CN104404155A - 甜瓜品种哈翠种子纯度的快速检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及品种纯度鉴定领域，特别涉及一种甜瓜品种哈翠种子纯度的快速检测方法，以父本序列SEQ ID 1-2和母本序列SEQ ID3-5为特异性片段进行检测哈翠种子的纯度。本发明提供一种快速高效的、无季节依赖性的、准确的哈翠种子纯度的检测方法，该方法以父本序列SEQ ID 1-2和母本序列SEQ ID 3-5为特异性片段进行检测，父本序列SEQ ID 1-2和母本序列SEQ ID 3-5是哈翠父母本间的稳定差异片段序列，通过这两个特异性片段进行检测，检测更为迅速，准确。

Description

甜瓜品种哈翠种子纯度的快速检测方法
技术领域
本发明涉及品种纯度鉴定领域，具体而言，涉及一种甜瓜品种哈翠种子纯度的快速检测方法。
背景技术
甜瓜是世界范围的重要经济作物，在世界上的种植面积仅次于柑橘与香蕉，是全球第三大水果作物，2009年全球的产量超过2500万吨。亚洲是甜瓜产量最大的产区，中国是全球最大的甜瓜生产国。2010年全国甜瓜播种面积590万亩，总产量1226.7万吨，产值达460亿元(许勇，2012)。甜瓜产业在全国种植业发展中占有极其重要的地位，对提高农民收入水平有重要的作用。哈密型甜瓜主要原产我国新疆，畅销全国，扬名海外，是世界上的著名甜瓜类型。随着设施农业的发展及育种家的不断努力，使得哈密型甜瓜在新疆以外的地区种植成功，极大地促进了哈密瓜的生产。
甜瓜新型品种“哈翠”是通过新疆哈密型甜瓜亲本和亚洲型甜瓜亲本杂交成功的一个哈密型甜瓜优良品种。该品种口感脆爽，果大美观，产量高，主要种植于江浙及长江流域，深受市场喜爱。但目前甜瓜“哈翠”的制种仍是采用母本去雄杂交的方式进行，这在操作过程中可能会出现母本去雄不完全从而导致杂交种不纯的现象，对农户造成极大地损失，同时会给公司的种子销售带来极大风险。目前，鉴定“哈翠”杂交种纯度的方法主要是田间性状观察，这样既耗工又耗时。一种新型快速精确的鉴定方法迫在眉睫。
鉴定种子纯度的研究早已开展，从早期的蛋白质、同工酶、AFLP到目前的应用较广泛的SSR标记等。SSR标记是一类基于简单重复(simple sequence repeat)序列的多态性标记，目前广泛应用于各类作物的多态性分析，遗传作图、基因定位及分子标记辅助育种等方面。现已报道的SSR引物已有1.3万多条(CuGen DB,CucurbitGenomics Database)。SRAP标记是由美国加州大学Li和Quiros于2001年提出的序列相关扩增多态性(sequence-related amplifiedpolymorphism,SRAP)。SRAP是在总结已有的DNA分子标记优缺点的基础上开发的一种新的基于PCR的DNA分子标记技术。其特点是针对基因外显子里GC含量丰富而启动子和内含子里AT含量丰富的特点对ORFs(open reading frames,开放阅读框)进行扩增来设计引物进行扩增。正向引物长17bp,5’端的前10bp是一段非特异性的填充序列,紧接着是CCGG，它们一起组成核心序列,然后是靠着3’端的3个选择性碱基,对外显子进行扩增。反向引物长18bp,即由5’的11个无特异性的填充序列和紧接着的AATT组成的核心序列,及3’的3个选择性碱基,对内含子和启动子区域进行特异扩增。通过不同引物的组合测试，从而寻找和发现因个体不同以及物种的内含子、启动子与间隔长度不等而产生多态性扩增产物。SRAP标记具有简便、中等产量、高共显性、重复性、易于分离条带及测序等优点，也可以用于尝试鉴定杂交种的种子的杂交情况及种子真实度，从而获得种子纯度的数据较为可靠地数据，对种子的繁育及销售意义重大。
在现有的文献或专利中，SSR标记主要用于生物性状的标记。在中国公布的专利中，黄瓜种子纯度的快速检测方法中公开了SSR标记在黄瓜纯度检测上的应用。而如何将SSR标记应用于甜瓜纯度检测中亟待研究。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种甜瓜品种哈翠种子纯度的快速检测方法，该方法通过选定哈翠种子的父本和母本的特异性基因序列，以该序列为基准进行PCR扩增，将样本的PCR扩增产物与纯父本和纯母本的扩增产物进行对比，来判断样本的纯度，从而得知哈翠种子是否为杂交种。本发明通过PCR扩增的方式进行检测，更为客观，准确率高，并且检测快速高效、无季节依赖性。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
