JP6348186B2 - 慢性ストレスのバイオマーカーとしての魚のうろこにおけるグルココルチコイドの定量化 - Google Patents
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Description
より具体的には、本発明は、魚における慢性ストレスレベルを定量化するためのin vitro方法であって、
−前記魚から少なくとも1枚のうろこを得ること、
−前記うろこからグルココルチコイドを抽出すること、
−前記うろこから抽出されたグルココルチコイドを精製すること、
−前記精製されたグルココルチコイドを定量化すること、および
−前記定量化されたグルココルチコイドと慢性ストレスレベルの、相関をとること、
を含む、前記方法に関する。
−コルチゾールまたは11β,17α,21−トリヒドロキシプレグナ−4−エン−3,20−ジオン:
本発明はさらに具体的に、前記魚が硬骨魚類下綱に属する、上述の方法に関する。
より具体的には、本発明は、前記硬骨魚類下綱に属する魚が、モロネ科(例えば、ヨーロピアンシーバス)、タイ科(例えば、タイ類(Sea breams))、ササウシノシタ科(例えば、ヨーロッパソールおよびセネガルソール)、サケ科(例えば、サケ、マス)、いわゆるキングフィッシュ(例えばイエローテールキングフィッシュ)、サバ科(例えばマグロ)、タラ科(例えばタラ)、コイ科(例えば、コイ、鯉(錦鯉))、およびシクリッド魚(例えば、モザンビークおよびナイルテラピア)に属する魚である、上述の方法に関する。
魚における「慢性ストレス」の用語は、時間とともに増大して長期に持続するストレスの多い状況を反映するストレスを意味し、かかる状況は、取り扱い、水質悪化、ストック密度、捕食、および風車(windmills)、漁船による輸送、接触等その他いくつかの人の活動の要因によるものである。慢性ストレスはこのように、魚が完全には回復できない長期に持続する条件である。ストレス因子の直接の影響、ならびに内分泌レベル、免疫システムまたは機能的レベルで生じる変化は、(前)病理学的結果に影響し得て、これは魚の福祉を低下させる。
「魚からうろこを得る」という用語は、前記(生きているか死んだ)魚の皮から、少なくとも1枚のうろこを、例えば微細ピンセットを用いて除去することを意味する。前記うろこは、魚の体の任意の部分から採取することができる:すなわち、背側、頭腹側、中腹側、尾側、右側または左側など。本発明の方法を標準化するために、うろこは胸びれの背側の中背腹ゾーンから採取した。試料収集のこの非侵襲的な方法は、除去されたうろこが短期間で再生するため、魚には影響を及ぼさない。これらの再生うろこは、経験したストレスに関して同一のグルココルチコイドの取り込みプロファイルを示すことが証明され、したがって、明確に定義された時間枠内の慢性的ストレスを定量化するための、追加のツールを提供する。
したがって、本発明は、また、上述の方法に関し、魚から少なくとも1枚のうろこを得ることが、前記魚から40〜80枚のうろこを得ることである。
したがって本発明は、グルココルチコイドの抽出が、メタノールを抽出溶媒として添加することにより実施される、上記の方法に関する。本発明の抽出の例は、以下である:均質化うろこ試料0.1g±0.001gを、10mLの試験管に秤量する。続いてメタノール8mlを抽出溶媒として添加し、0.5μg・L−1のコルチゾール−d4溶液10μLを、内部標準として添加する。試料を30秒間ボルテックス混合し、室温で1時間、60rpmでオーバーヘッドシェーカー上に置き、7℃、3500×gで10分間遠心分離する。すべての上清を採取し、窒素下60℃で窒素エバポレーターを用いて乾燥するまで蒸発させ、後続の固相抽出(SPE)のために、5mlのH2O/MeOH(80:20;v/v)中に再構成する。
特に、本発明はまた、メタノールを用いた抽出の後にSPE(固相抽出)が続く、上記の方法にも関する。本発明の精製ステップの非限定的な例は、以下である:C18 SPEカラムを3mlのメタノールと続いて3mlの超純水でコンディショニング後、上記のようにして得られた試料を供する。カラムを4.5mlのH2O/MeOH(65:35;v/v)で洗浄し、保持された化合物を、2.5mlのH2O/MeOH(20:80;v/v)で10mlの試験管に溶出し、窒素下60℃で窒素エバポレーターを用いて乾燥するまで蒸発させる。試料を最後に、バイアル内の100μLのH2O/MeOH(80:20;v/v)中に再構成し、タンデム質量分析と組み合わせた超高速液体クロマトグラフィー(UPLC−MS/MS)により分析する。
「精製したグルココルチコイドを定量化する」という用語は、上記のように抽出/精製後に得られたグルココルチコイドの量を決定するための、任意の方法を指す。
本発明はまた、タンデム質量分析と組み合わせた液体クロマトグラフィーが、超高速液体タンデム質量分析である、上述の方法に関する。
より具体的には、本発明は、免疫測定法が、ラジオイムノアッセイまたは酵素免疫測定法である、上述の方法に関する。
