CN103688861B - 一种东方百合组培苗壮苗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种东方百合组培苗壮苗的方法，包括：取东方百合无菌苗的鳞茎，将鳞片置于诱导培养基中进行芽诱导培养；诱导出芽后，将芽接至生根壮球培养基中进行培养，获得组培苗；其中，所述生根壮球培养基的组成为：MS粉，4～6g/L；蔗糖，60～70g/L；琼脂，6～8g/L；油菜素内酯，5×10^-5～5×10^-4mmol/L。本发明东方百合组培苗壮苗的方法，能够有效促进组培苗鳞茎的膨大，改善了鳞茎的质量，有利于获得健壮的组培苗。

Description

一种东方百合组培苗壮苗的方法

技术领域

本发明属于组织培养领域，尤其涉及一种东方百合组培苗壮苗的方法。

背景技术

百合（Liliumspp.）被誉为“球根花卉之王”，是世界五大鲜切花之一。近年来，随着我国国民生活水平的提升，百合消费量亦逐年升高。我国虽是主要的野生百合自然分布中心，但观赏用百合商品化栽培起步晚，育种和繁殖严重滞后。长期以来，我国切花百合尤其是主流品种东方系百合‘索邦’（L.orientalhybrids‘Sorbonne’）商品品种长期依赖进口（以荷兰为主），而种球的进口成本占总生产成本的极高比例。因而，东方百合种球国产化是降低生产成本，提高销售利润的重要途径。

解决种球国产化的一项有效措施是建立完善的新鳞茎培养体系。但目前百合种球工厂化生产中常遇到百合的组培苗生长势弱、根叶细长柔软、鳞茎发育慢、移栽过程中成活率低、容易重新感染病毒等突出问题。而这些问题的主要根源则是组培苗移栽时试管球不达标准。

植物激素是一类由植物体内天然产生的物质，它们是在植物体内合成，并从产生部位运输到其他的部位发挥作用，对植物生长发育产生显著作用的微量有机物。例如吲哚乙酸（IAA），它的合成部位是在植物的幼嫩部分，如茎尖、叶原基、嫩叶和未成熟的种子，合成后再运输到植物体的其它部位。迄今为止，已确认的植物激素有生长素类如吲哚乙酸、赤霉素类如GA₃、细胞分裂素类如玉米素、脱落酸和乙烯等五大类。

油菜素内酯（Brassinolide，简称BR）又称芸苔素内酯或芸苔素，它是一种甾体化合物，广泛存在于植物界，对植物生长发育有多方面的调节作用。以甾醇为基本结构的具有生物活性的天然产物统称为油菜甾体类化合物。其中，以油菜素内酯的生理活性最强，被认为是一种新的植物激素，一些植物生理学家也将之称为“第六大植物生长激素”。该激素具有高效、广谱、无毒的特点：其作用机理独特，生理效应特强，生物活性极高，但用量极微，是五大激素的千分之一。植物吸收后，能调节其生理机能，激发酶的活性，协调植物体内多种内源激素的相对水平；改变组织细胞化学成份的含量，促进新陈代谢；加速根系生长，增强吸水吸肥能力。其功效主要表现在：提高种子活力，促进生长发育，增加产量，增强抗性。油菜素内酯适用范围广，粮、棉、油、蔬菜等常见作物和茶、桑、果树、树木等木本植物均可施用，增产幅度大，产品质量好，无毒无副作用。

百合种球国产化难题涉及新品种选育、种球脱毒、种球培育和采后处理四个关键技术。此外，组培工厂化生产、鳞片扦插扩增、商品球培育等均涉及鳞茎发育膨大技术问题。

就百合组培工厂化生产而言，如何通过优化组织培养条件，培养膨大的试管鳞茎，从而促进壮苗、改善组培苗质量、缩短组培苗在大田生长周期、提高移栽成活率，且有利于种球的贮藏、运输和种质保存，是亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明提供了一种东方百合组培苗壮苗的方法，能够有效促进组培苗鳞茎的膨大和增重，改善了鳞茎的质量，有利于获得健壮的组培苗。

一种东方百合组培苗壮苗的方法，包括：

（1）取东方百合的无菌苗，切割获得鳞茎，从鳞茎上剥取鳞片，将所述鳞片置于诱导培养基中进行芽诱导培养；

（2）诱导出芽后，将芽接至生根壮球培养基中进行培养，获得组培苗；

其中，所述生根壮球培养基的组成为：MS粉，4～5g/L；蔗糖，60～70g/L；琼脂，6～8g/L；油菜素内酯，5×10^-5～5×10^-3mmol/L。

鳞茎质量的优劣直接影响组培苗的移栽成活率及其在大田的生长周期，本发明对生根壮球培养基进行优化，通过在生根壮球培养基中添加适宜浓度的油菜素内酯，可促使组培苗的鳞茎膨大，重量增加，提高了鳞茎的质量，从而有助于获得健壮的组培苗。优选的，生根壮球培养基中，所述油菜素内酯的浓度为5×10^-5～5×10^-4mmol/L，更优选的，所述油菜素内酯的浓度为5×10^-4mmol/L。

