CN101189022A - 促肾上腺皮质激素类似物以及相关方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的ACTH类似物化合物包括包含带有一个或多个结构修饰的ACTH肽序列的化合物，所述的结构修饰具有一种或多种下列优选的ACTH类似物的生物学功能：(1)与未修饰ACTH相比，降低了ACTH类似物存在情况下肾上腺膜对皮质类固醇的分泌；(2)降低在内源ACTH存在条件下肾上腺膜对皮质类固醇的分泌；和(3)与结合至MC－2R黑皮质素的未修饰ACTH相比，增加对MC－2R的结合亲和性同时降低对MC－2R受体的活化。因此，本发明的ACTH类似物化合物可用于治疗或预防与ACTH、ACTH受体或皮质类固醇分泌相关的疾病和病症，例如早产和库欣病。

Description

促肾上腺皮质激素类似物以及相关方法
政府支持
本申请主题得到了国立卫生研究院(National Institutes of Health)的研究基金(基金号NIH：DK50870)以及国立科学基金会(National ScienceFoundation)的基金(基金号NSF IBN-0132210)的支持。因此，政府具有本发明的某些权利。
对相关申请的交叉参考
本申请要求2004年10月27日提交的题目为“用于治疗早产、库欣综合征以及相关病症的组合物和方法组合物”的美国临时专利申请序列号60/622,436的权益，所述临时专利申请在此引用作为参考。
技术领域
本发明涉及ACTH类似物化合物以及相关药物组合物和治疗方法。
发明背景
促肾上腺皮质素(corticotropin)也称作促肾上腺皮质激素(ACTH)，是由垂体腺分泌的主要激素，垂体腺被认为是产生多种重要生长类固醇和生理控制类固醇的介质。ACTH刺激肾上腺皮质。更加具体而言，它刺激糖皮质激素如人体中的皮质醇(或者啮齿动物中的皮质酮)的分泌，并且很少控制来自肾上腺皮质的其它主要类固醇激素醛固酮的分泌。ACTH结合至肾上腺中表达的MC-2R促肾上腺皮质激素受体上。
ACTH是响应源自下丘脑的促肾上腺皮质素释放激素(CRH)而由垂体前叶分泌的。在垂体腺中，ACTH衍生自大的前体分子阿黑皮素原(POMC)，该前体分子通过特异性肽酶作用而断裂。ACTH对类固醇合成的影响包括增加胆固醇酯酶、胆固醇向线粒体膜和跨线粒体膜的转运、胆固醇与P450SCC的结合，因此增加了孕烯醇酮的产生(参见Nussey，S.和S.Whitehead，Endocrinology：An Integrated Approach，BIOS ScientificPublishers Ltd.(2001))。随后的作用包括诱导类固醇生成酶以及特征为超血管化的显著结构改变、细胞过度生长和超常增生。这在ACTH过量分泌较长时间阶段后特别明显。
类固醇糖皮质激素由肾上腺的束状带-网状带细胞(fasciculata-reticulacell)产生，并且作为对血浆促肾上腺皮质激素(ACTH)水平增加的反应而分泌。糖皮质激素涉及糖、蛋白质和脂肪代谢，已经表明其具有抗炎症特性并且在应激过程中过度分泌。过量的糖皮质激素会损害脑边缘系统的海马区，海马区对于认知功能如学习和记忆是至关重要的。参见例如Sapolsky，R.M.，Ann.N.Y.Acad.Sci.746：294(1994)；以及McEwen，B.S.，Ann.N.Y.Acad.Sci.746：134(1994)。此外，糖皮质激素的神经毒性以及神经危害性在神经系统发育和衰老以及与海马损伤相关的神经疾病中具有重要的作用。参见例如deKloet，E.R.等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.746：8(1994)。
皮质类固醇是在结构上与胆固醇相关的类固醇激素。这些激素在肾上腺皮质合成，并且包括糖皮质激素(例如皮质类固醇)、盐皮质激素(例如醛固酮)以及弱的雄激素和雌激素。与甲状腺一样，肾上腺的功能处于下丘脑(HPT)和垂体(PIT)的控制之下。当皮质类固醇(天然存在的糖皮质激素)水平下降到设定点时，下丘脑释放CRH(促肾上腺皮质素释放激素)，CRH刺激促肾上腺皮质激素(ACTH)从垂体释放。ACTH是促激素，其刺激皮质类固醇的合成和分泌(其对醛固酮的合成/分泌作用最小)以及肾上腺的生长。
这里需要能结合ACTH受体但对皮质类固醇分泌的活化降低的化合物，以便例如治疗ACTH相关疾病，包括库欣综合征、因皮质类固醇过度分泌导致的免疫应答受损以及某些肾上腺相关原因的早产。
库欣综合征是源自肾上腺皮质分泌皮质类固醇增加的病症。肾上腺皮质功能亢进可以是ACTH依赖性的，或者不依赖于ACTH的调节，例如由肾上腺皮质腺瘤癌导致的皮质类固醇产生。库欣综合征的共因是垂体腺过量产生ACTH。这种在血流中ACTH水平增加一般是因为垂体腺瘤(库欣病)产生的，但在罕见情况下病因不同。源自垂体腺外位点ACTH产生的库欣综合征被称作异位库欣综合征。异位位点实例包括胸腺瘤、甲状腺髓样癌、嗜铬细胞瘤、胰腺的胰岛细胞瘤以及肺的燕麦细胞癌。然而，在人中绝大多数的库欣综合征的病因是垂体腺瘤。库欣综合征的症状包括与未患该疾病的哺乳动物相比体重增加、中心性肥胖、类固醇分泌过多、尿皮质醇排泄增加、月亮脸、虚弱、疲劳、背痛、头痛、阳萎、精神状态改变、肌肉萎缩、口渴增加以及尿增加。库欣综合征的诊断和治疗仍然是一个挑战(参见Oldfield，E.W.等人，N.Engl.J.Med.，325：897-905(1991)；Findling，J.W.等人，″Diagnosis and differential diagnosis of Cushing’ssyndrome，″Endocrinol.Metab.Clin.North Am.，30：729-47(2001)；Orth，D.N.，″Cushing’s syndrome，″N Engl J Med.，332：791-803(1995))。对于库欣综合征，当前还没有医学治疗法。在有经验的专科中心，手术切除分泌ACTH的垂体微腺瘤的总体治愈率为大约70-80％，但是对于大腺瘤，治愈率仅为大约30％，需要广泛的手术切除预示着对周围正常垂体组织存在重大风险，在大约80％的病理中导致部分或全部的垂体功能减退(Simmons，N.E.等人，″Serum Cortisol response to transphenoidal surgery forGushing disease，″J.Neurosurg.，95：1-8(2001)；Mampalam，T.J.等人，″Transsphenoidal microsurgery for Cushing’s disease：A report of 216cases，″Ann.Intern.Med.，109：487-93(1988)；以及Trainer，P.J.等人，″Transsphenoidal resection in Cushing’s disease：undetectable serumcortisol as the definition of successful treatment，″Clin.Endocrinol.，38：73-8(1993))。因此，对于ACTH的来自为散步垂体肿瘤或者异位来源的库欣综合征，仍然需要有效且对患者没有危险的治疗法。结合ACTH受体但对皮质醇分泌的活化降低的化合物也可用于治疗引起早产的下丘脑-垂体-肾上腺轴。在所有分娩中，大约7-10％存在早产，并且早产在围产期发病率和死亡率中占相对大的比例(McCormick，M.C，″The contributionof low birth weight to infant mortality and childhood morbidity，″N Engl JMed.，312：82-90(1985))。由于种种原因，需要预防自发流产和早产以及延长女性的妊娠。因为下列原因需要延长妊娠：(i)更可能分娩出活的婴儿；(ii)降低早产儿健康并发症的发生率；以及(iii)减少早产儿接受特别护理(即便是健康的，但由于其大小和生存能力的原因必须接受特别护理)的时间阶段。如下所有因素(i)出生存活，(ii)婴儿健康，以及(iii)婴儿能在父母照看下能及时出院影响着父母和亲戚的幸福和安宁。早产还对社会产生影响，包括因护理过早出生婴儿而产生的非常巨大的社会经济影响。
在农业和水产业中，当生物在高群体密度下饲养时会更加划算。然而在哺乳动物、家禽和鱼类中，这经常导致过量产生肾上腺应激激素，这会造成有害的后果，包括免疫功能受损和生长降低。降低这些情况下或者由长时间应激产生并且导致不良健康改变(例如免疫功能降低并且对疾病易感)的其它情况下的肾上腺应激激素水平也是合乎需要的。
多种组合物和方法可用于降低ACTH水平，例如通过精氨酸血管升压素(AVP)的某些受体。2000年5月3日提出的美国专利号6,380,155涉及某些血管升压素受体拮抗物组合物用于调节ACTH释放的用途。调节ACTH水平以治疗ACTH相关病症的组合物是合乎需要的，例如能结合ACTH MC-2R受体但同时降低和消除了ACTH诱导的皮质类固醇产生以致于减轻了与ACTH水平提高相关不良病症的化合物。
发明简述
提供了多种修饰的促肾上腺皮质激素(ACTH)肽(“ACTH类似物”)，与未修饰ACTH相比，修饰的ACTH降低和消除了ACTH诱导的皮质类固醇的分泌。优选地，ACTH类似物还降低了在未修饰ACTH存在下肾上腺膜对皮质类固醇的分泌。
ACTH类似物化合物优选包含带有一个和多个氨基酸替代的未修饰ACTH中的至少氨基酸1-24。ACTH类似物化合物可包括一个和多个氨基酸替代或者相对于未修饰ACTH氨基酸序列而言为截断的。未修饰的人ACTH是具有下列序列的39个氨基酸残基的多肽：N-Ser1-Tyr-Ser-Met-Glu5-His-Phe-Arg-Trp-Gly10-Lys-Pro-Val-Gly-Lys15-Lys-Arg-Arg-Pro-Val20-Lys-Val-Tyr-Pro-Asn25-Gly-Ala-Glu-Asp-Glu30-Ser-Ala-Glu-Ala-Phe35-Pro-Leu-Glu-Phe39-Ac(SEQ ID NO.1)，其中N和Ac分别代表分子的氨基和羧基末端。ACTH类似物还可包含这样的化合物，即包括在序列N-Ser1-Tyr-Ser-Met-Glu5-His-Phe-Arg-Trp-Gly10-Lys-Pro-Val-Gly-Lys15-Lys-Arg-Arg-Pro-Val20-Lys-Val-Tyr-Pro-Ac(SEQ IDNO：2)中具有一个和多个替代和修饰的肽的化合物，其中N和Ac分别代表分子的氨基和羧基末端。优选的ACTH类似物化合物至少包括带有一个或多个氨基酸替代的hACTH和mACTH的至少氨基酸残基1-19、更优选hACTH或mACTH的氨基酸残基1-24。
ACTH类似物化合物包括包含带有一个或多个结构修饰的ACTH序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的化合物，所述修饰导致产生一种或多种下列优选的ACTH类似物生物功能：(1)与未修饰ACTH相比，降低在ACTH类似物存在条件下肾上腺膜对皮质类固醇的分泌，(2)降低在内源ACTH存在条件下肾上腺膜对皮质类固醇的分泌，以及(3)与未修饰ACTH相比，增加对MC-2R的结合亲和性同时降低对MC-2R受体的活化。优选的ACTH氨基酸替代以形成ACTH类似物化合物的实例包括下列的一种或多种：(1)保留位置6-9的氨基酸和/或促进或保留MC-2R结合而在位置1-13处进行的一个或多个氨基酸残基替代，(2)为了防止或对抗在位置15-18处进行酶切断裂而在位置25-18处进行的一个或多个氨基酸残基替代，(3)为了使ACTH类似物在位置15-18不包含相邻的带碱性侧链的氨基酸残基而在位置15-18处进行的一个或多个氨基酸残基替代，(4)为延长ACTH类似物的血清半衰期而在位置20-24进行的一个或多个氨基酸残基替代或截断，(5)为了与未修饰ACTH肽相比降低在ACTH类似物化合物存在条件下肾上腺膜对皮质类固醇的分泌，而在位置20-36处进行的一个或多个氨基酸残基替代，(6)为了向ACTH类似物化合物提供想要的释放特性而在位置25-39处进行的一个或多个氨基酸残基替代或者优选截断，或者(7)将氨基酸残基25-39截断，在位置24的氨基酸残基形成分子的羧基末端。
ACTH类似物化合物优选结合ACTH受体，如肾上腺膜中的黑皮质素2受体(MC-2R)。更加优选地，ACTH类似物化合物不活化或者较弱地活化表达MC-2R的细胞并且抑制或降低未修饰的内源ACTH的作用。
在第一个实施方案中，相对于未修饰的人ACTH氨基酸序列而言，多种ACTH类似物化合物可以包括一个或多个氨基酸替代或截断。例如，包含分离的ACTH类似物肽的组合物可以包括具有至少一种下列氨基酸替代的SEQ ID NO：2的肽：
a.SEQ ID NO：2位置19处的Pro残基替代成氨基酸Trp；或者
b.选自SEQ ID NO：2的氨基酸残基16-18的残基处的一个或多个氨基酸替代，以致于ACTH类似物的氨基酸残基16、17和18不包括任何两个相邻的选自Lys和Arg的氨基酸残基；并且在SEQ ID NO：2的位置16、17或18替代成的一个或多个氨基酸残基选自Lys、Arg、Gln、Gly、Ala、Val、Leu、Ile以及具有烷基侧链的氨基酸类似物(例如Nle)。任选地，ACTH类似物肽可以包括至少一个Ala、Gly或具有烷基侧链的另一个氨基酸(即Val、Leu、Ile、包含烷基侧链的氨基酸类似物如Nle)以及至少一个Arg残基，它们在SEQ ID NO：2的氨基酸位置15、16、17或18的任何两个位置进行替代。任选地，ACTH类似物基本上由具有下列氨基酸替代的SEQ IDNO：2的序列组成：SEQ ID NO：2中位置19处的Pro残基被氨基酸Trp替代；SEQ ID NO：2中位置15处的氨基酸选自Lys、Ala和Gln；以及ACTH类似物肽可以在选自SEQ ID NO：2中的氨基酸残基16、17和18的残基处包含一个或多个氨基酸替代，以致于ACTH类似物的氨基酸残基16、17和18不包括任何两个相邻的选自Lys和Arg的氨基酸残基。优选地，ACTH类似物肽在氨基酸残基6、7、8和9处包括SEQ ID NO：4的氨基酸序列。ACTH类似物肽还可以在氨基酸残基15-19处包括SEQ ID NO：12的氨基酸序列。
第一个实施方案还包括具有带有至少一个氨基酸替代的SEQ ID NO：1的肽的ACTH类似物，所述替代例如SEQ ID NO：1的位置19、26、30或36处的氨基酸残基替代。ACTH类似物肽也包括具有至少一个下列氨基酸替代的SEQ ID NO：1的肽：
a.SEQ ID NO：1位置19处的Pro残基替代成氨基酸Trp；或者
b.选自SEQ ID NO：1的氨基酸残基16-18的残基处的一个或多个氨基酸替代，以致于ACTH类似物的氨基酸残基16、17和18不包括任何两个相邻的选自Lys和Arg的氨基酸残基；并且在SEQ ID NO：1的位置16、17或18替代成的一个或多个氨基酸残基选自Lys、Arg、Gln、Gly、Ala、Val、Leu、Ile以及Nie(或者具有烷基侧链的另一个氨基酸类似物)。
其它优选的ACTH类似物肽包括对SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的肽的修饰，以致于ACTH类似物肽在氨基酸残基15-19处包括SEQ IDNO：6的氨基酸序列。ACTH类似物肽还包括对一个或多个肽的截断。ACTH类似物还包括对SEQ ID NO：1的氨基酸残基25-39截断。ACTH类似物肽SEQ ID NO：20是特别优选的。
在一些实施方案中，通过体外血清皮质类固醇诱导分析法(SerumCorticosteroid Induction Assay)所测定，与施用SEQ ID NO：2的肽相比，施用ACTH类似物肽使ACTH所诱导的肾上腺膜产生的皮质酮降低至少10％，优选降低高达100％。例如，在第二个实施方案中，ACTH类似物是修饰的ACTH肽，其与未修饰ACTH相比降低了在ACTH类似物存在条件下肾上腺膜对皮质类固醇的分泌。
在一些实施方案中，通过体外血清皮质类固醇抑制分析法(SerumCorticosteroid Inhibition Assay)所测定，施用ACTH类似物肽使ACTH所诱导的皮质类固醇分泌降低至少10％。在第三个实施方案中，ACTH类似物是修饰的ACTH肽，其降低了在内源ACTH存在条件下肾上腺膜对皮质类固醇的分泌。
在一些实施方案中，提供了组合物，所述组合物包括分离的带有至少一个氨基酸替代的SEQ ID NO：2的ACTH类似物的肽，其中ACTH类似物肽结合至肾上腺膜并替代下肾上腺膜上的SEQ ID NO：2的肽。可通过体外无血清肾上腺竞争结合分析法(Serum-Free Adrenal CompetitiveBinding Assay)测定肽的结合。例如，在第四个实施方案中，ACTH类似物是修饰的ACTH肽，其结合至肾上腺ACTH受体如MC-2R受体，并优选具有增加的MC-2R结合亲和性并且对MC-2R受体的活化降低(与未修饰ACTH相比)。优选地，ACTH类似物肽可结合至肾上腺膜并替代下肾上腺膜上的SEQ ID NO：2的肽，其中可通过体外无血清肾上腺竞争结合分析法测定肽的结合。最优选地，ACTH类似物肽以比SEQ ID NO：2的肽高2至少2倍的亲和性结合至MC-2R肾上腺膜。
