CN101953301A - 一种木麻黄无菌试管苗的生根方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种木麻黄无菌试管苗的生根方法，包括无菌操作条件下，在无菌试管苗的基部切出一个新鲜伤口，然后将无菌试管苗的基部插入灭菌冷却后含20-30μM萘乙酸和15-25g/L蔗糖的MSC液体培养基中，于温度27±3℃，每天光照12-20小时，光照强度45-60μmol/m2/s的条件下培养2-3天；随之将无菌试管苗取出，用灭菌去离子水清洗无菌试管苗的基部2-5次；将无菌试管苗转入灭菌冷却后含蔗糖30-50g/L的MSC液体培养基中，于温度27±3℃，每天光照12-20小时，光照强度45-60μmol/m2/s的条件下培养1-2周。本发明的木麻黄无菌试管苗的生根方法能够快速高效，培养10天就能生根，生根率高，培养两周生根率可以达到100％，生根数多，且根伸长生长明显。
Description
技术领域
本发明属于植物无性繁殖技术领域，具体地说，本发明涉及一种木麻黄无菌试管苗的生根方法。
背景技术
木麻黄是具有重要生态、社会和经济效益的树种，研究和开发该树种具有全球影响意义。目前世界热带和亚热带地区种植木麻黄人工林面积约200万公顷。木麻黄是营建沿海防护林的主要树种，也是农田防护林和退化地植被恢复的先锋树种，其木材可生产柱材、薪炭材、板材和纸浆等。目前，我国木麻黄人工林种植面积已达30多万公顷。木麻黄在我国华南沿海地区的防风固沙、植被恢复方面起到不可替代的作用；以木麻黄为主营造的沿海防护林被誉为华南沿海的“绿色长城”，庇护着我国华南沿海6000多公里海岸线上人民的生命和财产安全。
然而，我国木麻黄沿海防护林业面临着诸多问题，如基因资源的缺乏、种源单一、无性系选择范围狭窄。因此，研究和培育木麻黄新材料、新品种，丰富木麻黄种质和基因资源显得尤为迫切。近年来，随着研究的深入，国内学者已经陆续通过转基因技术研究创造木麻黄新材料、新品种。而无菌试管苗的生根培养是能否将这些新材料培育成完整植株的关键基础技术。
传统木麻黄水培生根培养是将2～3月龄的木麻黄枝条或萌芽条的半木质化的粗壮小枝末梢，用50ppm浓度的萘乙酸(naphthlcetic acid)或吲哚丁酸(indolebutyric acid)溶液处理24小时，之后用自来水冲洗浸泡部位，重新插入装有自来水的培养瓶中，置于充足的直射阳光下诱导培养，每隔24小时更换一次自来水，直到生根为止，通常需要大概2周左右才能顺利生根(梁子超等，1982；柯玉铸等，2000)。
众所周知，植物在无菌试管环境中培养，跟一般温室的培养条件差异很大。对木麻黄无菌试管苗来说，无法通过传统水培法诱导培养生根，因为传统木麻黄水培法需要充足的太阳光和持续频繁的更换培养液等条件，这些严重制约了传统木麻黄水培生根法适用于无菌试管苗的生根培养。因为没有直射阳光，加上无菌试管苗幼嫩(未木质化)，且频繁更换培养液也容易造成污染等。
因此，有人提出将无菌试管苗在没有根的情况直接拿去温室炼苗，再用传统水培方法培养生根，试验发现，这种方法生根率很低，并且无菌试管苗容易在没有生根前就枯死。也有研究者(Duhoux等，1990；Parthiban等，1996)将无菌试管苗在添加激素和活性炭等物质的固体培养基中诱导生根，但生根率不高，诱导生根的时间较长，并且容易诱导无菌试管苗基部伤口产生愈伤组织。此外，也有研究者将通常用于木麻黄组织培养的固体培养基换成液体培养基进行无菌试管苗诱导生根培养，生根率能达到50％左右，但根的伸长生长受到抑制，根伸长生长缓慢，伤口也会产生愈伤组织，效果同样不理想。
