CN104569444B - 一种ABO正反定型及RhD血型检测卡 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种ABO正反定型及RhD血型检测卡，包括含有六个微柱的检测卡，所述六个微柱中前三个微柱分别装有等量的抗A凝胶、抗B凝胶和抗D凝胶，其余三个微柱装有等量的空白凝胶，其通过以下方法制备而成：葡聚糖凝胶的溶胀、制备各抗体稀释液、制备各抗体工作液、凝胶洗涤、分装形成Rh血型检测卡。本发明采用不同大小、不同筛分范围的交联葡聚糖凝胶进行混合，并用纯化水进行溶胀，有效地保证特异性的同时还拥有很高的灵敏度，并有效保证了体系的离子强度。
Description
技术领域
本发明涉及医学领域，尤其涉及一种ABO正、反定型及RhD血型检测卡。
背景技术
人类红细胞膜上存在很多血型抗原系统，其中以ABO血型抗原系统最重要，Rh血型抗原系统次之。这是因为正确鉴定ABO血型是安全输血的保证，如果ABO血型不相容，则输血几乎毫无例外要发生严重的即发性溶血性输血反应症状。ABO血型最常见的表型有四种：A、B、AB和O，ABO血型定型试验由正定型和反定型试验组成，正、反定型结果相符，才能正确地判断ABO血型。
而Rh血型抗原系统中D抗原是最重要的抗原，人红细胞膜上存在D抗原，即为RhD阳性，不存在D抗原，即为RhD阴性，在输血中如果输入含有相应抗原的血液后，则会引起严重的免疫性溶血性输血反应，且IgG性质的Rh系统的抗体通过胎盘能力强，从而破坏胎儿具有与抗体对应抗原的红细胞，引发严重的新生儿溶血病，因此进行准确的Rh分型对于减少免疫性溶血性输血反应、对新生儿溶血病进行诊断、预防和治疗具有重要的临床意义。
微柱凝胶免疫检测技术是20世纪90年代产生的一种免疫检测技术，其基本原理是利用分子筛技术，离心技术和特异性免疫反应技术原理，把血型血清学技术与凝胶分子筛技术有机结合起来，可灵敏地检测出可能存在的微弱血型抗原抗体反应，被认为是血型血清学检验的里程碑。
目前国内外已有一些厂家生产ABO正、反定型及RhD血型检测卡，但是存在以下一些不足：一是采用单一型号的葡聚糖凝胶或聚丙烯葡聚糖凝胶，使得灵敏度与特异性无法兼顾；二是采用生理盐水或抗体缓冲液溶胀凝胶，使得凝胶无法充分完全溶胀，以及破坏反应体系的离子强度；三是对添加不同抗体的凝胶，凝胶洗涤缓冲液完全一致，无法有效保护抗体稳定性。
发明内容
本发明就是要克服以上不足，提供一种灵敏度高、特异型号，稳定性强、保质期长的ABO正、反定型及RhD血型检测卡。
为达到上述目的，本发明通过以下技术方案进行解决，一种ABO正反定型及RhD血型检测卡，包括含有六个微柱的检测卡，所述六个微柱中前三个微柱分别装有等量的抗A凝胶、抗B凝胶和抗D凝胶，其余三个微柱装有等量的空白凝胶，其通过以下方法制备而成：
（1）葡聚糖凝胶的溶胀：选用至少两种交联葡聚糖凝胶进行混合，然后加入纯化水中进行充分悬浮溶胀，再用纯化水洗涤去除破碎颗粒，得到大小均匀、呈完整球形的葡聚糖凝胶颗粒；
（2）制备各抗体稀释液：
抗A稀释液：以生理盐水为基液，其中含有乙二胺四乙酸二钾盐10-15g/L、牛血清白蛋白20-25g/L、蔗糖15-20g/L，稀释液的pH值为6.6-6.8；
抗B稀释液：以生理盐水为基液，其中含有乙二胺四乙酸二钾盐15-20g/L、牛血清白蛋白15-20g/L、蔗糖25-30g/L，稀释液的pH值为6.6-6.8；
抗D稀释液：以磷酸盐缓冲液为基液，其中含有乙二胺四乙酸二钾盐10-15g/L、牛血清白蛋白35-40g/L，稀释液的pH值为6.6-6.8；
空白凝胶洗涤缓冲液：以纯化水为溶剂，缓冲液中含有氯化钠1.75g-2.07g/L、磷酸氢二钠0.185-0.219g/L、磷酸二氢钠0.203-0.24g/L、甘氨酸18-21g/L；并调节pH值为6.6-6.8；
