CN105899950B - 鱼鳞中作为对于慢性应激的生物标记物的糖皮质激素的量化 - Google Patents

鱼鳞中作为对于慢性应激的生物标记物的糖皮质激素的量化 Download PDF

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Abstract

本发明涉及确定鱼类在长时间段内经历的应激水平，其可以用于评估鱼类的福利状态。更具体地，本发明涉及从鱼中取样的鳞片以及其他钙化组织如耳石、脊和软鳍条用于量化所述鳞片/基质中的糖皮质激素水平的用途。所述糖皮质激素如皮质醇或皮质酮的水平在鳞片中随时间累积并且反映鱼类在其生命期间经历的并且影响其应激水平的长期的和应激性状态。因此，本发明公开了，使用鳞片作为用于所述应激激素的准确和精确量化的逻辑可行并且非侵入性的基质，以量化鱼中慢性应激水平的体外方法。

Description

鱼鳞中作为对于慢性应激的生物标记物的糖皮质激素的量化
发明技术领域
本发明涉及确定鱼类经历的应激水平，其可以用于评估鱼类的慢性应激状态。更具体地，本发明涉及从鱼中取样的鳞片以及其他钙化组织如脊、软鳍条和耳石用于量化所述鳞片和其他基质中的糖皮质激素水平的用途。所述糖皮质激素如皮质醇或皮质酮的水平在鳞片中随时间累积并且反映鱼类在其生命期间经历的并且影响其应激水平的长期的和应激性状态。因此，本发明公开了，使用鳞片作为用于所述应激激素的准确和精确量化的逻辑可行并且非侵入性的基质，以量化鱼中慢性应激水平的体外方法。
背景技术
全世界范围内，鱼类越来越引起公共、科学和政治的兴趣。娱乐和商业渔场在我们社会中是重要的：鱼类问题在与保护生物学(1)和环境保护工作(例如，气候改变、新型食肉动物、新型动物-环境关系对应激的影响以及因此对健康(fitness)的影响)(2、3)有关的讨论中占据高度相关的位置。人类活动(例如，能量生产、船运交通、工业污染)损害了野生种群(4)。因此，各种国际性监测方案旨在科学地阐明它们对海洋生态位(niche)的健康状态的影响。对于淡水种群来说存在相似的情形，因为随着农业扩张，它们处于土壤侵蚀、肥料等的威胁下。人类人口持续膨胀，使得对可持续食物生产的需求成为全球的首要优先问题。鱼肉蛋白质是用于人类消耗的最重要的蛋白质来源之一。既然渔场在产率方面受限，水产养殖在世界范围迅速扩张并且对农民施加了日益增加的压力以最佳、可持续且动物友好的方式生产(5、6)。大量的鱼类(例如斑马鱼(zebrafish)和鳉鱼(medaka))在生物医学研究中(例如在骨生理研究中)用作脊椎动物模型和啮齿动物的替代方案。在全球经济输出减少的同时维持该领域中研究驱动的创新的必要性增加了对鱼类的开发。在最近，随着大量的鱼类参与到渔场(7)、迅速增长和加强的水产养殖产业(8、9)、公共水族馆(10、11)和科学研究实验室(12)中，与鱼类受折磨和福利相关的伦理学引起了更多的注意。理解和明白作为鱼类开发中管理、控制和做决策的基础的鱼类生物学对来自大量学科(从分子生物学到生态-生理学)、从多个角度(所有不同的利益相关者)观察并且代表高度具体且珍贵的专业知识的所包括的那些带来了明显的挑战。在该框架下，用于评估鱼类中的应激尤其是慢性应激的水平的新型的科学验证的生物标记物是最重要的。
鱼类福利容易被损害，并且产生了共识：适当的福利评估需要基于动物的生理指标优于较不一致的、间接农业相关的参数如水质。然而，对于用于慢性应激的实际、可靠和验证的生物标记物存在不足。经常使用的、似乎符合逻辑的用于鱼类的生物标记物是“应激类固醇”皮质醇的血液水平。面对应激性刺激的鱼类通过激活下丘脑-垂体-肾间组织(hypothalamic-pituitary-interrenal，HPI-)轴启动内分泌应激反应以将皮质醇(13、14)释放至血液中。皮质醇诱发一系列生理和行为变化(15-17)，这允许鱼类应对改变的环境(18-20)。广泛识别了短期皮质醇行为的适应性的值(21、22)。关于持久性应激及其对健康、生长、和繁殖的主要有害后果所知甚少(19、20)。稳健、容易发挥作用并且科学验证的慢性应激生物标记物的定义因此是最重要的。鱼类血浆中的糖皮质激素水平显示出昼夜变化(23)，不显示鱼类对应激的终生暴露，并且提供不多于一个在取样时的皮质醇状态的快照(snapshot)(24、25)。此外，血液取样是侵入性的并且由于网捕、空气暴露和处理而不可避免地对鱼类造成混乱应激(confounding stress)。这使得血浆皮质醇在遇到应激物之后数分钟水平迅速升高时易于产生偏差(13)。用于促进血液取样的麻醉剂其本身可以降低或阻断HPI轴的活化，从而影响血液中的皮质醇释放并且得到错误的结果(26、27)。限制也适用于在备选基质如黏液(28、29)、肠内容物(29)、排泄物(30)和水(31、32)中的皮质醇的测定。相关文献缺乏关于适用于慢性应激评价的基质中的皮质醇的数据。迄今为止，大多数研究仅提出了皮质醇，并且关于一种或多种糖皮质激素产生通路(33)或它们在慢性应激中的重要性的报道很少。鱼类记录了(非)生物事件并且将该历史储存在钙化组织中(34-37)。与鸟类的羽毛(38)和哺乳动物的毛发(39)一样，用于鱼类中慢性应激评估的理想基质应该至少满足以下标准：(i)糖皮质激素的结合；(ii)缓慢但持久性的生长；和(iii)取样容易。
骨鳞(elasmoid scale)，钙化皮肤外骨骼结构(40)，同鱼类一起生长，并且由非细胞胶原基质组成，其在外层被羟基磷灰石钙矿物质化并且衬有单层具有成骨细胞样和破骨细胞样性质的细胞。在移除时，鳞片将会在数天内重新生成(41)。鳞片是内分泌刺激的靶标。在虹鳟鱼(rainbow trout，Oncorhynchus mykiss)的造骨细胞细胞溶质中发现了高亲和性、低容量的雌二醇-17b结合(42)，并且已经在莫桑比克罗非鱼(Mozambique tilapia，Oreochromis mossambicus)和金头海鲷鱼(gilthead sea bream，Sparus auratus)中免疫组织化学检测到雌激素受体(43)。以可忽略的损伤和在不使其皮质醇水平由于取样操作而混乱的情况下对鱼类的应激，容易并且迅速地收集鳞片。
附图简述
图1：参与慢性应激反应的类固醇激素原理通路和分析物。44
图2：方法的示意性概述。
图3：针对用于验证的鳞片、脊和软鳍条的基质的最佳量。
图4：鳞片、脊和软鳍条中皮质醇的萃取时间和重复的优化。
图5：在稀释剂中和在基质中对鱼鳞中皮质醇的校准曲线。
图6：在处理第42天时的皮质醇(nM)、葡萄糖(mM)、乳酸盐(mM)、总钙(mM)、和同渗质量摩尔浓度(mOsmol kg-1)的血浆分析。观察值的百分之五十在框的下边缘和上边缘(第一和第三四分位数)之间出现，并且虚线(whisker)从框延伸至不大于四分位数间范围的1.5倍的最极端观察值；空心圆表示在所述范围外部的值。
图7：在处理第42天时的下丘脑(crf)、垂体远侧部(pomc)、和肾间组织(star)基因(平均标准化表达-MNE)的分析。框图中的虚线与图6中相同定义。
图8：在处理42天之后鳃中atplala的基因表达(MNE)。框图中的虚线与图6中相同定义。
