CN104396751A - 一种在液体培养基中培养铁皮石斛的方法 - Google Patents

一种在液体培养基中培养铁皮石斛的方法 Download PDF

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杨林森
王静
黄芳
袁莉
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Abstract

本发明公开了一种在液体培养基中培养铁皮石斛的方法，包括萌发培养、增殖培养和分化培养，其特征在于，萌发培养、增殖培养和分化培养在液体培养基中进行，在液体培养基中放置棉花，棉花的至少一部分浸入液体培养基中，至少另一部分未浸入液体培养基，在棉花上方放置滤纸，在滤纸上进行萌发培养、增殖培养和分化培养。本发明通过在液体培养基中放入合适的棉花等支持体，将培养物接种在支持体上表面，并使表面保持湿润，即可解决固体培养基存在的代谢物累积与培养基中营养成分难以扩散分布失衡的问题。

Description

一种在液体培养基中培养铁皮石斛的方法
技术领域
本发明涉及一种生物技术领域，主要应用于石斛属植物的扩繁培育，特别涉及一种在液体培养基中培养铁皮石斛的方法。
背景技术
石斛属植物组织培养过程的培养基主要是固体培养基，即在液体培养基中加入适量琼脂加热至100℃溶解，40℃下冷却并凝固成为固体状态。也有一些培养方法中在原球茎增殖阶段用液体培养基振荡培养。琼脂加营养液制成的固体培养基在培养过程中产生诸多问题，如固体培养基易造成干化较快，培养体附近代谢产物累积及培养基中的营养成分难以有效输送，在培养物周边容易累积代谢产物，培养物周边营养物分布不均衡，抑制愈伤组织生长等问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种液体培养基；
本发明的另一目的是提供一种在液体培养基中培养铁皮石斛的方法。
本发明提供的技术方案为：
一种在液体培养基中培养铁皮石斛的方法，包括萌发培养、增殖培养和分化培养，所述萌发培养、增殖培养和分化培养在液体培养基中进行，在液体培养基中放置棉花，棉花的至少一部分浸入液体培养基中，至少另一部分未浸入液体培养基，在棉花上方放置滤纸，在所述滤纸上进行所述萌发培养、增殖培养和分化培养。将配制好的液体培养基注入培养瓶中，加入适量棉花，使棉花均匀分布在瓶内，并且不随液体晃动，棉花上表面平整并稍高于液面以上0.3cm，将稍小于瓶内径的圆形滤纸平置瓶内，与棉花表面较好的接触。将液体培养基、棉花和滤纸在高压锅中进行常规消毒。本发明通过在液体培养基中放入合适的棉花等支持体，将培养物接种在支持体上表面，并使表面保持湿润，即可解决固体培养基存在的代谢物累积与培养基中营养成分难以扩散分布失衡的问题。
优选的是，所述的在液体培养基中培养铁皮石斛的方法中，所述萌发培养中，将铁皮石斛种子在温度23～27℃，光周期10～12小时/日和光照度1000～2000lx条件下培养55～70天至其萌发形成淡绿色的团簇状原球茎；
所述萌发培养中的液体培养基包含：1/2MS和20g/L蔗糖，其初始pH值为5.8。
优选的是，所述的在液体培养基中培养铁皮石斛的方法中，在所述萌发培养之后进行所述增殖培养，将萌发培养所得的原球茎在温度23～27℃，光周期10～12小时/日和光照度1000～2000lx条件下培养45～60天；
所述增殖培养中的液体培养基包含：1/2MS，6-BA 0.5mg/L，NAA 0.5mg/L，蔗糖20g/L和质量分数为20％的马铃薯提取液，其初始pH值为5.8。
优选的是，所述的在液体培养基中培养铁皮石斛的方法中，在所述增值培养之后进行所述分化培养，将经过增殖培养的原球茎在温度23～27℃，光周期10～12小时/日和光照度1000～2000lx条件下，培养45～60天至其分化长成0.5～1cm高的小苗；
所述分化培养中的液体培养基包含：MS，6-BA 0.5mg/L，NAA 0.1mg/L，蔗糖20g/L和质量分数20％的马铃薯提取液，其初始pH值为5.8。
