CN104530219A - 一种精制促皮质素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种精制促皮质素的方法，技术方案是将脑垂体前叶干粉经提取，吸附、洗脱和冻干，得到促皮质素。促皮质素活性效价在55iu/mg以上。

Description

一种精制促皮质素的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说涉及精制促皮质素的方法。
背景技术
促皮质素（ACTH）是从猪、牛、羊等动物的脑垂体前叶中提取出来的一种多肽类药物，呈白色或淡黄色粉末，无臭，有吸湿性，易溶于水，溶于70%的丙酮和70%的乙醇中，在干燥和酸性溶液中较稳定，100℃加热活力不减，在碱性溶液中容易失活。
促皮质素为39个氨基酸残基组成的直链多肽，N-端是丝氨酸，C-端是苯丙氨酸，无含硫氨基酸。种属差异仅仅表现在第25~33位上，1~24位的片段具有全部活性，第24位氨基酸之后的部分，不参与同受体的作用，仅能维持整个多肽结构的稳定性。在溶液中存在着高度的α-螺旋结构。被胃蛋白酶部分水解仍有活力。
促皮质素主要用途有（1）用于诊断垂体肾上腺轴的储备功能，其合成的类似物ACTH（1-24）由于引起变态反应的危险性低而更多用于诊断；（2）用于肾上腺皮质功能正常但需用糖皮质激素治疗的疾病。但用此药的效果较难预测，因为作用的强弱依赖于个体肾上腺的反应性，且用法不够方便，价格较昂贵，因此不比直接用糖皮质激素有更多的优点；（3）肾上腺皮质功能减退症，对于原发性者（病变在肾上腺）ACTH无效，对于继发性者（垂体ACTH不足）需长期注射用药，一般不作为治疗药；（4）用于活动性风湿病、类风湿性关节炎、红斑性狼疮等胶原性疾患；（5）用于严重的支气管哮喘、严重皮炎等过敏性疾病及急性白血病、何杰金氏病等.
生产促皮质素现有方法是酸丙酮法，该法操作简单，但效价不高于3单位/毫克；本方法是精制促皮质素法，效价高于55单位/毫克，使原料得到了，充分利用，减少浪费。
发明内容
本发明的目的是精制促皮质素，得到效价在55单位/毫克以上的促皮质素。
本发明的技术方案是：（1）将脑垂体前叶干粉，用酸溶液提取；（2）将提取液经交联羧甲基纤维素与阴阳离子交换树脂，吸附和洗脱；（3）冻干，得到促皮质素。其包括如下步骤：
（1）原料处理：将猪脑垂体取出后，立即投入丙酮中，浸泡脱水3次，每次约24小时，至垂体变硬为止，分离前、后叶，分别贮存于丙酮中备用。投料时，取出前叶，干燥，磨粉，过40~60目筛，得前叶干粉，水分应低于5%；
（2）提取：将垂体前叶干粉1 Kg，加入10~30 L预热到45~65℃的0.1~1mol/L的醋酸溶液中，搅拌，缓慢滴加40%~60%硫酸溶液，调pH为1.5~2.5，加热使温度达65~85℃，保温10分钟，速冷至20℃以下，加入硅藻土（用0.1~1mol/L醋酸溶液浸泡过夜）0.4~0.6Kg，过滤，滤液在2~10℃保存；滤渣加0.1~1mol/L醋酸溶液5~25L，并用40%~60%硫酸溶液，调pH至1.5~2.5，加热至65~85℃，保温5分钟，速冷20℃以下，加入硅藻土0.2Kg助滤，滤液2~10℃保存；将滤液合并，用5%~20%氢氧化钠溶液调节pH2.5~3.5，先用布氏漏斗过滤，再用4号垂熔漏斗过滤至澄清，得提取液；
（3）吸附：将提取液调节pH2.5~3.5后，加入25~70mL的吐温-80及100~400g的交联羧甲基纤维素，在2~10℃下，搅拌吸附10~15小时，静置10~15小时；
（4）洗脱：虹吸除去上清液，沉淀用3号垂熔漏斗过滤，收集交联羧甲基纤维素；先用0.05~0.5mol/L醋酸溶液8~12L洗涤1~3次，再用纯化水8~12L洗涤1~3次，溶液温度10~20℃左右，抽干，再用0.1~0.3mol/L盐酸溶液500~1000mL洗脱1次，合并滤液；
