CN104429950A

CN104429950A - 金边蝴蝶兰培养基及培养方法

Info

Publication number: CN104429950A
Application number: CN201410650513.7A
Authority: CN
Inventors: 陈永得
Original assignee: FOSHAN SHUNDE DISTRICT TODAYORCHID BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: FOSHAN SHUNDE DISTRICT TODAYORCHID BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2014-11-14
Filing date: 2014-11-14
Publication date: 2015-03-25
Anticipated expiration: 2034-11-14
Also published as: CN104429950B

Abstract

本发明公开了一种金边蝴蝶兰培养基及培养方法，所述的金边蝴蝶兰培养基包括初代诱导培养基和继代增殖培养基；所述初代诱导培养基以MS培养基为基础培养基，并添加有6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、胺鲜酯、活性炭、蔗糖和琼脂粉；所述继代增殖培养基以MS培养基为基础培养基，并添加有6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、玉米低聚肽粉、椰乳、活性炭、蔗糖和琼脂粉。本发明所述的培养基能使金边蝴蝶兰快速繁殖，且叶片金边性状能稳定遗传。

Description

金边蝴蝶兰培养基及培养方法

技术领域

本发明涉及兰花组织培养技术领域，特别是涉及一种金边蝴蝶兰培养基及培养方法。

背景技术

蝴蝶兰(Phalaenopsis)为兰科蝴蝶兰属多年生草本花卉，原产于热带和亚热带地区，其花形似蝴蝶，花色艳丽，花期持久，具有极高的观赏价值和经济价值，是当今国内外花卉市场上最热销的盆花之一。而蝴蝶兰的新品种“金边蝴蝶兰(Phalaenopsis Blume)”，其叶片边缘为金黄色，既可观花又可赏叶。近年来，带“金边”叶片的蝴蝶兰新产品，市场需求量大，供不应求，产品附加值比一般品种高出3、4倍，市场潜力大。

在组织培养扩大繁殖过程中，金边蝴蝶兰又比常规的蝴蝶兰品种更难进行无性繁殖，在初代培育中需要很漫长的萌发诱导过程；此外，由于金边蝴蝶兰的叶边为金黄色的特异性，其叶片所含的叶绿素比一般的蝴蝶兰少，在组培过程中生长比较缓慢，特别在初代诱导和继代增殖阶段，幼苗吸收光和营养的能力相对较弱，极容易发生死苗、叶片金边性状缺失等问题；由于叶片的金边性状为特殊的嵌合体彩色斑条，不能无条件遗传，在继代增殖培养过程中，金边性状率不足60％。这些因素导致了金边蝴蝶兰的生产效率低、生产成本高，难以形成规模化生产。

发明内容

基于此，有必要针对金边蝴蝶兰培育过程中金边性状容易缺失、萌发时间长、生长缓慢的问题，提供一种能使金边蝴蝶兰快速繁殖、叶片金边性状稳定遗传的培养基。

此外，有必要针对金边蝴蝶兰培育过程中金边性状容易缺失、萌发时间长、生长缓慢的问题，提供一种能使金边蝴蝶兰快速繁殖、叶片金边性状稳定遗传的培养方法。

一种金边蝴蝶兰培养基，其包括初代诱导培养基和继代增殖培养基；所述的初代诱导培养基以MS培养基为基础培养基，并添加有6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、胺鲜酯、活性炭、蔗糖和琼脂粉；所述的继代增殖培养基以MS培养基为基础培养基，并添加有6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、玉米低聚肽粉、椰乳、活性炭、蔗糖和琼脂粉。

在其中一个实施例中，所述的初代诱导培养基中，6-苄氨基腺嘌呤的浓度为0.6～1.2mg/L，萘乙酸的浓度为0.1～0.2mg/L，胺鲜酯的浓度为0.01～0.08mg/L，活性炭的浓度为0.2～0.3g/L，蔗糖的浓度为25～30g/L，琼脂粉的浓度为6～7g/L。