甜瓜品种哈翠种子纯度的快速检测方法，以父本序列SEQ ID1-2和母本序列SEQ ID 3-5为特异性片段进行检测哈翠种子的纯度；
其中，父本序列SEQ ID 1-2为：
TGGGTTTTCTTCTACTACTGTAATAATAAACAATTGAGTTTCTATTTTCTCAAAAATCATATTATCTGAAACA—(GA)18-19
–GTGTTTTTTGTTTATTTTATTTTTGAGTTGAATGAGAGTAAAAGCA；
母本序列SEQ ID 3-5为：
TGGGTTTTCTTCTACTACTGTAATAATAAACAATTGAGTTTCTATTTTCTCAAAAATCATATTATCTGAAACACA—(GA)36-39—GTGTTTTTTGTTTATTTTTATTTTTGAGTTGAATGAGAGTAAAAGCA。
针对目前甜瓜哈翠种子纯度的检测主要依靠对待测样品农艺性状的观察，费工费时、占用大量土地且准确率低下的方式，本发明提供一种快速高效的、无季节依赖性的、准确的哈翠种子纯度的检测方法，该方法以父本序列SEQ ID 1-2和母本序列SEQ ID 3-5为特异性片段进行检测，父本序列SEQ ID 1-2和母本序列SEQ ID 3-5是哈翠父母本间的稳定差异片段序列，通过这两个特异性片段进行检测，检测更为迅速，准确。
其中，父本序列SEQ ID 1-2中的(GA)18-19为18-19个GA重复序列；母本序列SEQ ID 3-5中的(GA)36-39为36-39个GA重复序列。
优选地，以引物CMAGN75分别对哈翠种子基因组、哈翠父本种子基因组和哈翠母本种子基因组进行PCR扩增来检测哈翠种子纯度；
其中，所述引物CMAGN75为：
F：5’-TGGGTTTTCTTCTACTACTG-3’
R：5’-TGCTTTTACTCTCATTCAAC-3’。
通过多个引物的筛选，引物CMAGN75在甜瓜品种哈翠杂交种中稳定存在；引物CMAGN75在杂交种、父本和母本中的基因组中均能PCR扩增得到条带，但是，该引物在父本中扩增后得到的条带较小，该引物在母本中扩增后得到的条带较大，该引物在杂交种中扩增后得到的条带既含有父本的条带也含有母本的条带，通过这种区别，即可很好的将父本、母本和杂交种很好的区分开来。
通过分别将哈翠种子基因组、父本基因组和母本基因组以引物CMAGN75进行PCR扩增，分别得到待测哈翠种子的扩增产物、父本基因组扩增产物和母本基因组扩增产物；将待测哈翠种子的扩增产物与父本基因组扩增产物和母本基因组扩增产物分别进行条带对比，从而得到种子的纯度。具体为：若条带只含有母本条带，则哈翠种子杂交未成功，仍然只是母本的基因序列；若条带只含有父本条带，则哈翠种子杂交未成功，仍然只是父本的基因序列；若条带既含有父本的条带又含有母本的条带，则哈翠种子杂交成功，为杂交种。
采用CTAB法提取哈翠种子基因组、哈翠父本种子基因组和哈翠母本种子基因组，简单易行，且提取得到的基因组杂质含量少，浓度高，PCR扩增的条带清晰，杂带少。优选地，哈翠种子基因组、哈翠父本种子基因组和哈翠母本种子基因组均通过CTAB法进行提取。为了便于提取种植的基因组，优选地，提取基因组前将种子去除种皮。
优选地，引物CMAGN75的PCR反应体系为10μl，包括以下成分：基因组15-25ng,浓度为10μM上下游引物各0.2μl；1.25μM的dNTPs 2.75μl，10×buffer 1μl,15mM MgCl2,1％Triton X-1002μl，5U/L的Taq DNA聚合酶0.1μl，无菌双蒸水补齐至10μl；
其中，10×buffer中含有500mM KCl,100mM Tris-HCl，Tris-HCl在25℃的pH为9.0。
以该成分的PCR反应体系进行PCR，得到的PCR产物条带的单一性强，且条带清晰。此外，PCR反应体系也可以为常用的15μl、20μl、50μl的体系，其中的成分相应地增加即可。
优选地，引物CMAGN75的PCR扩增程序为：95℃预变性3-5分钟；94℃变性1分钟；54℃退火45秒；72℃延伸1分钟；35个循环；72℃延伸5-10分钟；产物4℃保存。以该程序扩增的产物含有杂带少，条带的浓度适当，很好的满足检测的需要。
进一步地，引物CMAGN75的PCR产物用1.8-2.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。采用1.8-2.5％的琼脂糖凝胶电泳检测引物CMAGN75的PCR产物，即可将PCR产物分离开来，很好的达到检测的目的。
进一步地，还包括以引物a20b37分别对哈翠种子基因组、哈翠父本种子基因组和哈翠母本种子基因组进行PCR扩增来检测哈翠种子纯度；
所述引物a20b37为：