优选的是，所述的在液体培养基中培养铁皮石斛的方法中，所述棉花为脱脂棉。脱脂棉易得，且吸湿性更好，灭菌后更不容易污染。
优选的是，所述的在液体培养基中培养铁皮石斛的方法中，还包括在所述分化培养后进行壮苗培养，所述壮苗培养为将分化长成的小苗在温度为23～28℃，湿度为65～75％，光照度为1500～2500lx和光照时间为12小时/日的条件下培养60～70天，至小苗高度达5～8cm；
所述壮苗培养中的液体培养基包含：1/2MS，NAA 0.5mg/L，质量分数10％的马铃薯提取液，质量分数10％的香蕉汁提取液，蔗糖20g/L和琼脂6.8g/L，其初始pH值为5.8。
优选的是，所述的在液体培养基中培养铁皮石斛的方法中，在所述壮苗培养后还包括将所述小苗进行炼苗，之后再进行栽植。
本发明通过在液体培养基中放入合适的棉花等支持体，将培养物接种在支持体上表面，并使表面保持湿润，即可解决固体培养基存在的代谢物累积与培养基中营养成分难以扩散分布失衡的问题。
本发明是在瓶装液体培养基中加入适量脱脂棉后在上表面平置滤纸作为支持体。使填充的脱脂棉在瓶内不致随液体而晃动并略高于液面，将种子或外植体等接种在滤纸表面进行培养。培养液的配方可以根据外植体、培养阶段及培养目标不同而调整。
本发明通过采用简便易得的材料解决了使用固体培养基培养铁皮石斛中的诸多问题，使用液体培养基培养铁皮石斛，培养体附近代谢产物累积及培养基中的营养成分能有效输送，培养基周边不易累积代谢产物，培养物周边营养物分布均衡，愈伤组织生长良好。
具体实施方式
下面对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
本发明中使用的滤纸为“双圈”牌，购买自杭州沃华滤纸有限公司；
本发明中的脱脂棉为“徐卫”牌，购买自徐州市徐卫卫生材料有限责任公司。
本发明中的MS培养基的配方组成如下：
MS培养基
实施例1：
在在液体培养基中培养铁皮石斛的方法，包括如下步骤：
(1)萌发培养：将配制好的液体培养基注入培养瓶中，加入适量脱脂棉，使脱脂棉均匀分布瓶内液体并且不随液体晃动，棉花上表面平整并稍高于液面以上0.3cm，将稍小于瓶内径的圆形滤纸平置瓶内，与棉花表面较好的接触。培养基在高压锅中进行常规消毒。下面(2)-(3)步骤均采用如前的培养基支持体的处理办法。铁皮石斛种球消毒后将种球内的种子接种于培养基的滤纸上。15～20天后，种子萌发增大变成淡绿色。40～50天形成淡绿色的团簇状原球茎。培养基配方为：1/2MS和20g/L蔗糖，培养基初始pH5.8，培养条件为：光照度1000lx，光周期10h/d，温度25℃。
(2)原球茎增殖培养：将原球茎转接入增殖用液体培养基中的滤纸上。培养45～60天，可增殖5～10倍。培养基配方如下：1/2MS，6-BA 0.5mg/L，NAA 0.5mg/L，质量分数20％马铃薯提取液和蔗糖20g/L，初始pH值5.8。
(3)原球茎分化培养：将原球茎转接入分化培养用的液体培养基中的滤纸上，培养40～60天，原球茎不断增殖与分化，培育成0.5～1cm高的小苗。此阶段培养的分化苗会生长出较短的根及形成茎叶。培养基包含：MS，6-BA0.5mg/L，NAA 0.1mg/L，质量分数20％的马铃薯提取液和蔗糖20g/L，初始pH值5.8。
(4)将小苗转接入壮苗培养基，进行促生根及壮苗。此阶段用琼脂固体培养基培养，温度为23℃，湿度为65％，光照度为1500lx，光照时间为12小时/日，培养60～70天，小苗高可达5～8cm。培养基为1/2MS，0.5mg/LNAA，质量分数10％的马铃薯提取液，质量分数10％的香蕉汁提取液，蔗糖20g/L和琼脂6.8g/L，初始pH值5.8。
(5)出瓶栽植培养。石斛苗达到5cm左右即可进行炼苗，再进入大棚栽植或野生环境栽植。
实施例2
一种在液体培养基中培养铁皮石斛的方法，包括萌发培养、增殖培养和分化培养，所述萌发培养、增殖培养和分化培养在液体培养基中进行，在液体培养基中放置棉花，棉花的至少一部分浸入液体培养基中，至少另一部分未浸入液体培养基，在棉花上方放置滤纸，在所述滤纸上进行所述萌发培养、增殖培养和分化培养。