在一些实施方案中，通过体外无血清肾上腺抑制分析法(Serum-freeAdrenal Inhibition Assay)所测定ACTH类似物肽降低了ACTH诱导的肾上腺膜的皮质酮的产生。例如，在第五个实施方案中，ACTH类似物化合物可以体外降低外植体组织中由未修饰ACTH对皮质类固醇的诱导。ACTH类似物包括在体外无血清肾上腺抑制分析中降低ACTH诱导的肾上腺膜对皮质酮产生的肽。
在第六个实施方案中，提供了半衰期延长的ACTH类似物。半衰期延长的ACTH类似物被鉴定为通过体内检测的血清皮质类固醇浓度所测量的第一种活性高于通过体外活性检测的皮质类固醇的无血清浓度(serum-free concentration)所测量第二种活性，其中体内活性通过实施例2的血清肾上腺皮质类固醇抑制分析法测定，体外活性通过实施例4的体外无血清肾上腺皮质类固醇抑制分析法测定。
在第七个实施方案中，提供了筛选可阻断过量ACTH同时维持肾上腺健康状态的ACTH类似物的方法。可制备并向患者施用多种ACTH类似物来评估在体内对可的松的诱导。
在第八个实施方案中，本公开涉及包含ACTH类似物的药物组合物以及以适于治疗与ACTH相关病有关症状的方式向受试者施用。本文所述的ACTH类似物可以加入到药物组合物中来治疗ACTH相关病，如人或动物中的ACTH过表达。还提供了产生ACTH类似物以及包含ACTH类似物的相关药物组合物的方法。例如，在一个方面，提供了在一类ACTH类似物中筛选可用于阻断过量ACTH同时维持肾上腺健康状态的化合物的方法。
ACTH类似物化合物可用于治疗与ACTH水平相关的疾病，例如对ACTH受体(例如MC-2R)调节作出响应的病。还提供了用于调节皮质类固醇分泌或皮质类固醇水平的化合物。可施用ACTH类似物化合物来治疗与ACTH水平调节相关的病，例如降低患者中高水平ACTH的影响而同时维持了肾上腺功能的健康状态。例如，ACTH类似物组合物可用于治疗ACTH相关病，例如库欣综合征、因皮质类固醇过度分泌导致的免疫应答受损、引起早产(例如通过下丘脑-垂体-肾上腺轴)以及相关病。在一个方面，制备并向患者施用多种ACTH类似物来评估在体内对可的松的诱导。在另一个方面，提供了治疗兽类受试者的方法，例如降低应激激素以便利于高群体密度下农业和水产业物种健康生长的方法。
附图简述
在附图中：
图1显示与施用未修饰ACTH后测量的皮质酮水平相比，注射多种ACTH类似物化合物后体内测量的皮质酮水平。
图2比较了施用未修饰ACTH、组合施用ACTH类似物与未修饰ACTH、施用ACTH类似物后再单独施用未修饰ACTH、以及仅施用ACTH类似物所体内诱导的皮质酮。
图3是比较未修饰ACTH和ACTH类似物化合物对肾上腺ACTH受体竞争性结合分析结果的图。
图4比较了未修饰ACTH、ACTH类似物与未修饰ACTH的组合、以及单独的ACTH类似物在体外对外植肾上腺膜中中皮质酮的诱导。
图5比较了与未修饰ACTH的活性(即100％)相比，不同的ACTH激动剂化合物体内和体外诱导皮质酮的活性。
发明详述
除非另外定义，本文所用的所有技术术语和科学术语具有同本发明相关领域内普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。在相冲突的情况下，以本申请文件(包括定义)为准。优选的方法和材料描述如下，但是与本文所述的那些方法和材料相似或等效的方法和材料也可用于实践或测试本发明。本文提到的所有出版物、专利申请、专利文献和其它参考文献在此全部引用作为参考。本文公开的材料、方法和实施例仅是例证性的，并不是限制性的。
如本文所使用，术语“未修饰促肾上腺皮质激素”(“未修饰ACTH”)意思是指由垂体前叶腺体产生的刺激肾上腺皮质分泌糖皮质激素的肽激素，所述的糖皮质激素帮助细胞通过糖异生作用合成葡萄糖、分解代谢蛋白质、动员游离脂肪酸以及抑制变态反应中的炎症。一种此类激素是皮质类固醇，其调节糖、脂肪和蛋白质代谢。
如本文所使用的“皮质类固醇”包括人皮质类固醇皮质醇和啮齿动物皮质类固醇皮质酮。在涉及数量中所使用的术语“大约”包括相当于所述数量的所述数量的变化，例如对于预期的目的或功能而言与所述数量没有基本不同的数量。
如本文所使用的命名法“P(x-y)”(其中P是多肽的名称，x和y是整数)指由称作“P”的多肽的位置(x)至位置(y)的连续氨基酸组成的氨基酸序列。例如，“hACTH(1-24)”指由人ACTH肽从氨基末端开始的残基1至24组成的24个连续氨基酸的多肽。“mACTH”指鼠ACTH。特别地，hACTH(1-24)和mACTH(1-24)是相同的肽序列。
命名法“aXb”(其中a和b是氨基酸的单字母缩写，X是数字)指未修饰ACTH肽中“X”位置的氨基酸“a”被替代成氨基酸“b”。例如“(V26F，E30K)mACTH”指从从分子的氨基末端开始第26位的Val被替代成Phe并且第30位的Glu被替代成Lys的39个氨基酸的小鼠ACTH分子。类似地，命名法“αβχX-Yδεφ”(其中α、β、χδ、ε和φ代表氨基酸的单字母缩写，X和Y是数字)指位置X至Y的连续氨基酸“αβχ”被氨基酸“δεφ”替代。
ACTH类似物化合物包括包含具有一个或多个结构修饰的ACTH序列的化合物，所述修饰提供了一种或多种下列优选的ACTH类似物的生物学功能(1)与未修饰ACTH相比，降低在ACTH类似物存在条件下肾上腺膜对皮质类固醇的分泌，(2)降低在内源ACTH存在条件下肾上腺膜对皮质类固醇的分泌，(3)与未修饰ACTH相比，提高MC-2R结合亲和性同时降低对MC-2R受体的活化。据认为，ACTH类似物化合物通过结合至黑皮质素2受体(MC-2R)、较弱地活化表达MC-2R的细胞并阻断内源ACTH对MC-2R受体的作用而起作用。用于形成带有一种或多种期望功能的ACTH类似物化合物的优选的ACTH氨基酸替代实例包括：(1)保留位置6-9的氨基酸和/或促进或保留MC-2R结合而在位置1-13处进行的一个或多个氨基酸残基替代，(2)为了防止或对抗在位置15-18处进行酶切断裂而在位置25-18处进行的一个或多个氨基酸残基替代，(3)为避免出现两个相邻碱性氨基酸而在位置15-18处进行的一个或多个氨基酸残基替代，(4)为延长ACTH类似物的血清半衰期而在位置20-24进行的一个或多个氨基酸残基替代或截断，(5)为了向ACTH类似物化合物提供想要的释放特性而在位置25-39处进行的一个或多个氨基酸残基替代或者优选截断，或者(6)将氨基酸残基25-39截断，在位置24的氨基酸残基形成分子的羧基末端。
ACTH类似物化合物
在第一个实施方案中，相对于未修饰的人ACTH氨基酸序列而言，多种ACTH类似物化合物可以包括一个或多个氨基酸替代或截断。未修饰的人ACTH是具有下列序列的39个氨基酸残基的多肽：N-Ser1-Tyr-Ser-Met-Glu5-His-Phe-Arg-Trp-Gly10-Lys-Pro-Val-Gly-Lys15-Lys-Arg-Arg-Pro-Val20-Lys-Val-Tyr-Pro-Asn25-Gly-Ala-Glu-Asp-Glu30-Ser-Ala-Glu-Ala-Phe35-Pro-Leu-Glu-Phe39-Ac(SEQ ID NO：1)(“hACTH”)，其中N和Ac分别代表分子的氨基和羧基末端。ACTH(1-24)是保守的，因为在许多脊索动物中发现了ACTH(1-24)，包括人具有如下肽序列：N-Ser1-Tyr-Ser-Met-Glu5-His-Phe-Arg-Trp-Gly10-Lys-Pro-Val-Gly-Lys15-Lys-Arg-Arg-Pro-Val20-Lys-Val-Tyr-Pro-Ac(SEQ ID NO：2)的人ACTH(1-24)(以及与其相同的鼠ACTH的1-24部分(“mACTH(1-24)”)，其中N和Ac分别代表分子的氨基和羧基末端。
ACTH类似物化合物可以包括带有一个或多个氨基酸替代的hACTH(SEQ ID NO：1)的至少氨基酸残基1-19，更优选氨基酸残基1-24。优选的ACTH类似物化合物包含通过一个或多个氨基酸替代修饰的SEQID NO：2。ACTH类似物化合物包括包含带有一个或多个结构修饰的ACTH序列的化合物，所述修饰提供了一种或多种下列优选的ACTH类似物的生物功能：(1)与未修饰ACTH相比，降低在ACTH类似物存在条件下肾上腺膜对皮质类固醇的分泌，(2)降低在内源ACTH存在条件下肾上腺膜对皮质类固醇的分泌，以及(3)与未修饰ACTH相比，增加对MC-2R的结合亲和性同时降低对MC-2R受体的活化。
特别优选的ACTH类似物化合物具有对未修饰的人ACTH序列进行的一个或多个下列氨基酸替代：(1)保留位置6-9的氨基酸而在位置1-13处进行的一个或多个氨基酸残基替代，(2)防止或对抗在位置15-18上进行酶切断裂的在这些位点上的一个或多个氨基酸残基替代，(3)为避免出现两个相邻碱性氨基酸而在位置15-18处进行的一个或多个氨基酸残基替代，(4)为延长ACTH类似物的血清半衰期而在位置20-24进行的一个或多个氨基酸残基替代或截断，和(5)为了向ACTH类似物化合物提供延长的血清半衰期(与未修饰ACTH相比，或者与其它ACTH类似物化合物相比)而在位置25-39处进行的一个或多个氨基酸残基替代或者优选截断。
ACTH类似物优选包含通过下式(I)描述的多肽：
(I)N-(AA1-13)-(AA14)-(AA15-18)-(AA19)-Ac
其中N和Ac分别指多肽的氨基末端和羧基末端，(AA1-13)指第一个系列的13个连续氨基酸或氨基酸类似物，(AA14)代表连接到第一个系列羧基末端的氨基酸残基，(AA15-18)指连接到(AA14)羧基末端的第二个系列的4个连续氨基酸，(AA19)代表连接到第二个系列羧基末端的氨基酸残基。
式(I)的ACTH类似物还优选包含连接到(AA19)-Ac部分的羧基末端的一部分更大分子。ACTH类似物还可包括连接到式(I)的羧基末端(Ac)的另外氨基酸。最优选地，ACTH类似物包括连接到式(I)的Ac部分的总共5个另外氨基酸，这样在ACTH类似物中总共有24个氨基酸。
ACTH类似物可以包含对应于式(I)的未修饰ACTH的氨基酸序列，优选地包括一个或多个氨基酸替代。另外的氨基酸或氨基酸类似物优选地被连接到式(I)的(AA19)残基的羧基末端。
式(I)的(AA1-13)-部分代表着式(II)的13个氨基酸的序列：
(II)-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-AA8-AA9-AA10-AA11-AA12-AA13-
其具有表1第二行所述的未修饰ACTH氨基酸序列，任选地包括在表1第三行所提供的一个或多个氨基酸替代。未修饰的人ACTH的(AA1-13)-部分具有序列Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val(SEQID NO：3)。优选地，式(II)的AA6-AA7-AA8-AA9-部分具有可任选地被一个或多个其(D)氨基酸类似物替代的未修饰的氨基酸序列His-Phe-Arg-Trp-(SEQ ID NO：4)。
在表1中，标记(D)指所指定氨基酸的(D)对映异构体；Nle指氨基酸类似物正亮氨酸或带有烷基侧链的另一个氨基酸；Orn指鸟氨酸或者带有相似侧链的另一个修饰氨基酸；Dab指2，4二氨基丁酸或相似的二氨基酸；Dpr指2，3二氨基丙酸或者另一个二氨基酸；(D)p-iodo-Phe指空间基团(steric group)，例如对碘修饰的Phe；并且(D)-I-naph-Ala指I-萘基修饰的(D)-Ala或者另一个空间修饰氨基酸。包括对未修饰ACTH的未修饰的(AA1-13)-部分进行替代的ACTH类似物化合物优选包括在表1中给定残基位置之下指出的任选的ACTH类似物氨基酸残基之一。例如，未修饰的ACTH在位置AA5具有Glu残基，在所形成的ACTH类似物中其可以被(D)-Glu、Cys或Asp残基任选替代。式(II)的氨基酸序列还可以包括对应于MC-2R结合序列的一个或多个氨基酸替代，所述的MC-2R结合序列由Hruby等人在美国专利号4,485,039；4,457,864；4,866,038；5,731,408；5,714,576；5,049,547；4,918,055；4,649,191以及5,674,839中描述，这些专利在此引用作为参考。
式(I)的(AA14)-部分代表着一个氨基酸残基，其优选地为Gly或(D)Gly，但是保留了ACTH类似物化合物的良好生物学功能(例如与ACTH相比降低通过ACTH类似物产生的皮质类固醇分泌，降低通过内源ACTH和/或MC-2R结合产生的皮质类固醇分泌)的其它氨基酸也可以在(AA14)-位置进行替代。
式(I)的(AA15-18)-部分代表式(III)的4个氨基酸的序列：
(III)-AA15-AA16-AA17-AA18-。
未修饰的人ACTH的(AA15-18)-部分包含序列Lys-Lys-Arg-Arg(SEQ IDNO：5)，其包括4个相邻的具有碱性侧链的氨基酸。优选地，ACTH类似物化合物包括式(III)中的一个或多个氨基酸残基替代，这些替代防止或对抗在这些位点的酶切断裂。还优选地，ACTH类似物化合物包括式(III)中的一个或多个氨基酸替代，这些替代避免了存在相邻的带有碱性侧链的氨基酸。优选地，AA15-和AA16-独立地选自Lys、Ala、Gly和Val；优选地，AA17-AA18独立地选自Arg、Ala、Gly和Val。
在一个方面，这样选择SEQ ID NO：2或式(III)的残基AA16-AA17-AA18的一个或多个氨基酸替代，使得ACTH类似物的氨基酸残基16、17和18不包括2个相邻的选自Lys和Arg的氨基酸残基。换句话说，在一些ACTH类似物中，肽序列AA16-AA17-AA18部分中氨基酸Lys和Arg不能彼此相邻(即一个精氨酸与一个赖氨酸相邻，反之亦然)或者自身相邻(即一个精氨酸与另一个精氨酸相邻，或者一个赖氨酸与另一个赖氨酸相邻)出现。作为替代，AA16-AA17-AA18部分中的一个或多个氨基酸可以被除Lys或Arg外的任何氨基酸或氨基酸类似物替代，以提供了一种或多种下列优选的ACTH类似物的生物功能：(1)与未修饰ACTH相比，降低在ACTH类似物存在条件下肾上腺膜对皮质类固醇的分泌，(2)降低在内源ACTH存在条件下肾上腺膜对皮质类固醇的分泌，以及(3)与未修饰ACTH相比，增加对MC-2R的结合亲和性同时降低对MC-2R受体的活化。例如，ACTH类似物化合物可以包括在式(III)的一个或多个位置替代未修饰ACTH残基的Ala残基。ACTH类似物化合物可以包括替代式(III)中SEQ ID NO：5残基的Gly或者带有烷基侧链的任意氨基酸(即Ala、Val、Leu、Ile或者包含烷基侧链的氨基酸类似物，例如Nle)。还优选地，ACTH类似物还可以包括替代SEQ ID NO：2的氨基酸位置15、16、17或18中任意两个位置的至少一个Ala残基和至少一个Arg残基。任选地，在SEQ ID NO：2的位置15、16、17或18处的ACTH类似物替代物是选自下列的氨基酸：Lys、Arg、Ala、Gly、Val、Leu、Ile、包含烷基侧链的氨基酸类似物如Nle、Gln、Asn、Glu和Asp。最优选地，ACTH类似物包含根据式(III)的氨基酸序列，所述式(III)选自：Lys-Arg-Ala-Ala-(SEQ ID NO：6)、Ala-Lys-Ala-Arg(SEQ ID NO：7)、Lys-Ala-Ala-Arg(SEQ ID NO：8)、Lys-Ala-Arg-Ala-(SEQ ID NO：9)、Gln-Lys-Gln-Arg(SEQ ID NO：10)以及Ala-Ala-Ala-Ala(SEQ ID NO：11)。ACTH类似物化合物还可以包括在位置15、16、17或18处用具有烷基侧链的氨基酸或氨基酸类似物包括Gly、Ala、Val、Leu、Ile或Nle进行的一个或多个氨基酸残基替代。ACTH类似物包括在AA15-AA16-AA17-AA18位置的一个或多个位置替代的其它氨基酸，这些替代保留了ACTH类似物化合物的一种或者优选多种生物学功能，例如与未修饰ACTH相比降低通过ACTH类似物产生的皮质类固醇分泌，降低通过内源ACTH和/或MC-2R结合产生的皮质类固醇分泌。
式(I)的(AA19)-部分代表一个氨基酸残基，其可以是Pro、Trp或Ala，但是优选地是Trp、Ala或者可以在(AA19)-位置进行替代同时又保留了ACTH类似物化合物的一种或优选多种生物学功能(例如与未修饰ACTH相比降低通过ACTH类似物产生的皮质类固醇分泌，降低通过内源ACTH和/或MC-2R结合产生的皮质类固醇分泌)的其它氨基酸。优选地，ACTH类似物化合物具有可以在(AA19)-位置替换的除脯氨酸以外的其它氨基酸。更加优选地，ACTH类似物包括在(AA19)-位置替换的氨基酸Trp，而不是Pro。未修饰ACTH肽序列，例如hACTH和mACTH，包含(AA19)-位置的脯氨酸残基。脯氨酸具有下列化学结构：
Figure A20058004242700231
           脯氨酸(Pro)
脯氨酸的化学结构包括一个形成环结构的侧链。脯氨酸常存在于α螺旋的末端或者转角或环中。与在多肽中以几乎唯一的反式形式存在的其它氨基酸不同，脯氨酸在肽中可以以顺式构型存在。顺式和反式几乎是等能的。优选地，在式(III)中包含SEQ ID NO：6-10的ACTH类似物中，(AA19)-是Trp，但是还提供了在ACTH类似物中(AA19)-是Pro的化合物。