（5）精制：加入阴离子交换树脂1000~3000g，在2~5分钟内调节pH2.0~4.0以上，过滤，树脂用0.05~0.5mol/L醋酸溶液1L洗涤，洗、滤液合并，用0.5mol/L盐酸溶液或氢氧化钠溶液调节pH2.5~3.5，2~10℃静置10~15小时；
（6）二次吸附：取上述洗脱液，加入5~10mL吐温-80，搅拌均匀后加入交联羧甲基纤维素10~50g，在1~5℃搅拌吸附10~15小时，2~10℃静置10~15小时；
（7）二次洗脱：虹吸除去上清液，用4号垂熔漏斗过滤，收集交联羧甲基纤维素，分别用0.05~0.5mol/L醋酸溶液4L和纯化水4L，各洗涤1~3次，抽干，加入pH4~5.5、0.001~0.1mol/L 醋酸铵溶液1~2L，于10~15℃下搅拌1~3小时，过滤抽干，用纯化水1.2L洗1 次，再加pH6.0~7.5、0.05~0.5mol/L醋酸铵溶液1~2L，10~15℃下搅拌1~3小时，过滤后再用3L纯化水分2次洗涤，抽干，用0.1~0.5mol/L盐酸1L于25℃搅拌洗脱1~3小时，过滤，用0.1~0.5mol/L盐酸160mL洗涤1次，洗液并入洗脱液中；
（8）二次精制：洗脱液中加入阴离子交换树脂100~500g，调节pH至4左右，过滤。用0.1mol/L醋酸溶液150mL洗涤树脂1次，洗涤液并入滤液中，加732阳离子交换树脂50~100g，使pH调到2.0~4.0，过滤，用0.05~0.5mol/L醋酸溶液50mL洗涤树脂1次，洗涤液并入滤液中，冷冻干燥即得促皮质素。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明：
实施例1
（1）原料处理：将猪脑垂体取出后，立即投入丙酮中，浸泡脱水3次，每次约24小时，至垂体变硬为止，分离前、后叶，分别贮存于丙酮中备用。投料时，取出前叶，干燥，磨粉，过40~60目筛，得前叶干粉，水分应低于5%；
（2）提取：将垂体前叶干粉1 Kg，加入10L预热到45℃的0.15mol/L的醋酸溶液中，搅拌，缓慢滴加45%硫酸溶液，调pH为1.5，加热使温度达65℃，保温10分钟，速冷至20℃以下，加入硅藻土（用0.15mol/L醋酸溶液浸泡过夜）0.4Kg，过滤，滤液在2~10℃保存；滤渣加0.15mol/L醋酸溶液10L，并用45%硫酸溶液，调pH至1.5，加热至65℃，保温5分钟，速冷20℃以下，加入硅藻土0.2Kg助滤，滤液2~10℃保存；将滤液合并，用10%氢氧化钠溶液调节pH2.5，先用布氏漏斗过滤，再用4号垂熔漏斗过滤至澄清，得提取液；
（3）吸附：将提取液调节pH2.5后，加入30mL的吐温-80及250g的交联羧甲基纤维素，在2~10℃下，搅拌吸附10小时，静置11小时；
（4）洗脱：虹吸除去上清液，沉淀用3号垂熔漏斗过滤，收集交联羧甲基纤维素；先用0.2mol/L醋酸溶液9L分3次洗涤，再用纯化水9L洗涤3次，溶液温度10℃左右，抽干，再用0.15mol/L盐酸溶液650mL洗脱1次，合并滤液；
（5）精制：加入阴离子交换树脂1500g，在3分钟内调节pH2.5以上，过滤，树脂用0.2mol/L醋酸溶液1L洗涤，洗、滤液合并，用0.5mol/L盐酸溶液或氢氧化钠溶液调节pH2.5，2~10℃静置12小时；
（6）二次吸附：取上述洗脱液，加入10mL吐温-80，搅拌均匀后加入交联羧甲基纤维素35g，在1~5℃搅拌吸附10小时，2~10℃静置12小时；
（7）二次洗脱：虹吸除去上清液，用4号垂熔漏斗过滤，收集交联羧甲基纤维素，分别用0.2mol/L醋酸溶液4L和纯化水4L，各洗涤2次，抽干，加入pH4.0、0.05mol/L 醋酸铵溶液1L，于10℃下搅拌1小时，过滤抽干，用纯化水1.2L洗1 次，再加pH6.5、0.15mol/L醋酸铵溶液1L，10℃下搅拌1小时，过滤后再用3L纯化水分2次洗涤，抽干，用0.2mol/L盐酸1L于25℃搅拌洗脱2小时，过滤，用0.2mol/L盐酸160mL洗涤1次，洗液并入洗脱液中；