图9：处理21和42天之后的个体发育的鳞片中的皮质醇(pmol/鳞片)(CCα＝判定限并且CCβ＝检测能力)。由于展示原因，在框图中省略了第42天的STRESS的一个值(2.8pmol/鳞片)。框图中的虚线与图6中相同定义。
图10：个体发育和再生鳞片的相对collal表达(MNE)相对于血浆皮质醇(nM)的袋状图(bagplot)。袋含有全部观察值的50％。插图表示21天时的再生鳞片中的皮质醇(pmol/鳞片)。框图中的虚线与图6中相同定义。
图11：在处理第42天时的皮质醇(nM)、葡萄糖(mM)、总钙(mM)、和同渗质量摩尔浓度(mOsmol kg-1)的血浆分析。观察值的百分之五十在框的下边缘和上边缘(第一和第三四分位数)之间出现，并且虚线从框延伸至不大于四分位数间范围的1.5倍的最极端观察值；空心圆表示在所述范围外部的值。
图12：处理21和42天之后的个体发育的鳞片中的皮质醇(pmol/鳞片)(CCα＝判定限并且CCβ＝检测能力)。框图中的虚线与图11中相同定义。
图13：处理21天的再生鳞片中的皮质醇(pmol/鳞片)(CCα＝判定限并且CCβ＝检测能力)。框图中的虚线与图11中相同定义。
发明描述
本发明涉及在鳞片中获取了鱼类中的糖皮质激素分布(profile)，以及这些真皮骨板中的糖皮质激素水平反映鱼类随时间经历的应激程度的时间整合的样品的研究结果。鳞片实际上被认为是用于鱼类中慢性应激监测的理想基质，因为鳞片容易以非侵入性方式取样并且因为鳞片允许方便的样品制备以用于进一步量化所述鳞片中的糖皮质激素水平。本发明因此涉及用于量化鱼鳞中糖皮质激素如皮质醇以评估长时间段期间鱼类对应激的暴露的准确、精确和稳健的方法。
更具体地，本发明涉及一种用于量化鱼中慢性应激水平的体外方法，所述方法包括：
-从所述鱼中获得至少一个鳞片，
-从所述鳞片中萃取糖皮质激素，
-将从所述鳞片中萃取的糖皮质激素纯化，
-量化所述纯化的糖皮质激素，和
-将所述量化的糖皮质激素与慢性应激水平相关联。
术语“糖皮质激素”，当(骨)鳞采自属于真骨鱼类(Teleostei)次纲的鱼类(Pisces)时意指皮质醇，和/或当(硬鳞鱼)鳞采自属于软骨鱼纲(Chondrichtyes)的鱼类时意指皮质酮，和/或当额外需要检测可能的额外肾间(extra-interrenal)通路时意指皮质醇的前体如17α-羟基孕酮和/或11-脱氧皮质醇和/或皮质酮的前体如11-脱氧皮质酮，和/或意指皮质醇的代谢物如可的松、Reichstein’s U(或20-二氢可的松)、四氢皮质醇和/或四氢可的松和/或皮质酮的代谢物，因为这些代谢物可以影响鳞片中的糖皮质激素水平从而额外需要对它们的检测。
以上指出的糖皮质激素的化学结构如下45：
-皮质醇或11β，17α，21-三羟基孕-4-烯-3，20-二酮：
-皮质酮或11β，21-二羟基-4-孕烯-3，20-二酮：
-17α-羟基孕酮或17α-羟基孕-4-烯-3，20-二酮：
-11-脱氧皮质醇或17α，21-二羟基孕-4-烯-3，20-二酮：
-11-脱氧皮质酮或21-羟基孕-4-烯-3，20-二酮
-可的松或17α，21-二羟基-孕-4-烯-3，11，20-三酮：
-Reichstein′s U或20-二氢可的松或17a，20，21-三羟基-孕-4-烯-3，11-二酮：
-四氢皮质醇或3α，11β，17α，21-四羟基-5β-孕烷-20-酮：
-四氢可的松或3α，17α，21-三羟基-5β孕烷-11，20-二酮：
因此，本发明涉及如在此描述的方法，其中所述糖皮质激素是皮质醇、17α-羟基孕酮、11-脱氧皮质醇、皮质酮、11-脱氧皮质酮、可的松、Reichstein’s U、四氢皮质醇和/或四氢可的松。作为被认为反映硬骨鱼类中应激反应的经典参数，皮质醇被释放至血流中使得结合入钙化结构中成为可能，并且因此是用于慢性应激研究的首要靶标分析物。在所述方法中包括其前体17α-羟基孕酮和11-脱氧皮质醇以阐明可能的额外肾间通路的存在。因为鱼类中的额外肾间通路的存在目前是未知的，但是因为在人类中存在额外肾上腺通路的迹象46，出于将来的研究目的，在所述方法中并入两种分析物。这种通路的存在可能对我们对HPI轴和因此对应激的理解具有深远的影响。在所述方法中还包括代谢物可的松、Reichstein’s U、四氢皮质醇和四氢可的松，因为在水中的外源糖皮质激素(来自其他鱼类、人类活动等)可以充当可能影响鳞片中糖皮质激素分布的内分泌干扰剂。
术语“鱼类”基本上意指具有鳞片的任何带有鳃的、有头类水生动物，但是具体是指属于软骨鱼(Chondrichtyes)(软骨鱼类(cartilaginous fish))的分类学纲或属于真骨鱼类(Teleostei)(硬骨鱼(bony fish))的分类次纲的鱼类。
本发明还具体涉及如上所述的方法，其中所述鱼类属于真骨鱼类次纲。
更具体地，本发明涉及如上所述的方法，其中所述属于真骨鱼类次纲的鱼类是属于下列各项的鱼类：狼鲈科(Moronidae)(例如欧洲海鲈鱼(European Sea bass))、鲷科(Sparidae)(例如海鲷鱼(Sea breams))、鳎科(Soleidae)(例如鳎鱼(Solea solea)和塞内加尔鳎鱼(Solea senegalensis))、鲑科(Salmonidae)(例如，鲑鱼、鳟鱼)、所谓的石首鱼(Kingfish)(例如黄尾石首鱼)、鲭科(Scombridae)(例如金枪鱼)、鳕科(Gadidae)(例如鳕鱼)、鲤科(Cyprinidae)(例如常见的鲤鱼、锦鲤)、和丽鱼(cichlid fish)(例如莫桑比克以及尼罗河罗非鱼)。
术语“鳞片”意指通常发现于鱼皮中的真皮骨板，其显示出依赖于生长的同心环或圆环。更具体地，术语“鳞片”是指如在真骨鱼类中发现的“骨鳞(elasmoid scale)”并且是指如在软骨鱼中发现的“硬鳞(ganoid scale)”。
鱼类中的术语“慢性应激”意指归因于处理、差的水质、饲养密度、捕食和多种其他人类因素如风车、船只交通、触摸等随时间累积并且反映长期的和应激性状态的应激。慢性应激因此是鱼类不能完全恢复的长期状态。应激因素以及在内分泌水平、免疫系统或功能水平出现的变化的直接作用可以是造成降低所述鱼类的福利的(前)病理后果的原因。
术语“从鱼中获得鳞片”意指用例如细镊子从所述(活的或死的)鱼的皮肤移除至少一个鳞片。所述鳞片可以取自所述鱼的身体的任何部分：即，背部、颅腹部(cranioventral)、中腹部(medioventral)、尾部、左或右侧等。为了使本发明的方法标准化，从胸鳍背侧的中背腹区域取鳞片。因为被移除的鳞片在短时间内重新生长，因此这种非侵入性的样品收集方式对鱼类没有影响。这些再生的鳞片被证实展现出在经历的应激方面相同的糖皮质激素的结合分布，并且本身提供了额外的工具以在充分限定的时间期限内量化慢性应激。
因为单个鳞片的重量取决于鱼种类，以及取决于鱼的年龄，并且在幼鱼中是较小的鳞片，所需的鳞片的数量取决于这两种因素。由于这种原因，使用相当于例如100mg的鳞片的标准化的量的鳞片将本发明的方法标准化，尽管试验指出也可以使用较小的量(如80、60、40、20、10、5、1mg等的鳞片)。相当于100mg的鳞片的鳞片的数量通常为约40至80个鳞片，如60个鳞片，但是应当清楚的是，考虑如上所述的两种因素，可以使用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或多个鳞片进行本发明的方法。
