刀将两个谱带的凝胶切割分离，分别将两个胶带研磨后用有机溶剂萃取，即可分别得到异构纯的5‑羧基罗丹明化合物、6‑羧基罗丹明化合物。具有简单、方便、经济等特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用电泳分离5(6)-羧基罗丹明异构体的方法，特别涉及一种利用琼脂糖凝胶电泳分离5(6)-羧基罗丹明异构体的方法。
背景技术
荧光探针在表达分子间识别行为，传递复杂生命和环境体系的内部状态信息等方面具有优异的性能。罗丹明类化合物因其螺环结构变化伴随的分子荧光off-on转换特性，被广泛的应用于构建荧光探针分子。近年来罗丹明基荧光探针的发展呈现功能化的趋势，其中利用5(6)-羧基罗丹明的底环（苯环）羧基衍生化构建功能探针分子的策略引起了广泛的关注（参见图4）。Yuan（Org Lett, 2012, 14(2): 432-435）等利用罗丹明底环羧基与香豆素连接，构建了性能优异的比率荧光探针。Yan等（Theranostics, 2012, 2(10): 988-998）和Tânia等（J Inorg Biochem, 2013, 121: 156-166）通过罗丹明底环羧基将靶向基团引入探针分子，构建了靶向定位探针。Ryan等（Chem Commun, 2002, 21(18): 2092-2093）将罗丹明底环羧基与多肽连接，合成了一种可用于酶活性研究的功能探针。以上工作的特点是利用5(6)-羧基罗丹明的底环（苯环）羧基将功能基团组合到探针分子中，从而实现了探针的某种特殊功能。
由于5-、6-羧基罗丹明的荧光光谱存在着不可忽视的差异（QSAR Comb Sci,2006, 25(2): 147-155），采用罗丹明底环羧基衍生化构建功能探针分子时，必须采用异构纯的5-羧基罗丹明或6-羧基罗丹明为原料。遗憾的是异构纯的5-、6-羧基罗丹明并不易得。按照合成罗丹明类化合物的一般方法，采用比邻苯二甲酸酐多一个羧基的苯三酸酐与间氨基酚缩合制备羧基罗丹明时，只能得到比例接近的5和6位羧基罗丹明异构体的混合物，而且两种异构体的理化性质接近，难以用常规方法进行分离（Org Lett, 2003, 5(20):3675-3677）。因此制备高纯度的羧基罗丹明异构体，已成为发展该类荧光探针的关键性问题之一。
目前为了获得异构纯的5-、6-羧基罗丹明化合物，主要采用以下几种方法。方法一，使用高效制备液相色谱分离5(6)-羧基罗丹明混合物。这种方法是现在获得异构纯羧基罗丹明的主要方法，但是其成本高，无法大规模生产。方法二，对合成羧基罗丹明的中间体——两种异构体混合物进行拆分，然后分别用异构纯中间体进行第二步缩合，由此得到异构纯羧基罗丹明（Bioconjugate Chem. 2009, 20, 1673-1682）。合成路线见下述的方程式。这种方法的优点是适用于大规模生产，但是其异构纯中间体的产率很低，成本也较高。方法三，利用柱前衍生法对5(6)-羧基罗丹明混合物进行分离。这种方法是先将5(6)-羧基罗丹明混合物衍生化，增加异构体间的结构差异并降低分子极性，然后使用柱色谱进行分离。本申请人曾经对5(6)-羧基罗丹明110混合物采用酯化、柱色谱分离、水解的方法，成功地实现了克级量的异构体分离（有机化学，2007，27(2): 269-271）。与此类似，肖义等（CN201210080853）将5(6)-取得罗丹明混合物与水合肼或羟胺反应得到5(6)-取代的罗丹明螺内酰胺混合物，然后柱色谱分离、水解，制备得到5-、6-取代罗丹明异构纯化合物。这种方法优点是产率较高，但是步骤多，操作复杂。综上所述，开发一种简便、廉价分离5(6)-羧基罗丹明异构体的方法仍然是一个尚未圆满解决的问题。