因此，特别优选的ACTH类似物是修饰的hACTH、mACTH或hACTH(1-24)肽序列，其中(AA14)-(AA15-18)-(AA19)-选自：-Gly14-Lys15-Arg16-Ala17-Ala18-Yrp19-(SEQ ID NO：12)；
-Gly14-Ala15-Lys16-Ala17-Arg18-Pro19-(SEQ ID NO：13)；
-Gly14-Lys15-Ala16-Ala17-Arg18-Pro19-(SEQ ID NO：14)；-Gly14-Lys15-Ala16-Arg17-Ala18-Pro19-(SEQ ID NO：15)；
-Gly14-Gln15-Lys16-Gln17-Arg18-Pro19-(SEQ ID NO：16)以及
-Gly14-Lys15-Arg16-Ala17-Ala18-Pro19-(SEQ ID NO：17)。
ACTH类似物包含式(IVa)或式(Ivb)所述的多肽：
(IVa)N-(AA1-13)-(AA14)-(AA15-18)-(AA19)-(AA20-24)-
(IVb)N-(AA1-13)-(AA14)-(AA15-18)-(AA19)-(AA20-24)-Ac
其中N-指多肽的N末端，Ac指多肽的羧基末端。式(VIa)或(VIb)的ACTH类似物包括针对上面式(I)所述的N-(AA1-13)-(AA14)-(AA15-18)-(AA19)-，此外还包含连接至式(I)氨基酸序列羧基末端的(AA20-24)-部分。式(VIa)和(VIb)的(AA20-24)-部分代表着式(V)的5个氨基酸的序列：
(V)-AA20-AA21AA22AA23-AA24-。
未修饰的人ACTH(AA20-24)-部分包含序列Val-Lys-Val-Tyr-Pro (SEQID NO：18)。优选地，ACTH类似物化合物在式(V)中包括一个或多个氨基酸残基替代，所述替代延长了ACTH类似物的血清半衰期。例如ACTH类似物可以包含对应于式(V)的序列-Ala-Ala-Ala-Ala-Ala-(SEQ IDNO：19)。
特别优选的按照式(IVa)的ACTH类似物包含这样的序列hACTH(1-24)，即在该序列中包含被SEQ ID NO：6替代的式(III)-AA15-AA16-AA17-AA18-部分。一个特别优选的式(IVa)化合物是ACTH类似物(KKRRP15-19KRAAW)mACTH(1-24)，其具有序列N-Ser1-Tyr-Ser-Met-Glu5-His-Phe-Arg-Trp-Gly10-Lys-Pro-Val-Gly-Lys15-Arg-Ala-Ala-Trp-Val20-Lys-Val-Tyr-Pro-Ac(SEQ ID NO：20)，也称作“AT814”。其它特别优选的ACTH类似物化合物基本上由在位置15、16、17或18处的一个或多个氨基酸残基带有丙氨酸或谷氨酰胺替代和/或在位置20、21、22、23或24处的氨基酸残基带有丙氨酸替代的SEQ ID NO：2的肽组成。例如Costa，JL等人，″Mutational analysis of evolutionarilyconserved ACTH residues，″Gen Comp Endocrinol.Mar；136(1)：12-6(2004)所描述的那些，该文献在此全部引用作为参考。
在第一个实施方案的第三个方面，ACTH类似物包含通过式(VIa)或式(VIb)所述的多肽：
(VIa)N-(AA1-13)-(AA14)-(AA15-18)-(AA19)-(AA20-24)-(AA25-39)-
(VIb)N-(AA1-13)-(AA14)-(AA15-18)-(AA19)-(AA20-24)-(AA25-39)-Ac
其中N-指多肽的氨基末端，Ac指多肽的羧基末端。式(IVa)或(IVb)的ACTH类似物包括上面对于式(IVa)所描述的N-(AA1-13)-(AA14)-(AA11-18)-(AA19)-(AA20-24)-，并且还包含连接至式(IVa)氨基酸序列羧基末端的(AA25-39)-部分。式(VIa)可以任选地包括连接至AA39残基的额外化学结构，其中AA39残基形成了式(VIb)结构的羧基末端。式(VIa)和(VIb)的(AA25-39)-部分代表着式(VII)的15个氨基酸的序列：
(VII)-AA25-AA26-AA27-AA28-AA29-AA30-AA31AA32-AA33-AA34-AA35-AA36-AA37-AA38-AA39。
未修饰的人ACTH的(AA25-39)-部分包含序列Asn-Gly-Ala-Glu-Asp-Glu-Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu-Phe(SEQ IDNO：21)。优选地，ACTH类似物化合物包括式(VII)中的一个或多个氨基酸残基替代或者式(VII)的羧基末端的一个或多个氨基酸残基截断，只要ACTH类似物化合物具有想要的持续释放特性即可。例如，ACTH类似物可以包含对应于式(VII)的序列，其具有SEQ ID NO：10的未修饰ACTH序列并且可以任选地通过AA30的Lys替代和/或AA36的Arg替代修饰。
替代变体是那些在氨基酸序列中至少一个残基被去除并且在其位置上插入不同残基的变体。如果想要细微调整蛋白质特性时，可依照下表2进行此类替代。表2列出了可以替代蛋白质中原始氨基酸并且在本领域中认为是保守替代的氨基酸。ACTH类似物化合物包括带有一个或多个保守替代的化合物，所述替代保留了一种或多种下列优选的ACTH类似物的生物学功能：(1)与未修饰ACTH相比，降低在ACTH类似物存在条件下肾上腺膜对皮质类固醇的分泌，(2)降低在内源ACTH存在条件下肾上腺膜对皮质类固醇的分泌，以及(3)与未修饰ACTH相比，增加对MC-2R的结合亲和性同时降低对MC-2R受体的活化。
表2
Figure A20058004242700261
通过选择比表2中保守性差的替代进行功能或免疫学特性的替代变化，即选择对维持下列特性中具有更加明显不同的残基：(a)替代区域的多肽主链结构，例如为折叠构象或螺旋构象；(b)在靶位点分子的电荷或疏水性；或者(c)侧链体积。通常预期产生蛋白质特性最大变化的替代将是这些替代，即在其中：(a)亲水残基如丝氨酸或苏氨酸替代疏水残基如亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸或丙氨酸(或被疏水残基如亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸或丙氨酸替代)；(b)半胱氨酸或脯氨酸替代任何其它残基(或者被任何其它残基替代)；(c)具有正电侧链的残基如赖氨酸、精氨酸或组氨酸替代带负电的残基如谷氨酸或天冬氨酸(或者被带负电的残基如谷氨酸或天冬氨酸替代)；或者(d)具有大体积侧链的残基如苯丙氨酸替代没有侧链的残基如甘氨酸(或者被没有侧链的残基如甘氨酸替代)。
ACTH类似物化合物的优选的ACTH类似物生物学功能可通过任何适宜方法测量，但是优选地通过下面描述的一个或多个测定法开展。
具有降低的ACTH功能的ACTH类似物化合物
在第二个实施方案中，ACTH类似物是修饰的ACTH肽，与未修饰ACTH相比，其降低了在ACTH类似物存在情况下肾上腺膜对皮质类固醇的分泌。ACTH类似物的结构优选根据上面提供的一个或多个结构式选择。ACTH类似物化合物可降低ACTH介导的血液皮质酮的分泌，例如施用ACTH类似物后受试者血液皮质类固醇水平降低所示。如通过体内血清皮质类固醇诱导分析法所测定，与可比施用未修饰的ACTH肽相比，ACTH类似物优选使血清皮质酮水平降低至少10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
体内血清皮质类固醇诱导分析法用于测量受试者血流中的皮质类固醇或皮质酮水平。更加具体而言，体内血清皮质类固醇诱导分析法可包括下列步骤：首先，向小鼠受试者施用抑制内源ACTH产生的活性剂(agent)，例如腹腔内注射地塞米松；第二，在等待抑制内源ACTH产生适当时间阶段之后(例如1.5-2.0小时)，通过适宜方法(例如腹腔内注射或皮下注射)向小鼠施用测试化合物；第三，在等待所注射测试化合物作用适当时间阶段之后(例如1小时)，从受试者得到血液样品并且通过适宜方法，例如使用125I RIA试剂盒(ICN，Costa Mesa，CA)的竞争性放射免疫分析法确定血清皮质酮水平。实施例1详细描述了鼠体内血清皮质类固醇诱导分析法。
通过测定ACTH或ACTH类似物作为测试化合物施用后血清皮质类固醇，将通过ACTH类似物化合物体内诱导的皮质类固醇或皮质酮分泌与通过未修饰的ACTH化合物产生的皮质类固醇分泌水平相比较。图1显示了根据实施例1使用mACTH(1-24)和多种ACTH类似物测试化合物开展的鼠体内皮质类固醇肾上腺诱导分析法的结果。具有降低功能的ACTH类似物组合物通过使用标准的放射免疫分析法(RIA)测定血样样品中的皮质酮水平而鉴定，所述血样样品在向地塞米松抑制的小鼠施用mACTH(1-24)或ACTH类似物化合物后1小时收集。在图1中，多种ACTH类似物肽的潜能被表示为皮质酮诱导的百分数，其中鼠ACTH的潜能被认为是100％。图表10显示ACTH和9个ACTH类似物化合物样品14的皮质酮诱导百分数12。在样品2-10中ACTH类似物化合物的皮质酮诱导百分数12显示为占通过体内血清皮质类固醇肾上腺诱导分析法所测量的未修饰mACTH(1-24)的血清皮质酮浓度的百分数20。对于图1中样品2-10，结构修饰和所测量的降低百分数示于下表3。
表3
  样品  图1中的标记   结构修饰   血清中皮质类固醇降低百分数
  2   20   (V26F，E30K)mACTH   18.3％
  3   25   (P19W，K21E，Y23R)mACTH   36.5％
  4   30   (E30K，P36R)mACTH   41.5％
  5   35   (PVKVYP19-24AAAAA)mACTH   51％
  6   40   (V26F，P36R)mACTH   59.3％
  7   45   (P19W，K21E)mACTH   61.1％
  8   50   (P19W，K21A，delY23)mACTH   76.0％
  9   55   (P19W，K21A)mACTH   83.4％
  10   60   (KKRRP15-19KRAAW)mACTH   100％
内源ACTH诱导的皮质酮诱导降低
在第三个实施方案中，ACTH类似物是修饰的ACTH肽，其降低了在内源ACTH存在情况下肾上腺膜对皮质类固醇的分泌。当ACTH类似物化合物在施用ACTH之前施用或者与ACTH并行施用时可使血清皮质类固醇水平降低10-100％。优选地，如通过体内血清皮质类固醇抑制分析法如在实施例2中所述的分析法所测定，与单独施用ACTH相比，施用ACTH类似物化合物使血清皮质类固醇水平降低大约10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者100％。抑制内源ACTH所诱导肾上腺激素产生的例证性ACTH类似物化合物通过开展一系列体内血清皮质类固醇抑制分析法鉴定。ACTH类似物可在施用ACTH之前单独施用，或者与ACTH并行施用。
使用体内血清皮质类固醇抑制分析法测量了施用具有第一种产生皮质类固醇的生物学活性的化合物和测试化合物后受试者血流中的皮质类固醇或皮质酮水平。具有产生皮质类固醇的生物学活性的化合物可以是已知诱导皮质类固醇的产生发生可检测性增加的任何化合物。测试化合物可与产生皮质类固醇的化合物组合施用，测试化合物可在产生皮质类固醇的化合物施用之前和/或在产生皮质类固醇的化合物施用之后施用。产生皮质类固醇的化合物优选地是ACTH，但是也可以是具有已知的产生皮质类固醇的生物学活性的ACTH类似物。通过使用ACTH类似物测试化合物开展一系列的体内血清皮质类固醇抑制分析，可以鉴定出相对于所使用的产生皮质类固醇的化合物而言抑制皮质类固醇产生的ACTH类似物。优选地，以该方式鉴定出的ACTH类似物抑制在内源未修饰ACTH存在情况下皮质类固醇的产生。
体内血清皮质类固醇抑制分析法可包括通过下列步骤相继施用测试化合物和产生皮质类固醇的化合物：首先，向小鼠受试者施用抑制内源ACTH产生的活性剂，例如腹腔内注射地塞米松；第二，在等待抑制内源ACTH产生适当时间阶段之后(例如1.5-2.0小时)，通过适宜方法(例如腹腔内注射)向小鼠施用测试化合物；第三，在等待测试化合物作用适当时间阶段之后(例如1小时)，通过适宜方法(例如腹腔内注射)向小鼠施用具有产生皮质类固醇活性的化合物；以及第四，在等待所施用的两种化合物的生物学活性出现适当时间阶段之后(例如1小时)，从受试者得到血液样品并且通过适宜方法，例如使用125I RIA试剂盒(ICN，Costa Mesa，CA)的竞争性放射免疫分析法确定血清皮质酮水平。任选地，步骤2和3可颠倒(首先施用产生皮质类固醇的化合物，然后施用测试化合物)。体内血清皮质类固醇抑制分析法还可以包括通过下列步骤共施用测试化合物和产生皮质类固醇的化合物：首先，向小鼠受试者施用抑制内源ACTH产生的活性剂，例如腹腔内注射地塞米松；第二，在等待抑制内源ACTH产生适当时间阶段之后(例如1.5-2.0小时)，通过适宜方法(例如腹腔内注射)向小鼠共施用产生皮质类固醇的化合物和测试化合物；以及第三，在等待所施用的两种化合物的生物学活性出现适当时间阶段之后(例如1小时)，从受试者得到血液样品并且通过适宜方法，例如使用125I RIA试剂盒(ICN，Costa Mesa，CA)的竞争性放射免疫分析法确定血清皮质酮水平。同样，在一些实施方案中，在任何体内血清皮质类固醇抑制分析法中的第一个步骤可以换成以第4个步骤的方式测定受试者血液中的起始的内源皮质类固醇或皮质类固醇水平，而不是施用抑制ACTH产生的活性剂。实施例2详细描述了鼠体内血清皮质类固醇抑制分析法。
开展一系列个别的体内血清皮质类固醇抑制分析法鉴定体内抑制ACTH肾上腺激素产生的ACTH类似物。如实施例2中所述，在施用(1)ACTH(产生皮质类固醇的化合物)，(2)ACTH类似物(测试化合物)，然后施用ACTH，(3)ACTH和ACTH类似物组合，和(4)单独的ACTH类似物之后，测定了受地塞米松抑制的小鼠中的血清皮质酮水平。表4显示所测量的以施用时间为函数的小鼠血清皮质类固醇水平。
表4组合施用ACTH和ACTH类似物
Figure A20058004242700311
关于表4，如实施例2中所述，首先在时间＝0分钟向5个独立的体内血清皮质类固醇分析中的小鼠施用地塞米松。在“载体”样品中，在地塞米松注射后120分钟施用单独的液体载体，结果在1小时之后没有在血液样品中检测到皮质酮。在“ACTH”样品中，在地塞米松注射120分钟后施用ACTH，结果在1个小时后在血液样品中检测到的皮质酮水平为500±76ng/mL。在“AT90-ACTH 120”样品中，在地塞米松注射1.5小时时施用ACTH类似物(KKRRP15-19KRAAW)mACTH(1-24)，然后30分钟后施用ACTH(1-24)，结果在1个小时后检测到的血清皮质酮水平为175±27ng/mL。在“(AT+ACTH)120”样品中，在地塞米松注射120分钟后，同时施用ACTH类似物(KKRRP15-19KRAAW)mACTH(1-24)(“AT814”)和mACTH(1-24)，结果在1个小时后检测到的血清皮质酮水平为51±8ng/mL。在“AT”样品中，在地塞米松注射120分钟施用ACTH类似物(KKRRP15-19KRAAW)mACTH(1-24)，导致血清皮质酮水平可忽略不计，为7±7ng/mL。
图2显示了来自表2的结果，表示为如实施例2中所述在地塞米松注射180分钟时测定的皮质酮水平的百分数。图表100显示了对于表2中所述的ACTH和4个样品114的皮质酮诱导百分数，其中对于施用ACTH所测量的皮质酮水平120被归一化成为100％。样品“AT90-ACTH 120”140显示在施用ACTH之前30分钟施用ACTH类似物，其导致在ACTH施用后1小时时血液样品中的血清皮质酮水平降低大约65％。样品“(AT+ACTH)120”160显示同时施用ACTH类似物和ACTH，其导致1小时后血液样品中血清皮质酮水平降低大约90％。如在“AT”样品180以及表1中的样品10中所见，仅施用ACTH类似物导致1小时后血液样品中的血清皮质酮水平降低大约99％-100％。“载体”样品在图2中未显示。
肾上腺ACTH受体结合分析法
在第四个实施方案中，ACTH类似物是结合肾上腺ACTH受体，例如MC-2R受体的修饰的ACTH肽，优选地，与未修饰ACTH相比，其与MC-2R的结合亲和性增加但对MC-2R受体的活化降低。
优选的ACTH类似物化合物以比内源未修饰ACTH更大的亲和性结合至肾上腺膜，并且在体外无血清肾上腺竞争结合分析法(实施例3)中能够置换未修饰ACTH。如通过体外无血清肾上腺竞争结合分析法所测定，ACTH类似物化合物对结合至肾上腺膜制备物的ACTH的置换优选至少20％。更加优选地，与未修饰ACTH相比，ACTH类似物化合物对外植的肾上腺膜的亲和性高2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100倍。