本发明因此还涉及如上所述的方法，其中所述从所述鱼中获得至少一个鳞片是从所述鱼中获得40至80个之间的鳞片。
术语“从所述鳞片萃取糖皮质激素”涉及任何从所述鳞片分离/萃取糖皮质激素的方法。本发明的典型但是非限制性的萃取方法包括将糖皮质激素从水相萃取至有机相中。例如可以使用的萃取溶剂是甲醇、2-丙醇、乙腈、二乙醚等。然而，甲醇是优选的溶剂。
因此，本发明涉及如上所述的方法，其中所述萃取糖皮质激素通过加入甲醇作为萃取溶剂进行。本发明的萃取的实例如下：将均化的鳞片样品0.1g±0.001g称重至10ml试管中。随后，添加8ml甲醇作为萃取溶剂并且添加10μL的0.5μg L-1的皮质醇-d4溶液作为内部标准品。将样品涡旋混合30s，在室温下置于60rpm的架空摇床上1h，并且以3500g在7℃离心10分钟。取全部上清液，在氮下在60℃使用氮蒸发器蒸发干燥，并且在5ml H2O/MeOH(80∶20；v/v)中重构以用于随后的固相萃取(SPE)。
术语“将从所述鳞片中萃取的糖皮质激素纯化”涉及任何使得本发明的糖皮质激素纯或者更纯以及浓或更浓和/或尽可能多地消除杂质的方法。
更具体地，本发明还涉及如上所述的方法，其中所述用甲醇萃取之后进行SPE(固相萃取)。本发明的纯化步骤的非限制性实例如下：在用3ml甲醇接着3ml超纯水调节C18SPE柱之后，加载如以上得到的样品。将柱用4.5ml H2O/MeOH(65∶35；v/v)洗涤并且将残留的化合物用2.5ml H2O/MeOH(20∶80；v/v)洗脱至10ml试管中并且在氮下在60℃使用氮蒸发器蒸发干燥。最终在小瓶中将样品在100μL H2O/MeOH(80∶20；v/v)中重构并且借助与串联质谱法偶联的超高效液相色谱法(UPLC-MS/MS)进行分析。
术语“量化所述纯化的糖皮质激素”是指任何确定在如上所述的在萃取/纯化之后得到的糖皮质激素的量的方法。
更具体地，本发明涉及如上所述的方法，其中所述萃取和纯化的糖皮质激素的量化通过与串联质谱法偶联的液相色谱法((U)HPLC-MS/MS)47-48、与紫外线检测偶联的高效液相色谱法(HPLC-UV)和与二极管阵列检测偶联的高效液相色谱法(HPLC-DAD)49-50、或与荧光检测偶联的高效液相色谱法(HPLC-FL)51-52、气相色谱法(GC)53-54、(放射性)(酶)免疫测定(RIA)55-56(EIA)57-58或基于传感器的技术59-60进行。
本发明还涉及如上所述的方法，其中所述与串联质谱法偶联的液相色谱法是超高效液相串联质谱法。
更具体地，本发明涉及如上所述的方法，其中所述免疫测定是放射性免疫测定或酶免疫测定。
术语“将所述量化的糖皮质激素与慢性应激水平相关联”是指应激的硬骨鱼产生被释放至血流中的皮质醇的事实。当这种应激负荷时间延长时，皮质醇在这个延长的时间段内在血液中循环。考虑到鳞片的结构，特定百分比的这种生物活性和自由循环的皮质醇结合至鳞片中。在鳞片随时间生长时，这随时间提供了量化皮质醇以及因此量化应激负荷的机会。了解到这一点，可以分析暴露于不同应激负荷的鱼类的鳞片的糖皮质激素。例如，暴露于较小应激负荷的鱼类(即，每2天限制(confinement)在减小的体积(如“原始”体积的25％)30分钟)具有1.70μg kg-1的平均皮质醇量，而在高度应激的鱼类(即，每2天限制在10体积％30分钟，+追捕5分钟，+每周一次空气暴露1分钟)中，平均皮质醇量为3.44μg kg-1。
本发明因此基本上涉及从鱼中取样的鱼鳞用于测定或量化所述鱼的慢性应激水平的用途。
本发明涉及如上所述的用途，其中所述量化/测定通过根据上述方法的方法进行。
鳞片是用于慢性应激量化的最重要基质，因为它们以非侵入性方式收集的。然而，在某些情况下，可以使用其他钙化基质如耳石、脊和鳍条，以及用于慢性应激量化的基质。后一种量化可以以与以上对于鳞片描述的相同的方式进行。具体地，将脊和鳍条用剪子剪断并且通过将它们切成小块进行均化，而将耳石用手术刀移除并且通过使用研钵研磨进行均化。
软鳍条是柔性的、区段化的，并且在通过将新的区段加入至尖端而延长的远端部分支。脊不是区段化的而是与基部融合并且展现出连续生长。耳石是内耳中平衡器官的一部分并且主要由霰石(aragonite)形式的结晶碳酸钙和被称为otoline的纤维状、胶原蛋白状蛋白质组成。当不存在身体生长时，它们显示出径向沉积并且维持的可容易辨识的每日增量。软鳍条和鳞片当它们损失或受损时可以迅速重新生成。
本发明因此还涉及从鱼中取样的其他钙化基质如脊、鳍条或耳石用于量化所述鱼的慢性应激水平的用途。
本发明因此还涉及一种用于量化鱼中慢性应激水平的体外方法，所述方法包括：
-从所述鱼中获得至少一个脊、鳍条或耳石，
-从所述脊、鳍条或耳石中萃取糖皮质激素，
-将从所述脊、鳍条或耳石中萃取的糖皮质激素纯化，
-量化所述纯化的糖皮质激素，和
-将所述量化的糖皮质激素与慢性应激水平相关联。
现在将通过以下非限制性实施例说明本发明。
实施例1：用于量化欧洲海鲈鱼(Dicentrarchus labrax)的鳞片中糖皮质激素的 UPLC-MS/MS方法的开发和验证
方法和材料
仪器、材料、和试剂
在Acquity UPLC-MS/MS Premier XE上使用Acquity Ultra Performance LC BEHC18(1.7μm；2.1x100mm)柱(Waters，Milford，美国)进行色谱分析。将样品用TurbovapTM氮蒸发器(Biotage，瑞典)蒸发干燥。从Grace Davison Discovery Sciences(Lokeren，比利时)获得用于固相萃取(SPE)的Grace PureTM SPE C18-Max(500mg、6ml)柱。从VWRInternational BVBA(Leuven，比利时)获得作为萃取溶剂的高效液相色谱法(HPLC)-梯度级甲醇(Hipersolv Chromanorm)，同时使用来自Biosolve BV(Valkenswaard，荷兰)的无水甲醇LC-MS以及甲酸ULC-MS级和来自Millipore(Billerica，美国)的Milli-Q梯度Q-Gard 2的超纯水作为流动相溶剂。
化合物、标准品、和溶液
仅使用具有分析许可的产品。皮质醇、可的松、17α-羟基孕酮、和11-脱氧皮质醇来自Sigma-Aldrich(Diegem，比利时)。四氢皮质醇和四氢可的松来自Sequoia ResearchProducts Ltd(Pangbourne，英国)。使用来自CDN Isotopes(Pointe-Claire，加拿大)的皮质醇-d4作为内部标准品。
在甲醇中制备1mg mL-1的全部化合物和内部标准品的单独的储存标准溶液并且在4℃储存。通过将10μl的0.5μg L-1的皮质醇-d4溶液分别添加至0.5μL、1μL、2.5μL、5μL、和10μL的在100μLH2O/MeOH(80∶20；v/v)中的1μg L-1标准溶液，分别制备在0.005mg L-1至0.1mgL-1范围内的校准标准品。在使用100mg的样品时，这对应于在基质中5μg kg-1至100μg kg-1的范围。
