CN104592383B - CyHV‑2单克隆抗体、杂交瘤细胞和应用 - Google Patents

CyHV‑2单克隆抗体、杂交瘤细胞和应用 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种CyHV‑2单克隆抗体、杂交瘤细胞和应用。本申请的CyHV‑2单克隆抗体，由保藏号CCTCC No.C2013114的杂交瘤细胞GFHNV‑6G7或保藏号CCTCC No.C2013115的杂交瘤细胞GFHNV‑3B5分泌产生。本申请的CyHV‑2单克隆抗体具备良好的特异性和效价，将其制成快速免疫检测试纸，不仅能够提高检测速度和检测效率，而且能够实现鲤科疱疹病毒‑2的现场检测。本申请的CyHV‑2单克隆抗体填补了鲤科疱疹病毒‑2免疫检测的空缺，为鲤科疱疹病毒‑2的免疫学研究奠定了基础。

Description

CyHV-2单克隆抗体、杂交瘤细胞和应用
技术领域
本申请涉及单克隆抗体领域，特别是涉及用于CyHV-2的单克隆抗体，分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞，以及该单克隆抗体的应用。
背景技术
鲤科疱疹病毒-2(cyprinid herpesvirus 2，简写CyHV-2)是疱疹病毒性造血器官坏死病的病原，能引起养殖的金鱼、鲫鱼大量死亡。2011～2012年，在我国中部地区的养殖鲫鱼暴发了该病，造成了极高的死亡率(Wang等，2012)。2011年，我国出口马来西亚的金鱼被通报检出CyHV-2，同年江苏省暴发鲫鱼大量死亡，深圳局动植中心水生室派人采样后，通过分子生物学方法检测到CyHV-2，并且通过电镜检测成功在脾脏和肾脏中观察到了该病毒颗粒。可见，疱疹病毒性造血器官坏死病已经传入我国，并已对我国金鱼养殖业及金鱼出口贸易造成了严重的影响。目前，新加坡、马来西亚等国家明确要求对进口到国内的金鱼要求出具金鱼造血器官坏死病的健康证书。因此加强对该病的研究，对于我国鲤科鱼类养殖业和进出口贸易的健康发展具有重要意义。
目前对CyHV-2的检测鉴定主要包括细胞培养分离技术、分子检测和电镜观察。细胞培养分离技术是最准确的诊断方法，但是，研究发现CyHV-2很难在鱼类病毒分离常用的细胞系中进行增殖。分子检测方面，特别是PCR法是目前较为精确检测CyHV-2感染的方法，因为它可以检测到组织中极微量的病毒DNA；但分子检测需要变温PCR扩增仪器，为现场的快速诊断带来了不便。电镜观察是最直接的方法，但是，同样的需要特殊的检测设备，并且也不便于现场快速诊断检测。
现有的对金鱼疱疹病毒性造血器官坏死病的检测方法主要是PCR、组织病理学等方法，检测方法相对单一；而免疫学研究相对缺乏或滞后，尚无用于该病的免疫学检测方法。因此，进一步加强免疫学的研究，建立新的、更可靠的免疫学检测方法，成为当前对该病研究的重要任务。
发明内容
本申请的目的是提供新的CyHV-2的单克隆抗体，分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞，以及该单克隆抗体的应用。
为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：
本申请一方面公开了一种CyHV-2单克隆抗体，该单克隆抗体由保藏号CCTCCNo.C2013114的杂交瘤细胞GFHNV-6G7或保藏号CCTCC No.C2013115的杂交瘤细胞GFHNV-3B5分泌产生。其中杂交瘤细胞GFHNV-6G7于2013年9月13号保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No.C2013114；杂交瘤细胞GFHNV-3B5于2013年9月13号保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No.C2013115。
需要说明的是，本申请在对CyHV-2进行研究时，获得了两个杂交瘤细胞，都能够分泌产生高效价的CyHV-2单克隆抗体，因此，分别对其进行了保藏；可以理解，保藏号CCTCCNo.C2013114的杂交瘤细胞GFHNV-6G7或保藏号CCTCC No.C2013115的杂交瘤细胞GFHNV-3B5分泌产生的CyHV-2单克隆抗体都可以用于本申请。
本申请率先研制出了CyHV-2的单克隆抗体，为CyHV-2的免疫学检测以及后续研究奠定了基础；可以理解，本申请的CyHV-2单克隆抗体具备良好的特异性和效价，因此可以用于CyHV-2检测。
本申请的另一面公开了，本申请的单克隆抗体在制备CyHV-2检测试剂或设备中的应用。