したがって本発明は、本質的に、魚からサンプリングした魚のうろこの、前記魚における慢性ストレスレベルを決定または定量化するための使用に関する。
うろこは、それらが非侵襲的に収集されるため、慢性ストレスの定量化のための最も重要な基質である。しかし、耳石、棘、鰭条などの他の石灰化基質も、一定の状況においては、慢性ストレスの定量化のための基質と同様に使用することができる。後者の定量化は、うろこについて上述したのと同様の方法で行うことができる。特に、棘と鰭条はハサミで切断し、それらを小片にカットして均質化し、一方耳石はメスで除去し、乳鉢を用いて粉砕することにより均質化する。
柔鰭条は柔軟で、先端部で分節および分岐し、先端に新しい分節を追加することにより延長される。棘は分節していないが、基底から癒合しており、持続的な成長を示す。耳石は、内耳のバランスの器官の一部であり、アラゴナイトの形態の結晶化した炭酸カルシウム、およびオトリン(otoline)と呼ばれる繊維質のコラーゲン様タンパク質から、主として構成される。これらは、放射状に堆積され、体細胞の成長がない場合には維持される、容易に識別可能な毎日の増分を表示する。柔鰭条およびうろこは、失われたかまたは損傷された場合には、急速に再生可能である。
したがって本発明はさらに、魚における慢性ストレスレベルを定量化するin vitroの方法であって、
−前記魚から少なくとも1つの棘、鰭条または耳石を得ること、
−前記棘、鰭条または耳石からグルココルチコイドを抽出すること、
−前記棘、鰭条または耳石から抽出されたグルココルチコイドを精製すること、
−前記精製されたグルココルチコイドを定量化すること、および
−前記定量化されたグルココルチコイドと慢性ストレスレベルの、相関をとること、を含む、前記方法に関する。
本発明を、以下の非限定的な実施例によって説明する。
方法および材料
機器、材料、および試薬
クロマトグラフィー分析は、Acquity Ultra Performance LC BEH C18カラム(1.7μm;2.1×100mm)を用いてAcquity UPLC-MS/MS Premier XE(Waters, Milford, USA)で実施した。試料は、Turbovap(商標)窒素エバポレーター(Biotage, Sweden)で乾燥まで蒸発させた。固相抽出(SPE)用のGrace Pure(商標)SPE C18-Maxカラム(500mg、6ml)は、Grace Davison Discovery Sciences(Lokeren, Belgium)から入手した。抽出溶媒としての、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)勾配グレードのメタノール(Hipersolv Chromanorm)は、VWR International BVBA(Leuven, Belgium)から入手し、一方、Biosolve BV(Valkenswaard, The Netherlands)からのLC−MS無水メタノールおよびULC−MSグレードギ酸、およびMillipore(Billerica, USA)からのMilli-Q勾配Q-Gard 2の超純水を、移動相溶媒として使用した。
分析証明書を持つ製品のみを使用した。コルチゾール、コルチゾン、17α−ヒドロキシプロゲステロン、および11−デオキシコルチゾールは、Sigma-Aldrich(Diegem, Belgium)から入手した。テトラヒドロコルチゾールおよびテトラヒドロコルチゾンは、Sequoia Research Products Ltd(Pangbourne, United Kingdom)から入手した。CDN Isotopes(Pointe-Claire, Canada)からのコルチゾール−d4を、内部標準として使用した。
すべての化合物および内部標準の、1mg・mL−1の個々のストック標準溶液は、メタノール中に調製し、4℃で保存した。0.005mg・L−1〜0.1mg・L−1までの範囲の較正標準は、0.5μg・L−1のコルチゾール−d4溶液10μLを、100μLのH2O/MeOH(80:20;v/v)中のそれぞれ1μg・L−1の標準溶液0.5μL、1μL、2.5μL、5μL、および10μLに添加することにより調製した。100mgの試料を使用したので、これは、基質中5μg・kg−1〜100μg・kg−1の範囲に相当する。
すべての石灰化構造は、2−フェノキシエタノールで深く麻酔し脊髄切断により屠殺したヨーロピアンシーバス(Dicentrarchus labrax)からサンプリングした。すべての魚は約100gの重量であった。胸びれの背側の左中背腹ゾーンから60枚のうろこを、微細ピンセットで皮から除去した。尾びれからの4個の背棘と6個の柔鰭条は、ハサミを使用して取得した。2つの矢状耳石は、開いた頭骨から採取した。全試料は超純水ですすぎ、室温でティッシュペーパー上空気乾燥させた。