所以，研究和探索一种能够使木麻黄无菌试管苗快速高效生根的方法显得尤为重要，这关系到新形式新技术条件下，木麻黄在无性繁殖、基因遗传转化、资源保存等诸多研究领域的工作顺利开展。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种木麻黄无菌试管苗快速高效的生根方法。
为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案：
一种木麻黄无菌试管苗的生根方法，包括以下步骤：
(1)无菌操作条件下，在无菌试管苗的基部切出一个新鲜伤口，迅速将无菌试管苗的基部插入含20-30μM萘乙酸和15-25g/L蔗糖的无菌MSC液体培养基中，于温度27±3℃，每天光照12-20小时，光照强度45-60μmol/m2/s的条件下培养2-3天；
(2)将无菌试管苗取出，用灭菌去离子水清洗无菌试管苗的基部2-5次；
(3)将无菌试管苗转入含蔗糖30-50g/L的MSC液体培养基中，于温度27±3℃，每天光照12-20小时，光照强度45-60μmol/m2/s的条件下培养1-2周。
优选地，步骤(1)中所述萘乙酸的浓度为25μM，所述蔗糖的浓度为20g/L步骤(3)中所述蔗糖的浓度为40g/L。
优选地，步骤(1)中于温度27℃，每天光照16小时，光照强度50μmol/m2/s的条件下培养3天；步骤(2)中用无菌水清洗无菌试管苗的基部3次；步骤(3)中于温度27℃，每天光照16小时，光照强度50μmol/m2/s的条件下培养2周。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.本发明的木麻黄无菌试管苗的生根方法能够快速高效，培养10天就能生根，生根率高，培养两周生根率可以达到100％；且根伸长生长明显。
2.本发明方法不需要太阳光直射光照，也不需要频繁更换培养液，操作简单，成本低廉，容易推广，具有广阔的发展前景。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步阐述，其目的仅在于更好地理解本发明的内容，本发明的保护范围包括并不仅限于所举之例。
实施例1
一种木麻黄无菌试管苗的生根方法，步骤如下：
(1)配制含25μM萘乙酸和20g/L蔗糖的MSC液体培养基(改良培养基，含1/2MS培养基大量元素和1/1MS培养基微量元素，以及NN培养基的维他命)，用0.1M KOH调pH 5.6。
MSC液体培养基的成分是：NH4NO3 825mg/L，KNO3 950mg/L，CaCl2·2H2O220mg/L，MgSO4·7H2O 185mg/L，KH2PO4 85mg/L，KI 0.83mg/L，H3BO3 6.2mg/L，MnSO4·4H2O 22.3mg/L，ZnSO4·7H2O 8.6mg/L，NaMoO4·2H2O 0.25mg/L，CoCl2·6H2O 0.025mg/L，CuSO4·5H2O 0.025mg/L，Na2FeEDTA(FeSO4·7H2O27.8mg/L，Na2EDTA·2H2O 37.3mg/L)，生物素0.05mg/L，叶酸5mg/L，甘氨酸2mg/L，肌醇100mg/L，烟酸5mg/L，维生素B6 0.05mg/L，维生素B1 0.05mg/L。
(2)在试管(25×200mm)底部放入滤纸和棉花做支撑物，装入30ml步骤(1)配制好的液体培养基，塞好透气性良好的胶塞，将试管置于121℃灭菌20分钟。取出放入超净工作台冷却至室温。
(3)在超净工作台下，用消毒镊子将无菌试管苗从培养瓶中取出，用灭菌手术刀或剪刀在苗的基部切出新鲜伤口，迅速将苗的基部插入到步骤(2)灭菌冷却好的试管中，使浸入培养液的基部控制在0.5～1cm，用透气胶塞塞紧试管口。