取样
从使用2-苯氧乙醇深度麻醉并且通过脊髓横切杀死的处死欧洲海鲈鱼(Dicentrarchus labrax)中取样全部钙化结构。所有鱼重约100g。用细镊子将来自胸鳍背侧的左中背腹区域的六十个鳞片从皮肤移除。使用剪子从尾鳍获取四根背脊和六个软鳍条。从打开的头颅中取两个矢状(sagittal)耳石。将所有样品用超纯水冲洗并且在室温下在面巾纸上风干。
样品制备
使用剪子将鳞片、脊、和软鳍条切成细块。将耳石在研钵中研磨。将剪子和研钵用乙醇冲洗，接着用超纯水冲洗，并且用面巾纸干燥。将均化的样品0.1g±0.001g称重至10ml试管中。随后，添加8ml甲醇作为萃取溶剂并且添加10μL的0.5μg L-1的皮质醇-d4溶液作为内部标准品。将样品涡旋混合30s，在室温下置于60rpm的架空摇床上1h，并且以3500g在7℃离心10分钟。取全部上清液，在氮下在60℃使用氮蒸发器蒸发干燥，并且在5ml H2O/MeOH(80∶20；v/v)中重构。在用3ml甲醇接着3ml超纯水调节C18SPE柱之后，加载样品。将柱用4.5ml H2O/MeOH(65∶35；v/v)洗涤并且将残留的化合物用2.5ml H2O/MeOH(20∶80；v/v)洗脱至10ml试管中并且在氮下在60℃使用氮蒸发器蒸发干燥。最终在小瓶中将样品在100μLH2O/MeOH(80∶20；v/v)中重构并且借助UPLC-MS/MS进行分析。
LC-MS/MS分析
使用流动相A和B的梯度洗脱将糖皮质激素分离。流动相A是超纯水与0.1％甲酸的混合物，而流动相B是甲醇与0.1％甲酸的混合物。最初，以20％(v/v)的流动相B开始梯度洗脱。随后，在1.5分钟时将流动相B增加至56％，在6.5分钟时增加至63％，在7.5分钟时增加至99.1％，之后将其保持在99.1％至8分钟，并且最终在9分钟时减小至20％并且以这种方式保持至10分钟。将流量保持恒定在0.4ml分钟-1，得到了10分钟的运行时间。将样品在7℃在自动取样器中冷却。将注射体积设定为40μL，同时将柱温维持在30℃。
在以多反应监测(MRM)模式使用的质谱仪上进行色谱分析从而实现最佳灵敏度和选择性。对于每个靶标分析物，测定两个前体片段离子跃迁。通过以10μL min-1的流量直接输注在甲醇+0.1％甲酸中的10μg L-1标准溶液来优化仪器参数。两个前体片段离子跃迁的使用允许测定两个跃迁之间的比率，其与相对保留时间一起用于根据CommissionDecision No.2002/657/EC61的要求鉴别和确认每个分析物的特性。质谱仪以正离子电喷雾离子化模式(ESI+)使用。所有化合物作为其质子加合物[M+H]+进行分析。将MS检测器设置设定为以下值：120℃的源温度，在800L h-1的气流下300℃的去溶剂化温度，50L h-1的锥孔气流，和3kV的毛细管电压。在1.11.10-2毫巴的压力下使用氩作为碰撞气体。在表1中给出了具有所有化合物的保留时间、前体离子、产物离子、锥孔电压、和碰撞能量的指标的优化的UPLC-MS/MS条件。
表1.每个化合物的优化的UPLC-MS/MS条件
使用来自Waters的Quan/Targetlynx软件进行数据分析；分析结果报告为值(μgkg-1)±扩展的测量不确定度(μg kg-1)以及2的包含因数(k)(95％置信区间)。
验证
通过分别集中(pooling)来自在相似条件下饲养的51、51、57、和118只鱼的鳞片、脊、软鳍条、和耳石来制备每种钙化结构的验证样品。不存在认证的参考材料、实验室间比较试验或任何其他用于上述分析物/基质组合的验证方法，并且因此使用向验证样品的标准添加来完成验证。对于每种钙化结构，对在1至50μg kg-1范围内的五个浓度水平测试五次，并且其在一个月的时间段内的四个不同日期在内部再现性(intra-reproducibility)条件下重复，即由两个人使用不同溶液和一个UPLC-MS/MS系统。所有验证实验由授权人员在具有校准的设备和受控溶液的受控环境中根据标准EN ISO/IEC 17025：2005的要求进行62。使用由不同校准标准品、空白、阴性和阳性对照(均在稀释剂中)组成的标准化工序完成分析。通过评估化合物和片段的(相对)保留时间和相对离子强度来评价每种化合物的结果。根据Commission Decision No.2002/657/EC的要求测定和评价所有验证参数：真实性、精确度、工作范围、线性度、判定限(CCα)、检测能力(CCβ)、灵敏度、和选择性。
在内部再现性条件下测定所有化合物的表观回收率以及精确度(可重复性和实验室内再现性)，对于每个浓度水平得到20个分析，以及每种化合物和基质总计100个分析。由于低浓度水平，进行Dixon异常值检验63以及Grubbs64检验以检测可能的异常值。判定限(CCα)以校准曲线的截距加2.33倍实验室内再现性的标准差计算(α＝1％)，而检测能力(CCβ)以CCα的浓度加1.64倍实验室内再现性的标准差计算(β＝5％)。扩展测量不确定度基于真实性和实验室内再现性的验证数据并且使用两种不同的方法，通过线性加和和通过二次加和或Nordtest法测定。此外，在方法进行期间监测方法的稳健性和分析物在稀释剂中以及在基质中的稳定性。最终，通过线性加和以及通过二次加和或Nordtest法47-52测定扩展测量不确定度(在文献中对优选方法不一致)。
结果
鱼鳞中的皮质醇、其前体17α-羟基孕酮和11-脱氧皮质醇、可的松和关键代谢物四氢皮质醇和四氢可的松的UPLC-MS/MS量化方法在EN ISO/IEC 17025：2005认证环境中进行并且根据Commission Decision No.2002/657/EC的要求验证。作为被认为在大多数鱼类中反映应激反应的经典参数，皮质醇被释放至血流中使得结合入钙化结构中成为可能，并且因此是用于慢性应激研究的靶标分析物。在分析中包括其前体17α-羟基孕酮和11-脱氧皮质醇以涵盖对可能的额外肾间通路的检测。还包括代谢物四氢皮质醇和四氢可的松，因为外源糖皮质激素(在水中)可以起内分泌干扰剂的作用并且影响所研究的钙化结构的糖皮质激素分布。还针对脊、软鳍条、和耳石测试和验证了所述方法。说明了鳞片取样的便利性。
方法开发
取样和样品制备
对于每种钙化结构，确定用于取样的位置。鳞片是后变态发育鱼类中的中胚层骨元件。在从鱼的各个侧边(例如，背部、颅腹部、中腹部、或尾部)取的鳞片中，或者从左侧和侧选取的鳞片之间，没有发现皮质醇含量的差异。应当避免侧线的鳞片，因为它们结构上不同。处于容易程度和将来研究的目的(考虑到水产养殖中的适用性)，鳞片选自胸鳍背侧的中背腹区域。其中发现海鲈鱼中的脊在第一背鳍的颅部中(8至10根脊)。脊不是区段化的，而是在基部融合南区因此比软鳍条更具刚性。在脊中在其需要在该组织中随时间更好地精细调节皮质醇结合的基部发现了较高浓度的糖皮质激素。此外，除了远端部之外的所有脊均被上皮覆盖。在从背部、颅腹部、中腹部、和尾部的鳍中取的软鳍条中，没有发现皮质醇含量的差异。考虑到水产养殖中的适用性，软鳍条选自尾鳍。选择矢状耳石，因为它们最大并且最容易移除。