在其中一个实施例中，所述的继代增殖培养基中，6-苄氨基腺嘌呤的浓度为1.0～4.0mg/L，萘乙酸的浓度为0.1～0.7mg/L，玉米低聚肽粉的浓度为17～29g/L，椰乳的浓度为130～160mg/L，活性炭的浓度为0.2～0.3g/L，蔗糖的浓度为25～30g/L，琼脂粉的浓度为6～7g/L。

在其中一个实施例中，所述初代诱导培养基、所述继代增殖培养基的pH值均为5.8。

一种金边蝴蝶兰培养方法，包括以下步骤：

1)初代诱导培养：以金边蝴蝶兰的花梗腋芽为外植体，用消毒剂对花梗腋芽作消毒处理，然后将花梗腋芽与消毒剂接触的切口以倾斜角度切除，再以倾斜角度接种于本发明所述的初代诱导培养基中，使花梗腋芽的切口与培养基表面相平行，然后置于人工气候箱，在温度为23～26℃、光照强度为1500～2000Lux、光照时间为12h/d的条件下培养20～25天，使花梗腋芽萌发得到初培苗；

2)继代增殖培养：将步骤1)得到的初培苗接种于本发明所述的继代增殖培养基中，置于人工气候箱，在温度为23～26℃、光照强度为1500～2000Lux、光照时间为12h/d的条件下培养40～45天，得到金边蝴蝶兰丛生芽。

在其中一个实施例中，所述的消毒剂为质量浓度70～75％的酒精和质量浓度0.10～0.12％的氯化汞溶液；所述的消毒处理包括：对花梗腋芽用质量浓度为70～75％的酒精浸泡25～30秒，用无菌水清洗干净后，再用质量浓度为0.10～0.12％的氯化汞溶液灭菌10～15分钟，然后用无菌水清洗干净。

本发明所述的金边蝴蝶兰培养基，能够促使金边蝴蝶兰快速繁殖，并使其叶片的金边性状得到稳定遗传。其中，初代诱导培养基中添加的胺鲜酯(己酸二乙氨基乙醇酯，DA-6)为广谱和高效的植物生长调节剂，毒副作用小，DA-6能够提高植株体内叶绿素、蛋白质、核酸的含量和光合速率，并能提高过氧化物酶及硝酸还原酶的活性，促进植株的碳、氮代谢，促进植物细胞的分裂和伸长，从而增强植株对养分的吸收和干物质的积累，促进金边蝴蝶兰的生长，此外，植株吸收DA-6后，还能协同促进植物内源激素(包括促进植物生长的生长素、调节植物细胞生长和发育的细胞分裂素、加速细胞伸长的赤霉素等)和生理活性物质(包括碳水化合物、有机酸、氨基酸、生物碱等)的作用，从而调节植物的生长发育。继代增殖培养基中添加的玉米低聚肽粉富含玉米肽，玉米肽作为玉米蛋白经过酶降解而获得的多种小肽的混合物，除具有肽类物质的优良特性——优于氨基酸或蛋白质的直接吸收、溶解性强、稳定性强、安全性高等特性以外，还具有抗病毒、抗氧化、减少变异率的作用。6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)和萘乙酸(NAA)具有促进种苗生长的作用，在初代诱导培养基中，能够促进腋芽萌发，减少死芽发生；在继代增殖培养基中，6-BA和NAA则能够促进小苗生长和增殖，并具有壮苗的作用。椰乳为有机添加物，能够为植物生长提供必要的生理活性物质及微量成分。活性炭则能够提供暗环境，避免培养基中的营养物质和调节物质发生分解，以确保其稳定性和活性，并能够吸附离体培养中的酚类物质，使多酚氧化酶和过氧化酶失活，以防止植株发生褐化。此外，在初代诱导培养基中，胺鲜酯还能提高植株的同化能力，加速植株对培养基中各组分的吸收，并具有协同促进作用，因而能降低6-BA和NAA等的用量，并使之发挥更佳的效用，降低生产成本。