(4)将试管置于温度27±1℃，每天光照16小时，光照强度50μmol/m2/s的培养箱中培养3天。
(5)培养3天后，将无菌试管苗取出，用灭菌去离子水冲洗苗的基部三次。
(6)将无菌试管苗转入装有含40g/L蔗糖的MSC液体培养基灭菌试管中，试管置于温度27±1℃，每天光照16小时，光照强度50μmol/m2/s的培养箱中培养1周以上就能看到无菌试管苗成功诱导生根，随着继续培养，诱导生根率达到100％，并且根的伸长生长也十分明显，当根长达到3cm左右就能进行温室炼苗，移栽成活率高。
采用实施例1的条件，做了5次重复试验，每次重复采用6株无菌试管苗进行试验，对生根后的数据进行统计分析，生根率为100％，生根苗的平均生根数2.26，生根苗的平均最长根长是2.83cm。
实施例2
除了步骤(1)中MSC液体培养基中含20μM萘乙酸和15g/L蔗糖，步骤(6)的MSC液体培养基中含35g/L蔗糖外，其他操作均与实施例1相同。
采用实施例2的条件，做了5次重复试验，每次重复采用6株无菌试管苗进行试验，对生根后的数据进行统计分析，生根率为92.5％，生根苗的平均生根数1.72，生根苗的平均最长根长是1.63cm。
实施例3
除了步骤(1)中MSC液体培养基中含30μM萘乙酸和25g/L蔗糖，步骤(6)的MSC液体培养基中含48g/L蔗糖外，其他操作均与实施例1相同。
采用实施例2的条件，做了5次重复试验，每次重复采用6株无菌试管苗进行试验，对生根后的数据进行统计分析，生根率为86.0％，生根苗的平均生根数1.35，生根苗的平均最长根长是3.12cm。
实施例4 本发明方法与现有生根方法的比较
本发明方法与传统水培生根方法和现有的无菌试管苗生根方法的比较如表1。
表1
从表1可以看出，采用本发明的生根方法较传统水培生根方法和现有的无菌试管苗生根方法，生根率最高，生根数多，根伸长生长更明显。
以上是针对本发明的可行实施例的具体说明，但该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。
Claims (6)
1.一种木麻黄无菌试管苗的生根方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)无菌操作条件下，在无菌试管苗的基部切出一个新鲜伤口，迅速将无菌试管苗的基部插入含20-30μM萘乙酸和15-25g/L蔗糖的无菌MSC液体培养基中，于温度27±3℃，每天光照12-20小时，光照强度45-60μmol/m2/s的条件下培养2-3天；
(2)将无菌试管苗取出，用灭菌去离子水清洗无菌试管苗的基部2-5次；
(3)将无菌试管苗转入含蔗糖30-50g/L的MSC液体培养基中，于温度27±3℃，每天光照12-20小时，光照强度45-60μmol/m2/s的条件下培养1-2周。
2.根据权利要求1所述的木麻黄无菌试管苗的生根方法，其特征在于，步骤(1)中所述萘乙酸的浓度为25μM，所述蔗糖的浓度为20g/L。
3.根据权利要求1所述的木麻黄无菌试管苗的生根方法，其特征在于，步骤(3)中所述蔗糖的浓度为40g/L。
4.根据权利要求1所述的木麻黄无菌试管苗的生根方法，其特征在于，步骤(2)中用无菌水清洗无菌试管苗的基部3次。
5.根据权利要求1所述的木麻黄无菌试管苗的生根方法，其特征在于，步骤(1)中于温度27℃，每天光照16小时，光照强度50μmol/m2/s的条件下培养3天。
6.根据权利要求1所述的木麻黄无菌试管苗的生根方法，其特征在于，步骤(3)中于温度27℃，每天光照16小时，光照强度50μmol/m2/s的条件下培养2周。
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