实施例3
一种在液体培养基中培养铁皮石斛的方法，包括萌发培养、增殖培养和分化培养，所述萌发培养、增殖培养和分化培养在液体培养基中进行，在液体培养基中放置棉花，棉花的至少一部分浸入液体培养基中，至少另一部分未浸入液体培养基，在棉花上方放置滤纸，在所述滤纸上进行所述萌发培养、增殖培养和分化培养。
所述萌发培养中，将铁皮石斛种子在温度27℃，光周期12小时/日和光照度2000lx条件下培养55～70天至其萌发形成淡绿色的团簇状原球茎；
所述萌发培养中的液体培养基包含：1/2MS和20g/L蔗糖，其初始pH值为5.8。
在所述萌发培养之后进行所述增殖培养，将萌发培养所得的原球茎在温度27℃，光周期12小时/日和光照度2000lx条件下培养45～60天；
所述增殖培养中的液体培养基包含：1/2MS，6-BA 0.5mg/L，NAA 0.5mg/L，蔗糖20g/L和质量分数为20％的马铃薯提取液，其初始pH值为5.8。
在所述增值培养之后进行所述分化培养，将经过增殖培养的原球茎在温度27℃，光周期12小时/日和光照度2000lx条件下，培养45～60天至其分化长成0.5～1cm高的小苗；
所述分化培养中的液体培养基包含：MS，6-BA 0.5mg/L，NAA 0.1mg/L，蔗糖20g/L和质量分数20％的马铃薯提取液，其初始pH值为5.8。
在所述分化培养后进行壮苗培养，所述壮苗培养为将分化长成的小苗在温度为28℃，湿度为75％，光照度为2500lx和光照时间为12小时/日的条件下培养60～70天，至小苗高度达5～8cm；
所述壮苗培养中的液体培养基包含：1/2MS，NAA 0.5mg/L，质量分数10％的马铃薯提取液，质量分数10％的香蕉汁提取液，蔗糖20g/L和琼脂6.8g/L，其初始pH值为5.8。
在所述壮苗培养后还将所述小苗进行炼苗，之后再进行栽植。
实施例4
一种在液体培养基中培养铁皮石斛的方法，包括萌发培养、增殖培养和分化培养，所述萌发培养、增殖培养和分化培养在液体培养基中进行，在液体培养基中放置脱脂棉，脱脂棉的至少一部分浸入液体培养基中，至少另一部分未浸入液体培养基，在脱脂棉上方放置滤纸，在所述滤纸上进行所述萌发培养、增殖培养和分化培养。
所述萌发培养中，将铁皮石斛种子在温度25℃，光周期11小时/日和光照度1500lx条件下培养55～70天至其萌发形成淡绿色的团簇状原球茎；
所述萌发培养中的液体培养基包含：1/2MS和20g/L蔗糖，其初始pH值为5.8。
所述萌发培养之后进行所述增殖培养，将萌发培养所得的原球茎在温度25℃，光周期11小时/日和光照度1500lx条件下培养45～60天；
所述增殖培养中的液体培养基包含：1/2MS，6-BA 0.5mg/L，NAA 0.5mg/L，蔗糖20g/L和质量分数为20％的马铃薯提取液，其初始pH值为5.8。
在所述增值培养之后进行所述分化培养，将经过增殖培养的原球茎在温度25℃，光周期11小时/日和光照度1500lx条件下，培养45～60天至其分化长成0.5～1cm高的小苗；
所述分化培养中的液体培养基包含：MS，6-BA 0.5mg/L，NAA 0.1mg/L，蔗糖20g/L和质量分数20％的马铃薯提取液，其初始pH值为5.8。
在所述分化培养后进行壮苗培养，所述壮苗培养为将分化长成的小苗在温度为25℃，湿度为70％，光照度为2000lx和光照时间为12小时/日的条件下培养60～70天，至小苗高度达5～8cm；
所述壮苗培养中的液体培养基包含：1/2MS，NAA 0.5mg/L，质量分数10％的马铃薯提取液，质量分数10％的香蕉汁提取液，蔗糖20g/L和琼脂6.8g/L，其初始pH值为5.8。
在所述壮苗培养后将所述小苗进行炼苗，之后再进行栽植。
实施例5
一种在液体培养基中培养铁皮石斛的方法，包括萌发培养、增殖培养和分化培养，所述萌发培养、增殖培养和分化培养在液体培养基中进行，在液体培养基中放置棉花，棉花的至少一部分浸入液体培养基中，至少另一部分未浸入液体培养基，在棉花上方放置滤纸，在所述滤纸上进行所述萌发培养、增殖培养和分化培养。
