CN102964429A

CN102964429A - 一种采用生物提取法制备缩宫素溶液的生产工艺

Info

Publication number: CN102964429A
Application number: CN2012105129240A
Authority: CN
Inventors: 金荣富; 陈静
Original assignee: ANHUI HONGYE PHARMACEUTICAL CO LTD
Current assignee: ANHUI HONGYE PHARMACEUTICAL CO LTD
Priority date: 2012-12-04
Filing date: 2012-12-04
Publication date: 2013-03-13

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种采用生物提取法制备缩宫素溶液的生产工艺。本发明所述生产工艺运用独特的生物制备工艺技术，采用水提取垂体后叶干粉中的缩宫素，然后利用人造沸石吸附除去垂体后叶干粉提取液中加压素最后利用皂土除去小分子物质、有机有色物和热原，从而制得缩宫素。本发明所述生产工艺具有操作简单、污染小、收率高等特点，适用于缩宫素的大规模生产。制得的缩宫素纯度高、生物活性高，治疗的疗效显著、药物副作用小、安全性高，可广泛应用于医药及动、植物养殖领域。

Description

一种采用生物提取法制备缩宫素溶液的生产工艺

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种采用生物提取法制备缩宫素溶液的生产工艺。

背景技术

缩宫素（Oxytocin），又称催产素，是一种由9个氨基酸残基组成的、具有一个二硫键的、具有生物活性的多肽类产品，分子式C₄₃H₆₆N₁₂O₁₂S₂，分子量1007.2，等电点7.7，易溶于水，溶于丙酮、丁醇和稀醋酸，不溶于乙醚和石油醚，干品稳定，pH3.5～4.4的酸性溶液中稳定，碱性溶液中不稳定。结构式如下：

缩宫素多肽的N末端和C末端分别为半胱氨酸和甘氨酸，其间的七个氨基酸以肽键相连形成一级结构，在此基础上，由于氢键的形成，作用九肽间产生二级螺旋结构；而N末端的半胱氨酸和第6位的半胱氨酸的S结合形成双S键而形成一个内环，加之疏水基团，如9肽中的酪氨酸，亮氨酸和异亮氨酸等形成疏水键，使九肽中的极性基团在内部，而离子基团在外部，使产品内部排斥水相而形成紧密结构的趋势-β折叠，形成生物活性特定的空间结构：活性中心。而缩宫素具有天然的双S键和β-回折的结构决定了缩宫素的生物活性。

缩宫素是一种哺乳动物激素，于1895年被发现，主要由下丘脑视上核和室旁核的神经分泌大细胞系统分泌产生，从垂体后叶释放入血液，沿血液循环到达远端的器官发挥作用，在临床上被广泛用于引产、催产及预防因分娩后子宫乏力引起的大出血，是目前美国FDA唯一认可用于临床引产的药物。缩宫素还能刺激乳腺的平滑肌收缩，有助于乳汁自乳房排出，但并不增加乳腺的乳汁分泌量。

缩宫素不仅可作为育龄妇女生育时催产使用，同时该产品在国际上也被广泛应用于动、植物养殖方面，如用于动物，不仅可提高动物的受胎率及繁殖率，还可提高单位产奶量；用于果树，则不仅可加强果物的优异外观，还能起到催熟的作用。

目前主要采用化学合成法制备缩宫素。我国自1969年第一次合成缩宫素以来，国内30余家缩宫素制剂生产厂家均采用九肽酰胺经钠-液氨法消除、缩合的办法合成缩宫素。然而合成的缩宫素粗品含有一些与缩宫素结构类似的杂肽，例如氨基酸消旋化产生的非对映异构体、部分氨基酸未连接上产生的缺失肽、肽键断裂产生的断裂肽以及氧化不彻底产生的还原态开环肽等，造成缩宫素产品收率较低，纯化困难。而且采用化学合成法制备的缩宫素无法形成其天然的双S键和β-回折的结构，产品存在生物活性低的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于针对现有制备方法的缺陷提供一种采用生物提取法制备缩宫素溶液的生产工艺。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种采用生物提取法制备缩宫素溶液的生产工艺，包括

步骤1：垂体后叶干粉加水提取，离心收集提取液；

步骤2：提取液经含有0.25%冰醋酸水溶液（体积/体积）的层析柱分离收集层析液，其中所述层析柱的填料为人造沸石；

步骤3：层析液用冰醋酸调节pH至3.5，加热至100℃保温3分钟，立即冷却后过滤收集滤液，滤液用冰醋酸调节pH至3.5，加入皂土吸附，过滤收集滤液即得。

本发明所述生产工艺运用独特的生物制备工艺技术，采用水提取垂体后叶干粉中的缩宫素，然后利用人造沸石吸附除去垂体后叶干粉提取液中加压素最后利用皂土除去小分子物质、有机有色物和热原，从而使制得缩宫素具有天然的双S键和β-回折的结构，提高了制得的缩宫素的溶液的生物活性。