与肾上腺膜的结合亲和性比内源未修饰ACTH与肾上腺膜的结合亲和性更大并且可以置换未修饰ACTH的ACTH类似物化合物可以使用体外无血清肾上腺竞争结合分析法(实施例3)鉴定。图3显示了使用例证性的具有SEQ ID NO：20的ACTH类似物AT814(“AT814”)通过实施例3中所述的方法开展的体外无血清肾上腺竞争结合分析的结果。图表200显示了通过γ计数器对与放射性ACTH孵育的肾上腺膜制备物进行计数所测量的每分钟计数212(CPM)。CPM水平越高表明存在的放射标记化合物的量越大。柱210显示没有任何肾上腺膜存在下测量的背景值。柱220显示在外植的肾上腺膜与放射性标记的mACTH(1-24)混合2小时后(没有竞争性结合)检测的放射性标记的未修饰mACTH(1-24)的水平。柱230、240和250显示竞争结合分析的结果，其中非放射性标记的(“非标记”)mACTH(1-24)通过竞争性结合受体如肾上腺膜上的MC-2R从外植的肾上腺膜置换标记的mACTH(1-24)(在柱220中所测量)。具体而言，柱230显示在放射性标记的外植肾上腺膜与10nM“非标记”mACTH(1-24)混合后检测到的放射性标记的mACTH(1-24)水平的降低；柱240显示在加入100nM“非标记”mACTH(1-24)后结合至放射性标记外植肾上腺膜上的放射性标记mACTIH(1-24)水平进一步降低；并且柱250显示在外植肾上腺膜制备物与1000nM“非标记”mACTH(1-24)混合后连接至放射性标记的外植肾上腺膜上的放射性标记mACTH(1-24)水平进一步降低。随着“非标记”mACTH(1-24)浓度的增加，所检测到的放射性标记的mACTH(1-24)降低，这表明“非标记”mACTH(1-24)将放射性标记的mACTH(1-24)从MC-2R受体上置换下来。
使用通过SEQ ID NO：20所述的“非标记”(非放射性标记)AT814ACTH类似物化合物代替mACTH(1-24)重复进行体外无血清肾上腺竞争结合分析。柱235、245和255显示竞争性结合分析结果，其中通过10nM(柱235)、100nM(柱245)和1000nM(柱255)浓度的“非标记”AT814的竞争性结合，非放射性标记AT814将放射性标记的mACTH(1-24)从外植肾上腺膜(在柱220中所测量)上置换下来。随着“非标记”AT814浓度的增加，所检测到的放射性标记的AT814的水平降低，这表明“非标记”AT814置换了放射性标记的mACTH(1-24)。具体而言，图表200中的结果表明，AT814与肾上腺膜结合的亲和性比放射性标记的mACTH(1-24)与肾上腺膜结合的亲和性高大约3倍至大约4倍。AT814结合至肾上腺膜的亲和性的增加预示着与MC-2R受体结合的亲和性增加。
ACTH类似物化合物的体外测试
在第五个实施方案中，ACTH类似物化合物可以降低在外植组织中未修饰ACTH对皮质酮的体外诱导。当外植肾上腺膜与ACTH类似物化合物混合时优选地使无血清培养基中质类固醇水平降低10-100％。优选地，与单独施用未修饰ACTH相比，ACTH类似物化合物使通过体外无血清肾上腺皮质类固醇抑制分析法所测定的血清皮质类固醇水平降低大约10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者100％(实施例4)。抑制由外植肾上腺膜与未修饰ACTH接触所诱导的肾上腺激素产生的例证性ACTH类似物化合物通过一系列的体外无血清肾上腺皮质酮抑制分析鉴定出来，这表明ACTH类似物化合物对肾上腺皮质酮的产生具有直接作用。
开展了一系列体外无血清肾上腺皮质类固醇抑制分析，以鉴定抑制ACTH诱导的肾上腺激素体外产生的ACTH类似物。按照实施例4中的过程，测量了包含外植肾上腺膜和未修饰ACTH、AT814 ACTH类似物(SEQID NO：20)或ACTH与AT814组合(每种100ng/mL)的无血清培养基中的皮质酮浓度。表3显示了使用外植小鼠肾上腺膜开展的一系列体外无血清肾上腺皮质酮抑制分析中在无血清培养基中测量的皮质类固醇水平。在将肾上腺膜置于无血清M199培养基中之后2.0小时测定皮质酮水平，并且表5中的每一皮质酮水平为5个样品的平均值。
表5组合施用ACTH和ACTH类似物
Figure A20058004242700351
关于表5，如实施例4中所提供，将一半外植小鼠肾上腺置于M199无血清培养基(Invitrogen)中30分钟。在“M199培养基”样品中，在起始的30分钟之后，肾上腺膜在M199无血清培养基中总共浸泡2.0小时(共总2.5小时)，然后使用标准RIA放射测定技术测量培养基中的皮质酮水平。在“ACTH”样品中，将未修饰ACTH加入到M199培养基中，结果2个小时后在培养基中检测到的皮质酮水平为大约600mg/mL。在“AT-814”样品中，将ACTH类似物(KKRRP15-19KRAAW)mACTH(1-24)(SEQID NO：20)加入到M199培养基中，结果2个小时后在培养基中检测到的皮质酮水平为大约290mg/mL。在“ACTH+AT-814”样品中，将100ng/mLAT814 ACTH类似物(SEQ ID NO：20)和100ng/mL未修饰ACTH一起加入到M199培养基中，结果2个小时后在培养基中检测到的皮质酮水平为大约396mg/mL。图4为图表300，其显示了来自表3的皮质酮诱导百分数302，表示为如上面以及实施例4中所述的对于“ACTH”样品310、“AT-814”样品320以及“ACTH+AT-814”样品330所测定的M199培养基中的皮质酮水平相对于对于ACTH所测量的量310的百分数。“M199培养基中”样品未显示于图2中。关于图4，向M199无血清培养基中的肾上腺膜加入AT814所诱导皮质酮的量可以忽略不计，与仅加入未修饰ACTH相比，组合加入等量的AT814 ACTH类似物和未修饰ACTH使所诱导的皮质酮的量降低大约65％。
ACTH类似物化合物的体内测试
对于某些应用，优选使用血清半衰期延长的ACTH类似物化合物。ACTH类似物化合物可以任选包括一个或多个氨基酸替代或截断，使得ACTH类似物的血清半衰期与未修饰ACTH或另一个ACTH类似物相比得以延长。例如，ACTH类似物化合物可以包含未修饰ACTH序列氨基酸位置25-39中的一个或多个氨基酸替代，使得化合物的血清半衰期与ACTH序列相比延长。优选的ACTH类似物化合物可以具有比未修饰ACTH更长的血清半衰期。在血液中，ACTH的半衰期小于大约20分钟。因此，特别优选的ACTH类似物化合物具有大于大约20、30、40或50分钟或更长的血清半衰期。
在第六个实施方案中，提供了半衰期延长的ACTH类似物。半衰期盐城的ACTH类似物被鉴定为这样的类似物，即通过体内检测的血清皮质类固醇浓度所测定的第一种活性高于通过在体外活性中检测的皮质类固醇的无血清浓度所测定的第二种活性，其中体内活性通过实施例1的血清肾上腺皮质类固醇抑制分析法测定而体外活性通过实施例4的体外无血清肾上腺皮质类固醇抑制分析法测定。
在一些情况下，在其它位置进行氨基酸替代也能延长ACTH类似物的血清半衰期，因此某些实施方案通过对包括hACTH或mACTH在内的ACTH分子的20-24位置进行一个或多个氨基酸修饰而延长了ACTH类似物的血清半衰期。图5比较了7种ACTH类似物化合物410、420、430、440、450、460和470的体内活性(灰色柱)和体外活性(白色柱)。对于所有7种ACTH类似物化合物而言，使用实施例1的方法测定体内活性，并且使用实施例4的方法测定体外活性。结果以所测量的相对于mACTH(1-24)序列(SEQ ID NO：2)的百分数“％皮质酮诱导”柱型图提供。如在图5样品460中所见，所指定的“Ala19-24”指ACTH类似物(AAAAA20-24VKVYP)ACTH(1-24)，其包含在mACTH的氨基酸19-24的每一位置上的Ala残基替代。样品460显示，相对于该化合物的体外活性464而言，体内测定的血清半衰期462增加，并且比未修饰mACTH的体外活性高大约50％。此外，(AAAAA20-24VKVYP)ACTH(1-24)ACTH类似物460的体内活性比mACTH和其它ACTH类似物410、420、430、440、450和470的体内活性高。这些结果表明，在位置20-24处的氨基酸残基可能在决定ACTH类似物化合物的血清半衰期中起作用。特别优选地，ACTH类似物化合物在ACTH的20-24位置具有一个或多个氨基酸替代以延长(相对于ACTH而言)血清半衰期。
同样也希望的是，ACTH类似物化合物可以包括这样的氨基酸替代，即如通过体内(实施例1)或体外(实施例4)分析法所测定，延长了血清半衰期但一点也没有增加或者更加优选降低ACTH类似物对皮质酮的诱导。例如，与未修饰mACTH(1-24)相比，ACTH类似物410、420、430、440、450和470中位置15-19中的替代降低了ACTH类似物的体内和体外皮质酮诱导活性。具体而言，ACTH类似物410是(K15A，R17A)mACTH(1-24)ACTH类似物，表明其体外活性414大于其体内活性412；ACTH类似物420是(K16A，R17A)mACTH(1-24)ACTH类似物，表明其体外活性424大于其体内活性422；ACTH类似物430是(K16A，R18A)mACTH(1-24)ACTH类似物，表明其体外活性434大于其体内活性432；ACTH类似物440是(K15Q，R17Q)mACTH(1-24)ACTH类似物，表明其体外活性444大于其体内活性442；并且ACTH类似物470是(P19W，K21A)mACTH(1-24)ACTH类似物，表明其体外活性474大于其体内活性。
筛选方法
在第七个实施方案中，还提供了筛选可用于阻断过量ACTH同时维持肾上腺健康状态的ACTH类似物的方法。可制备多种ACTH类似物并向患者施用以评价体内对可的松的诱导。
某些化合物的的分子识别特异性(即抗原被抗体识别)能形成适宜的复合物，这可作为液体中的分析型免疫测定法和固相界面上免疫传感器的基础。这些分析方法可以是基于观察靶分析物(即结合MC2R受体的化合物)与高特异性结合试剂之间的配体结合反应产物的配体结合分析法。
在某些情况下，对于特定的敏感筛选法，将可选择的结合分析物的化合物例如适体应用于配体结合分析法中。适体是能够以高亲和性和特异性识别多种靶分子的单链DNA或RNA寡核苷酸序列。在多种诊断形式中，这些结合配体的寡核苷酸模拟抗体的特性。它们折叠成独特的总体形状以形成针对靶结构的复杂结合沟。适体通过称作指数富集配体系统进化(SELEX)的体外选择过程鉴定。在敏感表面(sensing surface)储存方面，适体比抗体优越。此外，虽然亲和常数一贯低于抗体的亲和常数并且这些化合物的稳定性仍然值得怀疑，但是由于存在可以以任何数量高度重复合成的方法，因此它们可特别用于复合物生物学度量法中的筛选应用(即用于筛选在ACTH-(15-19)和/或ACTH-(21)位置具有替代氨基酸残基并且在结合MC2R中特别活性的ACTH类似物中)。
备选地，分子印迹技术可用于筛选影响MC2R活性的化合物。这是一个基于制备聚合吸附剂的技术，对于特定物质或结构类似物选择预先确定聚合吸附剂。塑料材料的功能性和交联性单体例如甲基丙烯和苯乙烯可与模板配体(templating ligand)相互作用以产生低能量的相互作用。然后，诱导聚合。在该过程中，目的分子通过非共价自身装配方法或者可逆的共价方法陷入到聚合物中。在终止聚合反应后，将模板分子洗下来。所得到的模板的印迹被保留在刚性聚合物中并保留了模板的空间(大小、形状)和化学(互补功能性的特定排列)记忆。经过分子印迹的聚合物(MIP)可以与抗原-抗体相互作用相似的特异性结合模板(＝分析物)。
分子印迹聚合物除了主要用于固相提取和色谱以外，还可用作竞争结合分析法中抗体的非生物学替代物。在一般生物细胞的生长过程中，吸收含碳的营养物如葡萄糖并释放酸性代谢产物如乳酸。在微生理记录仪中，代谢率的这些变化被记录为细胞周围培养基酸化率的变化(即Raley-Susman，K.M.等人，″Effects of excitotoxin exposure on metabolicrate of primary hippocampal cultures：application of siliconmicrophysiometry to neurobiology，″J Neurosci.，12(3)：773-780(1992)；Baxter，GT.等人，″PKCεis involved in granulocyte-macrophagecolony-stimulating factor signal transduction：evidence frommicrophysiometry and antisense oligonucleotide experiments，″Biochemistry，31：19050-10954(1992)；Bouvier，C.等人，″Dopaminergicactivity measured in D1-and D2-transfected fibroblasts by siliconmicrophysiometry，″J.Recept.Res.，13(1-4)：559-571(1993)；以及McConnell，H.M.等人，″The cytosensor microphysiometer：biologicalapplications of silicon technology，″Science，257：1906-1912(1992))。微生理记录仪可用于检测影响细胞的分子。此类分子包括神经递质、生长因子、细胞因子、受体等。因此，微生理记录仪方法可提供关于影响MC2R受体活性的ACTH类似物的有价值的信息。
合成的组合文库可以是用于大规模生物化学筛选的多种多样结构的来源(即Sastry，L.等人，″Screening combinatorial antibody libraries forcatalytic acyl transfer reactions，″Ciba Found Symp.，159：145-155(1991)；Persson，MAA.等人，″Generation of diverse high-affinity monoclonalantibodies by repertoire cloning，″Proc.Natl.Acad.Sci.USA，33：2432-2436(1991)；以及Houghten，R.A.，″Generation and use ofsynthetic peptide combinatorial libraries for basic research and drugdiscovery，″Nature，354：84-86(1991))。此类文库通过组合液相和固相化学产生，并且从固相支持物上裂解下来用于筛选。
分离技术例如与质谱或串连质谱相连的液相色谱、气相色谱以及毛细管电泳建立起可用于结构评估的分析系统(即Hsieh，S.等人，″Separationand identification of peptides in single neurons by microcolumn liquidchromatography-Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flightmass spectrometry and postsource decay analysis，″Anal Chem.，70(9)：1847-1852(1998)；Tretyakova，N.Y.等人，″Quantitative analysis of1，3-butadene-induced DNA adducts in vivo and in vitro using liquidchromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry，″J.Mass Spectrom.，33：363-376(1998)；以及Taylor，G.W.等人，″Excursions inbiomedical mass spectrometry，″Br.J.Clin.Pharmacol.，41：119-126(1996))。质谱在提供化合物/分子的分子量信息方面特别有用。随着对大分子的精确和可控片段化，还可能得到关于序列的信息。
筛选ACTH类似物化合物以鉴定与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1的未修饰ACTH相比诱导肾上腺膜对皮质类固醇分泌较少的ACTH类似物化合物的方法包括肾上腺膜与ACTH类似物相接触的步骤。筛选ACTH类似物化合物以鉴定降低ACTH所诱导的皮质类固醇分泌的化合物的方法包括一个或多个下列步骤：
a.提供第一肾上腺膜和第二肾上腺膜；
b.将第一肾上腺膜与包含含有未修饰ACTH肽的未修饰肽的第一个组合物接触，然后测定与未修饰ACTH肽接触后由第一肾上腺膜所分泌的皮质类固醇的第一个浓度；
c.将第二肾上腺膜与包含ACTH类似物的第二个组合物接触，然后测定与ACTH类似物接触后由第二肾上腺膜所分泌的皮质类固醇的第二个浓度；
d.将所分泌皮质类固醇的第一个浓度与所分泌皮质类固醇的第二个浓度相比较；和
e.确定是否第二个化合物诱导的皮质类固醇分泌比第一个化合物诱导的皮质类固醇分泌少。
未修饰ACTH肽优选地为SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1的肽。
第一肾上腺膜和第二肾上腺膜可位于受试者中并且皮质类固醇的浓度为测定的受试者血液中的浓度(体内分析法)。备选地，第一肾上腺膜和第二肾上腺膜是从受试者外植的并且皮质类固醇浓度为测定的无血清培养基中的浓度(体外分析法)。包括体内抑制分析步骤或体外竞争性结合分析步骤的筛选分析法还可包括下列步骤，该步骤优选地替换步骤(c)或者位于步骤(c)之后而步骤(d)之前：