うろこ、棘、および柔鰭条は、ハサミで微細片に切断した。耳石は乳鉢で粉砕した。ハサミと乳鉢は、エタノールと続いて超純水で洗浄し、ティッシュペーパーで乾燥させた。均質化した試料0.1g±0.001gを、10mlの試験管に秤量した。続いて8mlのメタノールを抽出溶媒として添加し、0.5μg・L−1のコルチゾール−d4溶液10μLを、内部標準として添加した。試料を30秒間ボルテックス混合し、室温で1時間、60rpmでオーバーヘッドシェーカー上に置き、7℃、3500gで10分間遠心分離した。すべての上清を採取し、窒素下60℃で窒素エバポレーターを用いて乾燥するまで蒸発させ、5mlのH2O/MeOH(80:20;v/v)中に再構成した。C18 SPEカラムを3mlのメタノールと続いて3mlの超純水でコンディショニング後、試料を供した。カラムを4.5mlのH2O/MeOH(65:35;v/v)で洗浄し、保持された化合物を、2.5mlのH2O/MeOH(20:80;v/v)で10mlの試験管に溶出し、窒素下60℃で窒素エバポレーターを用いて乾燥するまで蒸発させた。試料を最後に、バイアル内の100μLのH2O/MeOH(80:20;v/v)中に再構成し、UPLC−MS/MSにより分析した。
グルココルチコイドを、移動相AおよびBの勾配溶出を使用して分離した。移動相Aは、超純水と0.1%ギ酸の混合物であり、一方移動相Bは、メタノールと0.1%ギ酸の混合物であった。最初に、勾配溶出は、20%(v/v)の移動相Bで開始した。次に、移動相Bを1.5分で56%まで、6.5分で63%まで、7.5分で99.1%まで増加し、その後これを8分まで99.1%に維持し、最終的に9分で20%まで減少させ、ここで10分まで維持した。流量は、0.4ml・分−1の一定値に維持し、10分の実行時間を得た。試料はオートサンプラーで7℃に冷却した。注入容量は40μLとし、一方カラム温度は30℃に維持した。
すべての石灰化構造の検証試料は、同様の条件下で飼育したそれぞれ51、51、57、および118匹の魚からのうろこ、棘、柔鰭条、および耳石のプーリングによって作製された。上記の分析物/基質の組み合わせについての認証標準物質、実験室間の比較試験、または任意の他の検証された方法は存在しないため、検証は、検証試料への標準添加を用いて行った。すべての石灰化構造に対して、1〜50μg・kg−1の範囲の5つの濃度レベルを5重で試験し、これを、1ヶ月の期間内の4つの異なる日に、実験内再現性条件(intra-reproducibility conditions)のもとで、すなわち2人が異なる溶液および1つのUPLC−MS/MSシステムを使用して、繰り返した。すべての検証実験は、許可された者により、制御された環境下で、較正機器と制御された溶液を用いて、標準EN ISO/IEC 1702562の要件に従って実施した。分析は、異なる較正標準、ブランク、陰性および陽性対照(すべて希釈液中)からなる標準化された順序を用いて行った。すべての化合物についての結果は、(相対)保持時間および化合物とその断片の相対的なイオン強度を評価することにより、評価した。全ての検証パラメータは、Commission Decision No. 2002/657/ECの要件に応じて決定し、評価した:真度、精度、動作範囲、直線性、決定限界(CCα)、検出能力(CCβ)、感度、および選択性。
魚のうろこにおける、コルチゾール、その前駆体である17α−ヒドロキシプロゲステロンおよび11−デオキシコルチゾール、コルチゾン、および重要な代謝物であるテトラヒドロコルチゾール、およびテトラヒドロコルチゾンについてのUPLC−MS/MS定量法は、EN ISO/IEC 17025:2005認定の環境で開発され、Commission Decision No. 2002/657/ECの要件に従って検証された。ほとんどの魚においてストレス応答を反映していると考えられる古典的なパラメータとして、コルチゾールは血流中に放出されて、石灰化構造への組み込みが可能となり、これにより、慢性ストレス研究のための標的分析物となっている。その前駆体17α−ヒドロキシプロゲステロンおよび11−デオキシコルチゾールも、可能な腎間外経路の検出をカバーするために分析に含めた。代謝物テトラヒドロコルチゾールおよびテトラヒドロコルチゾンも含めたが、これは、外因性グルココルチコイド(水中)が内分泌かく乱物質として作用し、試験する石灰化構造のグルココルチコイドプロファイルに影響を与える可能性があるためである。この方法は、棘、柔鰭条、および耳石についても試験して検証された。うろこのサンプリングの利便性が検討される。
サンプリングおよび試料調製
各石灰化構造について、サンプリング位置を決定した。うろこは、変態後の魚における中胚葉性骨格要素である。魚の様々な側面(例えば、背側、頭腹側、中腹側、または尾側)から採取したうろこにおけるコルチゾール含有量に差はなく、左側と右側から採取したうろこの間にも差は見出されなかった。側線のうろこは、構造が異なるため避けるべきである。簡便さと将来の研究のために(水産養殖における適用可能性を考慮して)、うろこは、胸びれの背側の中背腹ゾーンから選択した。シーバスの棘は、特に、第一背びれの頭骨部分に見出される(8〜10個の棘)。棘は分節しておらず、基底に癒合しており、したがって柔鰭条よりも硬い。グルココルチコイドのより高い濃度は、そのベースにある棘において見出だされ、この組織は経時的なコルチゾールの取り込みについてよりよい微調整を必要とする。さらに、棘の末端部を除く全体は上皮で覆われている。背びれ、頭腹部のひれ、中腹部のひれ、または尾びれから採取した柔鰭条におけるコルチゾール含有量に、差は見出されなかった。水産養殖における適用可能性を考慮して、尾びれからの柔鰭条を選択した。矢状耳石は、最も大きく、最も取り出しが簡単であるために選択された。