需要说明的是，本申请中检测试剂或用于相关检测的设备，包括现有的以免疫学为基础的各种检测试剂或设备，如与胶体金免疫层析相结合的快速检测试纸条或试纸卡等，在此不做具体限定；可以理解，本申请的CyHV-2单克隆抗体具备良好的特异性和效价，只要将现有试纸中的抗体替换成本申请的CyHV-2单克隆抗体，即可得到CyHV-2快速检测试纸，不仅可以提高CyHV-2的检测速度和检测效率，而且无需特殊设备，可以很方便进行现场诊断检测。
本申请的另一面公开了一种CyHV-2酶联免疫检测试剂盒，该试剂盒中含有本申请的单克隆抗体。可以理解，本申请的试剂盒以是简单的以试剂形式存在的CyHV-2单克隆抗体，以供实验室进行CyHV-2的免疫学研究；也可以是含有的CyHV-2单克隆抗体的快速检测试纸，以方便检验检疫实践使用；在此不做具体限定。
本申请的再一面公开了分泌CyHV-2单克隆抗体的杂交瘤细胞，其保藏号为CCTCCNo.C2013114或CCTCC No.C2013115。
本申请的杂交瘤细胞能够有效的分泌出特异性强、效价高的CyHV-2单克隆抗体，即本申请的CyHV-2单克隆抗体，为大批量生产本申请的CyHV-2单克隆抗体或含有该单克隆抗体的试剂盒奠定了基础。需要说明的是，本申请在对CyHV-2进行研究时，获得了两个杂交瘤细胞，因此分别对其进行了保藏。
由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：
本申请的CyHV-2单克隆抗体具备良好的特异性和效价，将其制成快速免疫检测试纸，不仅能够提高检测速度和检测效率，而且能够实现鲤科疱疹病毒-2的现场检测。本申请的CyHV-2单克隆抗体填补了鲤科疱疹病毒-2免疫检测的空缺，为鲤科疱疹病毒-2的免疫学研究奠定了基础。
本申请中有两株分泌CyHV-2单克隆抗体的杂交瘤细胞，杂交瘤细胞GFHNV-6G7，其微生物保藏号为：CCTCC No.C2013114；分类命名为：杂交瘤细胞hybridoma cell；保藏时间为：2013年9月13日；保藏单位是：中国典型培养物保藏中心；保藏地址是：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心。杂交瘤细胞GFHNV-3B5，其微生物保藏号为：CCTCCNo.C2013115；分类命名为：杂交瘤细胞hybridoma cell；保藏时间为：2013年9月13日；保藏单位是：中国典型培养物保藏中心；保藏地址是：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心。
具体实施方式
CyHV-2对我国的金鱼养殖和进出口贸易影响重大，因此，对其进行流行病学、理化特性、基因组学以及免疫学研究，建立多种免疫学快速检测方法；对了解金鱼疱疹病毒性造血器官坏死病在我国的流行情况，保障我国水产养殖业和进出口贸易健康发展尤为重要。本申请的CyHV-2单克隆抗体正是以上研究成果中的一部分。
下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。
实施例
一、材料与方法
1.病毒抗原和试剂
CyHV-2抗原：来自受CyHV-2感染的病鱼组织，取组织研磨样品，蔗糖梯度离心纯化。大肠杆菌TG1由中国科学院水生生物研究所戴和平研究员提供。
2YT培养基：称取17g胰蛋白胨，10g酵母抽提物，5g NaCl，溶于双蒸水中，定容至1L，高压蒸气灭菌。配固体培养基，再加入15g琼脂粉，高压蒸气灭菌。
SOBAG培养基：称取20g胰蛋白胨，5g酵母抽提物，0.5g NaCl，溶于双蒸水中，定容至1L。配固体培养基，再加入15g琼脂粉。高压蒸气灭菌。待冷却到40-50℃时加入已灭菌的10mL 1M MgCl2，使Amp为100μg/mL，葡萄糖含量为2％。
2.CyHV-2单克隆抗体制备
2.1免疫
使用CyHV-2抗原对五个小鼠进行免疫，第1天用无菌生理盐水将病毒液稀释成5倍后与QuickAntibody-Mouse5W佐剂1:1的混合，后腿肌肉注射100ul/只。第21天同首次免疫剂量，加强免疫，第35天断尾采血检测。
2.2血清检测
2.2.1血清效价检测
将CyHV-2抗原稀释1500倍后包被100ul/孔，4℃过夜；第二天用3％的脱脂奶粉封闭120ul/孔1h；将取自5个小鼠的血清分别稀释1000倍、2000倍、4000倍和8000倍，每孔50ulPBS，50ul稀释好的血清，37℃孵育30min；洗涤，加入用PBST稀释8000倍的酶标二抗，100ul/孔，37℃孵育30min；洗涤，加入显色液100ul/孔，37℃孵育15min；用2M的硫酸终止，在450nm处读数。
2.2.2血清抑制率检测