其中，本发明所述垂体后叶干粉可以通过商业渠道从市场上购买得到，也可由哺乳动物小脑垂体后叶自行制备得到。在一个实施例中，所述垂体后叶干粉的制备方法为取哺乳动物小脑置于丙酮中脱水后，分离垂体后叶，干燥后粉碎过40-60目筛得到。其中，所述哺乳动物为猪、狗、牛、羊、马中的一种。优选为猪、羊。

本发明所述生产工艺首先采用水提取垂体后叶干粉以将其中的缩宫素分离。其中，步骤1所述加水提取优选为加水提取四次，每次30分钟，合并提取液。

进一步的，作为优选，步骤1所述加水提取的步骤中垂体后叶干粉与水的重量比为1:10-1:20。更优选为1:12-1:16。

在本发明中，所述提取缩宫素的水可以为蒸馏水、去离子水、注射用水中的一种。优选为注射用水。

在一个具体实施例中所述加水提取为称后叶干粉，加入16倍注射用水，搅拌提取30分钟，离心，收集液体，残渣再分别加入14倍、12倍、12倍注射用水按同法提取三次，合并四次离心液。

本发明所述生产工艺步骤2利用人造沸石吸附除去垂体后叶干粉提取液中加压素，从而得到较纯的缩宫素。由于缩宫素在pH3.5～4.4的酸性环境中最稳定，因此本发明所述层析柱加入了0.25%的冰醋酸以使溶液呈酸性。

本发明所述生产工艺步骤2所述分离收集层析液的步骤为在人造沸石加入0.25%冰醋酸水溶液（体积/体积），搅拌后倒入层析柱内，使人造沸石自然沉降，等人造沸石沉降约2-3cm后，打开柱的出口，调节合适的流速，使人造沸石继续沉积，同时逐渐加入0.25%冰醋酸水溶液（体积/体积）平衡层析柱，待层析柱中人造沸石加至柱高2/3时，加入0.25%冰醋酸水溶液（体积/体积）至冰醋酸水溶液液面高于人造沸石沉积面2-3厘米，立即加入提取液，收集层析柱出口流出的白色浑浊的层析液。其中所述逐渐加入0.25%冰醋酸水溶液（体积/体积）平衡层析柱的目的是使层析柱内的人造沸石之间无缝隙，保证提取液的层析效率。

进一步地，在具体实施例方式中，当提取液面下降到人造沸石表面时，立即继续加注射用水，但浑浊液流尽后停止收集。

作为优选，按g/mL计，人造沸石与0.25%冰醋酸水溶液（体积/体积）的质量体积比为1:10。

进一步地，本发明所述生产工艺步骤2所述提取液的流速优选为45~50mL/min。

本发明所述生产工艺步骤3层析后的层析液用冰醋酸调节pH至3.5，加热然后加入皂土吸附以除去小分子物质、有机有色物和热原，从而能进一步纯化缩宫素。作为优选，所述加入皂土吸附的步骤为按每100mL滤液加入3mL10%皂土浆的量加入皂土浆，搅拌吸附40分钟。

从上述的技术方案可以看出，本发明制备缩宫素的方法取垂体后叶干粉加水提取，离心收集提取液；提取液经含有0.25%冰醋酸水溶液（体积/体积）的人造沸石层析柱分离收集层析液；层析液用冰醋酸调节pH至3.5，加热至100℃保温3分钟，立即冷却后过滤收集滤液，滤液用冰醋酸调节pH至3.5，加入皂土吸附，过滤收集滤液即得。本发明所述生产工艺运用独特的生物制备工艺技术，采用水提取垂体后叶干粉中的缩宫素，然后利用人造沸石吸附除去垂体后叶干粉提取液中加压素最后利用皂土除去小分子物质、有机有色物和热原，从而制得缩宫素。本发明所述生产工艺具有操作简单、污染小、收率高等特点，适用于缩宫素的大规模生产。本发明所述生产工艺制得的缩宫素纯度高、生物活性高，治疗的疗效显著、药物副作用小、安全性高，可广泛应用于医药及动、植物养殖领域。

具体实施方式

本发明实施例公开了一种采用生物提取法制备缩宫素溶液的生产工艺。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1：

