CN104488720A - 一种诱导紫山药微型种薯的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物组织培养领域，提供一种诱导紫山药微型种薯的培养方法，该方法以紫山药脱毒组培苗为诱导材料进行诱导培养，得到微型薯块。所述诱导培养采用的诱导培养基为，以MS基本培养基为基础，添加琼脂4000-8000mg/L，蔗糖10000-80000mg/L，活性炭500-2500mg/L，6-苄氨基腺嘌呤0.1-1mg/L，香豆素5-20mg/L，萘乙酸0.5-2.0mg/L，所述诱导培养基的pH值为5.8。本发明通过添加有活性炭，6-BA、香豆素、NAA的诱导培养基，与光照条件等协同作用，可以提高紫山药脱毒组培苗经诱导培养得到微型薯块的诱导率；操作简便易行，成本低廉，适合广泛使用。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养领域，特别涉及一种诱导紫山药微型种薯的培养方法，以紫山药脱毒组培苗为诱导材料进行诱导培养，得到微型薯块。
背景技术
山药是薯蓣科薯蓣属植物，为无性繁殖作物。其中，怀山药可以用零余子和块茎繁殖，而南方一些品种山药只能以块茎繁殖，传统的山药繁殖方式因病虫害积累易造成品种退化。因此，开展组培复壮术和扦插繁殖技术是解决山药品种退化问题的主要途径。
目前，紫山药(拉丁文名：Dioscorea alata L.var.purpurea(Roxb.)A.Pouchet)的脱毒种苗主要是通过组培无性繁殖的途径进行商品化生产。由于紫山药组培苗的移栽成活率较低，导致了紫山药脱毒种苗繁殖成本居高不下，且移栽成活的紫山药脱毒种苗运输困难，且运输成本非常高，不适合长距离运输。
因此，在紫山药脱毒种苗培养的科研和实践中，需要找到诱导率高、操作简便、成本低廉的微型种薯的诱导方法。
发明内容
本发明提供一种诱导紫山药微型种薯的培养方法，以紫山药脱毒组培苗为诱导材料进行诱导培养，得到微型薯块。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种诱导紫山药微型种薯的培养方法，该培养方法以紫山药脱毒组培苗为诱导材料进行诱导培养，得到微型薯块。
进一步地，所述诱导培养中，采用的诱导培养基为，以MS基本培养基为基础，添加琼脂4000-8000mg/L，蔗糖10000-80000mg/L，活性炭500-2500mg/L，6-苄氨基腺嘌呤0.1-1mg/L，香豆素5-20mg/L，萘乙酸0.5-2.0mg/L，所述诱导培养基的pH值为5.8；优选地，添加琼脂6000mg/L，蔗糖30000mg/L，活性炭1500mg/L，6-苄氨基腺嘌呤0.5mg/L，香豆素10mg/L，萘乙酸1.0mg/L。
进一步地，所述诱导培养基中，还添加有多效唑0.05-0.5mg/L；优选地，还添加有多效唑0.1mg/L。
进一步地，所述诱导培养中，光照条件为：红光或白光，光周期为16小时光照/天，8小时黑暗/天，光照强度为500-5000LUX，优选为900LUX。
进一步地，所述诱导培养中，温度为20-30℃，优选为25℃；湿度为30-60％，优选为40％。
进一步地，所述紫山药脱毒组培苗的培养方法包括以下步骤：
紫山药无菌组培苗获得步骤：将带腋芽的紫山药的茎段作为外植体，进行清洗处理和灭菌处理，得到灭菌后的茎段；再将所述灭菌后的茎段进行继代培养，得到无菌组培苗；
紫山药脱毒组培苗的获得：切取所述无菌组培苗的顶芽，培养得到不含病毒的幼苗；将所述不含病毒的幼苗再进行继代繁殖，得到脱毒组培苗。