就逻辑可行性和分析性能的最佳组合而言，通过掺加不同量的样品(即来自相同的鱼的不同数量的鳞片、脊和软鳍条，以及5μg kg-1的靶标分析物)对每种钙化结构确定用于分析的基质的最佳的量。在图3中给出了鳞片、脊和软鳍条的结果。考虑到将来在水产养殖和野生中的适用性，选择0.1g的每种钙化结构用于验证。
图3.针对用于验证的鳞片、脊和软鳍条的基质的最佳量
为了移除已知含有内源65以及外源糖皮质激素的黏液，用超纯水对所有样品进行强力洗涤。
测试四种具有不同萃取效率的溶剂：甲醇、2-丙醇、乙腈、和二乙醚。对于鳞片以及脊和软鳍条中各种糖皮质激素，甲醇得到最佳结果；在耳石中，溶剂之间没有看到明显的差异(数据未示出)。
接下来，测试利用甲醇温育的时间依赖性(15、60、120min和16h)以及重复萃取。对于鱼鳞中的皮质醇来说，在温育60min之后没有看到萃取的改善。没有看到第二次萃取的改善，也没有看到15min 2次循环的组合(相对于60min的1次循环)的改善。在图4中给出了鳞片、脊、和软鳍条的结果。
图4.鳞片、脊和软鳍条中皮质醇的萃取时间和重复的优化
因为需要高通量和成本有效的方法，将鳞片中的萃取用8ml甲醇在架空摇床上在室温下标准化1h。
SPE操作
C18相SPE筒成功用于从生物样品如血浆66、尿液67、排泄物68中萃取糖皮质激素，并且因此选择这种柱类型以优化本研究中来自钙化结构的所选糖皮质激素的萃取和纯化。
Grace PureTMSPE C18-Max(500mg、6ml)柱是在二氧化硅系支持物上具有聚合结合的17.1％碳负载的反相吸附剂。选择反相萃取操作，是因为其以适度的极性与来自极性样品基质的非极性化合物结合。500mg的床尺寸得到25mg的吸附保持容量。考虑到鳞片中以及其他钙化结构中糖皮质激素的预测的浓度范围，这种保持容量将足以结合所有目标分析物。针对溶剂类型和体积优化SPE的调节、样品加载、洗涤、和洗脱步骤。利用3ml甲醇以活化吸附剂配体接着利用3ml超纯水以平衡吸附剂床的调节步骤得到了最佳结果(皮质醇的平均回收率＞90％)。对于两种溶剂来说最小体积为2.5ml，而使用超过3ml的体积的试验未改善纯化。其中将蒸发的样品在5ml H2O/MeOH(80∶20；v/v)中重悬的样品加载步骤得到了最佳结果。在其中超纯水和/或甲醇的比例变化的溶剂组合得到了非最佳的结果。对于糖皮质激素回收率来说，利用4.5ml H2O/MeOH(65∶35；v/v)的柱的洗涤得到了最佳结果。较高的甲醇浓度导致糖皮质激素的洗脱，而较低的甲醇浓度引起噪声的增加。将残留的化合物用2.5ml H2O/MeOH(20∶80；v/v)洗脱至10ml试管中。分别地，较低的洗脱体积或超纯水的增加未回收所有的糖皮质激素，而就成本有效性而言，并且因为其从基质洗脱更多的干扰化合物，较高的洗脱体积或甲醇的增加是非最佳的。在蒸发之后，在小瓶中将样品在100μL H2O/MeOH(80∶20；v/v)中重构并且借助LC-MS/MS进行分析。选择在100μL中重构以具有双倍(duplo)注射的可能性。在其中超纯水与甲醇的比例改变的溶剂组合得到了非最佳的结果，因为优化了用于色谱分析的梯度从而以H2O/MeOH(80∶20；v/v)开始。在高达H2O/MeOH(20∶80；v/v)的浓度中的重构是可能的，但是对色谱峰的形状具有负面影响。
色谱分析
在使用Acquity Ultra Performance LC BEH C18(1.7μm；2.1x100mm)柱优化色谱分析的第一步中，使用质谱仪以正离子(ESI+)和负离子(ESI-)电喷雾离子化模式调节所有化合物以及内部标准品。在ESI-中得到的结果得到了小峰但是较少的噪声，而ESI+得到了整体上更好的结果并且选择其用于进一步测试。
在第二步中，测试使用超纯水和非极性溶剂如甲醇和乙腈连同0.1％甲酸的不同梯度体系。首先，测试使用超纯水和乙腈的梯度：较高的乙腈起始浓度得到了较短的保留时间并且仅看到皮质醇、可的松和17α-羟基孕酮的分离；运行缓慢增加乙腈浓度的梯度导致了17α-羟基孕酮峰的丧失，以及12min的运行时间，使得乙腈不适合作为流动相。随后，测试使用超纯水和甲醇的梯度：在运行甲醇浓度从缓慢到非常快速增加范围内的不同梯度之后，所有化合物完全分离并且测试不同添加剂的可变浓度。使用0.5％乙酸得到了比pH 3.0的2mM甲酸铵或pH 5.0的乙酸铵更好、但是比0.1％甲酸差的结果。随后，优化甲酸的浓度并且选择0.1％甲酸；归因于来自使用其他添加剂的方法的遗留物(carry-over)，较低的甲酸浓度导致不稳定的结果。最终，分别将柱温和流量优化为30℃和0.4ml min-1，以具有10min的总运行时间。
在最后一步中，优化MS/MS方法：针对最佳灵敏度增加驻留时间以确保横跨所有化合物的每个离子的峰的点由至少20个数据点组成并且因此优化MS框架窗口。
验证
在公开的文献中不能得到鳞片(或任何其他钙化结构)中的糖皮质激素的浓度值，这使得我们选择在1μg kg-1至50μg kg-1范围内的初步工作。
低于、等于和高于CCβ水平的鱼鳞中皮质醇的表观回收率范围为88.14％至98.85％，全部在根据Commission Decision No.2002/657/EC的要求的80％至110％性能标准内。无需考虑集中的验证样品的均质化不是最佳的(即，其不是均匀的粉末，而是一滩非常细的碎片)的事实，鱼鳞中的皮质醇的可重复性范围为12.36％至17.15％。实验室内再现性范围为14.63％至20.02％。在表2中给出了鱼鳞中被分析的化合物的真实性、精确度和测量不确定度的结果。
表2：鱼鳞中所有化合物的真实性的值(表观回收率AR，百分数)、精确度(可重复性CVr和实验室内再现性CVR)的变化值系数(CV，百分数)和扩展测量不确定度(U，百分数)
1使用线性加和分别利用2(95％置信区间)和3(99％置信区间)的包含因数(k)的扩展测量不确定度的计算
2使用二次加和(Nordtest法)利用2的包含因数(k)(95％置信区间)的扩展测量不确定度的计算
3对合格离子的不足的反应
因为在将来的研究中基质匹配的校准曲线实际上是不可行的，对于每种钙化结构中的所有化合物，通过比较在5μg kg-1至50μg kg-1范围内的从稀释剂中的校准曲线到基质匹配的校准曲线的数据来确定可能的基质影响。图5表明对于鱼鳞中的皮质醇没有明显影响(考虑到样品的生物学变异)，但是因为稀释剂和基质中的校准曲线通常是分开的，使用稀释剂中的校准曲线的量化是可能的。
图5.在稀释剂中和在用于鱼鳞中的皮质醇的基质中的校准曲线
随后，使用由在5μg kg-1至100μg kg-1范围内的五个校准点组成的稀释剂中的四倍校准曲线测试每种钙化结构中的所有化合物的反应的线性度，在实验室内再现性条件下分析。当在该范围内评估线性度时，对于所有化合物来说，未发现低于0.99的判定系数(R2)值。此外，计算的模型对于所有化合物表现出正态分布。在表3中给出鱼鳞中所有化合物的线性度、CCα，和CCβ的结果。
表3：鱼鳞中所有化合物的校准曲线的判定系数(R2)以及判定限(CCα，μg kg-1)和检测能力(CCβ、μg kg-1)的值