F：5’-TGAGTCCAAACCGGCAT-3’
R：5’-GACTGCGTACGAATTGCA-3’。
由于育种方式的原因，商业化的栽培品种在父本间或者母本间仍存在一定的多样性，因此，单个父母本间扩增出的差异条带并不一定说明是父母本间的稳定的差异条带。本发明还从多对引物中挑选出引物a20b37，以引物a20b37分别对哈翠种子基因组、哈翠父本种子基因组和哈翠母本种子基因组进行扩增，引物a20b37在哈翠父本种子基因组和哈翠种子基因组中能稳定的扩增出约205bp大小的条带；而在哈翠母本种子基因组中不能扩增出该条带。由于引物a20b37能在父本和哈翠种子中均能扩增出特定大小的条带，以此，可以鉴别得到种子是否只是母本的序列，从而排除只是母本的状况。
优选地，引物a20b37的反应总体系为10μl，包括以下成分：基因组15-25ng，浓度为10μM上下游引物各0.12μl，1.25μM的dNTPs 1.2μl，10×bμffer 1μl，15mM MgCl2,1％Triton X-1001.4μl，5U/L的Taq DNA聚合酶0.12μl，无菌重蒸水补齐至10μl；
其中，10×buffer中含有500mM KCl,100mM Tris-HCl，Tris-HCl在25℃的pH为9.0。
以该成分的PCR反应体系进行PCR，得到的PCR产物条带的单一性强，且条带清晰。此外，PCR反应体系也可以为常用的15μl、20μl、50μl的体系，其中的成分相应地增加即可。
优选地，引物a20b37的PCR扩增程序为：94℃预变性3-5分钟，94℃变性1分钟、35℃退火1分钟、72℃延伸1分钟，5个循环，94℃预变性1分钟、50℃退火1分钟、72℃延伸1分钟，35个循环，72℃延伸10分钟，产物4℃保存。以该程序扩增的产物含有杂带少，条带的浓度适当，很好的满足检测的需要。
引物a20b37扩增出的条带较多，琼脂糖电泳对条带的分辨率较低，因此，选用5-7％的非变性聚丙烯酰胺凝胶即可将条带很好的分离开来，从而实现检测的目的，进一步地，引物a20b37的PCR产物用5-7％非变性聚丙烯酰胺凝胶检测。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)以父本序列SEQ ID 1-2和母本序列SEQ ID 3-5为特异性片段进行检测哈翠种子的纯度，可快速高效的、无季节依赖性的、准确的检测出哈翠种子的纯度；
(2)特定选用引物CMAGN75鉴定哈翠种子的纯度，很好的区分出杂交种子、父本种子和母本种子，检测方便易行，准确率高；
(3)辅以引物a20b37鉴定哈翠种子的纯度，进一步确保检测的准确性，使检测更为准确。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施例1中不同引物在父本和母本中扩增的条带；
图2为本发明实施例1中引物CMAGN75在父本和母本中扩增的条带；
图3为本发明实施例2中引物CMAGN75在父本、母本和杂交种中扩增产物在琼脂糖凝胶上的条带；
图4为本发明实施例3中引物a20b37在在父本、母本和杂交种中扩增的条带；
图5为本发明实施例3中引物a20b37在父本和母本中扩增的条带。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售获得的常规产品。
实施例1
分别取哈翠母本种子、哈翠父本种子，分别剥去种皮，利用CTAB法分别提取得到哈翠父本种子基因组和哈翠母本种子基因组；
将得到的基因组分别采用引物1-12(如表1所示)进行PCR扩增，反应体系均为10μl，包括以下成分：基因组15-25ng,浓度为10μM上下游引物各0.2μl；1.25μM的dNTPs 2.75μl，10×buffer 1μl,15mM MgCl2,1％Triton X-100)2μl，5U/L的Taq DNA聚合酶0.1μl，无菌双蒸水补齐至10μl；其中，10×buffer中含有500mM KCl,100mM Tris-HCl，Tris-HCl在25℃的pH为9.0；
表1不同引物的基因序列
PCR扩增程序为：95℃预变性3-5分钟；94℃变性1分钟；54℃退火45秒；72℃延伸1分钟；35个循环；72℃延伸5-10分钟；产物4℃保存；
将得到的PCR产物在6％非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，功率额定100W，直至溴酚蓝跑至另一端；银染在胶片观察灯上照相，结果如图1所示。
