CN103688864B - 一种东方百合组培苗壮苗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种东方百合组培壮苗的方法，包括：取东方百合无菌苗的鳞茎，将鳞片置于诱导培养基中进行芽诱导培养；诱导出芽后，将芽接至生根壮球培养基中进行培养，获得组培苗；其中，所述生根壮球培养基的组成为：MS粉，4～5g/L；蔗糖，60～70g/L；琼脂，6～8g/L；腐殖酸，0.2～20mg/L；所述腐殖酸中黄腐酸的含量≥90%。本发明东方百合组培壮苗的方法，能够促进组培苗鳞茎的膨大或/和增重，从而可获得健壮的组培苗，缩短生产周期，节约成本。

Description

一种东方百合组培苗壮苗的方法

技术领域

本发明属于组织培养领域，具体涉及一种东方百合组培壮苗的方法。

背景技术

腐植酸（Humic Acid,HA）是自然界中广泛存在的，由生物（主要是植物）的残骸经过微生物分解和一系列地球化学过程而形成的有机质，是一类成分复杂的天然有机物质。HA由于其结构复杂，属于一种无定型的高分子化合物，通常我们所说HA的分子量，指的是其平均分子量。

1919年Oden提出将HA分为水溶性的黄腐酸、乙醇可溶的棕腐酸和碱溶性的黑腐酸。目前，腐植酸已广泛应用于农林牧、石油、化工、建材、医药卫生、环保等各个领域中，且由于我国泥炭资源中腐植酸含量丰富，具备大量潜在可大力开发的资源。

此外，腐殖酸对植物的生理活动也有促进作用。综合文献报道，其对植物的影响可以概括为以下几个方面，第一，促进种子萌发，类似GA，可使种子提前萌发，且发芽率高，苗全，苗壮。第二，促进根系活力，有“根系肥料”的称号。第三，促进植物中酶活性的增加，使呼吸强度、光合作用强度均有所提高，对物质的合成、运转、积累有利。第四，提高作物抗逆性，包括抗旱、防寒、抗病虫害。而从腐殖酸品种来看，分子量小、活性官能团含量高的黄腐酸对植物的促进作用更为明显，生理活性大。

百合（Lilium spp.）被誉为“球根花卉之王”，是世界五大鲜切花之一。近年来，随着我国国民生活水平的提升，百合消费量亦逐年升高。但长期以来，我国切花百合尤其是主栽品种东方系百合‘索邦’（L.orientalhybrids‘Sorbonne’）商品球长期依赖进口（以荷兰为主），而种球的进口成本则占总生产成本的极高比例。因而，东方百合种球国产化是降低生产成本，提高销售利润的重要途径。

解决种球国产化的一项有效措施是建立完善的新鳞茎培养体系。但目前百合种球工厂化生产中常遇到百合组培苗生长势弱、根叶细长柔软、鳞茎发育慢、移栽过程中成活率低、容易重新感染病毒等突出问题。而这些问题的主要根源则是组培苗移栽时试管球不达标准。

就百合组培工厂化生产而言，如何通过优化组织培养条件，培养膨大的试管鳞茎，从而促进壮苗、改善组培苗质量、缩短组培苗的大田生长周期、提高移栽成活率，又利于种球的贮藏、运输和种质保存，是亟待解决的技术问题。在一些试验中，多效唑可应用于培养健壮的组培苗。如公开号为102090331A的中国专利文献公开了一种郁金香组培苗壮苗的方法，将郁金香组培苗转接到添加了2mg～8mg/L的多效唑的MS液体培养基中培养；培养条件为温度23±2℃，光照1500～2000Lx，湿度75%～80%。然而目前，并未有任何关于腐植酸应用于百合组织培养中的报道。

发明内容

本发明提供了一种东方百合组培苗壮苗的方法，能够有效促进组培苗鳞茎的膨大和增重，改善了鳞茎的质量，有利于获得健壮的组培苗。

一种东方百合组培壮苗的方法，包括：

（1）取东方百合的无菌苗，切割获得鳞茎，从鳞茎上剥取鳞片，将所述鳞片置于诱导培养基中进行芽诱导培养；

（2）诱导出芽后，将芽接至生根壮球培养基中进行培养，获得组培苗；

其中，所述生根壮球培养基的组成为：MS粉，4～5g/L；蔗糖，60～70g/L；琼脂，6～8g/L；腐殖酸，0.2～20mg/L；所述腐殖酸中黄腐酸的含量≥90%。