将CyHV-2抗原稀释1500倍后包被100ul/孔，4℃过夜；第二天用3％的脱脂奶粉封闭120ul/孔1h；将取自5个小鼠的血清分别稀释1000倍、100倍和10倍，每孔50ul不同稀释倍数的病毒悬液，50ul稀释好的血清，同时用PBS作对照，37℃孵育30min；洗涤，加入用PBST稀释8000倍的酶标二抗，100ul/孔，37℃孵育30min；洗涤，加入显色液100ul/孔，37℃孵育15min；用2M的硫酸终止，在450nm处读数。
2.3融合
细胞融合前两周复苏SP2/0骨髓瘤细胞，融合前两天培养5瓶SP2/0骨髓瘤细胞。融合时收获SP2/0，离心，用RPMI-1640洗涤两次，加入20ml RPMI-1640悬浮，计数。取效价较高的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，配制成悬浮液。吸取含有1×108个脾细胞和2×107个骨髓瘤细胞的悬浮液，加入50ml离心管中，补加不完全培养液至30ml，充分混匀。1000rpm离心8min，将上清液尽量弃去。轻轻弹击管底，使沉淀细胞松散均匀成糊状。一手均匀转动离心管，另一手用l ml吸管吸取1m150％PEG3000溶液沿转动的管壁加入，从加入到加完的时间控制在60s左右，然后立即将细胞悬液全部吸入吸管，静置30s，再将其吹入离心管内，时间也控制30s左右。立即在5min内加入25ml不完全培养液使PEG稀释而失去促融作用。1000rpm离心5min，弃去上清。加入HAT培养液，10ml/板，轻轻吹吸沉淀的细胞，使其悬浮并混匀。将细胞悬液加入铺有饲养细胞的96孔培养板中，每孔0.1ml。培养板置37℃，含8％CO2的培养箱内培养。
2.4融合后检测
2.4.1融合后阳性孔筛选
将免疫原稀释1500倍后包被100ul/孔，4℃过夜；第二天用3％的脱脂奶粉封闭120ul/孔1h；每孔50ul PBS，50ul细胞上清液，37℃孵育30min；洗涤，加入用PBST稀释8000倍的酶标二抗，100ul/孔，37℃孵育30min；洗涤，加入显色液100ul/孔，37℃孵育15min；用2M的硫酸终止，在450nm处读数。
2.4.2阳性孔特异性检测
将免疫原稀释1500倍后包被100ul/孔，4℃过夜；第二天用3％的脱脂奶粉封闭120ul/孔1小时；将细胞培养上清稀释适合的倍数，每孔50ul不同稀释倍数的病毒悬液，50ul稀释好的细胞上清，同时用PBS作对照，37℃孵育30min；洗涤，加入用PBST稀释8000倍的酶标二抗，100ul/孔，37℃孵育30min；洗涤，加入显色液100ul/孔，37℃孵育15min；用2M的硫酸终止，在450nm处读数。
2.5单克隆抗体及筛选检测
有限稀释法进行克隆，克隆5天后挑选单个克隆孔，10天左右检测。
2.5.1单克隆筛选
CyHV-2病毒悬液稀释1500倍后包被100ul/孔，4℃过夜；第二天用3％的脱脂奶粉封闭120ul/孔1h；每孔50ul PBS，50ul细胞上清液。37℃孵育30分钟；洗涤，加入用PBST稀释8000倍的酶标二抗，100ul/孔，37℃孵育30min；洗涤，加入显色液100ul/孔，37℃孵育15min；用2M的硫酸终止，在450nm处读数。
2.5.2单克隆孔特异性检测
将阴性样本及免疫原分别稀释1500倍后包被100ul/孔，4℃过夜；第二天用3％的脱脂奶粉封闭120ul/孔1h；将细胞培养上清稀释适合的倍数，每孔100ul，同时用PBS作对照，37℃孵育30min；洗涤，加入用PBST稀释8000倍的酶标二抗，100ul/孔，37℃孵育30min；洗涤，加入显色液100ul/孔，37℃孵育15min；用2M的硫酸终止，在450nm处读数。
二、实验结果
1.小鼠血清效价检测实验结果
小鼠血清效价检测和血清抑制率检测如表1和表2所示。
表1 血清效价检测
表2 血清抑制率检测
表1和表2的结果显示，4号小鼠所产生的血清效价最高，血清抑制率也是最高，稀释100倍后仍然可以达到72.26285％。因此，以取自4号小鼠的脾细胞进行后续的细胞融合。
2.融合后阳性孔的筛选结果
本例采用了六个96孔板进行阳性筛选，结果如表3-表8所示。
表3 第一板的筛选结果
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0.118 0.104 0.095 0.111 0.127 0.207 0.138 0.129 0.111 0.094 1.796 0.145
B 0.124 0.104 0.494 0.101 0.103 0.097 0.12 0.109 0.128 0.13 0.115 0.144
C 0.112 0.079 0.087 0.094 0.09 0.845 0.127 0.111 0.092 0.089 0.159 0.12