（3）制备各抗体工作液：
取抗A单克隆抗体浓缩液与抗A稀释液进行混合，使得到的抗A单克隆抗体工作液的效价≥128；
取抗B单克隆抗体浓缩液与抗B稀释液进行混合，使得到的抗B单克隆抗体工作液的效价≥128；
取抗D单克隆抗体浓缩液与抗D稀释液进行混合，使得到的抗D单克隆抗体工作液的效价≥64；
（4）凝胶洗涤：
取六份等量的葡聚糖凝胶颗粒，其中三份分别用等量的抗A稀释液、抗B稀释液和抗D稀释液进行洗涤至少三次，再加入相对应的抗A单克隆抗体工作液、抗B单克隆抗体工作液和抗D单克隆抗体工作液进行混合，得到抗A凝胶、抗B凝胶和抗D凝胶；再将另外三份葡聚糖凝胶颗粒分别用等量的空白凝胶洗涤缓冲液进行洗涤至少三次，再加入空白凝胶洗涤缓冲液进行混合，得到三份空白凝胶；
（5）分装：
按照每管24-32微升的量，将抗A凝胶、抗B凝胶、抗D凝胶依次加到空白检测卡的前三个微柱中，将三份空白凝胶分别加到空白检测卡的后三个微柱中，形成ABO正反定型及RhD血型检测卡。
优选方案：所述步骤（1）中交联葡聚糖凝胶为交联葡聚糖凝胶G-25、交联葡聚糖凝胶G-50、交联葡聚糖凝胶G-75或交联葡聚糖凝胶G-100。
优选方案：所述步骤（1）中交联葡聚糖凝胶混合物和纯化水的质量体积比为1：2-1：3。
优选方案：所述步骤（1）中悬浮溶胀的时间为48-72小时。
优选方案：所述步骤（4）中抗体工作液与洗涤后凝胶的体积比为1：2-1：3。
本发明选择至少两种交联葡聚糖凝胶用纯化水中进行溶胀所得的葡聚糖凝胶颗粒，再用抗A稀释液、抗B稀释液和抗D稀释液分别对其进行洗涤至少三次，再加入相对应的抗A单克隆抗体工作液、抗B单克隆抗体工作液和抗D单克隆抗体工作液进行混合，得到抗A凝胶、抗B凝胶和抗D凝胶。再将三份等量的葡聚糖凝胶颗粒分别用等量的空白凝胶洗涤缓冲液进行洗涤后与空白凝胶洗涤缓冲液进行混合，得到空白凝胶。将这六份凝胶依次装入检测卡中的六个微柱中，形成ABO正反定型及RhD血型检测卡。该检测卡用来鉴定ABO血型及RhD血型，从而保证输血正确性，保障生命安全。
所以本发明的优点有：
1、本发明采用不同大小、不同筛分范围的交联葡聚糖凝胶进行混合，有效避免了单一交联葡聚糖凝胶的特异性与灵敏度不能兼顾的特点，可实现在保证特异性的同时，仍拥有很高的灵敏度；
2、本发明采用纯化水作为交联葡聚糖凝胶的溶胀溶液，可以使凝胶颗粒完全充分溶胀；
3、本发明用各抗体稀释液洗涤葡聚糖凝胶颗粒，从而不会破坏抗体的保护液成分，能更有效的保证抗体的稳定性；并保证了缓冲液体系的纯粹性，不受其他离子的影响，有效保证了体系的离子强度。
具体实施方式
实施例一：
一种ABO正反定型及RhD血型检测卡，包括含有六个微柱的检测卡，所述六个微柱中前三个微柱分别装有等量的抗A凝胶、抗B凝胶和抗D凝胶，其余三个微柱装有等量的空白凝胶，其通过以下方法制备而成：
（1）葡聚糖凝胶的溶胀：
选用交联葡聚糖凝胶G-25、交联葡聚糖凝胶G-50和交联葡聚糖凝胶G-75按照质量比1：2：1进行混合得葡聚糖凝胶混合物，然后按照葡聚糖凝胶混合物和纯化水的质量体积比为1：3加入纯化水，进行悬浮溶胀48小时后；再用纯化水对其洗涤三次，去除破碎颗粒，得到大小均匀、呈完整球形的凝葡聚糖胶颗粒；
（2）抗体稀释液的配制：
抗A稀释液：以生理盐水为基液，其中含有乙二胺四乙酸二钾盐10g/L、牛血清白蛋白20g/L、蔗糖20g/L，稀释液的pH值为6.6-6.8；
抗B稀释液：以生理盐水为基液，其中含有乙二胺四乙酸二钾盐15g/L、牛血清白蛋白15g/L、蔗糖30g/L，稀释液的pH值为6.6-6.8；
抗D稀释液：以磷酸盐缓冲液为基液，其中含有乙二胺四乙酸二钾盐15g/L、牛血清白蛋白40g/L，稀释液的pH值为6.6-6.8；