步骤（1）中，将东方百合无菌苗分为两部分，其中一部分进行基础的增殖培养，另一部分作为生产组培苗的原材料，取其鳞片进行芽诱导培养。这样，在已有的东方百合无菌苗的基础上，无菌苗一方面作为生产组培苗的原材料，另一方面还不断进行基础增殖培养，扩繁大量的东方百合无菌苗，保证了充足的原材料来生产组培苗，从而形成可循环的程序化操作步骤，缩短生产周期，适合于工业化生产，且所获组培苗均一化程度高。

选取鳞茎时，如果鳞茎过小，鳞片较嫩诱导时不易成活，当鳞茎直径达0.5～0.8cm较为适宜。

鳞茎中不同部位的鳞片诱导出芽的能力按照从外到内逐渐增强，内部鳞片几乎不能形成诱芽，通常，选取鳞茎由外至内的第1～2层鳞片进行芽诱导培养。

一般来说，百合芽点萌发部位均在鳞片内侧基部切口处，因此，在进行芽诱导培养时，将鳞片凹面朝上置于诱导培养基中。

诱导培养基的成分影响芽的诱导率，优选的，所述诱导培养基的组成为：MS粉，4～6g/L；6-BA，1.0～1.5mg/L；NAA，0.1～0.2mg/L；蔗糖，20～30g/L；琼脂，6～8g/L。

进一步优选的，所述诱导培养基的组成为：MS粉，4.43g/L；6-BA，1.0mg/L；NAA，0.2mg/L；蔗糖，20g/L；琼脂，6g/L。

芽诱导培养30～35天后，选取长度为1～2cm，直径为2～5mm的芽，将其进一步转接至生根壮球培养基中，选择该大小的芽培养一定时间，即可生根成球，且根系发达，植株健壮，所述培养的时间一般为55～65天，优选为60天。

上述东方百合组培苗生产过程中的芽诱导培养、生根培养以及东方百合无菌苗的基础增殖培养对应的光温条件与现有技术相近，如均可采用如下条件：温度为25±2℃，光照强度为1500lux，光照时间为12小时/天。

本发明中，所述东方百合的品种具体可以为‘索邦’。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

通常地，百合组培苗的生产主要包括诱导培养、增殖培养、生根培养和壮苗培养，获得的组培苗经炼苗及移栽后可向市场上批量供应，其中诱导培养前提又包含获得无菌苗。本发明在获得东方百合无菌苗的条件下，便可源源不断的生产组培苗，适合于工厂化生产，同时均是以东方百合无菌苗作为原材料，降低了污染率，也不需要再进行繁琐的消毒灭菌步骤，另外，本发明还将生根培养、壮苗培养合并为一步，简化了生产程序，提高了工效，降低了成本。

本发明以东方百合无菌苗为原材料，通过芽诱导及生根培养，生根培养60d，即可得到健壮且根系发达的组培苗，鳞茎直径可达9.485mm，质量可达278mg，约为对照的1.74倍，提高了组培苗的出苗质量，生产周期缩短，操作简易。

目前，尚未有油菜素内酯在百合组培方面具备生物学活性的文献报道。

附图说明

图1为东方百合组培苗程序化生产工序。

图2为实施例中东方百合‘索邦’鳞片诱芽培养3d后的图像。

图3为东方百合‘索邦’鳞片诱芽培养10d后的图像。

图4为东方百合‘索邦’鳞片诱芽培养18d后的图像。

图5为东方百合‘索邦’鳞片诱芽培养29d后的图像。

图6为东方百合‘索邦’鳞片诱芽培养35d后的图像。

图7为东方百合‘索邦’在添加5×10^-4mmol/L油菜素内酯生长60d的生长情况。

具体实施方式

下面结合具体实施方式进一步阐释本发明。

本发明中油菜素内酯购于上海生化试剂厂，规格100mg。

（1）选取生长健壮的东方百合‘索邦’的试管苗。

（2）其中部分试管苗接种于基本繁殖培养基中扩繁初始苗，基本繁殖培养基为：MS粉4.43g/L+蔗糖60g/L+琼脂6g/L，pH5.6～5.7。培养室温度为25±2℃，光照强度为1500lux，光照时间为12小时/天。