D 0.097 0.099 0.104 0.096 0.102 2.313 0.821 0.13 0.113 0.12 0.342 0.135
E 0.114 0.134 0.1 0.094 0.099 0.112 0.104 0.104 0.113 0.106 0.318 0.117
F 0.134 0.118 0.098 0.106 0.117 0.123 1.266 0.091 0.103 0.117 0.111 0.117
G 0.118 0.101 0.096 0.118 0.108 0.124 0.121 0.143 0.12 0.12 0.114 0.95
H 0.132 0.132 0.127 0.139 0.137 0.147 0.168 0.12 0.119 0.122 0.123 0.127
表4 第二板的筛选结果
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0.125 0.121 0.084 0.108 0.169 0.343 0.185 0.103 0.271 0.232 0.142 0.126
B 0.105 0.127 0.105 0.119 0.105 0.122 0.11 0.128 0.149 0.107 0.106 0.123
C 0.1 0.098 0.153 0.093 0.095 0.125 0.095 0.082 0.103 0.121 0.108 0.114
D 0.095 0.253 0.092 0.088 0.102 0.11 0.111 0.3 0.117 0.131 0.116 0.107
E 0.094 0.088 0.082 0.092 0.096 0.114 0.13 0.09 0.126 0.112 0.128 1.26
F 0.098 0.113 0.63 0.108 0.109 0.129 0.139 0.131 0.098 0.16 0.136 0.141
G 0.111 0.095 0.097 0.103 0.153 0.095 0.139 0.116 0.096 0.139 0.116 0.147
H 0.116 0.117 0.104 1.41 0.108 0.104 0.135 0.135 0.135 0.137 0.15 0.144
表5 第三板的筛选结果
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0.202 0.173 0.163 0.2 0.35 0.228 0.123 0.256 0.149 0.246 0.271 0.312
B 0.166 0.14 0.422 0.132 0.157 0.393 0.164 0.183 0.21 0.193 0.207 0.192
C 0.16 0.125 0.124 0.115 0.156 0.173 0.124 0.17 0.175 0.181 0.173 0.161
D 0.166 0.137 0.159 0.125 0.13 0.168 0.309 0.163 1.299 0.205 0.38 0.165
E 0.191 0.154 0.288 0.177 0.164 0.183 0.177 0.127 0.188 0.176 0.149 0.195
F 0.189 0.178 0.166 0.17 0.166 0.158 0.192 0.177 0.199 0.203 0.187 0.193
G 0.274 0.175 0.177 0.163 0.144 0.184 0.188 0.24 0.184 0.22 0.197 0.198
H 0.153 0.157 0.174 0.154 0.188 0.188 0.35 0.155 0.234 0.275 0.183 0.281
表6 第四板的筛选结果
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0.216 0.148 0.132 0.181 0.158 0.155 0.139 0.168 0.128 0.11 0.095 0.114
B 0.208 0.176 0.168 1.171 0.163 0.176 0.186 0.163 0.179 0.176 0.145 0.121
C 0.174 0.159 0.161 0.146 0.152 0.164 0.149 0.157 0.208 1.118 0.134 0.12
D 0.184 0.19 0.194 0.177 0.22 0.165 0.177 0.201 0.19 0.192 0.158 0.166
E 0.204 0.158 0.169 0.17 0.176 0.144 0.155 0.167 0.165 0.156 0.141 0.123