本发明所述的金边蝴蝶兰培养基中，胺鲜酯能够促进金边蝴蝶兰的腋芽快速萌发，实现快速繁殖；而玉米低聚肽粉能够增强金边蝴蝶兰遗传性状的稳定性。实验证明，采用本发明的培养基进行培养，金边蝴蝶兰在增殖培养阶段的繁殖系数提高到2.8～3.8，所培育出来的金边蝴蝶兰中，叶片金边性状的保持率高达97.4％，解决了金边蝴蝶兰萌发时间长、生长缓慢、叶片的金边性状容易缺失，以及难以形成规模产量的问题，并能降低生产成本，增加生产效益。

本发明所述的金边蝴蝶兰培养基中，所述初代诱导培养基、继代增殖培养基的pH值均控制为5.8，金边蝴蝶兰外植体在pH5.8的弱酸环境下，其多酚氧化酶的活性及总酚含量较低，能有效减缓外植体褐化现象，提高成活率。

本发明所述的金边蝴蝶兰培养方法，由于采用了本发明的金边蝴蝶兰培养基，能促使金边蝴蝶兰快速繁殖，并能使其叶片金边性状得到稳定遗传。花梗腋芽经消毒处理后，以倾斜角度切去其与消毒剂接触的切口，再以倾斜角度接种于本发明的初代诱导培养基中，花梗腋芽的切口与培养基表面相平行，能够增大腋芽切口与培养基的接触面积，增加外植体吸收养分的能力，促进外植体的生长，缩短腋芽的萌发时间。

具体实施方式

实施例一：制备本发明所述的金边蝴蝶兰培养基

1、按照以下表1的配方，分别称取MS培养基的各成分。

表1MS培养基的成分及其用量

2、配制初代诱导培养基

按照以下表2的配方，分别称取金边蝴蝶兰初代诱导培养基的各成分。

表2金边蝴蝶兰初代诱导培养基成分及其用量

样品编号

基础培养基

6-BA

NAA

胺鲜酯

活性炭

蔗糖

琼脂粉

培养基1号

MS培养基

0.6mg

0.1mg

0.01mg

0.2g

30g

7g

培养基2号

MS培养基

0.7mg

0.12mg

0.02mg

0.2g

30g

7g

培养基3号

MS培养基

0.8mg

0.14mg

0.03mg

0.2g

30g

7g

培养基4号

MS培养基

0.9mg

0.16mg

0.05mg

0.2g

30g

7g

培养基5号

MS培养基

1.0mg

0.18mg

0.06mg

0.2g

30g

7g

培养基6号

MS培养基

1.2mg

0.2mg

0.08mg

0.2g

30g

7g

培养基7号

MS培养基

1.0mg

0.2mg

0.05mg

0.2g

30g

7g

对照组1号

MS培养基

1.0mg

0.18mg

0

0.2g

30g

7g

对照组2号

MS培养基

0

0.18mg

0.06mg

0.2g

30g

7g

对照组3号

MS培养基

1.0mg

0

0.06mg

0.2g

30g

7g

配制方法如下：

1)取100mg的6-BA，用5mL浓度为1N的盐酸溶液溶解，然后加蒸馏水定容至1L，制得浓度为0.1mg/mL的6-BA溶液；取100mg的NAA，用1mL质量浓度为95％的酒精溶解，然后加蒸馏水定容至1L，制得浓度为0.1mg/mL的NAA溶液；

2)按照表1、表2所示的配方，分别将MS培养基的各成分、6-BA溶液、NAA溶液、胺鲜酯、活性炭、蔗糖及琼脂粉置于烧杯中，加入500mL蒸馏水搅拌溶解，然后加入蒸馏水定容至1L，并调节pH值至5.8，得到所述的金边蝴蝶兰初代诱导培养基。

备注：对照组1号不需要添加胺鲜酯，对照组2号不需要添加6-BA，对照组3号不需要添加NAA。

3、配制继代增殖培养基

按照以下表3的配方，分别称取金边蝴蝶兰继代增殖培养基的各成分。

表3金边蝴蝶兰继代增殖培养基成分及其用量

配制方法如下：

2)按照表1、表2所示的配方，分别将MS培养基的各成分、6-BA溶液、NAA溶液、椰乳、活性炭、蔗糖及琼脂粉置于烧杯中，加入500mL蒸馏水搅拌溶解，再加入玉米低聚肽粉，然后加入蒸馏水搅拌溶解，定容至1L，并调节pH值至5.8，得到所述的金边蝴蝶兰继代增殖培养基。