（8）二次精制：洗脱液中加入阴离子交换树脂250g，调节pH至4.1，过滤。用0.1mol/L醋酸溶液150mL洗涤树脂1次，洗涤液并入滤液中，加732阳离子交换树脂65g，将pH调到2.5，过滤，用0.15mol/L醋酸溶液50mL洗涤树脂1次，洗涤液并入滤液中，冷冻干燥即得促皮质素190g，效价为56iu/mg。
实施例2
（1）原料处理：将猪脑垂体取出后，立即投入丙酮中，浸泡脱水3次，每次约24小时，至垂体变硬为止，分离前、后叶，分别贮存于丙酮中备用。投料时，取出前叶，干燥，磨粉，过40~60目筛，得前叶干粉，水分应低于5%；
（2）提取：将垂体前叶干粉10Kg，加入300L预热到65℃的0.5mol/L的醋酸溶液中，搅拌，缓慢滴加50%硫酸溶液，调pH为2.0，加热使温度达80℃，保温10分钟，速冷至20℃以下，加入硅藻土（用0.5mol/L醋酸溶液浸泡过夜）5Kg，过滤，滤液在2~10℃保存；滤渣加0.5mol/L醋酸溶液250L，并用50%硫酸溶液，调pH至2.0，加热至80℃，保温5分钟，速冷20℃以下，加入硅藻土2Kg助滤，滤液2~10℃保存；将滤液合并，用10%氢氧化钠溶液调节pH3.0，先用布氏漏斗过滤，再用4号垂熔漏斗过滤至澄清，得提取液；
（3）吸附：将提取液调节pH3.0后，加入700mL的吐温-80及3500g的交联羧甲基纤维素，在2~10℃下，搅拌吸附15小时，静置15小时；
（4）洗脱：虹吸除去上清液，沉淀用3号垂熔漏斗过滤，收集交联羧甲基纤维素；先用0.5mol/L醋酸溶液120L洗涤3次，再用纯化水120L洗涤3次，溶液温度20℃左右，抽干，再用0.3mol/L盐酸溶液10L洗脱1次，合并滤液；
（5）精制：加入阴离子交换树脂30Kg，在5分钟内调节pH3.0以上，过滤，树脂用0.5mol/L醋酸溶液10L洗涤，洗、滤液合并，用0.5mol/L盐酸溶液或氢氧化钠溶液调节pH3.0，2~10℃静置15小时；
（6）二次吸附：取上述洗脱液，加入100mL吐温-80，搅拌均匀后加入交联羧甲基纤维素500g，在1~5℃搅拌吸附15小时，2~10℃静置15小时；
（7）二次洗脱：虹吸除去上清液，用4号垂熔漏斗过滤，收集交联羧甲基纤维素，分别用0.5mol/L醋酸溶液40L和纯化水40L，各洗涤3次，抽干，加入pH5.0、0.1mol/L 醋酸铵溶液2L，于10℃下搅拌3小时，过滤抽干，用纯化水12L洗1 次，再加pH7.0、0.5mol/L醋酸铵溶液1L，10℃下搅拌3小时，过滤后再用30L纯化水分2次洗涤，抽干，用0.5mol/L盐酸10L于25℃搅拌洗脱2小时，过滤，用0.5mol/L盐酸1600mL洗涤1次，洗液并入洗脱液中；
（8）二次精制：洗脱液中加入阴离子交换树脂5000g，调节pH至4，过滤。用0.1mol/L醋酸溶液1500mL洗涤树脂1次，洗涤液并入滤液中，加732阳离子交换树脂1000g，使pH调到3.5，过滤，用0.5mol/L醋酸溶液500mL洗涤树脂1次，洗涤液并入滤液中，冷冻干燥即得促皮质素2500Kg，效价为59iu/mg。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (10)

1.一种精制促皮质素的方法，其特征在于：（1）将脑垂体前叶干粉，用酸溶液提取；（2）将提取液经交联羧甲基纤维素与阴阳离子交换树脂，吸附和洗脱；（3）冻干，得到促皮质素。
2.根据权利要求1，一种精制促皮质素精制促皮质素的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
（1）提取：将脑垂体前叶干粉，加入酸溶液中，搅拌，调pH为1.0~3.0，加热使温度达65~85℃，速冷至25℃以下，过滤，滤液调节pH2.0~4.0，过滤至澄清，得提取液，在2~10℃下保存；
（2）吸附：将提取液调pH2.5~3.5后，加入吐温-80和交联羧甲基纤维素，搅拌吸附，静置；