空白凝胶洗涤缓冲液：以纯化水为溶剂，缓冲液中含有氯化钠1.75g/L、磷酸氢二钠0.185g/L、磷酸二氢钠0.203g/L、甘氨酸18g/L；并调节pH值为6.6-6.8；
（3）抗体稀释：
取抗A单克隆抗体浓缩液与（2）制备的抗A稀释液混合，使得到的抗A单克隆抗体工作液效价≥128；
取抗B单克隆抗体浓缩液与（2）中制备的抗B稀释液混合，使得到的抗B单克隆抗体工作液效价≥128；
取抗D单克隆抗体浓缩液与（2）中制备的抗D稀释液混合，使得到的抗D单克隆抗体工作液效价≥64；
（4）凝胶洗涤：
将步骤（1）中溶胀的葡聚糖凝胶颗粒均分为六等份，其中一份用等量的抗A稀释液洗涤三次，再用抗A单克隆抗体工作液与洗涤后的葡聚糖凝胶颗粒按照体积比1：2进行混合均匀，得到抗A凝胶；
第二份用等量的抗B稀释液洗涤三次，再用抗B单克隆抗体工作液与洗涤后的葡聚糖凝胶颗粒按照体积比1：2比例混合均匀，得到抗B凝胶；
第三份用等量抗D稀释液洗涤三次，再用抗D单克隆抗体工作液与洗涤后的葡聚糖凝胶颗粒按照体积比1：2比例混合均匀，得到抗D凝胶；
余下三份每份均用等量空白凝胶洗涤缓冲液洗涤三次，再用空白凝胶洗涤缓冲液与洗涤后的葡聚糖凝胶颗粒按照体积比1：2比例混合均匀，得到三份空白凝胶；
（5）分装：
按照每管32微升的量，将上述配制的各凝胶分别依次加入到空白检测卡中的六个微柱中，其中第一个微柱加抗A凝胶，第二个微柱加抗B凝胶，第三个微柱加抗D凝胶，余下三个微孔加空白凝胶，形成ABO正反定型及RhD血型检测卡。
实施例二：
一种ABO正、反定型及RhD血型检测卡包括含有六个微柱的检测卡，所述六个微柱中前三个微柱分别装有等量的抗A凝胶、抗B凝胶和抗D凝胶，其余三个微柱装有等量的空白凝胶，其通过以下方法制备而成：
（1）葡聚糖凝胶的溶胀：
选用交联葡聚糖凝胶G-75和交联葡聚糖凝胶G-100按照质量比1：1进行混合得葡聚糖凝胶混合物，然后按照葡聚糖凝胶混合物和纯化水的质量体积比为1：2加入纯化水，进行悬浮溶胀72小时后；再用纯化水对其洗涤四次，去除破碎颗粒，得到大小均匀、呈完整球形的凝葡聚糖胶颗粒；
（2）抗体稀释液的配制：
抗A稀释液：以生理盐水为基液，其中含有乙二胺四乙酸二钾盐15g/L、牛血清白蛋白22g/L、蔗糖18g/L，稀释液的pH值为6.6-6.8；
抗B稀释液：以生理盐水为基液，其中含有乙二胺四乙酸二钾盐18g/L、牛血清白蛋白20g/L、蔗糖25g/L，稀释液的pH值为6.6-6.8；
抗D稀释液：以磷酸盐缓冲液（PBS）为基液，其中含有乙二胺四乙酸二钾盐12g/L、牛血清白蛋白35g/L，稀释液的pH值为6.6-6.8；
空白凝胶洗涤缓冲液：以纯化水为溶剂，缓冲液中含有氯化钠1.8g/L、磷酸氢二钠0.2g/L、磷酸二氢钠0.22g/L、甘氨酸20g/L；并调节pH值为6.6-6.8；
（3）抗体稀释：
取抗A单克隆抗体浓缩液与（2）中制备的抗A稀释液进行混合，使得到的抗A单克隆抗体工作液效价≥128；
取抗B单克隆抗体浓缩液与（2）中制备的抗B稀释液混合，使得到的抗B单克隆抗体工作液效价≥128；
取抗D单克隆抗体浓缩液与（2）中制备的抗D稀释液混合，使得到的抗D单克隆抗体工作液效价≥64；
（4）凝胶洗涤：
将步骤（1）中溶胀的葡聚糖凝胶颗粒均分为六等份，其中一份用等量的抗A稀释液洗涤三次，再用抗A单克隆抗体工作液与洗涤后的葡聚糖凝胶颗粒按照体积比1：3进行混合均匀，得到抗A凝胶；
第二份用等量的抗B稀释液洗涤三次，再用抗B单克隆抗体工作液与洗涤后的葡聚糖凝胶颗粒按照体积比1：3比例混合均匀，得到抗B凝胶；
第三份用等量抗D稀释液洗涤三次，再用抗D单克隆抗体工作液与洗涤后的葡聚糖凝胶颗粒按照体积比1：3比例混合均匀，得到抗D凝胶；
余下三份每份均用等量空白凝胶洗涤缓冲液洗涤三次，再用空白凝胶洗涤缓冲液与洗涤后的葡聚糖凝胶颗粒按照体积比1：3比例混合均匀，得到三分空白凝胶；