図3.検証用のうろこ、棘、および柔鰭条についての基質の最適量
内因性65および外因性のグルココルチコイドを含むことが知られている粘液を除去するために、全試料を、超純水により集中的に洗浄した。
異なる抽出効率の4種の溶媒を試験した:メタノール、2−プロパノール、アセトニトリル、ジエチルエーテル。メタノールは、うろこならびに棘および柔鰭条における様々なグルココルチコイドについて、最良の結果を与えた;耳石中では、溶媒間に明確な差は見られなかった(データ示さず)。
次に、メタノールによる時間依存性のインキュベーション(15、60、120分および16時間)および反復抽出を試験した。魚のうろこ中のコルチゾールについて、抽出の改善は、60分のインキュベーション後に見られなかった。2回目の抽出での改善も、15分2サイクルの組み合わせ(60分1サイクルに対して)での改善も見られなかった。うろこ、棘、および柔鰭条についての結果を図4に示す。
図4.うろこ、棘、および柔鰭条におけるコルチゾールついての抽出時間と反復の最適化
SPE手順
C18相SPEカートリッジは、血漿66、尿67、糞68などの生物学的試料からのグルココルチコイド抽出に成功して使用され、したがってこのカラムの種類を、本研究における石灰化構造からの選択されたグルココルチコイドの抽出および精製を最適化するように選択した。
Grace Pure(商標)SPE C18-Max(500mg、6ml)カラムは、シリカベースの支持体上に重合的結合した17.1%の炭素が装填された逆相吸着剤である。逆相抽出法を選択した理由は、極性の試料基質からの、適度に極性から非極性の化合物に結合するためである。500mgの床のサイズは、25mgの吸着剤保持能力を提供する。うろこおよび他の石灰化構造におけるグルココルチコイドの予測濃度範囲を考慮すると、この保持能力は、関心のあるすべての分析物を結合するのに十分であろう。SPEのためのコンディショニング、試料の負荷、洗浄および溶出ステップは、溶媒の種類と量について最適化した。3mlのメタノールによるコンディショニングステップで吸着剤のリガンドを活性化し、続いて3mlの超純水で吸着床を平衡化することにより、最良の結果が得られた(コルチゾールの平均回収率>90%)。両方の溶媒の最小容量は2.5mlであり、一方3mlより多くの容量を使用した試験では、精製は改善されなかった。蒸発された試料を5mlのH2O/MeOH(80:20;v/v)に再懸濁させる、試料の負荷ステップは、最良の結果をもたらした。超純水および/またはメタノールの割合を変化させた溶媒の組み合わせは、次善の結果をもたらした。カラムを4.5mlのH2O/MeOH(65:35;v/v)で洗浄することは、グルココルチコイドの回収について最良の結果をもたらした。
Acquity Ultra Performance LC BEH C18カラム(1.7μm;2.1×100mm)を用いたクロマトグラフィー分析を最適化するための最初のステップにおいて、全化合物ならびに内部標準を、正(ESI+)および負(ESI−)のエレクトロスプレーイオン化モードでの質量分析計を使用して調整した。ESI−で得られた結果は小さなピークと少ないノイズを与え、一方ESI+は、全体的に良好な結果を与え、これをさらなる試験のために選択した。
最後のステップで、MS/MS法を最適化した:滞留時間を最適感度のために増加して、全化合物のすべてのイオンのピークに渡る点が少なくとも20のデータ点からなることを確実にし、MSフレームウィンドウをそれに応じて最適化した。
うろこ(または任意の他の石灰化構造)におけるグルココルチコイドの濃度の値は、公開された文献には載っておらず、そのため我々は、1μg・kg−1〜50μg・kg−1の初期動作範囲を選択した。
魚のうろこ中のコルチゾールの見かけの回収は、Commission Decision No. 2002/657/ECの要件に従って80%〜110%の性能基準内である、88.14%〜98.85%の範囲のCCβレベルより下か、このレベルであるか、またはこれより上である。プールされた検証試料の均質化が最適ではなかったという事実にもかかわらず(すなわち、均質な粉末ではなく、非常に細かい断片のプールであった)、魚のうろこ中のコルチゾールについての再現性は、12.36%〜17.15%の範囲であった。実験室内の再現性は、14.63%〜20.02%の範囲であった。魚のうろこにおいて分析された化合物の、真度、精度および測定不確かさの結果を表2に示す。
2包含係数(k)が2(95%の信頼区間)の二次加算(Nordtest法)を用いた、拡張測定不確かさの算出。