a.将第二肾上腺膜与包含ACTH肽的第一个组合物和包含ACTH类似物的第二个组合物同时接触，然后测定由第二肾上腺膜所分泌的皮质类固醇的第二个浓度。
筛选分析法可包括开展一个或多个其它分析法的步骤，所述分析法包括表述为血清皮质类固醇诱导分析法、血清皮质类固醇抑制分析法、肾上腺结合分析法或无血清肾上腺抑制分析法的分析法。除非另外指出，步骤可以任何顺序开展。
ACTH类似物组合物以及施用
ACTH类似物可以掺入到用于治疗患者中包括与ACTH过表达相关病在内的多种ACTH相关病的药物组合物中。
短语“可药用”或“可药理学接受”同义，指处于合理的医学判断范围内的配体、材料、组合物和/或剂量形式适宜与人和动物的组织接触使用，而没有额外的毒性、刺激、变态反应或其它问题或并发症，具有相称的合理收益/风险比。
关于治疗中使用的化合物如ACTH类似物肽的“治疗有效量”指制剂中多肽或肽的量，当该量作为目的剂量方案的一部分施用时(向脊索动物如哺乳动物或鱼类施用)，根据待治疗病症或病的临床可接受的标准或者用于化妆品目的的临床可接受的标准其减轻了症状、改善了状况或者减慢了疾病发作，例如对于任何医学治疗可应用的合理收益/风险比时。
如本文所使用，术语“治疗(treat)”或任何其派生词(即治疗(treatment)、治疗(treating))涉及并且包括：1)预防倾向于患高水平ACTH相关疾病或病但没有诊断患有这类疾病或病的患者发生这种高水平ACTH相关疾病或病；2)抑制高水平ACTH相关疾病或病，例如使其停止发展；或者3)减轻高水平ACTH相关疾病或病，例如导致疾病或病衰退。
“患者”或“受试者”在本文是同义的，用于指根据本发明为其提供治疗的生物、优选脊索动物如哺乳动物、鱼类或鸟类。从所公开ACTH类似物以及治疗方法受益的哺乳动物包括但不限于猿、黑猩猩、猩猩、人、猴；以及驯养动物(例如宠物)，例如狗、猫、小鼠、大鼠、豚鼠以及仓鼠。鱼类包括鲑鱼和水产业所用的其它物种。
在本文中所用的术语“ACTH相关病”指可以通过调节ACTH介导的皮质类固醇或皮质类固醇水平、调节ACTH与肾上腺膜结合、或者调节ACTH-受体如MC-2R可治疗或者对其具有反应的病、病症、症状或疾病，包括某些黑皮质素受体相关病。
在本文中使用的的术语“黑皮质素受体相关病”指通过调节受试者中受体与ACTH结合和/或通过降低受试者中皮质类固醇水平可以治疗的病、病症或疾病。ACTH相关病可以包括“MC-2R相关病”或者通过调节MC-2R受体可治疗的病、病症或疾病。优选地，MC-2R相关病可以通过MC-2R受体与ACTH类似物的结合(导致与通过内源ACTH所分泌的皮质类固醇水平相比所分泌的皮质类固醇水平降低)治疗。
本发明考虑了使用本发明方法所鉴定化合物的所有立体异构体，包括对映异构体和非对映异构体形式。本发明化合物的各个立体异构体可以例如基本上没有其它异构体或者可以是例如外消旋物混合物或者与所有其它立体异构体或其它所选择立体异构体的混合物。通过本发明鉴定的化合物的手性中心可以具有由IUPAC 1974推荐(Recommendation)中定义的S或R、或者D或L构型。
在第八个实施方案中，本发明涉及包含ACTH类似物的药物组合物以及其以治疗ACTH相关病的相关症状的方式向受试者的施用。可以选择与已知方法相一致的施用途径。可将ACTH类似物作为包含可药用载体的药物组合物的部分使用。可以根据药物配制领域众所周知的技术，与适于目的施用方式的常规固体或液体载体或稀释剂以及药物添加剂(例如赋形剂、粘合剂、防腐剂、稳定剂、矫味剂等)混合配制包含至少一种本发明ACTH类似物的药物组合物，以治疗与ACTH水平提高相关的疾病或病。
包含ACTH类似物的药物组合物可通过任何适宜的手段施用。例如，包含ACTH类似物的组合物可通过皮下、静脉内、肌肉内、脑池内注射或灌注技术(例如作为无菌注射水溶液或非水溶液或混悬液)施用；或者鼻内施用，例如通过吸入喷雾；或者局部施用，例如以霜剂或软膏剂的形式；并且以包含非毒性的可药用载体或稀释剂的剂量单位制剂形式施用。本发明的ACTH类似物可以以例如适宜立即释放或者延长释放的形式施用。立即释放或者延长释放可通过使用包含本发明ACTH类似物的适宜药物组合物实现，或者特别以延长释放为例，通过使用装置如皮下植入物或者渗透泵实现。本发明的ACTH类似物还可以以脂质体的形式施用。
可以根据已知的方法配制包含本发明ACTH类似物多肽的药物组合物，由此其ACTH类似物产物与可药用载体媒介物组合。可用于预防性和治疗性治疗的组合物包括一种和多种ACTH类似物化合物以及一种应用手段(例如可注射的载体系统、鼻内模式或透皮模式)。
如本文所使用的“载体”包括在所使用的剂量和浓度对所接触的细胞或者受试者无毒的可药用载体、赋形剂或稳定剂。如本文所使用的短语“可药用载体”意思是指参与携带或转运目的化学药品从一种器官或身体的一部分到另一种器官或身体的另一部分的可药用材料、组合物或媒介物，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料。每一载体必须是“可接受的”(在与制剂中的其它成分相容方面)、对患者无毒的并且基本上是无热原的。可用作可药用载体的材料的一些实例包括：(1)糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素以及醋酸纤维素；(4)powdered kagacanth；(5)麦芽；(6)白明胶；(7)滑石；(8)赋形剂，例如可可脂以及suppository waxes；(9)油类，例如花生油、棉花子油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)乙二醇，例如丙二醇；(11)多元醇，例如丙三醇、山梨糖醇、甘露醇以及聚乙二醇；(12)酯，例如油酸乙酯以及月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)褐藻酸；(16)无热原水；(17)等张盐；(18)林格氏液；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲溶液；以及(21)在药物配制中可用的其它无毒的相容物质。在某些实施方案中，本发明的药物组合物是非热原的，即在向患者施用时不引起温度显著升高。通常，生理可接受的载体是水溶性的pH缓冲溶液。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所使用的剂量和浓度对接受者无毒，并且包括缓冲剂例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；包含抗坏血酸在内的抗氧化剂；低分子量(小于大约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、白明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸或氨基酸衍生物，例如正亮氨酸或鸟氨酸；单糖、二糖以及其它糖类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂例如EDTA；糖醇例如甘露醇或山梨糖醇；形成盐的抗衡离子例如钠；和/或非离子表面活性剂例如TWEENTM、PLURONICSTM或者PEG。可以通过常规手段制造用于ACTH类似物的任何载体。然而，如果在载体中使用醇，则ACTH类似物应该在微团、脂质体或“反(reverse)”脂质体中以防止ACTH类似物变性。同样地，当将ACTH类似物置于载体中并且载体是加热过的或者已经被加热过，则应该在载体稍稍变冷后加入ACTH类似物，以避免ACTH类似物被热变性。载体优选是无菌的。一种或多种ACTH类似物可以以液体形式或者冻干状态加入到这些物质中，其中当ACTH类似物遇到液体时其会溶解。
在修饰的ACTH类似物与载体系统混合之前或者混合的同时，ACTH类似物可以处于稳定化的缓冲环境中以维持药理学适宜的pH范围，例如在大约4.0和大约9.0之间，包括pH大约5.0、6.0、7.0、8.0或者它们之间的以0.05为间隔的任何pH或者它们之间的多个0.05的间隔，例如5.2、6.5、7.4、7.5和8.5的pH值。通过将具有预期纯度的ACTH类似物活性成分任选地与生理可接受载体、赋形剂和稳定剂(Remington′sPharmaceutical Sciences 16th edition，Osol，A.Ed.(1980))混合，制备适于储存的冻干制剂和水溶液形式的治疗性制剂。稳定化的缓冲液应该允许ACTH类似物发挥最佳活性。缓冲液可以包含还原剂，例如二硫苏糖醇。稳定化的缓冲液还可以是或者包括金属螯合剂，例如乙二胺四乙酸二钠盐，或者其还可以包含磷酸盐或柠檬酸盐磷酸盐缓冲液或者任何其它缓冲液。
本发明采用的化合物的有效量可以通过本领域的普通技术人员确定。ACTH类似物的有效剂量比或者有效量会部分地依赖于ACTH类似物是治疗性使用还是预防性使用、接受者接触传染性细菌的持续时间、个体大小和体重以及医学判断范围内的其它考虑因素。使用包含ACTH类似物的组合物的持续时间也取决于是预防性目的还是治疗性目的，在预防性目的中，使用可以是每小时、每天和每周使用较短时间，在治疗性目的中，需要强度更大的组合物使用方案，以致于使用会持续数小时、数天或者数周和/或在每天的基础上或者在每天的固定间隔使用。所采用的剂量形式应该提供对于最短时间(a minimum amount of time)的最小数量单位。本发明药物组合物的剂量以及目的药物浓度会取决于特定用途而变化。例如，当本发明的ACTH类似物为了治疗库欣综合征和早产向患者施用时，对于成人的例证性剂量包括每天每kg体重大约0.001至100mg活性化合物，其可以以单次剂量形式施用或者以各个分开的剂量形式(例如每天1-4次)施用。应当理解，对于任何特定化合物的特定剂量水平和剂量频率可以变化，并且会依赖于多种因素，包括所采用特定化合物的活性、该化合物的代谢稳定性和作用时间长短、物种、年龄、体重、一般健康状况、患者的性别和饮食、施用方式和时间、排泄率、药物组合以及特定病的严重性。
对适当剂量或者施用途径的确定在本领域普通医师的技术范围内。动物实验为确定治疗人的有效量提供了可靠的指导。有效量的种间类推可按照Mordenti，J.和Chappell，W.″The use of interspecies scaling intoxicokinetics″In Toxicokinetics and New Drug Development，Yacobi等人编，Pergamon Press，New York 1989，第42-96页中设计的原则进行。提供有效量ACTH类似物的ACTH类似物活性单位的浓度可以在大约10单位/ml至大约500,000单位/ml液体(鼻和口腔通道的湿和湿润环境中的液体)范围内，并且一般可以在大约10、20、30、40、50、60、70、80、90或100单位/ml至大约50,000单位/ml范围内。因此，代表性的数值包括大约200单位/ml、300单位/ml、500单位/ml、1,000单位/ml、2,500单位/ml、5,000单位/ml、10,000单位/ml、20,000单位/ml、30,000单位/ml和40,000单位/ml。更加具体而言，接触活性ACTH类似物单位的时间可以影响目的浓度活性ACTH类似物单位/ml。用于体内施用的制剂优选是无菌的。这可以在冻干和重构之前或之后，通过无菌滤膜过滤而容易地实现。本文的治疗性组合物一般被置于具有无菌入口的容器中，例如带有可通过皮下注射针头刺穿塞子的静脉溶液袋或瓶。
包含ACTH类似物的药物组合物实例包括可注射组合物、提供在目的时间阶段内持续释放ACTH类似物的组合物、用于皮肤施用的组合物、可注射凝胶、用于可植入医学装置的涂层(coating)、粘膜粘附组合物或者用于鼻的组合物或其它可吸入组合物。
在一些实例中，ACTH类似物可以通过肌肉内或静脉内注射施用。例如，ACTH类似物可以通过肌肉内、静脉内、皮下、真皮下、皮内或其组合方式施用。
可注射组合物优选地包含适宜载体和一种或多种ACTH类似物化合物。载体可以由蒸馏水、盐溶液、白蛋白、血清或其任意组合组成。在选择肌肉内注射作为施用方式的情况下，可以使用等张制剂。通常，用于维持等张性的添加剂包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨糖醇和乳糖。在一些情况下，使用了等张溶液，例如磷酸缓冲盐水。稳定剂包括白明胶和白蛋白。在一些实例中，向制剂中加入血管收缩剂。提供的药物制剂是无菌的且无热原的。通常，如上面所提到，静脉内注射是最适宜的。用于肠胃外施用的例证性组合物包括可注射溶液或混悬液，其可以包含例如适宜的、无毒的、肠胃外施用可接受的稀释剂和溶剂，例如甘露醇、1，3-二丁醇、水、林格氏液、等张氯化钠溶液，或者其它适宜的分散剂或润湿剂和悬浮剂，包括合成的甘油一酯或甘油二酯和包括油酸在内的脂肪酸。丙三醇或甘油(1，2，3丙三醇)是商业可得的用于药物用途的载体。丙三醇或甘油可稀释于注射用无菌水中、或者注射用氯化钠中或者其它可药用水溶性注射液中，并且以0.1至100％(v/v)、1.0至50％或者大约20％的浓度使用。DMSO是非质子溶剂，其可增强许多局部应用药物的渗透。DMSO可稀释于注射用无菌水中、或者注射用氯化钠中或者其它可药用水溶性注射液中，并且以0.1至100％(v/v)的浓度使用。媒介物也可包括林格氏液、缓冲溶液和右旋糖溶液，特别是当制备静脉内施用溶液使更是如此。
在将ACTH类似物加入到载体系统中之前或同时，理想的是ACTH类似物处于维持适宜pH范围的稳定化的缓冲环境中。稳定化缓冲液使得ACTH类似物发挥最佳活性。缓冲液可以是还原试剂，例如二硫苏糖醇。稳定化缓冲液也可以是或者包括金属螯合剂，例如乙二胺四乙酸二钠盐，或者其还可以包含磷酸盐或柠檬酸盐磷酸盐缓冲液。载体中的缓冲液可用作稳定ACTH类似物的环境。
载体可任选包含较少量的添加剂，例如增加等张性和化学稳定性的物质。此类物质在所采用的剂量和浓度时对接受者是无毒的，并且包括缓冲液如磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、乙酸和其它有机酸或其盐；抗氧化剂，如抗坏血酸；低分子量(小于大约10个残基)多肽，例如多聚精氨酸或三肽；蛋白质，例如血清白蛋白、白明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；甘氨酸；氨基酸，例如谷氨酸、天冬氨酸、组氨酸或者精氨酸；单糖，二糖以及其它糖，包括纤维素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖、海藻糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖醇，例如甘露醇或山梨糖醇；抗衡离子，例如钠；非离子表面活性剂，例如聚山梨醇酯、poloxamers或聚乙二醇(PEG)；和/或可药用盐，例如NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2等。
术语“可药用盐”指抑制剂的相对无毒的无机酸和有机酸加成盐。这些盐可以在抑制剂的最后分离和纯化过程中原位制备，或者通过将游离碱形式的纯化的抑制剂与适宜有机或无机酸反应产生并且分离如此形成的盐。代表性的盐包括-14氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、硝酸盐、醋酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、延胡索酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘酸盐(naphthylate)、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖酸盐和laurylsulphonate等(参见例如Berge等人，(1977)″Pharmaceutical Salts″，J.Pharm.Sci.66：1-19)。在其它情况下，在本发明方法中可用的抑制剂可以包含一个或多个酸性官能团，因此能够与可药用碱形成可药用盐。在这些情况中的“可药用盐”指抑制剂的相对无毒的无机和有机碱加成盐。同样，这些盐可以在抑制剂的最后分离和纯化过程中原位制备，或者通过将游离酸形式的纯化的抑制剂与适宜碱(例如可药用金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐、重碳酸盐)、与氨、或者与可药用有机伯胺、仲胺或叔胺反应制备。代表性的碱金属盐或碱土金属盐包括锂、钠、钾、钙、镁和铝盐等。用于形成碱加成盐的代表性的有机胺包括乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪等(参见例如Berge等人，同上)。
包含ACTH类似物的可注射药物制剂可任选包括其它治疗剂，包括抗菌剂、抗炎药、抗病毒药和局部麻醉药。局部麻醉药包括丁卡因、盐酸丁卡因、利多卡因、盐酸利多卡因、达克罗宁、盐酸达克罗宁、盐酸奎尼卡因、辛可卡因、盐酸辛可卡因、苦味酸氨苯丁酯以及盐酸丙吗卡因。用于局部麻醉的例证性浓度为占总组成成分的大约0.025％至大约5％(重量比)。麻醉药例如苯佐卡因还可以以大约2％至大约25％(重量比)的优选浓度使用。