进一步地，所述继代繁殖采用的继代培养基为：以MS基本培养基为基础，添加琼脂6000mg/L，蔗糖30000mg/L，活性炭1500mg/L；所述继代培养基的pH值为5.8。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
1、本发明通过添加有活性炭，6-BA、香豆素、NAA的诱导培养基，与光照条件等协同作用，可以提高紫山药脱毒组培苗经诱导培养得到微型薯块的发生率。
2、本发明操作简便易行，成本低廉，适合广泛使用。
附图说明
图1为实施例1的紫山药试管苗的照片。
图2为对比例1中对照组1的紫山药试管苗的照片。
具体实施方式
本发明提供一种诱导紫山药微型种薯的培养方法，该培养方法以紫山药脱毒组培苗为诱导材料进行诱导培养，得到微型薯块；该培养方法包括以下步骤：
步骤一、脱毒组培苗培养：将紫山药的外植体培养为无菌组培苗，再切取该无菌组培苗的顶芽，培养成为脱毒组培苗。
(1)、试验之前准备工作：准备操作工具(如刀片、解剖针等)、烧杯、量筒、无菌水、培养皿、灭菌后的吸水纸等；
(2)、无菌组培苗的获得：从室外选择长势健壮、没有病虫危害的、带3～4叶的、尤其带有茎尖部位最好的紫山药的茎段作为外植体；将该茎段带入室内，把叶子剪掉，留下带腋芽的茎段；将该带腋芽的茎段进行清洗处理：放入烧杯，加入洗涤灵3毫升，加水300毫升，搅拌5分钟；再用流水冲洗20min，得到清洗后的茎段；
之后将该清洗后的茎段用保鲜膜包好，转入超净台操作，进行灭菌处理：首先放置于75％酒精溶液中消毒30s，再用20％的次氯酸钠溶液浸泡10min，再用无菌水冲洗5次，再放在吸水纸上吸干，得到灭菌后的茎段；
再用剪刀把灭菌后的茎段的基部受损部分切除，将剩余部分插入MS基本培养基内；进行观察，7天后，挑出没有污染的茎段，于MS基本培养基上继续培养，得到无菌组培苗；
(3)、不含病毒的幼苗的获得：选取生长良好的无菌组培苗，用无菌解剖刀切取无菌组培苗1-2毫米长的顶芽，将切取的顶芽转移至新鲜的MS基本培养基中继续生长；每次切取顶芽后，必须对解剖刀进行火焰高温灭菌，以防解剖刀交叉污染；当顶芽经过4周的培养形成无菌幼苗后，检查每株幼苗的病毒含量，将不含病毒的幼苗用于下一步的继代繁殖；
步骤二、脱毒组培苗的继代繁殖：在超净工作台中，取上述不含病毒的幼苗的带有叶片的茎段(长度为1-2cm)5-7段，置于继代培养基进行继代繁殖：培育间温度为25℃，湿度为40％，光照为白色日光灯，光照强度为3000LUX，光周期为16小时光照/天，8小时黑暗/天；得到脱毒组培苗。
继代培养基为：以MS基本培养基为基础，添加琼脂6000mg/L，蔗糖30000mg/L，活性炭1500mg/L，继代培养基的pH值为5.8。
步骤三、微型种薯诱导培养：在超净工作台中，取脱毒组培苗的带有叶片的茎段(长度为1-2cm)，置于诱导培养基进行诱导培养，得到微型薯块。
该诱导培养基为，以MS基本培养基为基础，添加有：琼脂(Agar)4000-8000mg/L，蔗糖10000-80000mg/L，活性炭500-2500mg/L，6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)0.1-1mg/L，香豆素5-20mg/L，萘乙酸(NAA)0.5-2.0mg/L，诱导培养基的pH值为5.8；
示例性地，该诱导培养基中添加有：
琼脂可以为4000mg/L、5000mg/L、6000mg/L、7000mg/L、8000mg/L等中任意或任意两者之间的范围，优选为6000mg/L，
蔗糖可以为10000mg/L、20000mg/L、30000mg/L、40000mg/L、50000mg/L、60000mg/L、70000mg/L、80000mg/L等中任意或任意两者之间的范围，优选为30000mg/L，