所述萌发培养中，将铁皮石斛种子在温度24℃，光周期10小时/日和光照度1200lx条件下培养55～70天至其萌发形成淡绿色的团簇状原球茎；
所述萌发培养中的液体培养基包含：1/2MS和20g/L蔗糖，其初始pH值为5.8。
在所述分化培养后进行壮苗培养，所述壮苗培养为将分化长成的小苗在温度为24℃，湿度为68％，光照度为1800lx和光照时间为12小时/日的条件下培养60～70天，至小苗高度达5～8cm；
所述壮苗培养中的液体培养基包含：1/2MS，NAA 0.5mg/L，质量分数10％的马铃薯提取液，质量分数10％的香蕉汁提取液，蔗糖20g/L和琼脂6.8g/L，其初始pH值为5.8。
在所述壮苗培养后还包括将所述小苗进行炼苗，之后再进行栽植。
实施例6
一种在液体培养基中培养铁皮石斛的方法，包括萌发培养、增殖培养和分化培养，所述萌发培养、增殖培养和分化培养在液体培养基中进行，在液体培养基中放置棉花，棉花的至少一部分浸入液体培养基中，至少另一部分未浸入液体培养基，在棉花上方放置滤纸，在所述滤纸上进行所述萌发培养、增殖培养和分化培养。
在所述萌发培养之后进行所述增殖培养，将萌发培养所得的原球茎在温度26℃，光周期11小时/日和光照度1800lx条件下培养45～60天；
所述增殖培养中的液体培养基包含：1/2MS，6-BA 0.5mg/L，NAA 0.5mg/L，蔗糖20g/L和质量分数为20％的马铃薯提取液，其初始pH值为5.8。
在所述分化培养后进行壮苗培养，所述壮苗培养为将分化长成的小苗在温度为27℃，湿度为72％，光照度为2300lx和光照时间为12小时/日的条件下培养60～70天，至小苗高度达5～8cm；
所述壮苗培养中的液体培养基包含：1/2MS，NAA 0.5mg/L，质量分数10％的马铃薯提取液，质量分数10％的香蕉汁提取液，蔗糖20g/L和琼脂6.8g/L，其初始pH值为5.8。
在所述壮苗培养后还包括将所述小苗进行炼苗，之后再进行栽植。
实施例7
一种在液体培养基中培养铁皮石斛的方法，包括萌发培养、增殖培养和分化培养，所述萌发培养、增殖培养和分化培养在液体培养基中进行，在液体培养基中放置脱脂棉，脱脂棉的至少一部分浸入液体培养基中，至少另一部分未浸入液体培养基，在脱脂棉上方放置滤纸，在所述滤纸上进行所述萌发培养、增殖培养和分化培养。
所述萌发培养中，将铁皮石斛种子在温度26℃，光周期12小时/日和光照度1700lx条件下培养55～70天至其萌发形成淡绿色的团簇状原球茎；
所述萌发培养中的液体培养基包含：1/2MS和20g/L蔗糖，其初始pH值为5.8。
在所述增值培养之后进行所述分化培养，将经过增殖培养的原球茎在温度26℃，光周期12小时/日和光照度1700lx条件下，培养45～60天至其分化长成0.5～1cm高的小苗；
所述分化培养中的液体培养基包含：MS，6-BA 0.5mg/L，NAA 0.1mg/L，蔗糖20g/L和质量分数20％的马铃薯提取液，其初始pH值为5.8。
在所述分化培养后进行壮苗培养，所述壮苗培养为将分化长成的小苗在温度为27℃，湿度73％，光照度为1700lx和光照时间为12小时/日的条件下培养60～70天，至小苗高度达5～8cm；
所述壮苗培养中的液体培养基包含：1/2MS，NAA 0.5mg/L，质量分数10％的马铃薯提取液，质量分数10％的香蕉汁提取液，蔗糖20g/L和琼脂6.8g/L，其初始pH值为5.8。
在所述壮苗培养后还包括将所述小苗进行炼苗，之后再进行栽植。
实施例8
一种在液体培养基中培养铁皮石斛的方法，包括萌发培养、增殖培养和分化培养，所述萌发培养、增殖培养和分化培养在液体培养基中进行，在液体培养基中放置棉花，棉花的至少一部分浸入液体培养基中，至少另一部分未浸入液体培养基，在棉花上方放置滤纸，在所述滤纸上进行所述萌发培养、增殖培养和分化培养。
在所述增值培养之后进行所述分化培养，将经过增殖培养的原球茎在温度27℃，光周期12小时/日和光照度2000lx条件下，培养45～60天至其分化长成0.5～1cm高的小苗；
所述分化培养中的液体培养基包含：MS，6-BA 0.5mg/L，NAA 0.1mg/L，蔗糖20g/L和质量分数20％的马铃薯提取液，其初始pH值为5.8。