备注：对照组4号不需要添加玉米低聚肽粉，对照组5号不需要添加NAA，对照组6号不需要添加6-BA。

实施例二：金边蝴蝶兰组织培养方法

1、初代诱导培养

以金边蝴蝶兰的花梗腋芽为外植体，用质量浓度为70～75％的酒精浸泡25～30秒，用无菌水清洗干净后，再用质量浓度为0.10～0.12％的氯化汞溶液灭菌10～15分钟，再用无菌水清洗干净，然后用灭菌的手术刀将花梗腋芽与消毒剂接触的切口以倾斜角度切除，再以倾斜角度接种于实施例一制得的初代诱导培养基中，使花梗腋芽的切口与培养基表面相平行，然后置于人工气候箱，在温度为23～26℃、光照强度为1500～2000Lux、光照时间为12h/d的条件下培养25天，使腋芽萌发得到初培苗，并分别记录其萌发时间、萌发率，结果如表4所示。

表4金边蝴蝶兰初代培养试验结果

样品编号	萌发时间_y1	萌发率y₂	y*
				培养基1号	17.2天	87.31％	9.26
培养基2号	16.7天	89.14％	11.17
				培养基3号	16.1天	92.43％	14.02
培养基4号	15.8天	95.25％	16.03
				培养基5号	15.3天	99.07％	18.94
培养基6号	16.1天	94.65％	15.13
				培养基7号	17.5天	90.77％	10.39
对照组1号	18.5天	76.21％	1.11
				对照组2号	18.1天	80.63％	4.11
对照组3号	17.9天	81.17％	4.79

备注：萌发率y₂＝初培苗数/接种腋芽数×100％；

y*表示培养基的综合评分，y*＝(y₁)×(-3)+(y₂)×50。

由表4的试验结果可见，与对照组相比，采用本发明的初代诱导培养基对金边蝴蝶兰进行初代培养，能缩短金边蝴蝶兰腋芽的萌发时间，并提高其萌发率，证明胺鲜酯具有缩短萌发时间、提高萌发率的作用。随着6-BA、NAA及胺鲜酯添加量的增加，金边蝴蝶兰腋芽的萌发时间越短，萌发率越高，其中培养基5号的配方，具有最佳的萌发促进作用，而含量高于培养基5号的用量时，开始出现抑制作用。

2、继代增殖培养

将步骤1得到的初培苗分别接种于实施例一制得的继代增殖培养基中，置于人工气候箱，在温度为23～26℃、光照强度为1500～2000Lux、光照时间为12h/d的条件下培养45天，得到金边蝴蝶兰丛生芽，并分别记录其叶数、叶长和金边性状率，结果如表5所示。

表5金边蝴蝶兰继代培养试验结果

样品编号	叶长y₁	单株叶数y₂	增殖系数y₃	金边性状率y₄	y*
						培养基8号	2.1cm	2.1片	2.8	80.3％	90.55
培养基9号	2.3cm	2.4片	3.3	87.6％	100.7
						培养基10号	2.4cm	2.6片	3.4	92.0％	106.2
培养基11号	2.6cm	2.8片	3.5	94.3％	111.65
						培养基12号	2.7cm	3.1片	3.8	97.4％	118.1
培养基13号	2.5cm	2.7片	3.6	94.5％	110.05
						培养基14号	2.4cm	2.5片	3.3	91.8％	104.8
对照组4号	2.0cm	1.7片	2.3	73.2％	80.5
						对照组5号	2.2cm	1.8片	2.4	76.5％	85.45
对照组6号	2.3cm	1.9片	2.5	77.3％	88.15