F 0.166 0.161 0.182 0.166 0.183 0.164 0.173 0.168 0.393 0.169 0.471 0.127
G 0.178 0.201 0.238 0.165 2.772 0.166 0.175 0.173 0.165 0.182 0.183 0.152
H 0.188 0.301 0.276 0.174 0.271 0.199 0.201 0.169 0.177 0.185 0.184 2.085
表7 第五板的筛选结果
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0.158 0.163 0.168 0.132 0.147 0.121 0.368 0.224 0.235 0.244 0.188 0.154
B 0.882 0.148 1.028 0.135 0.119 0.328 0.14 0.131 0.134 0.147 0.104 0.139
C 0.184 0.123 0.125 0.119 0.138 0.126 0.129 0.123 0.134 0.125 0.128 0.127
D 0.14 0.464 0.791 0.136 0.141 0.115 0.124 0.124 0.14 0.119 0.172 0.13
E 0.148 0.083 0.113 0.121 0.134 0.135 0.156 0.126 0.127 0.125 0.169 0.127
F 0.136 0.116 0.128 0.137 0.134 0.137 0.126 0.13 0.138 0.189 0.132 0.192
G 0.13 0.217 0.128 0.133 0.129 0.119 0.144 0.123 0.122 0.13 0.126 0.116
H 0.133 0.147 0.159 0.152 0.442 0.138 0.151 0.126 0.131 0.132 0.133 0.142
表8 第六板的筛选结果
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0.172 0.328 0.131 0.138 0.125 0.124 0.18 0.122 0.135 0.099 0.116 0.14
B 0.574 0.237 0.141 0.172 0.154 0.112 0.169 0.137 0.131 1.085 0.141 0.118
C 0.187 0.141 0.302 0.125 2.04 0.129 0.135 0.097 0.138 0.142 0.361 0.136
D 0.188 0.141 0.145 0.143 0.138 0.135 0.148 0.13 0.141 0.138 0.168 0.12
E 0.144 0.13 0.139 0.114 0.126 0.152 0.15 0.108 0.142 0.185 0.119 0.127
F 1.147 0.182 0.144 0.122 0.125 0.119 0.119 0.112 0.135 0.132 0.136 0.129
G 0.134 0.143 0.143 0.13 0.135 0.134 0.132 0.102 0.126 0.121 0.167 0.118
H 0.271 0.163 0.334 0.16 0.17 0.157 0.104 0.095 0.304 0.159 0.128 0.128
表3-表8的结果显示，本例筛选出了1A11、1C6、1D6、1D7、1F7、1G12、2E12、2H4、3D9、4B4、4C10、4G5、4H12、5B3、5D3、6B10、6C5和6F1等十八个阳性孔。其中第一位数字表示96孔板编号“1”为第一板、“2”为第二板，大写字母及其后面的数字表示96孔板上的空位；例如“3D9”表示第三板上的D排第9列的孔。
对筛选出的阳性孔进行进一步的特异性检测，部分结果如表9所示。
表9 阳性孔特异性检测试验结果
细胞编号 上清稀释倍数 PBS 1/1000病毒 抑制率％
1D6 10× 2.022 0.795 60.68249
1F7 2× 1.095 0.312 71.50685
1A11 4× 1.185 1.596 -34.6835
1G12 1× 0.983 2.718 -176.501
2F3 1× 0.447 0.652 -45.8613
2H4 2× 1.569 1.861 -18.6106
2E12 2× 1.241 1.427 -14.9879
3D9 2× 0.963 2.564 -166.251