药物组合物还可以任选包含一种或多种额外的生物活性剂以在不同水平抑制类固醇激素合成(即催化类固醇激素合成不同阶段的酶的抑制剂)，包括在J.类固醇Biochem.，第5卷，第501页，(1974)中综述的那些生物活性剂，其包括下列几种：a)二苯基甲烷衍生物，例如amphenon B(其在羟化酶的11-β-、17-和21-羟化阶段抑制类固醇激素合成)；b)吡啶衍生物(SU-c系列)，例如metirapon(其在羟化酶的11-β-羟化阶段抑制合成)；c)取代的α，α-戊二酰胺，例如氨鲁米特(其通过抑制20-α-羟化酶和C20，C22-裂解酶而阻止从胆固醇合成孕烯醇酮)；d)类固醇物质，例如腈环氧雄烷(3β-取代的类固醇-3β-羟基-5-雄甾烯-17-酮)，其抑制3β-去氧类固醇羟化酶-5.4-异构酶(Steroids，第32卷，第257页)；e)螺内酯家族类固醇，其用作快速离解的抗盐皮质激素(PNAS USA 71(4)，第1431-1435页，(1974))；f)作为抗盐皮质激素描述的合成类固醇ZK91587，显示对肾脏(Z.Naturforsch.，45b，第711-715页，(1990))和海马的I型MR(Life Science，59，第511-21页，(1996))具有特异结合特性，但对II型GR没有特异结合特性。因此，其常规用作研究在包含该两个受体系统的组织中MR功能的工具。
ACTH类似物可以任选地与特异性抑制糖皮质激素与激素受体相互作用的生物活性剂一起施用，所述生物活性剂包括：a)米非司酮(11β，17β)-11-[-4-(二甲氨基)苯基]-17-羟基-17-(1-丙炔基)雄甾-4，9-二烯-3-酮，其与糖皮质激素受体作用形成复合物，该复合物不能够启动产生糖皮质激素效应机制(Annals of New-York Academy of Science，第761卷，第296-310页，(1995))；所述的化合物也称作宫缩剂(RU38486或RU486)；b)非类固醇物质(J.Steroid Biochem.，第31卷，第481-492页，(1988))，例如盐酸氢乙罂粟碱(isoquinoline-1-(3.4-dietoxibenezilidene)-6.7-dietoxy-1，2，3，4-tetrahydrizoquinoline的衍生物)或者acetvlsalicic acid(Moskovskava Meditsina，1990，″Receptor mechanisms ofthe glucocorticoid effect″，V.P.Golikov)。抗糖皮质激素(例如米非司酮)已经在临床中使用用于治疗不宜手术的非垂体性库欣综合征。以米非司酮(抗孕酮和抗糖皮质激素)为例，需要使用高剂量(高达800mg/天)。随着采用系统应用策略来提高活性并且降低交叉反应性和不良副作用，在开发具有更大潜能和选择性的抗激素药物中，特别是在抗雌激素和抗雄激素领域已经取得了令人印象深刻的进展。
待肠胃外施用的ACTH类似物的有效剂量率或有效量以及治疗持续时间部分地取决于感染的严重程度、患者体重、接受者接触感染性细菌的持续时间、感染的严重程度以及大量其它可变因素。组合物可以一天使用一次至数次，可以短期使用或长期使用。使用持续数天或数周。所采用的剂量形式应该提供对于最短时间(a minimum amount of time)的最小数量单位。认为可以提供有效量或有效剂量ACTH类似物的ACTH类似物活性单位的浓度可以在大约10、20、30、40、50、60、70、80、90或100单位/ml组合物至大约10,000,000单位/ml组合物的范围内、在大约1000单位/ml组合物至大约10,000,000单位/ml组合物的范围内、以及在大约10,000单位/ml组合物至10,000,000单位/ml组合物的范围内。每毫升活性单位的量以及接触的持续时间取决于感染种类以及接触ACTH类似物的载体的量。应该记得，ACTH类似物在液体环境中时作用较佳。因此，ACTH类似物的效果部分地与载体所含有的水分的量有关。用于治疗的ACTH类似物的浓度取决于血液中的细菌数和血液体积。
当体内施用ACTH类似物时，正常的剂量为每天大约10ng/kg至100mg/kg受试者体重或更高，或者大约1μg/kg/天至10mg/kg/天，这取决于施用途径。关于特定剂量以及递送方法的指导还在下面以及文献中提供。可以预料到，不同的制剂会对于不同的治疗化合物和不同的病症是有效的，靶向一种器官或组织施用有必要以与递送至另一器官或组织不同的方式递送。
用于灌注或注射的药物溶液可以以常规方式制备，例如加入防腐剂如p-羟基苯甲酸盐或者稳定剂如乙二胺四乙酸的碱金属盐，然后将溶液转移至灌注容器、注射瓶或安瓿瓶种。备选地，用于注射的化合物可以与其它成分一起冻干或者单独冻干，并且在使用时按照需要溶解于缓冲溶液中或蒸馏水中。在这里还可使用非水溶性媒介物，例如不挥发油类、脂质体以及油酸乙酯。
另外，多种方法可用于辅助ACTH类似物跨细胞膜转运。ACTH类似物可于脂质体中转运，其中通过已知的技术将ACTH类似物“插入”至脂质体中。同样，ACTH类似物可以在反微团中。ACTH类似物还可以是聚乙二醇化的，其中聚乙二醇与ACTH类似物的非活性部分相连。备选地，疏水分子可用于跨细胞膜转运ACTH类似物。最后，ACTH类似物的糖基化可用于靶向细胞膜上的特异内化受体。
具有可控释放能力的材料特别适合于某些治疗方法。ACTH类似物可与载体系统组合使用，所述载体系统例如使得ACTH类似物化合物在预期的时间阶段内持续释放的聚合物。在此类制剂中还可包括高分子量的赋形剂，例如纤维素(avicel)或聚乙二醇(PEG)。此类制剂还可以包括帮助粘膜附着的赋形剂，例如羟丙基纤维素(HPC)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羧甲基纤维素钠(SCMC)、马来酐共聚物(例如Gantrez)，以及控制释放的试剂，例如聚丙烯酸共聚物(例如Carbopol 934)。为了便于润滑和使用还可使用润滑剂、助流剂、矫味剂、着色剂和稳定剂。
ACTH类似物化合物可与Loughman在美国专利号6,893,645(于2002年7月15日提交，并且于2005年5月17日颁发)中所述的持续释放载体成分组合，该专利文献在此引用作为参考。可与ACTH类似物组合的持续释放制剂和可控释放制剂以及方法的其它实例包括所公布的美国专利申请号US2005/0164927 A1(由Cheung等人于2004年8月18日提出)、US2003/0125528 A1(由Hay等人于2002年9月27日提出)、US2003/0211966 A1(由Kubek等人于2002年10月21日提出)、US2003/0148938 A1(由Sharma等人于2001年11月7日提出)以及US2003/0181361 A1(由Sharma等人于2003年3月31日提出)，这些专利文献的公开在此全部引用作为参考。在一些实施方案中，可控释放治疗组合物可包括可控释放聚合物以及有效量的ACTH类似物。可控释放聚合物可以是水膨胀性聚合物，其任选包括预期水平的交联部分。可控释放聚合物可具有预期水平的水溶解度或者具有最小的水溶解度。
可使用的聚合物增稠剂包括本领域人员已知的那些，例如在化妆品和制药业经常用到的亲水凝胶化剂和水醇凝胶化剂。亲水凝胶化剂或水醇凝胶化剂可包括例如CARBOPOL
Figure A20058004242700511
(B.F.Goodrich，Cleveland，Ohio)、HYPAN
Figure A20058004242700512
(Kingston Technologies，Dayton，N.J.)、NATROSOL
Figure A20058004242700513
(Aqualon，Wilmington，Del.)、KLUCEL
Figure A20058004242700514
(Aqualon，Wilmington，Del.)或者STABILEZE
Figure A20058004242700515
(ISP Technologies，Wayne，N.J.)。凝胶化剂可占组成成分的大约0.2％至大约4％(重量比)。更加具体而言，对于CARBOPOL
Figure A20058004242700516
，组成的重量百分比范围实例可以在大约0.5％至大约2％之间，而对于NATROSOL
Figure A20058004242700517
和KLUCEL的重量百分比范围在大约0.5％至大约4％之间。对于HYPAN
Figure A20058004242700519
和STABILEZE
Figure A200580042427005110
的组成重量百分比范围在大约0.5％至大约4％之间。
CARBOPOL是众多交联丙烯酸聚合物之一，其一般采用的名称为卡波姆(carbomer)。这些聚合物溶解于水，并且当用腐蚀性物质例如氢氧化钠、氢氧化钾、三乙醇胺和其它胺碱基中和时会形成清晰和略模糊的凝胶。KLUCEL
Figure A200580042427005112
是纤维素聚合物，其分散于水中并且当完全水合时形成均一凝胶。其它凝胶化聚合物包括羟乙基纤维素、纤维素胶、MVE/MA癸二烯交联聚合物、PVM/MA共聚物和其组合。
在本发明中还可以使用防腐剂，并且防腐剂可以占例如总组成成分的大约0.05％至0.5％(重量比)。使用防腐剂可以保证，如果产物被微生物污染，则制剂会防止和降低微生物的生长。可用于本发明的一些防腐剂包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、对氯间二甲苯酚、苯甲酸钠、DMDM乙内酰脲、3-碘代-2-丙基丁基氨甲酸酯、山梨酸钾、葡萄糖酸氯己定或其组合。
在具有适合治疗任何疾病或病症(需要施用ACTH类似物)的释放特征的制剂中期望ACTH类似物持续释放施用，在这种情况下考虑将ACTH类似物微胶囊化。适宜与ACTH类似物使用的优选的微胶囊化组合物包括在Pellet等人的美国专利号6,475,507(2000年11月6日提出)以及Ignatious等人的6,911,218(1999年4月20日提出)中描述的那些，该两个专利在此全部引用作为参考。用于持续释放的重组蛋白质的微胶囊化已经用人生长激素(rhGH)、干扰素-(rhIFN-)、白细胞介素-2以及MN rgp120成果开展。Johnson等人，Nat.Med.，2：795-799(1996)；Yasuda，Biomed.Ther.，27：1221-1223(1993)；Hora等人，Bio/Technology.8：755-758(1990)；Cleland，″Design and Production of Single Immunization Vaccines UsingPolylactide Polyglycolide Microsphere Systems.″in Vaccine Design：TheSubunit and Adjuvant Approach，Powell和Newman编(Plenum Press：New York，1995)，第439462页；WO 97/03692，WO 96/40072，WO96/07399；以及美国专利号5,654,010。
持续或可控释放载体可以是“长期”或“慢速”释放载体(例如某些喷鼻剂、聚合物或胶囊)或者“短期”或“快速”释放载体(例如含漱液)，“长期”或“慢速”释放载体会具有或者提供较低浓度的活性(ACTH类似物)单位/ml，但持续较长的时间；而“短期”或“快速”释放载体会具有或提供较高浓度的活性(ACTH类似物)单位/ml，但持续时间较短。每毫升活性单位的数量以及接触的持续时间取决于感染种类、治疗为预防性治疗还是治疗性治疗以及其它可变因素。因此，给药次数会取决于环境，并且可以每天1-4次或更多，持续时间从一天至数周。感染可发生在皮肤中，因此还可使用众所周知的媒介物，例如美国专利6,056,954和6,056,955中描述的那些将此类组合物配制成适于局部应用。还可使用微团和多层微团以控制ACTH类似物的释放。
在这些蛋白质的持续释放制剂中可使用生物可吸收聚合物，例如聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)聚合物，因为它们具有生物适应性合广泛的生物可降解特性。PLGA的降解产物乳酸和乙醇酸可被人体快速清除。此外，可调节该聚合物的降解性，使其从数月至数年，这取决于其分子量和组成。Lewis，″Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolidepolymer，″in：M.Chasin and R.Langer(Eds.)，Biodegradable Polymers asDrul：Delivery Systems(Marcel Dekker：New York，1990)，第1-41页。
在一些实例中，治疗性组合物包含粘膜粘附持续释放制剂和ACTH类似物。如所公开和所描述，粘膜衬里包括例如上呼吸道和下呼吸道、眼睛、口腔、鼻、直肠、阴道、牙周袋、肠和结肠。来自E.R.Squibb&Co的Orahesive粘合剂，其在粘性烃聚合物中组合了果胶、白明胶和羧甲基纤维素钠，用于粘附于口腔粘膜。然而，此类亲水和疏水成分的物理混合物会最终脱落下来。与之相反，本公开中的亲水和疏水结构域产生了不溶的共聚物。美国专利号4,948,580描述了生物粘性的药物递送系统，该专利在此引用作为参考。组合物包括冻干的聚合物混合物，该聚合物混合物是分散于软膏基质如包含分散聚乙烯的矿物油中的聚(甲基乙烯基醚/马来酸酐)与白明胶的共聚物形成的。美国专利号5,413,792(在此引用作为参考)公开了糊剂，如包含(A)包含聚硅氧烷和水溶性聚合材料(可以以3∶6至6∶3的重量比存在)的糊状基质，和(B)活性成分的制剂。美国专利号5,554,380要求保护包含具有至少两个相的油包水系统的固体和半固体生物粘附口腔吸收药物递送系统。一相包含大约25％至大约75％(体积比)的内部亲水相，另外的相包含大约23％至大约75％(体积比)的外部疏水相，其中外部疏水相由以下3种成分组成：(a)乳化剂，(b)甘油酯，和(c)蜡材料。美国专利号5,942,243描述了用于施用抗菌剂的一些代表性的释放材料，其公开在此引用作为参考。该公开组合物的剂量形式可通过常规方法制备。
包含ACTH类似物的组合物可通过喷鼻剂、滴鼻剂、鼻用软膏、洗鼻液、鼻注射、鼻填塞、支气管喷雾和吸入器施用。当ACTH类似物通过使用喷鼻剂、滴鼻剂、鼻用软膏、洗鼻液、鼻注射、鼻填塞、支气管喷雾、口腔喷雾和吸入器直接引入时，ACTH类似物可以为液体和凝胶形式，其中液体作用载体起作用。虽然可以以液体递送形式使用，但干燥的无水修饰的ACTH类似物可以通过吸入器和支气管喷雾施用。鼻喷雾可以是长效喷雾或者定期释放喷雾，并且可以通过本领域众所周知的方法制造。还可使用吸入器，使ACTH类似物可以达到支气管道(包括肺)的更下端。适于鼻气溶胶或吸入施用的例证性组合物包括盐水中的溶液，在其中还包括例如苯甲醇或其它适宜防腐剂、增加生物利用度的吸收促进剂和/或其它稳定剂或分散剂，例如本领域已知的那些。
适于经皮施用ACTH类似物的组合物可使用递送至少一种ACTH类似物至或穿过皮肤的载体配制。ACTH类似物的应用模式包括多种不同类型以及载体的组合，所述载体包括但不限于水溶性液体、基于醇的液体、水溶性凝胶、洗液、软膏、非水溶性液体基质、矿物油基质、矿物油和凡士林的混合物、羊毛脂、脂质体、蛋白质载体如血清白蛋白或白明胶、粉末纤维素carmel以及其它的组合。包含治疗剂的载体的递送模式包括但不限于涂沫、喷雾、限时释放pACTH、液体可吸收性擦拭以及它们的组合。ACTH类似物可直接应用于绷带上或者以一种其它载体的方式应用于绷带上。绷带可以是购买的湿绷带或者干绷带，其中ACTH类似物以冻干的形式存在于绷带上。该应用方法对于治疗感染的皮肤是最有效的。局部组合物的载体可包含半固体和凝胶样媒介物，所述的媒介物包括聚合物增稠剂、水、防腐剂、表面活性剂和乳化剂、抗氧化剂、防晒剂以及溶剂或者混合溶剂系统。美国专利号5,863,560(Osborne)讨论了许多可以帮助皮肤和药物接触的不同载体组合。用于局部施用的另一组合物包括局部载体，例如Plastibase(用聚乙烯凝胶化的矿物油)。
在一个实例中，本发明包含具有大约0.5％至10％的卡波姆和大约0.5％至10％的药物的皮肤病学组合物，其中药物以溶解状态和微粒状态存在。溶解的药物具有穿过角质层的能力，而微粒状态的药物则不能。加入胺碱、氢氧化钾溶液或者氢氧化钠溶液使凝胶完全形成。更加具体而言，药物可以包括氨苯砜，其是一种具有抗炎特性的抗菌剂。一个例证性的微粒形式氨苯砜与溶解形式氨苯砜之比是5或者更小。
在另一实例中，本发明包含大约1％卡波姆、大约80-90％水、大约10％乙氧基二甘醇(ethoxydiglycol)、大约0.2％对羟基苯甲酸甲酯、大约0.3％至3.0％氨苯砜(包括微粒氨苯砜和溶解的氨苯砜)以及大约2％腐蚀性物质。更加具体而言，卡波姆可包括CARBOPOL
Figure A20058004242700551
980，并且腐蚀性物质可包括氢氧化钠溶液。
治疗方法
ACTH类似物化合物可用于治疗多种ACTH相关病。治疗方法包括施用一种或多种ACTH类似物化合物，以降低ACTH诱导的肾上腺激素分泌率、减轻高水平ACTH对患者的影响或者阻断过量ACTH并且同时维持健康状态的肾上腺功能。ACTH类似物化合物可用于治疗与ACTH水平相关的疾病，例如对ACTH受体(例如MC-2R)的调节作出反应的疾病。可施用ACTH类似物化合物来治疗与ACTH水平调节相关的病，例如降低高水平ACTH对患者的影响并且同时维持正常健康状态的肾上腺功能。