（3）剩余部分的试管苗选择0.5～0.8cm直径子球，用手术刀轻轻将根、茎、叶切除，再以此子球为后续试验的母球，剥取中外层鳞片（鳞茎由外至内的第1～2层）待用；

（4）将鳞片凹面朝上置于诱导培养基上进行培养，生长过程见图2～图6，待其生长约30～35d时，转接。其中，诱导培养基为：MS粉4.43g/L+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6g/L，pH5.6～5.7。培养室温度为25±2℃，光照强度为1500lux，光照时间为12小时/天。

（5）选取芽长约1～2cm，直径约2～5mm的芽接种于生根壮球培养基中（含一定浓度油菜素内酯的MS固体培养基），即配方为MS粉4.43g/L+琼脂6g/L+油菜素内酯，pH5.6～5.7。培养室温度为25±2℃，光照强度为1500lux，光照时间为12小时/天；

①试验组A：5×10^-5mmol/L油菜素内酯的MS固体培养基。

②试验组B：5×10^-4mmol/L油菜素内酯的MS固体培养基。

③试验组C：5×10^-3mmol/L油菜素内酯的MS固体培养基。

④对照组：不添加任何激素的MS固体培养基。

培养60天后，统计各组株高、叶片数、重量、根长、鳞茎直径等指标。每个指标随机选取10株组培苗进行统计，其中，株高、根长采用直尺测定，植株总重、鳞茎重量采用百分之一电子天平测定，鳞茎直径采用电子游标卡尺测定。

表1不同浓度油菜素内酯对东方百合试管鳞茎生根壮苗的影响

通过表1可得，在三组不同油菜素内酯浓度处理下，除试验组A以外，试验组B和C的组培苗株高及叶片数均显著高于对照组，B和C两组平均株高为4.98cm，为对照（3.60cm）的1.38倍。相似的，叶片数更繁茂，达4.75片，对照仅为2.0。但综合鳞茎重量及鳞茎直径两个关键指标，以试验组A及B更佳，最高分别为对照的1.74倍和1.38倍。

有研究表明，BR一方面能维持较高的叶绿素含量，提高叶片的净光合速率；另一方面还可促进光合产物的运输，维持较高的可溶性蛋白质含量，且可解除光对生长的抑制作用，从而提高光合速率，促进光合作用，促进生长。可以推测，在中高浓度下，油菜素内酯促进了光合作用（组培室白炽灯包含红光及蓝紫光，此两种光为主要的光合作用吸收波长，故组培苗同样在进行高效的光合作用），增加了有机物的积累，其中一种重要的形式为淀粉，是百合鳞茎的主要组成部分。但是，浓度过高导致鳞茎缩小，根少且细短。综上所述，在添加油菜素内酯的条件下，浓度过高过低虽然在一定程度上均可使组培苗的鳞茎健壮（鳞茎的直径、重量得到不同程度的增加），但是浓度过高过低均会对植株造成不良影响，以中浓度5×10^-4mmol/L的效果最好，鳞茎直径和质量均明显增加，且植株健壮，根系生长良好，营养吸收正常。

Claims (8)

1.一种东方百合组培苗壮苗的方法，其特征在于，包括：

(1)取东方百合的无菌苗，切割获得鳞茎，从鳞茎上剥取鳞片，将所述鳞片置于诱导培养基中进行芽诱导培养；

(2)诱导出芽后，将芽接至生根壮球培养基中进行培养，获得组培苗；

其中，所述生根壮球培养基的组成为：MS粉，4～5g/L；蔗糖，60～70g/L；琼脂，6～8g/L；油菜素内酯，5×10^-5～5×10^-4mmol/L；

所述诱导培养基的组成为：MS粉，4～6g/L；6-BA，1.0～1.5mg/L；NAA，0.1～0.2mg/L；蔗糖，20～30g/L；琼脂，6～8g/L。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生根壮球培养基的组成为：MS粉，4.43g/L；蔗糖，60g/L；琼脂，6g/L；油菜素内酯，5×10^-4mmol/L。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述鳞茎的直径为0.5～0.8cm。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述鳞片取自鳞茎由外至内的第1～2层。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在进行芽诱导培养时，将鳞片凹面朝上置于诱导培养基中。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱导培养基的组成为：MS粉，4.43g/L；6-BA，1.0mg/L；NAA，0.2mg/L；蔗糖，20g/L；琼脂，6g/L。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述芽的长度为1～2cm，直径为2～5mm。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述培养的时间为55～65天。