4B4 2× 0.222 0.195 12.16216
4G5 1× 2.509 1.672 33.3599
4C10 2× 0.434 0.328 24.42396
4H12 5× 1.916 2.045 -6.73278
5B3 2× 0.592 0.088 85.13514
5D3 1× 0.553 0.199 64.01447
6F1 2× 0.778 0.808 -3.85604
6C5 5× 1.807 0.248 86.27559
6B10 2× 0.736 0.136 81.52174
表9的结果显示，1D6、1F7、5B3、5D3、6C5和6B10的抑制效果较好。将1D6、1G12、6C5和6B10进行单克隆亚克隆。
3.单克隆检测结果
6B10、6C5、1D6和1G12亚克隆后的进行的单克隆检测结果依序如表10-表13所示。
表10 6B10单克隆筛选试验结果
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 1.283 0.944 1.671 0.181 1.704 0.217 0.085 0.084 0.083 0.086 0.08 2.088
B 0.639 1.83 0.244 0.107 0.099 1.551 0.111 0.666 0.102 1.987 0.182 0.127
C 0.085 0.08 1.839 0.125 0.101 0.138 0.112 0.107 0.487 0.086 0.135 0.173
D 0.087 1.834 0.114 0.191 0.146 0.108 0.116 0.179 0.102 0.098 0.168 0.096
E 0.123 1.558 0.161 0.078 0.101 0.092 0.104 0.085 1.822 0.073 0.083 0.112
F 0.082 0.082 0.082 0.086 0.092 0.093 0.145 0.084 0.082 0.124 0.082 0.084
G 0.077 0.084 0.076 1.735 0.088 0.087 0.104 1.856 0.243 1.591 2.053 0.402
H 0.077 0.086 0.078 0.251 0.09 0.119 0.107 0.099 0.084 0.084 0.088 0.104
表11 6C5单克隆筛选试验结果
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 2.649 0.554 0.718 1.08 0.267 0.198 2.578 0.167 1.21 0.429 0.826 0.782
B 0.252 2.071 0.339 0.277 0.501 0.955 0.203 2.657 1.017 2.009 2.675 2.13
C 2.674 1.372 1.119 0.256 0.295 0.571 0.574 0.419 2.907 0.207 0.634 2.464
D 2.697 0.222 0.504 0.255 2.625 0.245 0.202 0.173 0.383 2.671 0.184 0.335
E 0.568 0.293 0.638 0.244 1.744 0.924 0.416 1.533 0.391 2.138 0.23 0.745
F 0.295 1.149 1.062 0.785 0.257 0.413 1.426 0.409 0.53 0.34 0.451 0.819
G 2.786 1.626 0.609 0.552 0.467 0.897 0.605 0.934 1.288 0.588 0.594 2.878
H 2.868 2.83 2.924 1.058 2.279 2.774 2.067 1.119 1.812 2.106 1.994 1.323
表12 1D6单克隆筛选试验结果
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0.101 0.091 2.812 2.696 0.103 2.715 2.715 0.09 0.096 2.777 0.092 0.108
B 2.677 0.103 2.881 0.105 0.113 2.853 2.814 0.138 0.11 2.84 2.779 0.124
C 0.09 0.098 2.786 2.766 2.766 2.786 1.088 2.841 0.098 0.133 0.106 0.105
D 2.691 2.699 0.105 2.717 0.124 2.764 0.126 0.707 2.805 2.754 0.096 0.107