ACTH类似物组合物可用于例如治疗ACTH相关病，例如库欣综合征、因皮质类固醇过度分泌导致的免疫应答受损、引起早产(例如通过下丘脑-垂体-肾上腺轴)以及相关病。在一个方面，制备了多种ACTH类似物并向患者施用以评价在体内对可的松的诱导。
结合高分辨率MR垂体影像，施用ACTH类似物化合物可治疗垂体腺中产生ACTH的肿瘤。结合岩窦采样，施用ACTH类似物化合物可确立垂体来源的ACTH过度分泌、手术前垂体肿瘤的定位和偏侧性(参见Oldfield，E.W.等人，″Petrosal sinus sampling with and withoutcorticotrophin-releasing hormone for the differential diagnosis ofCushing’s syndrome，″N Engl J Med.，325：897-905(1991)；以及Findling，J.W.等人，Endocrinol Metab Clin North Am.，30：729-47(2001))。虽然经蝶骨方法可以成功切除70％的垂体微腺瘤，但是对大大腺瘤的手术“治愈”率仅为专科中心患者的大约三分之一(Mampalam，T.J.等人，Ann InternMed.，109：487-93(1988))。
可以在肿瘤治疗中，包括与治疗ACTH过度分泌的联合治疗中或者与垂体放射治疗的联合治疗中也可以施用ACTH类似物化合物，以抑制肿瘤的生长和激素水平。放射的效果在几天内不明显，并且在多数患者中与最终的垂体损伤和功能紊乱相关(Brada，M.等人，″The long-term efficacy ofconservative surgery and radiotherapy in the control of pituitaryadenomas，″Clin Endocrinol.，38：571-8(1993))。皮质醇增多症、皮质醇过度分泌可通过肾上腺切除术(手术切除一个或两个肾上腺)完全解决，但是该方法不能够抑制垂体肿瘤生长并且还与其它共病有关(参见Trainer，P.J.等人，″Cushing’s syndrome：Therapy directed at the adrenal glands，″Endocrinol Metab Clin North Am.，23：571-584(1994))。
ACTH类似物化合物可与医学疗法组合施用，例如与塞庚啶共施用，塞庚啶是一种抗血清素药物，其用于抑制ACTH分泌但是最终的效果较差，并且已经停止使用(Krieger，D.T.等人，″Cyproheptadine-inducedremission of Cushings disease，″N Engl J Med.293：893-6(1975))。虽然抗真菌药物酮康唑能抑制肾上腺的皮质醇生物合成，但是该药物不能抑制垂体肿瘤的生长或者ACTH的分泌，并且特质性肝损害限制了其长期使用(参见Sonino，N.，″The use of ketoconazole as an inhibitor of steroidproduction，″N Engl J Med.，317：812-8(1987))。
在妊娠的第九个月，胎盘和胎膜产生相当大数量的CRH(参见Frim，D.M.等人，″Characterization and gestational regulation ofcorticotrophin-releasing hormone messenger RNA in human placenta，″JClin Invest.，82：287-292(1988))，引起母体外周血液CRH浓度增加，特别是妊娠30周后(参见Sasaki，A.等人，″Immunoreactivecorticotropin-releasnig hormone in human plasma during pregnancy，labor，and delivery，″J Clin Endocrinol Metab.，64：224-229(1987)以及Goland，R.S.等人，″High levels of corticotropin-releasing hormoneimmunoreactivity in maternal and fetal plasma during pregnancy，″J ClinEndocrinol Metab.，63：119-1204(1986))。最近的研究表明，在早产孕妇的血液中CRH水平提高(参见Wolfe，C.D.A.等人，″Plasma corticotrophinreleasing factor(CRF)in abnormal pregnancy，″Br J Obstet Gynaecol.，95：1003-1006(1988)；Warren，W.B.等人，″Elevated maternal plasmacorticotropin-releasing hormone levels in pregnancies complicated bypreterm labor，″Am J Obstet Gynecol.，166：1198-1207(1992)；以及McLean，M.等人，″A placental clock controlling the length of humanpregnancy，″Nat Med.，1：460-463(1995))，并且在过期分娩的孕妇中降低(McLean等人，同上)。
ACTH类似物可以与抗分娩药或防止分娩的药物组合使用以推迟分娩。抗分娩药的实例包括利托君和特布他林，它们是β-拟交感性的。然而，为了产生效果，这些药物通常必须在分娩之前或者开始发生分娩时施用，如果在分娩开始之后施用则效果或安全性不可靠。虽然有时在妊娠的高危险阶段(一般在妊娠的大约28周和34周之间)向孕妇连续施用(一般通过灌注)低水平的抗分娩药，但是药物对肾脏功能、呼吸功能、心率和全面的肌肉组织健康状态具有不良副作用。剂量通常必须维持在低于例如大约0.1cc/小时(1mg/cc特布他林溶液)。在避免发生分娩的这些低剂量的效果是不一致的并且很难量化。因此，需要治疗早产的治疗药物(treatments)和方法。更加具体而言，需要用于治疗早产的不存在现有不良副作用的新的治疗药物和方法。
在一个实施方案中，可施用ACTH类似物组合物以降低ACTH的生物合成。该治疗方法可以与施用药物(例如甲吡酮)相组合，或者优选地代替之。优选地，可施用ACTH类似物组合物治疗妊娠过程中发展的库欣病的发生，如在J.R.Lindsay和L.K.Nieman(2005)″TheHypothalamic-Pituitary-Adrenal Axis in Pregnancy：Challenges in DiseaseDetection and Treatment，″Endocrine Reviews 26：775-800中所述。对该病的治疗(通常延长妊娠或者准备分娩)可包括施用ACTH多肽和/或甲吡酮，经观察这种治疗具有很好的耐受性，不会对母体肝脏功能和胎儿发育产生不良影响。可向患者施用甲吡酮以降低ACTH的生物合成。当确信皮质类固醇过度分泌的原因是因为ACTH水平提高(推测来自这些女性的垂体肿瘤)时，则ACTH类似物组合物特别优选地作为降低皮质类固醇合成策略的一部分。
在另一方面，提供了治疗兽类受试者的方法，例如用于降低应激激素以利于高密度的农业和水产业物种健康生长的方法。可以用降低应激激素以利于高密度的农业和水产业物种健康生长的方法施用包含一种或多种ACTH类似物化合物的组合物。
实施例
下面的实施例用于阐明本发明的优选实施方案。本领域的技术人员应当意识到，在实施例中公开的材料和技术(接着给出本发明者所公开的材料和技术)可以很好的实践本发明，因此可以认为构成该实践的优选模式。然而，本领域的技术人员应当意识到，按照本公开可以对所公开的特定实施方案进行诸多修改而仍然可得到相同和相似的结果，这没有偏离本发明的精神和范围。
实施例1血清皮质类固醇诱导分析法(体内)
通过开展体内血清皮质类固醇诱导分析法测定施用ACTH类似物后受试者血液中的皮质类固醇水平，来鉴定具有降低的ACTH所介导皮质类固醇分泌的ACTH类似物。
体内血清皮质类固醇诱导分析根据下列方法开展。首先，向我们所繁殖的2-3月龄的雄性FVB/N小鼠(每组5只)腹膜内注射地塞米松(每只小鼠0.4mg/0.1ml PBS；Sigma，St.Louis，MO)以抑制它们的内源性ACTH产生。参见Hajos，GT等人，″Studies of the potency of polypeptides withACTH action by a new method based on continuous measurement ofplasma corticosterone，″Steroids Lipids Res 3：225-228(1972)；Costa，JL等人，″Mutational analysis of evolutionarily conserved ACTH residues，″GenComp Endocrinol，136：12-16(2004)；以及Karpac，J等人，″Development，Maintenance，and Function of the Adrenal Gland in Early PostnatalPro-opiomelanocortin Null Mutant Mice，″Endocrinology(2005)，于2005年2月24日印刷之前在线公布，所有这些文献在此引用作为参考。
第二，90分钟至120分钟之后，向用地塞米松抑制的小鼠在肩胛骨间皮下注射未修饰mACTH(1-24)、或者几种ACTH类似物肽化合物之一(1μg/0.1mL PBS/0.5％BSA)、或者仅有媒介物(对照)(0.1mL PBS/0.5％BSA)。向各个小鼠施用下列ACTH类似物肽化合物：1：鼠ACTH 1-24；2：V26F，E30K；3：P19W，K21E，Y23R；4：E30K，P36R；5：ALA19-24；6：V26F，P36R；7：P19W，K21E；8：P19W，K21A，delY23；9：P19W，K21A；10：KRRP16-19RAAW(AT814)(SEQ ID NO：20)。
第三，1小时之后，在1分钟之内从尾部的小切口处收集血液，将血清速冻并储存于-80℃直至分析。通过竞争性放射免疫分析法(125I RIA试剂盒；ICN，Costa Mesa，CA)根据厂商的推荐确定血清皮质酮。对于每一分析样品，使用1μl血清。将样品一式两份开展分析。如上所述的对于ACTH类似物肽的结果示于图1中的图表中，活性显示为ACTH活性的百分数。与天然ACTH相比，这些ACTH类似物的活性较低。
实施例2血清皮质类固醇抑制分析法(体内)
通过开展体内血清皮质类固醇抑制分析法测试其抑制由未修饰ACTH所诱导的肾上腺激素产生的能力，来鉴定具有降低的ACTH所介导皮质类固醇分泌的ACTH类似物。在组合施用ACTH类似物测试化合物与具有已知的皮质类固醇诱导活性的化合物(例如ACTH或另一种ACTH类似物)之后，测量受试者血液中的皮质类固醇水平。ACTH类似物测试化合物可在产生皮质类固醇的化合物施用之前、同时或之后施用。
按照下列方法开展体内血清皮质类固醇抑制分析。测试了ACTH类似物测试化合物，例如表1中的具有低活性的那些化合物抑制由未修饰ACTH所诱导的肾上腺激素产生的能力。
首先，向我们所繁殖的2-3月龄的雄性FVB/N小鼠(每组5只)腹膜内注射地塞米松(每只小鼠0.4mg/0.1ml PBS；Sigma，St.Louis，MO)以抑制它们的内源性ACTH产生。
第二，90分钟至120分钟之后，向动物在肩胛骨间皮下注射野生型mACTH和/或测试ACTH类似物肽(1μg/0.1mL PBS/0.5％BSA)或者仅有媒介物(0.1mL PBS/0.5％BSA)。
第三，1小时之后，在1分钟之内从尾部的小切口处收集血液，将血清速冻并储存于-80℃直至分析。通过竞争性放射免疫分析法(125I RIA试剂盒；ICN，Costa Mesa，CA)根据厂商的推荐确定血清皮质酮。对于每一分析样品，使用1μl血清。将样品一式两份开展分析。
如上所述的对于类似物AT814(SEQ ID NO：20)的结果图示于图2中。肽的活性显示为皮质酮诱导的百分数，其中天然的小鼠ACTH被设成100％。通过对最后一次注射肽1小时后的皮质酮诱导的比较表明，当在ACTH注射前30分钟使用时，AT814使皮质酮诱导降低至野生型ACTH的35％；当在ACTH注射的同时使用时，AT814使皮质酮诱导降低至野生型ACTH的10％。
实施例3肾上腺结合分析法(体外)
通过开展体外肾上腺结合分析法可鉴定出具有结合肾上腺受体能力的ACTH类似物。可测定结合至外植肾上腺膜上的放射性标记的ACTH类似物测试化合物的量，以鉴定具有肾上腺受体结合活性的ACTH类似物。优选地，这可以在无血清培养基中进行(体外无血清肾上腺结合分析法)。
通过体外肾上腺竞争性结合分析法还可以鉴定这样的ACTH类似物，该ACTH类似物具有结合肾上腺受体的能力，其结合亲和性比已知具有肾上腺结合活性的化合物(优选ACTH)更高，在体外肾上腺竞争性结合分析法中，对放射性标记的结合至肾上腺的化合物(例如ACTH)的数量降低的测量是通过测量包含外植肾上腺膜的培养基中非放射性标记的ACTH类似物测试化合物的不同浓度实现。被放射性标记的肾上腺结合化合物结合的肾上腺膜的减少可用于鉴定和表征ACTH类似物测试化合物的结合活性。在一系列体外肾上腺竞争性结合分析法，向肾上腺膜培养基中加入ACTH类似物测试化合物，测定放射性标记ACTH结合的降低。
体外无血清肾上腺竞争结合分析法按照下列方法开展。首先，从小鼠中取出肾上腺，切除脂肪并切成两半。参见Costa，JL等人，″Mutationalanalysis of evolutionarily conserved ACTH residues，″Gen CompEndocrinol.136：12-16(2004)；以及Weber，MM等人，″Postnataloverexpression of insulin-like growth factor II in transgenic mice isassociated with adrenocortical hyperplasia and enhanced steroidogenesis，″Endocrinology 140：1537-1543(1999)，其在此引用作为参考。
第二，将每一半肾上腺置于4-孔皿的各个空中，每一只老鼠的肾上腺置于一个皿中。将分成两半的肾上腺在0.5ml无血清培养基(M199；Invitrogen)中于5％CO2、37℃下平衡30分钟。
第三，将分成两半的肾上腺浸软或者使用Dounce匀浆器分离形成膜部分。将该部分重新悬浮于适当的缓冲液中(Tris或HEPES)。然后向重悬的膜部分中加入125I放射性标记的ACTH(200ml)和非放射性标记的测试化合物(例如ACTH或者ACTH类似物，例如AT814(SEQ ID NO：20))，所加入的量使得测试化合物的总浓度为0nm、10nm、100nm和1000nm；在对照中不加入肽。回收膜部分并且使用γ检测器检测放射性信号。在加入非放射性标记的测试化合物之后所检测到的放射性信号的降低可以与多种测试化合物的结合亲和性关联起来。在加入ACTH类似物肽测试化合物之后放射性信号的降低表明，其具有增加的对肾上腺ACTH受体如MC-2R的亲和性并具有置换肾上腺MC-2R受体处ACTH的能力。
图3显示了一系列体外无血清肾上腺竞争性结合分析的结果。
实施例4肾上腺抑制分析法(体外)
通过开展体外无血清皮质类固醇抑制分析法测试其抑制由未修饰ACTH所诱导的肾上腺激素产生的能力，来鉴定降低和封闭ACTH所介导的肾上腺膜对皮质类固醇分泌的ACTH类似物。在组合施用ACTH类似物测试化合物与具有已知的皮质类固醇诱导活性的化合物(例如ACTH或另一种ACTH类似物)之后，测量无血清培养基中的皮质类固醇水平。ACTH类似物测试化合物可在产生皮质类固醇的化合物施用之前、同时或之后施用。
体外无血清肾上腺抑制分析法按照下列方法开展。首先，从小鼠中取出肾上腺，切除脂肪并切成两半。参见Costa，JL等人，″Mutational analysisof evolutionarily conserved ACTH residues，″Gen Comp Endocrinol.136：12-16(2004)；以及Weber，MM等人，″Postnatal overexpression ofinsulin-like growth factor II in transgenic mice is associated withadrenocortical hyperplasia and enhanced steroidogenesis，″Endocrinology140：1537-1543(1999)，其在此引用作为参考。
第二，将每一半肾上腺置于4-孔皿的各个空中，每一只老鼠的肾上腺置于一个皿中。将分成两半的肾上腺在0.5ml无血清培养基(M199；Invitrogen)中于5％CO2、37℃下平衡30分钟。
第三，除去培养基并换成0.5ml含ACTH、AT814或者两者(每一种为100ng/ml)的M199；对照种不加入肽。
第四，孵育2小时后，除去培养基中，将4个来自每一小鼠的半片肾上腺混合，并使用标准RIA方法通过皮质酮分析。通过竞争性放射免疫分析法(125I RIA试剂盒；ICN，Costa Mesa，CA)按照厂商的推荐测定皮质酮。对于每一分析样品，使用1μl血清。将样品一式两份开展分析。结果示于图4。