鳞茎质量的优劣直接影响组培苗的移栽成活率及其在大田的生长周期，本发明对生根壮球培养基进行优化，通过在生根壮球培养基中添加适宜浓度的腐植酸，可促使组培苗的鳞茎膨大，重量增加，提高了鳞茎的质量，从而有助于获得健壮的组培苗。优选的，生根壮球培养基中，所述腐植酸的浓度为0.1～0.3mg/L，更优选的，所述腐殖酸的浓度为0.2mg/L。

本发明中腐殖酸具体可购于上海晶纯生化科技股份有限公司，品牌为阿拉丁，货号为H108498，内含黄腐酸（FA）≥90%，活性官能团含量高。

步骤（1）中，将东方百合无菌苗分为两部分，其中一部分进行基础的增殖培养，另一部分作为生产组培苗的原材料，取其鳞片进行芽诱导培养。这样，在已有的东方百合无菌苗的基础上，无菌苗一方面作为生产组培苗的原材料，另一方面还不断进行基础增殖培养，扩繁大量的东方百合无菌苗，保证了充足材料来生产组培苗，从而形成可循环的程序化操作步骤，缩短生产周期，适合于工业化生产，且所获组培苗均一化程度高。

选取鳞茎时，如果鳞茎过小，鳞片较嫩诱导时不易成活，当鳞茎直径达0.5～0.8cm较为适宜。

鳞茎中不同部位的鳞片诱导出芽的能力按照从外到内逐渐增强，内部鳞片几乎不能形成诱芽，通常，选取鳞茎由外至内的第1～2层鳞片进行芽诱导培养。

一般来说，百合芽点萌发部位均在鳞片内侧基部切口处，因此，在进行芽诱导培养时，将鳞片凹面朝上置于诱导培养基中。

诱导培养基的成分影响芽的诱导率，优选的，所述诱导培养基的组成为：MS粉，4～6g/L；6-BA，1.0～1.5mg/L；NAA，0.1～0.2mg/L；蔗糖，20～30g/L；琼脂，6～8g/L。

进一步优选的，所述诱导培养基的组成为：MS粉，4.43g/L；6-BA，1.0mg/L；NAA，0.2mg/L；蔗糖，20g/L；琼脂，6g/L。

芽诱导培养30～35天后，选取长度为1～2cm，直径为2～5mm的芽，将其进一步转接至生根壮球培养基中，选择该大小的芽培养一定时间，即可生根成球，且根系发达，植株健壮，所述培养的时间一般为55～65天，优选为60天。

上述东方百合组培苗生产过程中的芽诱导培养、生根培养以及东方百合无菌苗的基础增殖培养对应的光温条件与现有技术相近，如均可采用如下条件：温度为25±2℃，光照强度为1500lux，光照时间为12小时/天。

本发明中，所述东方百合的品种具体可以为‘索邦’。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

通常地，百合组培苗的生产主要包括诱导培养、增殖培养、生根培养和壮苗培养，获得的组培苗经炼苗及移栽后可向市场上批量供应，其中诱导培养前提又包含获得无菌苗。本发明在获得的东方百合无菌苗的条件下，便可源源不断的生产组培苗，适合于工厂化生产，同时均是以东方百合无菌苗作为原材料，降低了污染率，也不需要再进行繁琐的消毒灭菌步骤，另外，本发明还将生根培养、壮苗培养合并为一步，简化了生产程序，提高了工效，降低了成本。

本发明以东方百合无菌苗为原材料，通过芽诱导及生根壮球培养，共培养60d，即可得到健壮且根系发达的组培苗，鳞茎直径可达10.137mm，质量可达344mg，约为对照（160mg）的2.15倍，提高了组培苗的出苗质量，生产周期缩短，操作简易，生产成本可控制。

目前，尚未有腐殖酸，尤其是黄腐酸在植物组培方面具备生物学活性的文献报道。

附图说明

图1为东方百合组培苗程序化生产工序。

图2为实施例中东方百合‘索邦’鳞片诱芽培养3d后的图像。

图3为东方百合‘索邦’鳞片诱芽培养10d后的图像。

图4为东方百合‘索邦’鳞片诱芽培养18d后的图像。

图5为东方百合‘索邦’鳞片诱芽培养29d后的图像。

图6为东方百合‘索邦’鳞片诱芽培养35d后的图像。

图7为东方百合‘索邦’在添加0.2mg/L腐殖酸生长60d的生长情况。

具体实施方式

下面结合具体实施方式进一步阐释本发明。

本发明中腐殖酸为购于上海晶纯生化科技股份有限公司，品牌为阿拉丁，内含黄腐酸（FA）≥90%，货号为H108498，活性官能团含量高。

（1）选取生长健壮的东方百合‘索邦’的试管苗。

（2）其中部分试管苗接种于基本繁殖培养基中扩繁初始苗，基本繁殖培养基为：MS粉4.43g/L+蔗糖60g/L+琼脂6g/L，pH5.6～5.7。培养室温度为25±2℃，光照强度为1500lux，光照时间为12小时/天。