E 2.849 0.119 0.088 0.344 0.098 0.124 0.164 0.104 0.12 0.132 2.849 0.108
F 2.799 0.096 0.088 2.809 0.099 2.82 0.142 2.741 0.116 2.866 3.024 0.149
G 0.086 0.106 2.705 2.705 0.103 0.129 0.15 0.107 0.125 2.877 3.006 2.902
H 2.841 2.841 2.841 0.107 2.893 0.274 0.157 2.829 2.935 0.161 3.036 2.935
表13 1G12单克隆筛选试验结果
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0.254 1.943 2.389 2.464 1.916 0.194 1.717 1.579 1.75 2.598 2.646 2.027
B 0.73 0.514 1.808 2.489 2.146 0.437 1.958 2.671 2.604 2.761 2.74 2.75
C 1.388 1.518 2.505 1.199 1.48 2.036 0.521 1.727 1.462 1.563 2.289 2.79
D 2.452 2.457 1.507 2.41 1.308 1.808 2.702 2.72 2.582 1.654 2.602 2.81
E 1.349 1.379 2.561 1.334 2.44 1.502 2.642 2.693 2.741 2.856 2.856 2.568
F 1.182 1.275 2.603 1.28 1.389 2.416 2.898 1.793 2.668 2.803 3.115 2.565
G 1.94 1.282 2.582 1.875 1.288 2.724 2.883 1.878 2.25 2.294 2.506 2.428
H 1.584 1.386 2.644 2.644 2.144 1.762 1.892 2.835 2.233 2.457 2.848 2.644
从表10-表13所示的结果中选取36个阳性孔进行特异性检测，并采用10个提取自正常金鱼组织的样品作为阴性对照，编号为阴397、阴398、阴400、阴401、阴404、阴405、阴408、阴409、阴411和阴413。结果如表14所示，其中孔号前两位表示96孔板的编号，后两位表示96孔板中的位置，例如“1GD2”，“1G”表示1G12亚克隆后进行筛选的孔板，“D2”表示该孔板中的第D排2列的孔位。
表14 单克隆孔特异性检测结果
表14的结果显示，1GH8和1GE9与阴性样品交叉反应弱，具有良好的特异性；因此，最终将其对应的杂交瘤细胞分别进行保藏，即本申请的保藏号为CCTCC No.C2013114的杂交瘤细胞GFHNV-6G7和保藏号为CCTCC No.C2013115的杂交瘤细胞GFHNV-3B5。该两株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体即本例的最终产品。
本例成功筛选制备出了抗CyHV-2的单克隆抗体，且所制备的单克隆抗体具有良好的效价和特异性，能够用于CyHV-2检测。
在以上研究的基础上，本例还将所获得的单克隆抗体制成试剂盒，以用于检验检疫实践，并与电镜观察检测进行对比，结果显示，本例的单克隆抗体检测结果与电镜观察结果一致，能够有效的对CyHV-2进行检测。
以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护范围。

Claims (4)

1.一种CyHV-2单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体由保藏号CCTCC No.C2013114的杂交瘤细胞GFHNV-6G7或保藏号CCTCC No.C2013115的杂交瘤细胞GFHNV-3B5分泌产生。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体在制备CyHV-2检测试剂或设备中的应用。
3.一种CyHV-2酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有权利要求1所述的单克隆抗体。
4.一种分泌CyHV-2单克隆抗体的杂交瘤细胞，其保藏号为CCTCC No.C2013114或CCTCCNo.C2013115。
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