实施例5(预测)治疗性的兽医学施用
鱼类孵化面临着诸多挑战，因为为了商业目的将鱼类的总吨数最大化的目标被拥挤以及感染传播的影响所打乱。在这些环境中，鱼类试图通过下丘脑/垂体/肾间(HPI)轴来对付这种慢性应激。在这些情况中，死亡率、对皮质类固醇的脱敏以及对于种群密度形成新的稳态在一些水平上源于皮质类固醇的增加。相反，在这种“调整”循环过程中，皮质类固醇水平的长期提高降低了对感染的抗性。
可通过定时释放，例如从这些鱼中的硅橡胶胶囊植入物定时释放施用本发明的ACTH类似物调节孵化场鱼的HPI。对HPI轴的这种缓冲应该改善了存活并可能利于孵化场鱼的体重增加。
可将植入本发明的ACTH类似物或者单独的ACTH的鱼置于激活HPI轴的环境条件下(即拥挤、pH变化、氨和硝酸盐增加)。在这些范例中可以分析的两个参数是死亡率和体重变化。此类参数可以阐明，本发明的ACTH类似物在降低鱼类皮质酮水平中是否有效。
序列表
<110>丹佛大学(UNIVERSITY OF DENVER)
佛罗里达大学(UNIVERSITY OF FLORIDA)
俄克拉荷马州医学研究基金会(OKLAHOMA MEDICAL RESEARCH FOUNDATION)
<120>促肾上腺皮质激素类似物以及相关方法
<130>12968/003(DU-144)
<150>US 60/622,436
<151>2004-10-27
<160>21
<170>PatentIn 3.3版
<210>1
<211>39
<212>PRT
<213>人
<400>1
Ser Tyr Ser Met Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Val Gly Lys Lys
1               5                   10                  15
Arg Arg Pro Val Lys Val Tyr Pro Asn Gly Ala Glu Asp Glu Ser Ala
            20                  25                  30
Glu Ala Phe Pro Leu Glu Phe
        35
<210>2
<211>24
<212>PRT
<213>人
<400>2
Ser Tyr Ser Met Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Val Gly Lys Lys
1               5                   10                  15
Arg Arg Pro Val Lys Val Tyr Pro
            20
<210>3
<211>13
<212>PRT
<213>人
<400>3
Ser Tyr Ser Met Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Val
1               5                   10
<210>4
<211>4
<212>PRT
<213>人
<400>4
His Phe Arg Trp
1
<210>5
<211>4
<212>PRT
<213>人
<400>5
Lys Lys Arg Arg
1
<210>6
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>ACTH类似物的(AA15-18)部分
<400>6
Lys Arg Ala Ala
1
<210>7
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>ACTH类似物的(AA15-18)部分
<400>7
Ala Lys Ala Arg
1
<210>8
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>ACTH类似物的(AA15-18)部分
<400>8
Lys Ala Ala Arg
1
<210>9
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>ACTH类似物的(AA15-18)部分
<400>9
Lys Ala Arg Ala
1
<210>10
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>ACTH类似物的(AA15-18)部分
<400>10
Gln Lys Gln Arg
1
<210>11
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>ACTH类似物的(AA15-18)部分
<400>11
Ala Ala Ala Ala
1
<210>12
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>ACTH类似物的(AA14)-(AA15-18)-(AA19)部分
<400>12
Gly Lys Arg Ala Ala Trp
1               5
<210>13
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>ACTH类似物的(AA14)-(AA15-18)-(AA19)部分
<400>13
Gly Ala Lys Ala Arg Pro
1               5
<210>14
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>ACTH类似物的(AA14)-(AA15-18)-(AA19)部分
<400>14
Gly Lys Ala Ala Arg Pro
1               5
<210>15
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>ACTH类似物的(AA14)-(AA15-18)-(AA19)部分
<400>15
Gly Lys Ala Arg Ala Pro
1               5
<210>16
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>ACTH类似物的(AA14)-(AA15-18)-(AA19)部分
<400>16
Gly Gln Lys Gln Arg Pro
1               5
<210>17
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>ACTH类似物的(AA14)-(AA15-18)-(AA19)部分
<400>17
Gly Lys Arg Ala Ala Pro
1               5
<210>18
<211>5
<212>PRT
<213>人
<400>18
Val Lys Val Tyr Pro
1               5
<210>19
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>ACTH类似物的(AA20-24)部分
<400>19
Ala Ala Ala Ala Ala
1               5
<210>20
<211>24
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>ACTH类似物
<400>20
Ser Tyr Ser Met Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Val Gly Lys Arg
1               5                   10                  15
Ala Ala Trp Val Lys Val Tyr Pro
            20
<210>21
<211>15
<212>PRT
<213>人
<400>21
Asn Gly Ala Glu Asp Glu Ser Ala Glu Ala Phe Pro Leu Glu Phe
1               5                   10                  15

Claims (42)

1.包含分离的ACTH类似物肽的组合物，其中ACTH类似物肽包含具有下列至少一个氨基酸替代的SEQ ID NO：2的肽：
a.SEQ ID NO：2中位置19上的Pro残基被氨基酸Trp替代；或者
b.选自SEQ ID NO：2的氨基酸残基16-18的残基处的一个或多个氨基酸替代，以致于
i.ACTH类似物的氨基酸残基16、17和18不包括任何两个相邻的选自Lys和Arg的氨基酸残基；以及
ii.在SEQ ID NO：2中位置16、17或18处替代的一个或多个氨基酸残基选自：Lys、Arg、Ala、Gly、Val、Leu、Ile、包含烷基侧链的氨基酸类似物、Gln、Asn、Glu和Asp。
2.权利要求1所述的组合物，其中ACTH类似物肽包含在SEQ IDNO：2的氨基酸位置15、16、17或18中的任何两个位置进行替代的至少一个Ala和至少一个Arg残基。
3.权利要求1或2所述的组合物，其中ACTH类似物基本上由具有下列氨基酸替代的SEQ ID NO：2的序列组成：SEQ ID NO：2的位置19处的Pro残基被氨基酸Trp替代；SEQ ID NO：2的位置15处的氨基酸选自：Lys、Ala和Gln；并且ACTH类似物肽包含选自SEQ ID NO：2的氨基酸残基16-18的残基处的一个或多个氨基酸替代，以致于ACTH类似物的氨基酸残基16、17和18不包括任何两个相邻的选自Lys和Arg的氨基酸残基。
4.权利要求1、2或3所述的组合物，其中ACTH类似物肽包括氨基酸残基6-9处的氨基酸序列-His6-Phe7-Arg8-Trp9-。
5.权利要求1、2或3所述的组合物，其中ACTH类似物肽包括氨基酸残基15-19处的氨基酸序列-Lys15-Arg16-Ala17-Ala18-Trp19-。
6.权利要求1、2、3、4或5所述的组合物，其中在体内血清皮质类固醇抑制分析法中，ACTH类似物肽的施用使ACTH诱导的皮质类固醇的分泌降低至少10％。
7.权利要求1、2、3、4、5或6所述的组合物，其中ACTH类似物肽结合并置换肾上腺膜上的SEQ ID NO：2的肽，在其中肽的结合通过体外无血清肾上腺竞争结合分析法测定。
8.权利要求7所述的组合物，其中ACTH类似物肽以比SEQ ID NO：2的肽高至少两倍的亲和性结合MC-2R肾上腺膜。
9.权利要求1、7或8所述的组合物，其中在体外无血清肾上腺抑制分析法中ACTH类似物肽降低了ACTH所诱导的肾上腺膜对皮质酮的产生。
10.包含分离的ACTH类似物肽的组合物，ACTH类似物肽包含具有至少一个氨基酸替代的SEQ ID NO：2的肽，其中ACTH类似物肽结合并置换肾上腺膜上的SEQ ID NO：2的肽，在其中通过体外无血清肾上腺竞争结合分析法测定肽的结合。
11.权利要求10所述的组合物，其中ACTH类似物肽具有至少一个下列氨基酸替代：(a)SEQ ID NO：2中位置19上的Pro残基被氨基酸Trp替代，或者(b)选自SEQ ID NO：2的氨基酸残基16-18的残基处的一个或多个氨基酸替代，以致于ACTH类似物的氨基酸残基16、17和18不包括任何两个相邻的选自Lys和Arg的氨基酸残基；以及在SEQ ID NO：2中位置16、17或18处替代的一个或多个氨基酸残基选自：Lys、Arg、Ala、Gly、Val、Leu、Ile、包含烷基侧链的氨基酸类似物、Gln、Asn、Glu和Asp。
12.权利要求10或11所述的组合物，其中ACTH类似物肽包括氨基酸残基15-19处的氨基酸序列-Lys15-Arg16-Ala17-Ala18-Trp19-。
13.权利要求10、11或12所述的组合物，其中在体外无血清肾上腺抑制分析法中，ACTH类似物肽降低了ACTH诱导的肾上腺膜对皮质酮的产生。
14.权利要求10、11、12或13所述的组合物，其中ACTH类似物肽的施用使ACTH诱导的皮质类固醇诱导降低至少10％，其中皮质酮诱导通过体内血清皮质类固醇抑制分析法测定。
15.权利要求10、11、12、13或14所述的组合物，其中与SEQ ID NO：2的肽相比，在体外血清皮质类固醇诱导分析法中ACTH类似物肽使ACTH诱导的肾上腺膜对皮质酮的产生降低至少10％。
16.包含分离的ACTH类似物肽的组合物，其中ACTH类似物肽包含具有至少一个氨基酸替代的SEQ ID NO：1的肽，其中与SEQ ID NO：2的肽相比，在体外血清皮质类固醇诱导分析法中ACTH类似物肽使ACTH诱导的肾上腺膜对皮质酮的产生降低至少10％，其中至少一个氨基酸替代包括SEQ ID NO：1的位置19、26、30或36处的氨基酸残基的替代。
17.权利要求16所述的组合物，其中ACTH类似物肽具有至少一个下列氨基酸替代：(a)SEQ ID NO：1中位置19上的Pro残基被氨基酸Trp替代，或者(b)选自SEQ ID NO：1的氨基酸残基16-18的残基处的一个或多个氨基酸替代，以致于ACTH类似物的氨基酸残基16、17和18不包括任何两个相邻的选自Lys和Arg的氨基酸残基；以及在SEQ ID NO：2中位置16、17或18处替代的一个或多个氨基酸残基选自：Lys、Arg、Ala、Gly、Val、Leu、Ile、包含烷基侧链的氨基酸类似物、Gln、Asn、Glu和Asp。
18.权利要求16或17所述的组合物，其中ACTH类似物肽包括氨基酸残基15-19处的氨基酸序列-Lys15-Arg16-Ala17-Ala18-Trp19-。
19.权利要求16、17或18所述的组合物，其中ACTH类似物还包含对SEQ ID NO：1中氨基酸残基25-39的截断。
20.权利要求16、17、18或19所述的组合物，其中ACTH类似物肽包含SEQ ID NO：20的肽。
21.ACTH类似物用于制造治疗ACTH相关病的药物中的用途，其包括将权利要求1、10或16所述的ACTH类似物与适宜载体混合的步骤。
22.权利要求21所述的用途，其中ACTH相关病的一种症状是血液皮质类固醇浓度升高。
23.权利要求21所述的用途，其中ACTH相关病选自：库欣病、早产、垂体肿瘤以及下丘脑/垂体/肾间(HPI)轴疾病。
24.权利要求21所述的用途，其中将药物配制成用于通过注射、吸入或经皮吸收施用。
25.权利要求21、22、23或24所述的用途，其中药物包含SEQ IDNO：20的ACTH类似物。
26.治疗ACTH相关病的方法，包括向受试者施用包含权利要求1、10或16所述ACTH类似物的药物组合物。
27.权利要求26所述的方法，其中将药物组合物配制成用于通过注射、及入或经皮吸收向受试者施用。
28.权利要求27所述的方法，其中将药物组合物配制成用于注射施用，其中所述方法还包括向受试者注射药物组合物的步骤。
29.权利要求26所述的方法，其还包括在施用药物组合物之前测定受试者血液皮质类固醇水平的步骤。
30.权利要求28所述的方法，其中药物组合物通过皮下或静脉内注射。
31.权利要求28所述的方法，其还包括在向受试者注射药物组合物之前注射降低受试者血液皮质类固醇水平的药物的步骤。
32.权利要求31所述的方法，其中降低血液皮质类固醇水平的药物包含地塞米松。
33.权利要求26所述的方法，其中受试者是人。
34.权利要求26所述的方法，其中药物组合物包含持续释放组合物。
35.权利要求25、26、27、28、29、30、31、32、33或34所述的方法，其中药物组合物包含SEQ ID NO：20的ACTH类似物。
36.对ACTH类似物化合物进行筛选以鉴定与SEQ ID NO：2的未修饰ACTH相比诱导肾上腺膜对皮质类固醇分泌较少的ACTH类似物化合物的方法，其包括将肾上腺膜与ACTH类似物相接触的步骤。
37.权利要求36所述的方法，其中筛选方法还包括步骤：
a.提供第一肾上腺膜和第二肾上腺膜；
b.将第一肾上腺膜与包含含有SEQ ID NO：2的未修饰肽的第一个组合物接触，然后测定与包含SEQ ID NO：2的未修饰肽接触后由第一肾上腺膜所分泌的皮质类固醇的第一个浓度；
c.将第二肾上腺膜与包含ACTH类似物的第二个组合物接触，然后测定与ACTH类似物接触后由第二肾上腺膜所分泌的皮质类固醇的第二个浓度。
38.权利要求37所述的方法，其还包括将第一个所分泌皮质类固醇浓度与第二个所分泌皮质类固醇浓度相比较的步骤。
39.权利要求38所述的方法，其还包括确定是否第二个化合物诱导的皮质类固醇分泌比第一个化合物诱导的皮质类固醇分泌少的步骤。
40.权利要求36、37、38或39所述的方法，其中ACTH类似物是权利要求1、10或16所述的ACTH类似物。
41.权利要求36、37、38或39所述的方法，其中第一肾上腺膜和第二肾上腺膜位于受试者中并且皮质类固醇的浓度为测定的受试者血液中的浓度。
42.权利要求36、37、38或39所述的方法，其中第一肾上腺膜和第二肾上腺膜是从受试者外植的并且皮质类固醇浓度为测定的无血清培养基中的浓度。
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