通过对空白基质样品制备稀释系列来确定方法的灵敏度，当考虑到预测的工作范围时，得到了对鱼鳞中的所有化合物具有良好灵敏度的方法。通过分析空白和掺加的样品证实了方法的选择性。在掺加的样品中，所有化合物在预测的保留时间出现，伴随它们的两个离子跃迁。将离子比与标准注射比较，并且发现其根据Commission Decision No.2002/657/EC的要求是可接受的。此外，未观察到干扰峰。
在方法开发期间通过改变最佳值针对所有重要步骤如萃取和SPE纯化测试方法的稳健性。
对于鱼鳞中的皮质醇、其前体(17α-羟基孕酮和11-脱氧皮质醇)、可的松和代谢物(四氢皮质醇和四氢可的松)的UPLC-MS/MS方法在EN ISO/IEC 17025：2005认证环境中开发并且根据Commission Decision No.2002/657/EC的要求验证，并且被证实适用于其预期的目的。此外，针对三种其他钙化结构，即脊、软鳍条和耳石，测试和验证所述方法。
实施例2：应激的与未应激的海鲈鱼(Dicentrarchus labrax)的鳞片中糖皮质激 素水平的量化
方法和材料(参见实施例1)
实验设置
试验存在3个条件的2次重复：对照(低应激、中应激和高应激)。应激是在3周的时间段期间随机施用的各种类型应激物(拥挤、追捕和空气暴露)的组合。在一天的多个不可预测的时刻，如指出的施用应激物：
·低应激：每2天限制(25体积％)30min
·中应激：每2天限制(25体积％)30min，追捕5min
·高应激：每2天限制(10体积％)30min，追捕5min，每周一次空气暴露1min
根据Gorissen等人69使用RIA在96孔板中一式两份测量血浆皮质醇。一抗显示与皮质醇100％的交叉反应性，与11-脱氧皮质醇0.9％的交叉反应性，与皮质酮0.6％的交叉反应性，和与11-脱氧皮质酮、孕酮、17-羟基孕酮、睾酮和雌二醇＜0.01％的交叉反应性。除了“非特异性孔(non-specifics)”之外的所有孔接收100μl皮质醇抗体(皮质醇抗体[xm210]单克隆和纯化的IgG(Abcam)；在50mM NaHCO3、50mM NaH2CO3、0.02％NaN3，pH＝9.6中1∶2000)并且在4℃温育过夜。之后一天，将板用200μl/孔的洗涤缓冲液(100mM Tris、0.9％NaCl、0.02％NaN3)洗涤三次。随后，通过向每个孔添加100μl封闭缓冲液(100mM Tris、0.9％NaCl、0.02％NaN3、0.25％普通牛血清)来封闭非特异性位点。将板覆盖并且在37℃温育一小时。随后，将10μl标准品(4pg-2048pg皮质醇/10μl含有100mM Tris、0.9％NaCl、0.1％8-苯胺基-1-萘磺酸、0.02％NaN3的测定缓冲液)或10μl未稀释的血浆或灌流介质添加至指定孔。非特异性孔和B0接收10μl测定缓冲液。在添加标准品和样品之后，将90μl(333Bq)的3H-氢化可的松(PerkinElmer，美国，在测定缓冲液中1∶10，000)溶液添加至所有孔。将板在室温下温育四小时，或者在4℃储存过夜。之后将板用洗涤缓冲液洗涤三次。在最终的洗涤步骤之后，所有孔接收200μl的“Optiphase hisafe-3闪烁液体”(PerkinElmer，美国)并且将其覆盖。使用Microbeta Plus(Wallac/PerkinElmer，美国)通过3min计数/孔量化β发射。内和外测定变化分别为12.5和3.5％。
结果
实施例3：鲤鱼(Cyprinus carpio L.)的鳞片中糖皮质激素水平的量化
方法和材料(还参见实施例1并且进一步)
实验设置
利用鲤鱼的试验存在4个条件的2次重复，各自具有6条鱼：对照(未应激的)、地塞米松(dexamethasone)(应激通路的抑制)、皮质醇(应激通路的活化)和通过以随机施用方式提供6周的各种应激物诱导的应激。
方法
实验步骤根据荷兰法规并且由当地伦理委员会批准。在Nijmegen的Radboud大学饲养常见的鲤鱼(Cyprinus carpio L.)以确保历史。将维持在12∶12h光亮∶黑暗下、每天以体重的0.9％喂食2餐(09.30am和15.30pm)的生长中的成年鱼(在第21天时：340±92g和24.6±2.4cm；在第42天时：377±108g和25.4±2.5cm)在20.0±0.4℃保持6周。分别设置四组，每组2个重复的箱，每个140-L箱6只鱼。留下CTR组的鱼不受打扰。DEX和CORT组接收以500mg kg-1掺加的饲料。使STRESS组每天应激一次；应激物的类型、持续时间和时机随机应用并且包括：网捕(15-60min)、空气暴露(1-3min)、温度下降(高达5℃)、追捕(高达10min)和限制(在具有低水位的桶中)。在整个实验期间，没有注意到受损害的健康和行为的迹象。在42天之后，将鱼在2-苯氧基-乙醇(0.1％v/v)中麻醉并且处死，从尾部血管取血并收集鳞片(个体发育的和21天再生的鳞片)。分析血浆的皮质醇69、葡萄糖70、乳酸盐70、总钙71、和同渗质量摩尔浓度70。从侧线背侧的标准化的排对鳞片进行取样。使用eeflal rps5和β-肌动蛋白作为参比基因评估靶基因的MNE72。使用线性混合模型在SAS 9.4(SAS InstituteInc.，Cary，NC)中以处理、取样日期和它们的相互作用(在适当时)作为固定影响对所有参数建模。在模型中引入箱的随机截距以校正鱼在箱中的聚集。进行Dunnett检验以将处理组与对照比较。
结果
1)原理的控制和实验设置的执行
在6周的试验期间，我们比较了不受打扰的(CTR)和每日应激的(STRESS)鲤鱼。地塞米松(DEX)或皮质醇(CORT)喂食的鱼类分别充当对于鳞片中结合皮质醇的阴性和阳性对照。在所有处理中，所提供的喂食量在5分钟内消耗，如通过条件因素73表明的，所有鱼保持临床健康，并且未观察到死亡。通过每日(pH、温度、溶解氧)或每周(亚硝酸盐、硝酸盐、铵)监测维持足够的水质。可以排除水性糖皮质激素(作为从饲料泄漏的结果)对所观察到的效果的影响。借助内部开发和验证的(参见鳞片皮质醇)超高效液相色谱法串联质谱法(UPLC-MS/MS)分析皮质醇、其前体和代谢物，揭示在喂食之后2.5h内水中提高的皮质醇浓度恢复至基线。
通常用作应激指标的五个血液参数的结果确认，可以分别认为DEX鱼类是阴性对照并且CORT鱼类是阳性对照(图6)。血浆皮质醇在CORT组(CORT相对于CTR：P＜0.0001)中提高，确认了皮质醇从饲料吸收到血液中；在STRESS鱼中，皮质醇水平与阴性对照没有区别，表明了后者不适用于慢性应激评估。次要应激参数血浆葡萄糖(反映了预测的糖皮质激素作用(糖原异生))在DEX(DEX相对于CTR：P＜0.0001)中增加，而CORT(CORT相对于CTR：P＝0.2004)和STRESS(STRESS相对于CTR：P＝0.0531)没有显著差异，与DEX的更强效的作用一致。血浆乳酸盐在DEX(DEX相对于CTR：P＜0.0001)和CORT(CORT相对于CTR：P＝0.0004)中增加，但是在STRESS(STRESS相对于CTR：P＝0.4224)中不显著，与DEX和CORT的下游效应一致。血浆总钙和同渗质量摩尔浓度不受影响，表明处理未超过鱼类的恢复力(resilience)并且不产生痛苦(distress)。我们得出结论：(i)CTR、DEX和CORT处理引起了预期的糖皮质激素作用；(ii)在STRESS鱼类的血浆中，没有观察到HPI轴的活化的迹象；(iii)血浆参数是慢性应激的差的预测物，因为它们在给定时刻反映出不多于一张的应激反应的快照。