电泳是带电分子在电场作用下向所带电荷相反的电极迁移的现象。含有酸性和碱性基团的两性分子，如蛋白质，多肽，核酸等在非等电点条件下都带有电荷，在电场的作用下，它们会向所带电荷相反的电极迁移。由于不同的分子其所带电荷量，分子大小，形状等具有差异，所以不同的分子以不同的迁移速度运动，从而可以实现分离，鉴定，纯化和制备。琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法，其应用非常广泛，从各类小分子如：氨基酸、多肽、激素、核苷酸到复杂的大分子如：蛋白质、核酸甚至病毒颗粒的分离、鉴定都可以使用。如果采用大型设备也可以实现化合物的规模化分离。
5(6)-羧基罗丹明类化合物是具有氨基和羧基的两性化合物，可以看做是一种特殊的氨基酸。由于5-、6-羧基罗丹明化合物结构的差异，在特定的pH值条件下其可电离基团发生电离的程度会有所不同，因此它们具有不同的等电点。当5(6)-羧基罗丹明混合物在一定条件下进行电泳时，5-羧基罗丹明和6-羧基罗丹明会因为迁移率不同而被分离。本发明利用这一特点，用琼脂糖凝胶电泳法构建了一种分离5(6)-羧基罗丹明异构体的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用琼脂糖凝胶电泳分离5(6)-羧基罗丹明异构体的方法。该方法根据5-、6-羧基罗丹明化合物具有不同等电点的特点，通过琼脂糖凝胶电泳将5(6)-羧基罗丹明混合物进行分离，从而得到异构纯的5-、6-羧基罗丹明化合物。该方法具有简便、廉价、可工业化生产的特点，具广阔的应用前景。
本发明的目的是这样实现的，所述的一种分离5(6)-羧基罗丹明异构体的方法，包括如下步骤：
（1）样品的准备
将5-羧基罗丹明和6-羧基罗丹明的混合物溶于溶剂中，配制成一定浓度的溶液，将其在一定温度下超声分散一定时间后获得样品溶液，备用；
（2）凝胶的制备
制备一定浓度的琼脂糖凝胶液，将其冷却到65℃后小心地倒入电泳槽内的有机玻璃内槽中，添加一定pH值的Tris碱缓冲溶液至没过凝胶板为止；
（3）电泳分离
用移液器将步骤（1）的样品溶液加到样品孔中，控制一定的电场强度，对凝胶板通电进行电泳，当凝胶上原有的一条样品谱带在移动中分裂为两条紫红色谱带后，结束电泳。
（4）样品后处理
取出凝胶板后，用小刀将两个谱带的凝胶切割分离，分别将两个胶带研磨后用有机溶剂萃取，浓缩萃取液即可分别得到异构纯的5-羧基罗丹明化合物、6-羧基罗丹明化合物。
所述的5-羧基罗丹明异构体或6-羧基罗丹明异构体具有下列结构通式：
其中：R1、R2、R3同时为氢，或者R1、R2、R3选自氢、2-6个碳原子烷基中的一种。
所述步骤（1）中溶剂为无水乙醇、丙酮、乙醚、乙酸乙酯、甲醇或含有上述溶剂与水的任意比率的水溶液。
所述步骤（1）中样品溶液的浓度在0.02 ~4 mol/L之间。
步骤（1）中所述的一定温度在10~50℃之间；步骤（1）中所述的一定时间在10~120分钟之间。
所述步骤（2）中琼脂糖凝胶液的浓度在0.5～2wt%之间。
所述步骤（2）中pH值在4~10.5之间，其Tris碱缓冲溶液的浓度为0.04~2.00 mol/L。
所述步骤（2）中Tris碱缓冲溶液选自Tris-乙酸、Tris-磷酸或Tris-硼酸。
步骤（3）中所述的一定电场强度在0.5 ~20 V/cm之间。