3クオリファイヤーイオンについての不十分な応答。
図5.魚のうろこ中のコルチゾールについての、希釈液中および基質中の検量線
その後、すべての石灰化構造内の全化合物に対する応答の直線性を、希釈液における、5μg・kg−1〜100μg・kg−1の範囲の、5個の較正点からなる4重の検量線を用いて、実験室間の再現性条件下で分析して試験した。全化合物についてこの範囲の線形性を評価した場合、0.99より低い決定係数(R2)の値は見出されなかった。さらに、計算されたモデルは、全化合物について正規分布を示した。魚のうろこにおける全化合物についての直線性、CCα、およびCCβの結果を、表3に示す。
この方法の堅牢性を、抽出およびSPE精製などのすべての重要なステップについての方法の開発中に、最適値を変化させることにより試験した。
魚のうろこにおけるコルチゾール、その前駆体(17α−ヒドロキシプロゲステロンおよび11−デオキシコルチゾール)、コルチゾンおよび代謝物(テトラヒドロコルチゾールおよびテトラヒドロコルチゾン)に対するUPLC−MS/MS法は、EN ISO/IEC 17025:2005認定の環境で開発され、Commission Decision No. 2002/657/ECの要件に従って検証され、その意図する目的に適していることが証明された。さらにこの方法は、棘、柔鰭条および耳石である他の3種類の石灰化構造に対しても試験され検証された。
方法および材料(例1参照)
実験の設定
3つの条件の2回の反復で試験した:対照(低ストレス、中ストレスおよび高ストレス)。ストレスは、3週間の期間中にランダム適用された様々な種類のストレッサー(混雑、追い回しおよび空気曝露)の組み合わせであった。ストレッサーは、1日のうちいくつかの予測不可能な時点に、示されているように適用した:
・低ストレス:閉じ込め(25%容積)30分を1日おき
・中ストレス:閉じ込め(25%容積)30分、追い回し5分を1日おき
・高ストレス:閉じ込め(10%容量)30分、追い回し5分を1日おき、大気への暴露を週1回1分間
方法および材料(例1など参照)
実験の設定
各6匹の魚の、4つの条件の3回の反復でコイについて試験した:対照(ストレスなし)、デキサメタゾン(ストレス経路の阻害)、コルチゾール(ストレス経路の活性化)、および6週間ランダム適用の様式で与えられた種々のストレッサーに起因するストレス。
実験手順はオランダの法律に従い、地元の倫理委員会によって承認された。コイ(Cyprinus carpio L.)は、Radboud University of Nijmegenで飼育し、既往歴を確実にした。成長した成魚(21日目:340±92gおよび24.6±2.4cm;42日目:377±108gおよび25.4±2.5cm)を、12:12時間の明:暗の下で保持し、1日に2食(9:30amおよび15:30pm)、体重の0.9%を与えて、20.0±0.4℃で6週間維持した。4つの群を、1群当たり2つのタンクの反復で、各140Lのタンク当たり6匹の魚に設定した。CTR群の魚は、妨害なしで維持した。DEX群およびCORT群には、500mg・kg−1でスパイクした餌を与えた。STRESS群には、1日1回ストレスを与えた;ストレッサーの種類、持続時間およびタイミングはランダムに適用され、以下を含む:網による捕獲(15〜60分)、空気暴露(1〜3分)、温度低下(5℃まで)、追い回し(10分まで)、および閉じ込め(低水位のバケツで)。全実験の間に、健康および挙動の劣化の兆候は認められなかった。42日後、魚を2−フェノキシ−エタノール(0.1%v/v)で麻酔して屠殺し、尾部血管から血液およびうろこ(個体発生および21日間再生うろこ)を収集した。血漿は、コルチゾール69、グルコース70、乳酸塩70、全カルシウム71、および重量オスモル濃度70について分析した。うろこは側線の背側の標準化された列からサンプリングした。標的遺伝子のMNEを、eef1a1 rps5およびβ-アクチンを参照遺伝子として用いて評価した72。すべてのパラメータは、SAS 9.4(SAS Institute Inc., Cary, NC)の線形混合モデルを用いて、処置、サンプリングの日およびそれらの相互作用(適切な場合)を固定効果としてモデル化した。タンクについてのランダム切片をモデルに導入して、タンク内の魚のクラスタリングを補正した。ダネット検定を実施して、処置と対照を比較した。
1)論理的根拠の制御および実験設定の実行
6週間の試験期間中、妨害なしのコイ(CTR)と毎日ストレスを与えたコイ(STRESS)を比較した。デキサメタゾン(DEX)またはコルチゾール(CORT)を与えた魚は、うろこにおけるコルチゾール取り込みについての、それぞれ陰性および陽性対照とした。すべての処置において、提供された餌は5分以内に消費され、条件因子73によって示されるようにすべての魚は臨床的に健康なままであり、死亡は観察されなかった。適切な水質は、毎日(pH、温度、溶存酸素)または毎週(亜硝酸塩、硝酸塩、アンモニウム)のモニタリングにより維持した。餌からの漏れによる、水に媒介されたグルココルチコイドの観察された効果に対する寄与は、排除可能である。コルチゾール、その前駆体および代謝物の、社内開発され検証された(うろこコルチゾールを参照)超高速液体クロマトグラフィータンデム質量分析(UPLC−MS/MS)による分析は、水中でのコルチゾール濃度の上昇が、給餌後2.5時間以内にベースラインに戻ったことを明らかにした。