称羊垂体后叶干粉100g，加入注射用水1.6升，搅拌提取30分钟，离心，收集液体，残渣再分别加水1.4升、1.2升、1.2升按同法提取三次，合并四次离心液。取人造沸石1600g，加入0.25%冰醋酸水溶液（体积/体积）16升，搅拌后倒入层析柱内，使人造沸石自然沉降，等人造沸石沉降约2-3cm后，打开柱的出口，调节合适的流速，使人造沸石继续沉积，同时逐渐加入0.25%冰醋酸水溶液（体积/体积）平衡层析柱，待0.25%冰醋酸水溶液（体积/体积）液面高于人造沸石沉积面2-3厘米时，立即加入提取液，适当调节流速45~50mL/min，收集吸附柱开始流出的白色浑浊液。当提取液面下降到沸石表面时，立即继续加注射用水，但浑浊液流尽后停止收集。流出沸石柱的层析液用冰醋酸调节pH至3.5，水浴迅速加热搅拌至100℃保温3分钟，立即冷却后纸浆过滤后收集滤液。滤液用冰醋酸调节pH至3.5，并按每100mL溶液加入3mL10%皂土浆的用量加入皂土，搅拌吸附40分钟后，经过滤后收集无色澄清溶液即得缩宫素溶液。每克后叶干粉制得缩宫素980单位以上。放入洁净的塑料桶中，按45kg/桶加盖后贴签，桶用洁净的塑料膜包扎密封后，存放于-5℃以下冷库中，有效期12个月。取样，用磺基水杨酸试液检查，不发生沉淀。

实施例2：

称后猪垂体后叶干粉50g，加入注射用水0.8升，搅拌提取30分钟，离心，收集液体，残渣再分别加水0.7升、0.6升、0.5升按同法提取三次，合并四次离心液。取人造沸石1000g，加入0.25%冰醋酸水溶液（体积/体积）10升，搅拌后倒入层析柱内，使人造沸石自然沉降，等人造沸石沉降约2-3cm后，打开柱的出口，调节合适的流速，使人造沸石继续沉积，同时逐渐加入0.25%冰醋酸水溶液（体积/体积）平衡层析柱，待0.25%冰醋酸水溶液（体积/体积）液面高于人造沸石沉积面2-3厘米时，立即加入提取液，适当调节流速45~50mL/min，收集吸附柱开始流出的白色浑浊液。当提取液面下降到沸石表面时，立即继续加注射用水，但浑浊液流尽后停止收集。流出沸石柱的层析液用冰醋酸调节pH至3.5，水浴迅速加热搅拌至100℃保温3分钟，立即冷却后纸浆过滤后收集滤液。滤液用冰醋酸调节pH至3.5，并按每100mL溶液加入3mL10%皂土浆的用量加入皂土，搅拌吸附40分钟后，再经过滤后收集无色澄清溶液即得缩宫素溶液。每克后叶干粉制得缩宫素980单位以上。放入洁净的塑料桶中，按45kg/桶加盖后贴签，桶用洁净的塑料膜包扎密封后，存放于-5℃以下冷库中，有效期12个月。取样，用磺基水杨酸试液检查，不发生沉淀。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims

1.一种采用生物提取法制备缩宫素溶液的生产工艺，包括

步骤1：垂体后叶干粉加水提取，离心收集提取液；

2.根据权利要求1所述生产工艺，其特征在于，步骤1所述垂体后叶干粉的制备方法为取哺乳动物小脑置于丙酮中脱水后，分离垂体后叶，干燥后粉碎过40-60目筛即得。

3.根据权利要求2所述生产工艺，其特征在于，所述哺乳动物为猪、狗、牛、羊、马中的一种。

4.根据权利要求1所述生产工艺，其特征在于，步骤1所述加水提取为加水提取四次，每次30分钟，合并提取液。

5.根据权利要求1所述生产工艺，其特征在于，步骤1所述加水提取的步骤中垂体后叶干粉与水的重量比为1:10-1:20。

6.根据权利要求1所述生产工艺，其特征在于，步骤2所述分离收集层析液的步骤为在人造沸石加入0.25%冰醋酸水溶液（体积/体积），搅拌后倒入层析柱内，使人造沸石自然沉降，等人造沸石沉降约2-3cm后，打开柱的出口，调节合适的流速，使人造沸石继续沉积，同时逐渐加入0.25%冰醋酸水溶液（体积/体积）平衡层析柱，待层析柱中人造沸石加至柱高2/3时，加入0.25%冰醋酸水溶液（体积/体积）至冰醋酸水溶液液面高于人造沸石沉积面2-3厘米，立即加入提取液，收集层析柱出口流出的白色浑浊的层析液。

7.根据权利要求6所述生产工艺，其特征在于，按g/mL计，人造沸石与0.25%冰醋酸水溶液（体积/体积）的质量体积比为1:10。

8.根据权利要求1所述生产工艺，其特征在于，步骤2所述提取液的流速为45~50mL/min。

9.根据权利要求1所述生产工艺，其特征在于，步骤3所述加入皂土吸附的步骤为按每100mL滤液加入3mL10%皂土浆的量加入皂土浆，搅拌吸附40分钟。