所述步骤（4）中有机溶剂至少有一种选自甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、氯仿或乙醚。
具体地说，本发明所分离的5(6)-羧基罗丹明异构体具有下列结构通式：
其中：R1、R2、R3可以同时为氢，或者R1、R2、R3选自氢、2-6个碳原子烷基中的一种。
本发明所述的利用琼脂糖凝胶电泳分离5(6)-羧基罗丹明异构体的方法，具体步骤如下：
（1）样品的准备
将5-羧基罗丹明和6-羧基罗丹明的混合物溶于溶剂中，配制成一定浓度的溶液。将其在一定温度下超声分散一定时间后获得样品溶液，备用。
（2）凝胶的制备
制备一定浓度的琼脂糖凝胶液，将其冷却到65℃后小心地倒入电泳槽内的有机玻璃内槽中，添加一定pH值的Tris碱缓冲溶液至没过凝胶板为止。
（3）电泳分离
用移液器将步骤（1）的样品溶液加到样品孔中。控制一定的电场强度，对凝胶板通电进行电泳。当凝胶上原有的一条样品谱带在移动中分裂为两条紫红色谱带后，结束电泳。
（4）样品后处理
取出凝胶板后，用小刀将两个谱带的凝胶切割分离。分别将两个胶带研磨后用有机溶剂萃取。浓缩萃取液即可分别得到异构纯的5-羧基罗丹明化合物、6-羧基罗丹明化合物。
所述步骤（1）中溶剂为无水乙醇、丙酮、乙醚、乙酸乙酯、甲醇或含有上述溶剂与水的任意比率的水溶液。
所述步骤（1）中样品溶液的浓度在0.02 ~4 mol/L之间。
所述步骤（1）中一定温度在10~50℃之间。
所述步骤（1）中一定时间在10~120分钟之间。
所述步骤（2）中琼脂糖凝胶液的浓度在0.5～2 wt%之间。
所述步骤（2）中pH值在4~10.5之间，其Tris碱浓度为0.09 ~2mol/L。
所述步骤（2）中Tris碱缓冲溶液为Tris-乙酸、Tris-磷酸或Tris-硼酸中的一种。
所述步骤（3）中一定的电场强度在0.5 ~20 V/cm之间。
所述步骤（4）中有机溶剂至少有一种选自甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、氯仿或乙醚。
本方法得到的5-、6-羧基罗丹明化合物经高效液相色谱检测纯度可达95%以上，完全可以满足制备荧光探针的需要。本方法是基于5(6)-羧基罗丹明化合物的结构差异进行分离，因此具有一定的普遍性。采用实验用凝胶色谱仪单次实验异构体产量可达1g。如果采用大型凝胶色谱仪单次实验的产量可达10g，这对于用量少且附加值高的5-、6-羧基罗丹明化合物来说，具有准工业化生产的意义。
本发明的有益效果是：提供了一种简单，方便，经济的分离5(6)-羧基罗丹明异构体的方法。该方法通过放大可以实现规模生产，具有良好的工业化前景。
附图说明
图 1 为实施例1的电泳结束时两种异构体分离的情况图，图中：1a为日光下分离的情况图，1b为紫外光下分离的情况图。
图 2 为实施例2的电泳结束时两种异构体分离的情况图，图中：2a为日光下分离的情况图，2b为紫外光下分离的情况图。
图 3 为实施例3的电泳结束时两种异构体分离的情况图，图中：3a为日光下分离的情况图，3b为紫外光下分离的情况图。
图4为功能化5(6)-羧基罗丹明探针结构示意图。
具体实施方式
实施例1：分离5(6)-羧基罗丹明1
5、6-羧基罗丹明1结构如下：
5-羧基罗丹明1 6-羧基罗丹明1
（1）样品的准备