血漿コルチゾールのレベルでは見えない、慢性ストレスの第2の証拠は、えらのNa+/K+−ATPase74のサブユニットα1をコードする遺伝子の上方制御である(図8)。DEX(DEX対CTR:P=0.0001)、CORT(CORT対CTR:P<0.0001)およびSTRESS(STRESS対CTR:P=0.0215)の魚において、有意に増大された発現レベルが観察され、コルチコイドの作用を示す。
要約すると、結果は、STRESS群の魚が慢性的にストレスを受けたことを示す。我々は次に、板状鱗におけるコルチゾールの定量化に着手した。
5枚(21日目)から6枚(42日目)のうろこを、検証されたUPLC−MS/MS法(Commission Decision No. 2002/657/ECの要件に従って)によりNBN EN ISO/IEC 17025規制環境下で、コルチゾールについて分析した。CTRおよびDEXのすべての魚は、検出能力(CCβ)未満のうろこのコルチゾール値を示した;21日目に、12匹のCORTの魚のうち10匹はCCβを超える値を示し、42日目ではすべてがCCβを超えていた;21日目に、11匹のSTRESSの魚のうち7匹はCCβを超える値を示し、42日目ではすべてがCCβを超えていた(図9)。処置を比較すると、21日目にCORTの魚に有意な蓄積が見出された(CORT対CTR:P<0.0001);42日目にSTRESSの魚に有意な蓄積が見出された(STRESS対CTR:P=0.0001)。21〜42日の処置内で比較すると、うろこのコルチゾールの有意な増加が、STRESS(P=0.0031)およびCORT(P=0.0026)の魚で見出された。これらの所見は、時間経過によるうろこ中のコルチゾールの、予測された取り込みおよび蓄積と整合するものであり、うろこのコルチゾール含有量を、慢性ストレスのバイオマーカーとして確認した。DEXによる、内因性コルチゾールの生産をブロックする予測された効果と整合して、我々は、DEX処置の魚のうろこにコルチゾールの取り込みは認めなかった。一方、魚にコルチゾールを供給して物理的にストレスを与えると、うろこのコルチゾールレベルが増大された。
要約すると、個体発生うろこ中のコルチゾールの結果により、うろこ中のコルチゾールは、魚が時間と共に経験するストレスレベルを反映することを確認した。我々は、慢性ストレスの定量化のための追加のツールとしての、再生うろこ中のコルチゾールの定量化と、最も豊富な基質タンパク質コラーゲン1αの遺伝子発現レベルとのその相関について着手した。
コルチゾール濃度を、個体発生うろこの除去後21日に、魚当たり5枚の再生うろこにおいて決定した(図10)。col1a1のMNEは、個体発生うろこで阻害されることが見出され、高い血漿コルチゾールレベルと相関し、これは、よく知られている骨形成に対するグルココルチコイドの阻害効果と整合する。再生うろこにおいて、骨片母細胞(うろこを形成する骨芽細胞様の細胞75は、すべての処置における同様のcol1a1発現により示されるように、グルココルチコイドフィードバックに対し感度が低いように見える。形態学的には、CTR、STRESS、およびCORTの再生うろこは類似していることが判明し、一方、DEXの魚のうろこの面積、周囲長、および隆起部の数は、顕著に低い値を示し、障害され遅延された再生を示す。CORTの魚における、42日目の個体発生および再生うろこのサンプリングの時点における、高いコルチゾール血漿レベルは、うろこの高いコルチゾール含有量と相関し、これは、遊離コルチゾールがうろこに取り込まれていることを確認する。さらに、STRESSの魚中の再生うろこのコルチゾール含有量は、有意ではないが、CTRよりも高くしかしCORTよりも低いようであり、基質中でコルチゾールの最大の封鎖(sequestering)に達していなかったことを示す。これにより、分析された基質の非常に低い量(平均してうろこ4mg)に注意すべきである。CORTの魚のうろこにおいて、コルチゾールの有意な増加が観察された(CORT対CTR:P<0.0001)。この所見は、コルチゾールのうろこ中への時間経過による取り込みおよび蓄積、および高い血漿コルチゾールレベルと整合し、個体発生うろこについての我々の所見を再確認する。再生うろこについての結果は、このように個体発生うろこの結果を、したがってうろこ中のコルチゾールが、時間内に魚が経験するストレスレベルを反映しているという事実を裏付ける。
方法および材料(例1など参照)
実験の設定
各6匹の魚の、4つの条件の2回の反復でテラピアについて試験した:対照(ストレスなし)、デキサメタゾン(ストレス経路の阻害)、コルチゾール(ストレス経路の活性化)、および6週間ランダム適用の様式で与えられた種々のストレッサーに起因するストレス。