根据以上得出，慢性应激的鱼类中的血浆皮质醇值未提供对于所经历的应激来说足够的读数。然而，图7显示，内分泌应激轴是最确定被活化的。下丘脑、垂体远侧部、和肾间组织各自的关键基因crf(STRESS相对于CTR：P＝0.0002)、pomc(STRESS相对于CTR：P＜0.0001)、和star(STRESS相对于CTR：P＝0.0140)的表达确实显著上调。由显著降低的pomc表达(DEX相对于CTR：P＝0.0236)表明了负糖皮质激素反馈。
在血浆皮质醇的水平不可见的慢性应激的第二条证据是编码鳃Na+/K+-ATP酶的α1亚基的基因的上调74(图8)。在DEX(DEX相对于CTR：P＝0.0001)、CORT(CORT相对于CTR：P＜0.0001)和STRESS(STRESS相对于CTR：P＝0.0215)鱼类中，发现了显著增强的表达水平，表明了皮质激素作用。
总而言之，结果表明，STRESS组的鱼类是慢性应激的。我们之后着手于骨鳞中皮质醇的量化。
2)作为慢性应激的生物标记物的鱼类的个体发育鳞片中的皮质醇
利用验证的UPLC-MS/MS方法(根据Commission Decision No.2002/657/EC的要求)在NBN EN ISO/IEC 17025监管环境中分析五个(第21天)至六个(第42天)鳞片的皮质醇。所有CTR和DEX鱼类显示出低于检测能力(CCβ)的鳞片皮质醇值；12只CORT鱼中的10只在第21天显示出高于CCβ的值并且全部在第42天高于CCβ；11只STRESS鱼中的7只在第21天显示出高于CCβ的值并且全部在第42天高于CCβ(图9)。在对处理进行比较时，在第21天，对于CORT鱼类(CORT相对于CTR：P＜0.0001)发现了明显的累积；在第42天，对于STRESS鱼类(STRESS相对于CTR：P＝0.0001)发现了明显的累积。当在从21至42天的处理内进行比较时，分别在STRESS(P＝0.0031)和CORT(P＝0.0026)鱼类中发现了鳞片皮质醇的明显增加。这些发现与预测的鳞片中皮质醇随时间的结合和累积一致，并且验证了鳞片皮质醇含量为慢性应激的生物标记物。与通过DEX阻断内源皮质醇产生的预测效果一致，我们发现在DEX处理的鱼类的鳞片中没有皮质醇结合。另一方面，喂食皮质醇和使鱼类物理应激增强了鳞片皮质醇水平。
总而言之，个体发育鳞片中皮质醇的结果确认了，鳞片中的皮质醇反映了鱼类随时间经历的应激水平。我们着手于作为用于慢性应激量化的额外工具的再生鳞片中皮质醇的量化及其与最充足的基质蛋白质胶原蛋白1α的基因表达水平的相关性。
c)在个体发育鳞片之后，皮质醇还在再生鳞片中积累
在移除个体发育鳞片之后21天，在每只鱼5个再生鳞片中测定皮质醇浓度(图10)。发现collal的MNE在个体发育鳞片中受到抑制并且与高血浆皮质醇水平相关，与糖皮质激素对骨形成的公知的抑制效果一致。如由在所有处理中相似的collal表达所示出的，在再生鳞片中，造骨细胞(形成鳞片的成骨细胞样细胞75)似乎对糖皮质激素反馈不敏感。形态学上，发现CTR、STRESS、和CORT的再生鳞片是相似的，而DEX鱼类的鳞片的面积、周长和隆起(ridge)的数量显示出明显更低的值，表明受打扰的和延缓的再生。在第42天，在再生和个体发育鳞片取样时CORT鱼类中的高皮质醇血浆水平与高鳞片皮质醇含量相关，并且这确认了游离的皮质醇在鳞片中结合。此外，STRESS鱼类中的再生鳞片皮质醇含量似乎还没有明显高于CTR但是低于CORT，表明基质中皮质醇的最大隔离(sequestering)尚未未达到。在此应当注意所分析的基质的极其低的量(平均4mg的鳞片)。观察到CORT鱼类(CORT相对于CTR：P＜0.0001)中鳞片皮质醇的明显增加。这个发现与鳞片中皮质醇随时间的结合和累积一致，并且可以得到较高的血浆皮质醇水平，因此再次确认了我们关于个体发育鳞片的发现。再生鳞片的结果证实了个体发育鳞片的结果，以及因此证明了鳞片中的皮质醇反映鱼类随时间经历的应激水平的事实。
实施例4：罗非鱼(莫桑比克罗非鱼(Oreochromis mossambicus))的鳞片中糖皮质 激素水平的量化
方法和材料(参见实施例1并且进一步)
实验设置
利用罗非鱼的试验存在4个条件的2次重复，各自具有6条鱼：对照(未应激的)、地塞米松(dexamethasone)(应激通路的抑制)、皮质醇(应激通路的活化)和通过以随机施用方式提供的各种应激物6周诱导的应激。
方法
实验操作根据荷兰法规并且由Radboud大学动物伦理委员会(Animal EthicsCommittee of the Radboud University)批准(许可编号：RU-DEC2013-192)。在Nijmegen的Radboud大学饲养常见的罗非鱼(莫桑比克罗非鱼(Oreochromis mossambicus))以确保历史。将维持在12∶12h光亮∶黑暗下、每天以体重的0.9％喂食2餐(09.30am和15.30pm)的生长中的成年鱼(在第21天时：321±37g和26.0±0.9cm；在第42天时：328±38g和26.5±0.9cm)在20.0±0.4℃保持6周。分别设置两组，每组2个重复的箱，每个140-L箱6条鱼。留下CTR组的鱼不受打扰。使STRESS组每天应激一次；应激物的类型、持续时间和时机随机应用并且包括：网捕(15-60min)、空气暴露(1-3min)、温度下降(高达5℃)、追捕(高达10min)和限制(在具有低水位的桶中)。在整个实验期间，没有注意到受损害的健康和行为的迹象。在42天之后，将鱼在2-苯氧基-乙醇(0.1％v/v)中麻醉并且处死，从尾部血管取血并收集鳞片(个体发育的和21天再生的鳞片)。分析血浆的皮质醇、葡萄糖70、总钙71、和同渗质量摩尔浓度70。从侧线背侧的标准化的排对鳞片进行取样并且使用超高效液相色谱法串联质谱法(UPLC-MS/MS)分析。
结果
原理的控制和实验设置的执行
在6周的试验期间，我们比较了不受打扰的(CTR)和每日应激的(STRESS)罗非鱼。在所有处理中，所提供的喂食量在5分钟内消耗，如通过条件因素73表明的，所有鱼保持临床健康，并且未观察到死亡。通过每日(pH、温度、溶解氧)或每周(亚硝酸盐、硝酸盐、铵)监测维持足够的水质。可以排除水性糖皮质激素(作为从饲料泄漏的结果)对所观察到的效果的影响。借助内部开发和验证的UPLC-MS/MS分析皮质醇、其前体和代谢物，揭示在喂食之后2.5h内水中提高的皮质醇浓度恢复至基线。