活性炭可以为500mg/L、1000mg/L、1500mg/L、2000mg/L、2500mg/L等中任意或任意两者之间的范围，优选为1500mg/L，
6-苄氨基腺嘌呤可以为0.1mg/L、0.3mg/L、0.5mg/L、0.8mg/L、1mg/L等中任意或任意两者之间的范围，优选为0.5mg/L，
香豆素可以为5mg/L、8mg/L、10mg/L、13mg/L、15mg/L、18mg/L、20mg/L等中任意或任意两者之间的范围，优选为10mg/L，
萘乙酸可以为0.5mg/L、0.8mg/L、1mg/L、1.3mg/L、1.5mg/L、1.8mg/L、2.0mg/L等中任意或任意两者之间的范围，优选为1mg/L；
上述诱导培养基中，可以再添加有多效唑0.05-0.5mg/L(示例性地，可以为0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L、0.4mg/L、0.5mg/L等中任意或任意两者之间的范围)，优选地为0.1mg/L；
上述MS基本培养基(不含蔗糖和琼脂)的成分为：
大量元素，包括：
硝酸钾(KNO3)：1900mg/L，硝酸铵(NH4NO3)：1650mg/L，硫酸镁(MgSO4·7H2O)：370mg/L，磷酸二氢钾(KH2PO4)：170mg/L，氯化钙(CaCl2·2H2O)：440mg/L；
微量元素，包括：
硫酸锰(MnSO4·H2O)：16.9mg/L，硫酸锌(ZnSO4·7H2O)：8.6mg/L，硼酸(H3BO3)：6.2mg/L，碘化钾(KI)：0.83mg/L，钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)：0.25mg/L，硫酸铜(CuSO4·5H2O)：0.025mg/L，氯化钴(CoCl2·6H2O)：0.025mg/L；
铁盐，包括：
二水合乙二胺四乙酸二钠(Na2-EDTA)：37.3mg/L，硫酸亚铁(FeSO4·4H2O)：27.8mg/L；
有机物，包括：
甘氨酸：2.0mg/L，盐酸吡哆醇：0.5mg/L，盐酸硫胺素：0.1mg/L，烟酸：0.5mg/L，肌酸：100mg/L；
该诱导培养中，光照条件为：红光，光周期为16小时光照，8小时黑暗；光照强度为500-5000LUX(示例性地，可以为500LUX、700LUX、1000LUX、2000LUX、3000LUX、5000LUX、8000LUX、9000LUX等中任意或任意两者之间的范围，优选为900LUX)；温度为20-30℃，优选为25℃；湿度为30-60％，优选为40％。
上述诱导培养3周后，微型薯块的发生率达到40％以上；微型薯块的发生率＝形成的微型薯块数/接种的脱毒组培苗茎段数。
以上方法通过诱导培养基，与光照条件等协同作用，可以提高紫山药脱毒组培苗经诱导培养得到微型薯块的诱导率。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。对外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1：
一种诱导紫山药微型种薯的培养方法，包括以下步骤：
在超净工作台中，无菌操作取脱毒组培苗的带有叶片的茎段(长度为1.5cm)，置于诱导培养基进行诱导培养，得到微型薯块；
该诱导培养基为，以MS基本培养基为基础，添加琼脂6000mg/L，蔗糖30000mg/L，活性炭1500mg/L，6-BA 0.5mg/L，香豆素10mg/L，PP3330.1mg/L，NAA 1.0mg/L，所述诱导培养基的pH值为5.8。
该诱导培养中，光照条件为：红光(LED灯)，光周期为16小时光照，8小时黑暗，光照强度为900LUX；温度为25℃；湿度为40％。