実験手順はオランダの法律に従い、Animal Ethics Committee of the Radboud University(許可番号:RU-DEC2013-192)により承認された。テラピア(Oreochromis mossambicus)は、Radboud University of Nijmegenで飼育し、既往歴を確実にした。成長した成魚(21日目:321±37gおよび26.0±0.9cm;42日目:328±38gおよび26.5±0.9cm)を、12:12時間の明:暗の下で保持し、1日に2食(9:30amおよび15:30pm)、体重の0.9%を与えて、20.0±0.4℃で6週間維持した。2つの群を、1群当たり2つのタンクで反復し、各140Lのタンク当たり6匹の魚で設定した。CTR群の魚は、妨害なしで維持した。STRESS群には、1日1回ストレスを与えた;ストレッサーの種類、持続時間およびタイミングはランダムに適用され、以下を含む:網による捕獲(15〜60分)、空気暴露(1〜3分)、温度低下(5℃まで)、追い回し(10分まで)、および閉じ込め(低水位のバケツで)。全実験の間に、健康および挙動の劣化の兆候は認められなかった。42日後、魚を2−フェノキシ−エタノール(0.1%v/v)で麻酔して屠殺し、尾部血管から血液およびうろこ(個体発生および21日間再生うろこ)を収集した。血漿は、コルチゾール、グルコース70、全カルシウム71、および重量オスモル濃度70について分析した。うろこは側線の背側の標準化された列からサンプリングし、超高速液体クロマトグラフィータンデム質量分析(UPLC−MS/MS)を用いて分析した。
1)論理的根拠の制御および実験設定の実行
6週間の試験期間中、妨害なしのテラピア(CTR)と毎日ストレスを与えたテラピア(STRESS)を比較した。すべての処置において、提供された餌は5分以内に消費され、条件因子73によって示されるようにすべての魚は臨床的に健康なままであり、死亡は観察されなかった。適切な水質は、毎日(pH、温度、溶存酸素)または毎週(亜硝酸塩、硝酸塩、アンモニウム)のモニタリングにより維持した。餌からの漏れによる、水に媒介されたグルココルチコイドの観察された効果に対する寄与は、排除可能である。コルチゾール、その前駆体および代謝物の、社内開発され検証されたUPLC−MS/MSによる分析は、水中でのコルチゾール濃度の上昇が、給餌後2.5時間以内にベースラインに戻ったことを明らかにした。
一般的にストレスの指標として使用される、5つの血液パラメータを分析した(図11)。血漿コルチゾールは、STRESS群で上昇しており(STRESS対CTR:P=0.0014)、後者が急性ストレスの評価に適当であることを示す。二次ストレスパラメータである血漿グルコースは、予想されるグルココルチコイドの作用(糖新生)を反映するが、これはSTRESSで増加し(STRESS対CTR:P=0.0006)、有意に異なった。血漿総カルシウムおよび重量オスモル濃度は影響を受けず、処置が魚の回復力を超えず、ストレスを引き起こさなかったことを示した。我々は以下の結論を得た:(i)STRESSでの処置は、意図されたグルココルチコイド作用を誘発した、なぜならばSTRESSの魚の血漿において、HPI軸の活性化の兆候が観察されたからである;および(ii)血漿パラメータは、所与の時点でのストレス応答のスナップショット以上のものを反映しないために、慢性ストレスの優れた予言者ではない。
5枚(21日目)から6枚(42日目)のうろこを、検証されたUPLC−MS/MS法(Commission Decision No. 2002/657/ECの要件に従って)によりNBN EN ISO/IEC 17025規制環境下で、コルチゾールについて分析した。
21日目に、全21匹のCTRおよびSTRESSの魚は、決定限界(CCα)未満のうろこのコルチゾール値を示し、一方42日目では、STRESSの魚のレベルはほとんどがCCαを超えていた(図12)。
処置を比較すると、21日目に、有意に近い蓄積がSTRESSの魚で見出された(STRESS対CTR:P=0.0590);42日目に、有意に近い蓄積がSTRESSの魚で見出された(STRESS対CTR:P=0.0515)。21〜42日の処置内で比較すると、うろこのコルチゾールの有意な増加は、CTRでは見出されず(P=0.3962)、一方、うろこのコルチゾールの有意な増加が、STRESSの魚で見出された(P=0.0020)。これらの所見は、うろこ中のコルチゾールの、時間経過による予測された取り込みおよび蓄積と整合するものであり、うろこのコルチゾール含有量を、慢性ストレスのバイオマーカーとしてさらに確認する。対照群での予測された効果と整合して、我々は、CTRの魚のうろこにおけるコルチゾールの有意な取り込みは認めなかった(CTR21対CTR42:P=0.0770)。一方、物理的に魚にストレスを与えると、うろこのコルチゾールレベルが増大した(STRESS21対STRESS42:P<0.0001)。