5(6)-羧基罗丹明1混合物参考文献合成（Chem. Eur. J. 2012, 18, 2700-2706.）。将1.0g苯三酸酐和1.0g 3-二甲氨基苯酚加入三口烧瓶中，在N2保护下搅拌。将反应物在3h内升温至160℃，再加入0.5g 3-二甲氨基苯酚和3mL的浓磷酸。加热至175℃，反应2h。冷却至室温后加入60mL的甲醇和40mL的水，室温搅拌4h。用二氯甲烷萃取，减压蒸除溶剂后得5(6)-羧基罗丹明1混合物（即5-羧基罗丹明1和6-羧基罗丹明1的混合物）1.96g。
取上述5-羧基罗丹明1和6-羧基罗丹明1的混合物0.4329g溶于5mL甲醇中，配制成浓度为0.2mol/L的样品溶液。将其在20℃下超声分散50分钟，备用。
（2）凝胶的制备
制备1wt%浓度的琼脂糖凝胶液，将其冷却到65℃后小心地倒入电泳槽内的有机玻璃内槽中，添加Tris碱浓度为0.09 mol/L、pH值为6.3的Tris-乙酸缓冲溶液至没过凝胶板为止。
（3）电泳分离
用移液器将样品溶液加到样品孔中。控制电场强度为0.5V/cm，对凝胶板通电进行电泳。当凝胶上原有的一条样品谱带在移动中分裂为两条紫红色谱带后（见图1），结束电泳。
（4）样品后处理
取出凝胶板后，用小刀将两个谱带的凝胶切割分离。分别将两个胶带研磨后用甲醇萃取。浓缩萃取液得到异构纯的5-羧基罗丹明化合物0.2101g，产率：49%、6-羧基罗丹明化合物0.2034g，产率：47%，HRMS：433.1860（M+1）。
实施例2：分离5(6)-羧基罗丹明2
5、6-羧基罗丹明2结构如下：
5-羧基罗丹明2 6-羧基罗丹明2
（1）样品的准备
5(6)-羧基罗丹明2混合物参考文献合成（Chem. Eur. J. 2012, 18, 2700-2706.）。将1.0g苯三酸酐和1.1g 4-甲基-3-二甲氨基苯酚加入三口烧瓶中，在N2保护下搅拌。将反应物在3h内升温至160℃，再加入0.6g 4-甲基-3-二甲氨基苯酚和3mL的浓磷酸。加热至175℃，反应2h。冷却至室温后加入60mL的甲醇和40mL的水，室温搅拌4h。用二氯甲烷萃取，减压蒸除溶剂后得5(6)-羧基罗丹明2混合物（即5-羧基罗丹明2和6-羧基罗丹明2的混合物）2.49g。
取上述5-羧基罗丹明2和6-羧基罗丹明2的混合物1.0346g溶于5mL乙醇中，配制成浓度为0.4mol/L的样品溶液。将其在40℃下超声分散100分钟，备用。
（2）凝胶的制备
制备1.5wt%浓度的琼脂糖凝胶液，将其冷却到65℃后小心地倒入电泳槽内的有机玻璃内槽中，添加Tris碱浓度为1.00 mol/L、pH值为6.7的Tris-硼酸缓冲溶液至没过凝胶板为止。
（3）电泳分离
用移液器将样品溶液加到样品孔中。控制电场强度为1.5V/cm，对凝胶板通电进行电泳。当凝胶上原有的一条样品谱带在移动中分裂为两条紫红色谱带后（见图2），结束电泳。
（4）样品后处理
取出凝胶板后，用小刀将两个谱带的凝胶切割分离。分别将两个胶带研磨后用甲醇萃取。浓缩萃取液得到异构纯的5-羧基罗丹明化合物0.5001g，产率：48%、6-羧基罗丹明化合物0.4914g，产率：47%，HRMS：517.5314（M+1）。
实施例3：分离5(6)-羧基罗丹明3
5、6-羧基罗丹明3结构如下：
5-羧基罗丹明3 6-羧基罗丹明3
（1）样品的准备
5(6)-羧基罗丹明3混合物参考文献合成（Chem. Eur. J. 2012, 18, 2700-2706.）。将1.0g苯三酸酐和1.2g 8-羟基久洛尼定加入三口烧瓶中，在N2保护下搅拌。将反应物在3h内升温至160℃，再加入0.7g 8-羟基久洛尼定和3mL的浓磷酸。加热至175℃，反应2h。冷却至室温后加入60mL的甲醇和40mL的水，室温搅拌4h。用二氯甲烷萃取，减压蒸除溶剂后得5(6)-羧基罗丹明3混合物（即5-羧基罗丹明3和6-羧基罗丹明3的混合物）2.69g。