上述诱导培养3周后，微型薯块的发生率为67％。
实施例2：
一种诱导紫山药微型种薯的培养方法，包括以下步骤：
在超净工作台中，无菌操作取脱毒组培苗的带有叶片的茎段(长度为1.5cm)，置于诱导培养基进行诱导培养，得到微型薯块；
该诱导培养基为，以MS基本培养基为基础，添加琼脂6000mg/L，蔗糖30000mg/L，活性炭1500mg/L，6-BA 0.5mg/L，香豆素10mg/L，PP3330.1mg/L，NAA 1.0mg/L，所述诱导培养基的pH值为5.8。
该诱导培养中，光照条件为：白光(日光灯)，光周期为16小时光照，8小时黑暗，光照强度为3000LUX；温度为25℃；湿度为40％。
上述诱导培养3周后，微型薯块的发生率为64％。
实施例3：
一种诱导紫山药微型种薯的培养方法，包括以下步骤：
在超净工作台中，无菌操作取脱毒组培苗的带有叶片的茎段(长度为1.5cm)，置于诱导培养基进行诱导培养，得到微型薯块；
该诱导培养基为，以MS基本培养基为基础，添加琼脂6000mg/L，蔗糖30000mg/L，活性炭1500mg/L，6-BA 0.5mg/L，香豆素10mg/L，PP3330mg/L，NAA1.0mg/L，所述诱导培养基的pH值为5.8。
该诱导培养中，光照条件为：红光(LED灯)，光周期为16小时光照，8小时黑暗，光照强度为900LUX；温度为25℃；湿度为40％。
上述诱导培养3周后，微型薯块的发生率为60％。
实施例4：
一种诱导紫山药微型种薯的培养方法，包括以下步骤：
在超净工作台中，无菌操作取脱毒组培苗的带有叶片的茎段(长度为1.5cm)，置于诱导培养基进行诱导培养，得到微型薯块；
该诱导培养基为，以MS基本培养基为基础，添加琼脂6000mg/L，蔗糖30000mg/L，活性炭1500mg/L，6-BA 1.0mg/L，香豆素10mg/L，PP3330.1mg/L，NAA 1.0mg/L，所述诱导培养基的pH值为5.8。
该诱导培养中，光照条件为：红光(LED灯)，光周期为16小时光照，8小时黑暗，光照强度为900LUX；温度为25℃；湿度为40％。
上述诱导培养3周后，微型薯块的发生率为55％。
实施例5：
一种诱导紫山药微型种薯的培养方法，包括以下步骤：
在超净工作台中，无菌操作取脱毒组培苗的带有叶片的茎段(长度为1.5cm)，置于诱导培养基进行诱导培养，得到微型薯块；
该诱导培养基为，以MS基本培养基为基础，添加琼脂6000mg/L，蔗糖30000mg/L，活性炭1500mg/L，6-BA 0.5mg/L，香豆素20mg/L，PP3330.1mg/L，NAA 1.0mg/L，所述诱导培养基的pH值为5.8。
该诱导培养中，光照条件为：红光(LED灯)，光周期为16小时光照，8小时黑暗，光照强度为3000LUX；温度为25℃；湿度为40％。
上述诱导培养3周后，微型薯块的发生率为48％。
对比例1：
本对比例为实施例1的诱导培养与对照组1的诱导培养的对比。
对照组1的诱导培养条件参见实施例1，区别在于：
A、采用的诱导培养基为：
以MS基本培养基为基础，添加琼脂6000mg/L，蔗糖80000mg/L，活性炭1500mg/L，6-BA 2mg/L，NAA 1.0mg/L，pH值为5.8。
B、光照条件为：白光(日光灯管)，光周期为16小时光照，8小时黑暗，光照强度为900LUX；温度为25℃；湿度为40％。
3周后，实施例1的微型薯块的发生率为67％；对比例1的微型薯块的发生率为20％。
实施例1的紫山药试管苗生长速度缓慢，新生的叶片小且叶子发白，但是微型薯块发生时间在接种后2-3周(箭头指向微型薯块)，参见图1；对照组1的紫山药试管苗生长正常，新生的叶片大而且紫绿，但是微型薯块发生时间较长，需要连续培养5-6周后才出现微型薯块(箭头指向微型薯块)，参见图2。