（3）洗脱：虹吸除去上清液，过滤，收集滤饼，先用酸溶液和水洗涤，再用酸溶液洗脱，合并滤液；
（4）精制：加入阴离子交换树脂，过滤，树脂用酸溶液洗涤，合并滤液，调 pH为2.0~4.0，静置10~15小时；
（5）二次吸附：将洗脱液中加入吐温-80，搅匀后加入交联羧甲基纤维素，搅拌吸附，冷藏10~15小时；
（6）二次洗脱：虹吸除去上清液，用4号垂熔漏斗过滤，收集滤饼，分别用酸溶液和水洗涤，抽干，加入醋酸铵溶液，搅拌，过滤，水洗1~3次，再加醋酸铵溶液，搅拌，过滤后用水洗涤1~3次；用盐酸溶液搅拌洗脱1~3小时，过滤，洗涤，洗液并入洗脱液中；
（7）二次精制：洗脱液中加入阴离子交换树脂，调节 pH为3~5，过滤，用酸溶液洗树脂1次，洗涤液与滤液合并，加阳离子交换树脂，pH调到2~4，过滤，用酸溶液洗树脂1次，洗涤液并入滤液中，冷冻干燥，即得精制促皮质素。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，加入的酸溶液是预热到45~65℃的0.1~1mol/L的醋酸溶液，加入酸溶液的体积与脑垂体前叶干粉重量的比是10/1~30/1（L/Kg）；第一次调pH用40%~60%硫酸溶液调pH1.5~2.5，第二次调pH用5%~20%氢氧化钠液调pH为2.5~3.5。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，滤渣要加入0.1~1mol/L醋酸溶液，并用40%~60%硫酸溶液，调pH至1.5~2.5，加热至70~80℃，保温5分钟，速冷至20℃以下，过滤，滤液在2~10℃下保存。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，交联羧甲基纤维素的重量与脑垂体前叶干粉的重量比是1/10~4/10（g/g）,交联羧甲基纤维素的重量与吐温-80的体积比是4/1~6/1（g/mL）；在2~10℃下搅拌吸附10~15小时，静置10~15小时。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（３）中，先用0.05~0.5mol/L醋酸溶液洗涤1~3次，再用0.1~0.3mol/L盐酸溶液洗脱。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（4）中，加入阴离子交换树脂与脑垂体前叶干粉重量比为1:1~3:1（g/g），在2~5分钟内调节pH2.0~4.0；树脂用0.05~0.5mol/L醋酸溶液洗涤；用盐酸溶液或氢氧化钠溶液调节pH2.5~3.5。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（5）中，交联羧甲基纤维素的重量与脑垂体前叶干粉的重量比是1/100~5/100（g/g）,交联羧甲基纤维素的重量与吐温-80的体积比是2/1~5/1（g/mL）；在1-5℃搅拌吸附10~15h。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（6）中，用0.05~0.5mol/L醋酸溶液洗涤；第一次加入pH4~5.5的0.001~0.1mol/L醋酸铵溶液，第二次加入pH6.0~7.5的0.05~0.5mol/L醋酸铵溶液；盐酸溶液的浓度是0.1~0.5mol/L。
10.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（7）中，阴离子交换树脂与脑垂体前叶干粉的重量比为1/10~5/10（g/g）；阳离子交换树脂与脑垂体前叶干粉的重量比为5/100~10/100（g/g）；酸溶液为0.05~0.5mol/L醋酸溶液。
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