在所述分化培养后进行壮苗培养，所述壮苗培养为将分化长成的小苗在温度为28℃，湿度为75％，光照度为2500lx和光照时间为12小时/日的条件下培养60～70天，至小苗高度达5～8cm；
所述壮苗培养中的液体培养基包含：1/2MS，NAA 0.5mg/L，质量分数10％的马铃薯提取液，质量分数10％的香蕉汁提取液，蔗糖20g/L和琼脂6.8g/L，其初始pH值为5.8。
在所述壮苗培养后还包括将所述小苗进行炼苗，之后再进行栽植。
本发明培养方法能简化操作，节省人工与用料，经过8～10个月培养，一个种球能培养出1～3万株苗。若对原球茎进行进一步增殖培养，一个种球一年半能培养10余万株苗。
本发明的关键点是将一般的固体培养基表面培养改为液体培养基中加入脱脂棉后在上表面平置滤纸作为支持体的表面培养。操作要点为在培养瓶的液体培养基中加入适量脱脂棉，使填充的脱脂棉在瓶内不随液体而晃动并略高于液面，在脱脂棉上表面平置滤纸作为支持体，将外植体接种在滤纸表面进行培养。培养液的配方可以根据外植体、培养阶段及培养目标不同而调整。本发明可用于石斛属等植物的种子萌发、愈伤组织培养与增殖、原球茎增殖与分化等过程。生根培养与壮苗培养采用琼脂固体培养基培养。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出的实施例。

Claims (7)

1.一种在液体培养基中培养铁皮石斛的方法，包括萌发培养、增殖培养和分化培养，其特征在于，所述萌发培养、增殖培养和分化培养在液体培养基中进行，在液体培养基中放置棉花，棉花的至少一部分浸入液体培养基中，至少另一部分未浸入液体培养基，在棉花上方放置滤纸，在所述滤纸上进行所述萌发培养、增殖培养和分化培养。
2.如权利要求1所述的在液体培养基中培养铁皮石斛的方法，其特征在于，所述萌发培养中，将铁皮石斛种子在温度23～27℃，光周期10～12小时/日和光照度1000～2000lx条件下培养55～70天至其萌发形成淡绿色的团簇状原球茎；
所述萌发培养中的液体培养基包含：1/2MS和20g/L蔗糖，其初始pH值为5.8。
3.如权利要求1所述的在液体培养基中培养铁皮石斛的方法，其特征在于，在所述萌发培养之后进行所述增殖培养，将萌发培养所得的原球茎在温度23～27℃，光周期10～12小时/日和光照度1000～2000lx条件下培养45～60天；
所述增殖培养中的液体培养基包含：1/2MS，6-BA 0.5mg/L，NAA 0.5mg/L，蔗糖20g/L和质量分数为20％的马铃薯提取液，其初始pH值为5.8。
4.如权利要求1～3任一项所述的在液体培养基中培养铁皮石斛的方法，其特征在于，在所述增值培养之后进行所述分化培养，将经过增殖培养的原球茎在温度23～27℃，光周期10～12小时/日和光照度1000～2000lx条件下，培养45～60天至其分化长成0.5～1cm高的小苗；
所述分化培养中的液体培养基包含：MS，6-BA 0.5mg/L，NAA 0.1mg/L，蔗糖20g/L和质量分数20％的马铃薯提取液，其初始pH值为5.8。
5.如权利要求1所述的在液体培养基中培养铁皮石斛的方法，其特征在于，所述棉花为脱脂棉。
6.如权利要求1所述的在液体培养基中培养铁皮石斛的方法，其特征在于，还包括在所述分化培养后进行壮苗培养，所述壮苗培养为将分化长成的小苗在温度为23～28℃，湿度为65～75％，光照度为1500～2500lx和光照时间为12小时/日的条件下培养60～70天，至小苗高度达5～8cm；
所述壮苗培养中的液体培养基包含：1/2MS，NAA 0.5mg/L，质量分数10％的马铃薯提取液，质量分数10％的香蕉汁提取液，蔗糖20g/L和琼脂6.8g/L，其初始pH值为5.8。
7.如权利要求6所述的在液体培养基中培养铁皮石斛的方法，其特征在于，在所述壮苗培养后还包括将所述小苗进行炼苗，之后再进行栽植。
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