由此可见，两种条件下微型薯块的质量相当，但对照组1的材料和能耗较实施例1高，且微型薯块的诱导率低于实施例1。
对比例2：
本对比例为实施例1的诱导培养与对照组2-6的诱导培养的对比。
对照组2-6的诱导培养条件参见实施例1，区别在于：
A、采用的诱导培养基为：以MS基本培养基为基础，添加的试剂详见下表。
B、光照条件详见下表；温度为25℃；湿度为40％。
3周后，对照组2的微型薯块的发生率为2％，对照组3-5的微型薯块的发生率均为0％，对照组6的微型薯块的发生率为15％。
由此可见，在紫山药微型种薯的诱导培养中，需要适合的培养基成分、培养条件等协同作用，才能达到理想的微型薯块发生率。由以上实验组合的紫山药微型种薯诱导率发现，紫山药微型种薯的形成与不同激素的组合、光周期密切相关。细胞分裂素类激素，如6-BA在微型种薯的形成上非常关键，如果缺少细胞分裂素，紫山药的微型种薯很难形成。其次生长素类激素如NAA和蔗糖的浓度对微型种薯的形成也有重要作用。光质和光周期对微型种薯的形成也有一定的影响，红光较白光和蓝光更容易诱导形成微型种薯，短的光照时间也有利于微型种薯的形成。矮壮素PP333和香豆素在微型种薯的生长上有一定的促进作用。因此，在紫山药微型种薯的诱导培养中，需要适合的激素组合和合适的激素浓度、合适的培养条件等协同作用，才能达到理想的微型薯块发生率。
Claims (7)
1.一种诱导紫山药微型种薯的培养方法，其特征在于：该培养方法以紫山药脱毒组培苗为诱导材料进行诱导培养，得到微型薯块。
2.根据权利要求1所述诱导紫山药微型种薯的培养方法，其特征在于：所述诱导培养中，采用的诱导培养基为，以MS基本培养基为基础，添加琼脂4000-8000mg/L，蔗糖10000-80000mg/L，活性炭500-2500mg/L，6-苄氨基腺嘌呤0.1-1mg/L，香豆素5-20mg/L，萘乙酸0.5-2.0mg/L，所述诱导培养基的pH值为5.8；
优选地，添加琼脂6000mg/L，蔗糖30000mg/L，活性炭1500mg/L，6-苄氨基腺嘌呤0.5mg/L，香豆素10mg/L，萘乙酸1.0mg/L。
3.根据权利要求2所述诱导紫山药微型种薯的培养方法，其特征在于：所述诱导培养基中，还添加有多效唑0.05-0.5mg/L；优选地，还添加有多效唑0.1mg/L。
4.根据权利要求2或3所述诱导紫山药微型种薯的培养方法，其特征在于：所述诱导培养中，光照条件为：红光或白光，光周期为16小时光照/天，8小时黑暗/天，光照强度为500-5000LUX，优选为900LUX。
5.根据权利要求2或3所述诱导紫山药微型种薯的培养方法，其特征在于：所述诱导培养中，温度为20-30℃，优选为25℃；湿度为30-60％，优选为40％。
6.根据权利要求2或3所述诱导紫山药微型种薯的培养方法，其特征在于：所述紫山药脱毒组培苗的培养方法包括以下步骤：
紫山药无菌组培苗获得步骤：将带腋芽的紫山药的茎段作为外植体，进行清洗处理和灭菌处理，得到灭菌后的茎段；再将所述灭菌后的茎段进行继代培养，得到无菌组培苗；
紫山药脱毒组培苗的获得：切取所述无菌组培苗的顶芽，培养得到不含病毒的幼苗；将所述不含病毒的幼苗再进行继代繁殖，得到脱毒组培苗。
7.根据权利要求6所述诱导紫山药微型种薯的培养方法，其特征在于：
所述继代繁殖采用的继代培养基为：以MS基本培养基为基础，添加琼脂6000mg/L，蔗糖30000mg/L，活性炭1500mg/L；所述继代培养基的pH值为5.8。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150408 |