（5）分装：
按照每管24微升的量，将经（4）配制的各凝胶分别依次加入到空白检测卡中的六个微柱中，其中第一个微柱加抗A凝胶，第二个微柱加抗B凝胶，第三个微柱加抗D凝胶，余下三个微孔加空白凝胶，形成ABO正反定型及RhD血型检测卡。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种ABO正反定型及RhD血型检测卡，包括含有六个微柱的检测卡，其特征在于：所述六个微柱中前三个微柱分别装有等量的抗A凝胶、抗B凝胶和抗D凝胶，其余三个微柱装有等量的空白凝胶，其通过以下方法制备而成：
（1）葡聚糖凝胶的溶胀：选用至少两种交联葡聚糖凝胶进行混合，然后加入纯化水中进行充分悬浮溶胀，再用纯化水洗涤去除破碎颗粒，得到大小均匀、呈完整球形的葡聚糖凝胶颗粒；
（2）制备各抗体稀释液：
抗A稀释液：以生理盐水为基液，其中含有乙二胺四乙酸二钾盐10-15g/L、牛血清白蛋白20-25g/L、蔗糖15-20g/L，稀释液的pH值为6.6-6.8；
抗B稀释液：以生理盐水为基液，其中含有乙二胺四乙酸二钾盐15-20g/L、牛血清白蛋白15-20g/L、蔗糖25-30g/L，稀释液的pH值为6.6-6.8；
抗D稀释液：以磷酸盐缓冲液为基液，其中含有乙二胺四乙酸二钾盐10-15g/L、牛血清白蛋白35-40g/L，稀释液的pH值为6.6-6.8；
空白凝胶洗涤缓冲液：以纯化水为溶剂，缓冲液中含有氯化钠1.75g-2.07g/L、磷酸氢二钠0.185-0.219g/L、磷酸二氢钠0.203-0.24g/L、甘氨酸18-21g/L；并调节pH值为6.6-6.8；
（3）制备各抗体工作液：
取抗A单克隆抗体浓缩液与抗A稀释液进行混合，使得到的抗A单克隆抗体工作液的效价≥128；
取抗B单克隆抗体浓缩液与抗B稀释液进行混合，使得到的抗B单克隆抗体工作液的效价≥128；
取抗D单克隆抗体浓缩液与抗D稀释液进行混合，使得到的抗D单克隆抗体工作液的效价≥64；
（4）凝胶洗涤：
取六份等量的葡聚糖凝胶颗粒，其中三份分别用等量的抗A稀释液、抗B稀释液和抗D稀释液进行洗涤至少三次，再加入相对应的抗A单克隆抗体工作液、抗B单克隆抗体工作液和抗D单克隆抗体工作液进行混合，得到抗A凝胶、抗B凝胶和抗D凝胶；再将另外三份葡聚糖凝胶颗粒分别用等量的空白凝胶洗涤缓冲液进行洗涤至少三次，再加入空白凝胶洗涤缓冲液进行混合，得到三份空白凝胶；
（5）分装：
按照每管24-32微升的量，将抗A凝胶、抗B凝胶、抗D凝胶依次加到空白检测卡的前三个微柱中，将三份空白凝胶分别加到空白检测卡的后三个微柱中，形成ABO正反定型及RhD血型检测卡。
2.根据权利要求1所述的血型检测卡，其特征在于：所述步骤（1）中交联葡聚糖凝胶为交联葡聚糖凝胶G-25、交联葡聚糖凝胶G-50、交联葡聚糖凝胶G-75或交联葡聚糖凝胶G-100。
3.根据权利要求1所述的血型检测卡，其特征在于：所述步骤（1）中在交联葡聚糖凝胶混合物中加入纯化水中进行充分悬浮溶胀，其交联葡聚糖凝胶混合物和纯化水的质量体积比为1：2-1：3。
4.根据权利要求1所述的血型检测卡，其特征在于：所述步骤（1）中悬浮溶胀的时间为48-72小时。
5.根据权利要求1所述的血型检测卡，其特征在于：所述步骤（4）中抗A单克隆抗体工作液与洗涤后的葡聚糖凝胶颗粒按照体积比为1：2-1：3；抗B单克隆抗体工作液与洗涤后的葡聚糖凝胶颗粒的体积比为1：2-1：3；抗D单克隆抗体工作液与洗涤后的葡聚糖凝胶颗粒的体积比为1：2-1：3；空白凝胶洗涤缓冲液与洗涤后的葡聚糖凝胶颗粒的体积比为1：2-1：3。
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