要約すると、個体発生うろこ中のコルチゾールの結果により、うろこ中のコルチゾールが、魚が時間と共に経験するストレスレベルを反映するという、コイにおける最初の所見が確認された。我々は、慢性ストレスの定量化のための追加のツールとしての、再生うろこ中のコルチゾールの定量化について着手した。
コルチゾール濃度を、個体発生うろこの除去後21日に、魚当たり5枚の再生うろこにおいて決定した(図13)。
STRESSの魚の再生うろこにおいて、コルチゾールの有意な増加が観察された(STRESS対CTR:P=0.0105)。42日目の再生うろこおよび個体発生うろこのサンプリング時点での、STRESSの魚における高いコルチゾール血漿レベルは、うろこの高いコルチゾール含有量と相関し、これは、遊離コルチゾールがうろこに取り込まれるという我々の仮説を確認した。この所見は、利用可能なより高い血漿コルチゾールレベルに伴う、時間経過によるうろこ中のコルチゾールの予測された取り込みおよび蓄積と整合し、これにより、個体発生うろこでの我々の所見を再確認する。再生うろこについての結果は、個体発生うろこの結果およびコイについての我々の前の所見を裏付けし、したがって、うろこ中のコルチゾールが時間内に魚が経験するストレスレベルを反映することを確認する。
方法および材料(例1参照)
実験の設定
キングサーモンの12の試料(ストレス前およびストレス(1時間の閉じ込め))を、サケにおける慢性ストレスに関する米国との延長協力の枠組みの中で、うろこのグルココルチコイドについてブラインドで分析した。
方法および材料(例1参照)
実験の設定
魚に対するコンディショニングの影響(1日目対3日目)を、シーバス(Dicentrarchus labrax)およびタイ(Pagrus pagrus)を用いて試験した。
結果
シーバス
A.背景技術の参考文献
Claims (13)
- 魚における慢性ストレスレベルを定量化するためのin vitro方法であって、
−前記魚から少なくとも1枚のうろこを得ること、
−前記うろこからグルココルチコイドを抽出すること、
−前記うろこから抽出されたグルココルチコイドを精製すること、
−前記精製されたグルココルチコイドを定量化すること、および
−前記定量化されたグルココルチコイドと慢性ストレスレベルの、相関をとること、
を含む、前記方法。 - グルココルチコイドが、コルチゾール、コルチコステロン、17α−ヒドロキシプロゲステロン、11−デオキシコルチゾール、11−デオキシコルチコステロン、コルチゾン、20−ジヒドロコルチゾン、テトラヒドロコルチゾール、および/またはテトラヒドロコルチゾンである、請求項1に記載の方法。
- 魚が硬骨魚類下綱に属していることを特徴とする、請求項1または2に記載の方法。
- 魚から少なくとも1枚のうろこを得ることが、魚から40〜80枚のうろこを得ることである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- グルココルチコイドを抽出することが、メタノールを抽出溶媒として添加することにより実施される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- メタノールによる抽出に続いて固相抽出を行う、請求項5に記載の方法。
- 抽出されたグルココルチコイドの定量化を、タンデム質量分析と組み合わせた液体クロマトグラフィー、紫外線、ダイオードアレイ、もしくは蛍光検出と組み合わせた高速液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、ラジオイムノアッセイ、酵素免疫測定法、またはセンサーに基づく技術により行う、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- タンデム質量分析と組み合わせた液体クロマトグラフィーが、超高速液体タンデム質量分析である、請求項7に記載の方法。
- 免疫測定法が、ラジオイムノアッセイまたは酵素免疫測定法である、請求項7に記載の方法。
- 魚からサンプリングした魚のうろこの、グルココルチコイドを定量化することによる、前記魚の慢性ストレスレベルを定量化するための使用。
- 定量化が、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法により実施される、請求項10に記載の使用。
- 魚からサンプリングした棘、鰭条または耳石の、グルココルチコイドを定量化することによる、前記魚の慢性ストレスレベルを定量化するための使用。
- 魚における慢性ストレスレベルを定量化するためのin vitro方法であって、
−前記魚から少なくとも1つの棘、鰭条または耳石を得ること、
−前記棘、鰭条または耳石からグルココルチコイドを抽出すること、
−前記棘、鰭条または耳石から抽出されたグルココルチコイドを精製すること、
−前記精製されたグルココルチコイドを定量化すること、および
−前記定量化されたグルココルチコイドと慢性ストレスレベルの、相関をとること、
を含む、前記方法。
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