（3）剩余部分的试管苗选择0.5～0.8cm直径子球，用手术刀轻轻将根、茎、叶切除，再以此子球为后续试验的母球，剥取中外层鳞片（鳞茎由外至内的第1～2层）待用；

（4）将鳞片凹面朝上置于诱导培养基上进行培养，生长过程见图2～图6，待其生长约30～35d时，转接。其中，诱导培养基为：MS粉4.43g/L+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6g/L，pH5.6～5.7。培养室温度为25±2℃，光照强度为1500lux，光照时间为12小时/天。

（5）选取芽长约1～2cm，直径约2～5mm的芽接种于生根培养基中（含一定浓度腐殖酸的MS固体培养基），即配方为MS粉4.43g/L+琼脂6g/L+腐植酸，pH5.6～5.7。培养室温度为25±2℃，光照强度为1500lux，光照时间为12小时/天；

①试验组A：0.2mg/L腐殖酸的MS固体培养基。

②试验组B：2mg/L腐殖酸的MS固体培养基。

③试验组C：20mg/L腐殖酸的MS固体培养基。

④对照组：不添加任何激素的MS固体培养基。

培养60天后，统计各组株高、叶片数、重量、根长、鳞茎直径等指标。每个指标随机选取10株组培苗进行统计，其中，株高、根长采用直尺测定，植株总重、鳞茎重量采用百分之一电子天平测定，鳞茎直径采用电子游标卡尺测定。

表1不同浓度腐殖酸对东方百合试管鳞茎生根壮苗的影响

通过表1可得，在三组不同腐殖酸浓度处理下，组培苗株高及叶片数均等于或高于对照组，平均株高为4.43cm，为对照（3.60cm）的1.23倍。相似的，叶片数更繁茂，达3.4片，对照仅为2.0。有研究表明，腐殖酸可以促进Mg²⁺或Fe²⁺的吸收，从而使叶绿素含量增加，叶绿素含量增加会导致光合作用加强，并会使干物质积累增加。可以推测，在较低浓度下，腐殖酸促进了光合作用（组培室白炽灯包含红光及蓝紫光，此两种光为主要的光合作用吸收波长，故组培苗同样在进行高效的光合作用），增加了有机物的积累，其中一种重要的形式为淀粉，为百合鳞茎的主要组成部分。

在添加腐殖酸的条件下，植株总重、鳞茎重量、鳞茎直径三个关键指标均显示，当腐殖酸浓度低于20mg/L时，均显著高于对照，其中以0.2mg/L最为有效，分别为对照的2.68倍、2.15倍、1.45倍。

总体而言，在腐殖酸处理下，浓度在0.2mg/L至20mg/L间，东方百合‘索邦’生长情况均优于对照，组培苗植株健硕，根系完整粗壮，未产生畸形现象，其中又以极低浓度0.2mg/L最佳，生长60d时，鳞茎鲜重可达344mg，直径达10.137mm，参照图7。

Claims (6)

1.一种东方百合组培苗壮苗的方法，包括：

(1)取东方百合的无菌苗，切割获得鳞茎，从鳞茎上剥取鳞片，将所述鳞片置于诱导培养基中进行芽诱导培养；所述诱导培养基的组成为：MS粉，4.43g/L；6-BA，1.0mg/L；NAA，0.2mg/L；蔗糖，20g/L；琼脂，6g/L；

(2)诱导出芽后，将芽接至生根壮球培养基中进行培养，获得组培苗；

其中，所述生根壮球培养基的组成为：MS粉，4.43g/L；蔗糖，60g/L；琼脂，6g/L；腐殖酸，0.2mg/L；所述腐殖酸中黄腐酸的含量≥90％。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述鳞茎的直径为0.5～0.8cm。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述鳞片取自鳞茎由外至内的第1～2层。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在进行芽诱导培养时，将鳞片凹面朝上置于诱导培养基中。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述芽的长度为1～2cm，直径为2～5mm。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述培养的时间为55～65天。