取上述5-羧基罗丹明3和6-羧基罗丹明3的混合物2.1476g溶于4mL乙醇中，配制成浓度为1mol/L的样品溶液。将其在50℃下超声分散120分钟，备用。
（2）凝胶的制备
制备2wt%浓度的琼脂糖凝胶液，将其冷却到65℃后小心地倒入电泳槽内的有机玻璃内槽中，添加Tris碱浓度为2.00 mol/L、pH值为7.7的Tris-磷酸缓冲溶液至没过凝胶板为止。
（3）电泳分离
用移液器将样品溶液加到样品孔中。控制电场强度为5V/cm，对凝胶板通电进行电泳。当凝胶上原有的一条样品谱带在移动中分裂为两条紫红色谱带后（见图3），结束电泳。
（4）样品后处理
取出凝胶板后，用小刀将两个谱带的凝胶切割分离。分别将两个胶带研磨后用甲醇萃取。浓缩萃取液得到异构纯的5-羧基罗丹明化合物1.0030g，产率：47%、6-羧基罗丹明化合物0.9748g，产率：45%，HRMS：537.2766（M+1）。
Claims (4)
1.一种分离5(6)-羧基罗丹明异构体的方法，包括如下步骤：
（1）样品的准备
将5-羧基罗丹明和6-羧基罗丹明的混合物溶于溶剂中，配制成一定浓度的溶液，将其在一定温度下超声分散一定时间后获得样品溶液，备用；
（2）凝胶的制备
制备一定浓度的琼脂糖凝胶液，将其冷却到65℃后小心地倒入电泳槽内的有机玻璃内槽中，添加一定pH值的Tris碱缓冲溶液至没过凝胶板为止；
（3）电泳分离
用移液器将步骤（1）的样品溶液加到样品孔中，控制一定的电场强度，对凝胶板通电进行电泳，当凝胶上原有的一条样品谱带在移动中分裂为两条紫红色谱带后，结束电泳；
（4）样品后处理
取出凝胶板后，用小刀将两个谱带的凝胶切割分离，分别将两个胶带研磨后用有机溶剂萃取，浓缩萃取液即可分别得到异构纯的5-羧基罗丹明化合物、6-羧基罗丹明化合物；
所述的5-羧基罗丹明异构体或6-羧基罗丹明异构体具有下列结构通式：
其中：R1、R2、R3同时为氢，或者R1、R2、R3选自氢、2-6个碳原子烷基中的一种；
所述步骤（1）中溶剂为无水乙醇、丙酮、乙醚、乙酸乙酯、甲醇或含有上述溶剂与水的任意比率的水溶液；
所述步骤（1）中样品溶液的浓度在0.02 ~4 mol/L之间；
所述步骤（1）中所述的一定温度在10~50℃之间；步骤（1）中所述的一定时间在10~120分钟之间；
所述步骤（2）中琼脂糖凝胶液的浓度在0.5～2wt%之间；
所述步骤（2）中Tris碱缓冲溶液的pH值在4~10.5之间，Tris碱缓冲溶液的浓度为0.04~2.00 mol/L。
2.根据权利要求1所述的一种分离5(6)-羧基罗丹明异构体的方法，其特征在于步骤（3）中所述的一定电场强度在0.5 ~20 V/cm之间。
3.根据权利要求1或2所述的一种分离5(6)-羧基罗丹明异构体的方法，其特征在于所述步骤（2）中Tris碱缓冲溶液选自Tris-乙酸、Tris-磷酸或Tris-硼酸。
4.根据权利要求1或2所述的一种分离5(6)-羧基罗丹明异构体的方法，其特征在于所述步骤（4）中有机溶剂至少有一种选自甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、氯仿或乙醚。
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20170118 Termination date: 20180213 |