备注：增殖系数y₃＝有效苗数/接种苗数；

金边性状率y₄＝带金边性状的植株数/培养基中总植株数×100％；

y*表示培养基的综合评分，y*＝(y₁)×10+(y₂)×10+(y₃)×3+(y₄)×50。

由表5的试验数据可见，采用本发明的继代增殖培养基对金边蝴蝶兰进行继代培养，所获得的金边蝴蝶兰长势更好，其平均叶长、叶数、增殖率及金边性状率的数据均优于对照组，证明玉米低聚肽粉能使其金边性状在组培快繁中稳定遗传。随着6-BA、NAA及玉米低聚肽粉添加量的增加，金边蝴蝶兰的丛生芽叶长、叶数、带金边性状率增大，其中培养基12号的配方，具有最佳的培养效果，而含量高于培养基12号的用量时，开始出现抑制作用。

综上所述，本发明所述的金边蝴蝶兰培养基，可使金边蝴蝶兰腋芽快速萌发，并使其性状的遗传稳定性增强，很好地解决了金边蝴蝶兰在较短时间内难以形成规模产量和金边性状容易缺失的问题，从而可以快速生产稀缺品种、降低生产成本、增加生产效益。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种金边蝴蝶兰培养基，其特征在于：包括初代诱导培养基和继代增殖培养基；所述的初代诱导培养基以MS培养基为基础培养基，并添加有6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、胺鲜酯、活性炭、蔗糖和琼脂粉；所述的继代增殖培养基以MS培养基为基础培养基，并添加有6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、玉米低聚肽粉、椰乳、活性炭、蔗糖和琼脂粉。

2.根据权利要求1所述的金边蝴蝶兰培养基，其特征在于：所述的初代诱导培养基中，6-苄氨基腺嘌呤的浓度为0.6～1.2mg/L，萘乙酸的浓度为0.1～0.2mg/L，胺鲜酯的浓度为0.01～0.08mg/L，活性炭的浓度为0.2～0.3g/L，蔗糖的浓度为25～30g/L，琼脂粉的浓度为6～7g/L。

3.根据权利要求2所述的金边蝴蝶兰培养基，其特征在于：所述初代诱导培养基的pH值为5.8。

4.根据权利要求1所述的金边蝴蝶兰培养基，其特征在于：所述的继代增殖培养基中，6-苄氨基腺嘌呤的浓度为1.0～4.0mg/L，萘乙酸的浓度为0.1～0.7mg/L，玉米低聚肽粉的浓度为17～29g/L，椰乳的浓度为130～160mg/L，活性炭的浓度为0.2～0.3g/L，蔗糖的浓度为25～30g/L，琼脂粉的浓度为6～7g/L。

5.根据权利要求4所述的金边蝴蝶兰培养基，其特征在于：所述继代增殖培养基的pH值为5.8。

6.一种金边蝴蝶兰培养方法，包括以下步骤：

1)初代诱导培养：以金边蝴蝶兰的花梗腋芽为外植体，用消毒剂对花梗腋芽作消毒处理，然后将花梗腋芽与消毒剂接触的切口以倾斜角度切除，再以倾斜角度接种于权利要求1所述的初代诱导培养基中，使花梗腋芽的切口与培养基表面相平行，然后置于人工气候箱，在温度为23～26℃、光照强度为1500～2000Lux、光照时间为12h/d的条件下培养20～25天，使花梗腋芽萌发得到初培苗；

2)继代增殖培养：将步骤1)得到的初培苗接种于权利要求1所述的继代增殖培养基中，置于人工气候箱，在温度为23～26℃、光照强度为1500～2000Lux、光照时间为12h/d的条件下培养40～45天，得到金边蝴蝶兰丛生芽。

7.根据权利要求6所述的金边蝴蝶兰培养方法，其特征在于：所述的消毒剂为质量浓度70～75％的酒精和质量浓度0.10～0.12％的氯化汞溶液；所述的消毒处理包括：对花梗腋芽用质量浓度为70～75％的酒精浸泡25～30秒，用无菌水清洗干净后，再用质量浓度为0.10～0.12％的氯化汞溶液灭菌10～15分钟，然后用无菌水清洗干净。