分析通常用作应激指标的四个血液参数(图11)。血浆皮质醇在STRESS组(STRESS相对于CTR：P＝0.0014)中提高，表明了后者适用于急性应激评估。次要应激参数血浆葡萄糖(反映了预测的糖皮质激素作用(糖原异生))在STRESS(STRESS相对于CTR：P＝0.0006)中增加并且差异显著。血浆总钙和同渗质量摩尔浓度不受影响，表明处理未超过鱼类的恢复力并且不产生痛苦(distress)。我们得出结论：(i)在STRESS鱼类的血浆中观察到HPI轴的活化的迹象时，STRESS处理引起了预期的糖皮质激素作用；并且(ii)血浆参数是慢性应激的差的预测物，因为它们在给定时刻反映不多于一张的应激反应的快照。
作为慢性应激的生物标记物的鱼类的个体发育鳞片中的皮质醇
利用验证的UPLC-MS/MS方法(根据Commission Decision No.2002/657/EC(EC，2002)的要求)在NBN EN ISO/IEC 17025(EN ISO/IEC，2005)监管环境中分析五个(第21天)至六个(第42天)鳞片的皮质醇。
在第21天，所有CTR和STRESS鱼类显示出低于判定限(CCα)的鳞片皮质醇值，而在第42天，STRESS鱼类的水平大多高于CCα(图12)。
在对处理进行比较时，在第21天，对于STRESS鱼类(STRESS相对于CTR：P＝0.0590)发现了接近明显的累积；在第42天，对于STRESS鱼类(STRESS相对于CTR：P＝0.0515)发现了接近明显的累积。当在从21至42天的处理内进行比较时，在CTR(P＝0.3962)中发现了鳞片皮质醇没有明显增加，而在STRESS(P＝0.0020)鱼类中发现了鳞片皮质醇的明显增加。这些发现与预测的鳞片中皮质醇随时间的结合和累积一致，并且进一步验证了鳞片皮质醇含量为慢性应激的生物标记物。与对照组中的预测效果一致，我们发现CTR鱼类(CTR21相对于CTR42：P＝0.0770)的鳞片中没有明显的皮质醇结合。另一方面，使鱼类物理应激增强了鳞片皮质醇水平(STRESS21相对于STRESS42：P＜0.0001)。
总而言之，个体发育鳞片中皮质醇的结果确认了我们最初在鲤鱼中的发现，鳞片中的皮质醇反映了鱼类随时间经历的应激水平。我们着手于作为用于慢性应激量化的额外工具的再生鳞片中皮质醇的量化。
在个体发育鳞片之后，皮质醇还在再生鳞片中积累
在移除个体发育鳞片之后21天，在每只鱼5个再生鳞片中测定皮质醇浓度(图13)。
观察到STRESS鱼类(STRESS相对于CTR：P＝0.0105)中再生鳞片皮质醇的明显增加。在第42天取样再生和个体发育鳞片时STRESS鱼类中的高皮质醇血浆水平与高鳞片皮质醇含量相关，并且这确认了我们的假设，游离的皮质醇结合在鳞片中。这个发现与预测的鳞片中皮质醇随时间的结合和累积一致，具有高的血浆皮质醇水平，因此再次确认了我们关于个体发育鳞片的发现。再生鳞片的结果证实了个体发育鳞片的结果以及我们之前关于鲤鱼的发现，并且因此确认了鳞片中的皮质醇反映鱼类随时间经历的应激水平的事实。
血浆中以及备选基质如排泄物、黏液和水中的皮质醇的测定不适用于慢性应激的评估。我们示出了，鳞片皮质醇含量高度适用于鱼类中慢性应激的量化，这种想法使得鳞片皮质醇成为与鱼类相关的科学和行业(例如，生理学、毒理学、免疫学、行为研究等)中具有高潜在影响的创新的和超过现有技术水平的生物标记物。对于鲤鱼和对于罗非鱼给出的发现适用于所有具有骨鳞的鱼类(例如，鲤鱼)。在较广泛的意义上，盾鳞(例如，鲨鱼)和硬鳞(例如，鲟鱼)也是适合的，使这种生物标记物的用途扩展到其他辐鳍亚纲(actinopterygian)物种和甚至软骨鱼纲(chondrichtyan)物种。最后，这种用于慢性应激监测的新型工具具有可能用于大范围的政府、学术和工业环境的巨大价值，如对动物友好的水产养殖做决策(例如再循环水产养殖系统的基于动物的优化和产品质量的改善)、野生鱼类种群的监测(例如基于生态学的种群动态)、在公共水族馆和在动物试验中的鱼类福利。保证了用于对鱼类鳞片中皮质醇的现场分析的经济上、逻辑上、且广泛适用的可行的测定的开发。
实施例5：鲑鱼的鳞片中糖皮质激素水平的量化
方法和材料(参见实施例1)
实验设置
针对鲑鱼中的慢性应激，在与美国的拓展合作框架内，盲法分析大鳞大麻哈鱼(Chinook salmon)的十二只样品(预应激和应激(1小时限制))的鳞片糖皮质激素。
结果
实施例6：海鲷鱼和海鲈鱼的鳞片中糖皮质激素水平的量化
方法和材料(参见实施例1)
实验设置
利用海鲈鱼(欧洲海鲈鱼(Dicentrarchus labrax))和海鲷鱼(赤鲷(Pagruspagrus))测试鱼类的调节的影响(第一天与第3天)。
结果
海鲈鱼
海鲷鱼
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Claims (13)

1.一种用于量化鱼中慢性应激水平的体外方法，所述方法包括：
-从所述鱼中获得至少一个鳞片，
-从所述鳞片中萃取糖皮质激素，
-将从所述鳞片中萃取的糖皮质激素纯化，
-量化所述纯化的糖皮质激素，和
-将所述量化的糖皮质激素与慢性应激水平相关联。
2.根据权利要求1所述的方法，糖皮质激素是皮质醇、皮质酮、17α-羟基孕酮、11-脱氧皮质醇、11-脱氧皮质酮、可的松、20-二氢可的松、四氢皮质醇和/或四氢可的松。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述鱼属于真骨鱼类(Teleostei)的次纲。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述从所述鱼中获得至少一个鳞片是从所述鱼中获得40至80个之间的鳞片。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述萃取糖皮质激素通过加入甲醇作为萃取溶剂进行。
6.根据权利要求5所述的方法，其中用甲醇萃取之后进行固相萃取。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述纯化的糖皮质激素的量化通过与串联质谱法偶联的液相色谱法、与紫外线偶联的高效液相色谱法、二极管阵列或荧光检测、气相色谱法、放射性免疫测定、酶免疫测定或基于传感器的技术进行。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述与串联质谱法偶联的液相色谱法是超高效液相串联质谱法。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述纯化的糖皮质激素的量化通过放射性免疫测定或酶免疫测定进行。
10.萃取自从鱼中取样的鱼鳞的糖皮质激素用于量化所述鱼的慢性应激水平的用途。
11.根据权利要求10所述的用途，其中所述量化通过根据权利要求1-9中任一项所述的方法进行。
12.萃取自从鱼中取样的脊、鳍条或耳石的糖皮质激素用于量化所述鱼的慢性应激水平的用途。
13.一种用于量化鱼中慢性应激水平的体外方法，所述方法包括：
-从所述鱼中获得至少一个脊、鳍条或耳石，
-从所述脊、鳍条或耳石中萃取糖皮质激素，
-将从所述脊、鳍条或耳石中萃取的糖皮质激素纯化，
-量化所述纯化的糖皮质激素，和
-将所述量化的糖皮质激素与慢性应激水平相关联。
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