图1中，1-12为不同引物：1、CMAGN283；2、CMTCN41；3、CMTC168；4、CMGAN3；5、TJ27；6、TJ2；7、CMAGN75；8、CMAT141；9、CMAGN52；10、ECM61；11、CMBR108；12、CMGAN271。其中，每对引物分别在母本和父本中扩增，每个编号靠近M的为母本，另一个为父本。
从图1可以看出，标号7中的父本和母本的PCR扩增产物存在很大的差异，并且扩增得到的条带清晰。因此，初步筛选得到标号7引物CMAGN75作为检测甜瓜品种哈翠种子的纯度。
对引物CMAGN75在父本和母本中的稳定性进行验证，具体为：选用多个父本和多个母本，对其分别提取基因组，然后进行PCR扩增得到产物，提取基因组方法以及PCR扩增体系和程序同上。扩增得到的产物在6％非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，功率额定100W，直至溴酚蓝跑至另一端；银染在胶片观察灯上照相，结果如图2所示。
图2中，1-11为不同父本基因组PCR扩增产物；12-19为不同母本基因组PCR扩增产物。从图2可以看出，引物CMAGN75在父本和母本中均能稳定的扩增特异性片段，并且父本和母本中扩增的特异性条带差异很大。
实施例2
由于聚丙烯酰胺法检测扩增产物需要银染，比较繁琐，因此，将引物CMAGN75的扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，具体如下：
分别取哈翠母本种子、哈翠父本种子和多个哈翠杂交种子，分别剥去种皮，利用CTAB法分别提取得到哈翠父本种子基因组、哈翠母本种子基因组和多个哈翠杂交种子基因组；
将得到的基因组分别采用引物CMAGN75进行PCR扩增，反应体系均为10μl，包括以下成分：基因组15-25ng,浓度为10μM上下游引物各0.2μl；1.25μM的dNTPs 2.75μl，10×buffer 1μl,15mMMgCl2,1％Triton X-100)2μl，5U/L的Taq DNA聚合酶0.1μl，无菌双蒸水补齐至10μl；其中，10×buffer中含有500mM KCl,100mMTris-HCl，Tris-HCl在25℃的pH为9.0；
PCR扩增程序为：95℃预变性3-5分钟；94℃变性1分钟；54℃退火45秒；72℃延伸1分钟；35个循环；72℃延伸5-10分钟；产物4℃保存；
取扩增产物10μl，加6×loading buffer 1.7μl，2％的琼脂糖凝胶(含0.6ng/L的EB)电泳(额定电压90V)，直至溴酚蓝跑至另一端，凝胶成像仪照相，得到图5。
图3中，F为父本基因组扩增条带；M为母本基因组扩增条带；1-6为不同已知的哈翠杂交种子基因组扩增条带。
从图3可以看出，哈翠杂交种子的扩增条带有两条，一个是与父本基因组扩增条带大小一致，一个与母本基因组条带大小一致，其中，哈翠杂交种子扩增出的与母本基因组条带大小一致的条带有些模糊，但还是可以明显看到的。依此可以明显的将未知的哈翠种子很好的区分出是否为杂交种子。
实施例3
对哈翠杂交种子中的核苷酸序列测序
利用引物CMAGN75对2个哈翠父本和3个哈翠母本种子提取的基因组分别进行PCR扩增，PCR扩增使用Q5高保真DNA聚合酶(New England BioLabs,USA)，反应体系为25ul，成分为：哈翠杂交种子基因组20ng,浓度为10μM上下游引物各1.25μl，10mM的dNTPs 0.5ul，5×Q5Reaction buffer 5μl，Q5DNA聚合酶0.25ul，无菌重蒸水补齐至25ul；反应程序为：95℃预变性2分钟，98℃变性10秒钟，55℃退火22秒，72℃延伸1分钟，35个循环，产物16℃保存。扩增的DNA产物在2％琼脂糖电泳上进行分离。将各自特异的片段切出，回收。
将回收的特异片段分别进行克隆测序，具体为：回收的平滑端片段利用Quick ligase(New England BioLabs,USA)直接连接到pJet1.2/Blunt载体(Fisher Scientific Co.,USA)上，并转化到DH5α大肠杆菌中；通过直接PCR筛选5个相应地含有插入片段的大肠杆菌在含100ng/μl的LB液体培养基中过夜培养；然后取菌液分别进行DNA测序(Eton Bioscience Inc,USA)，测序所用的引物为载体通用引物(T7和pJET1.2反向引物428-405)，所得的序列参见核苷酸序列ID 1-5，如序列表所示。
其中，F1和F2为父本中测出的2个不同基因型；M3、M 15和M 41为母本中测出的2个不同基因型。
此外，对哈翠杂交种同父母本相同的方法进行扩增和测序，得到的序列与父母本相应片段比较。同样的引物和PCR条件下，杂交种将出现两条条带，短的条带和父本在同一分离距离上，长的条带和母本在同一分离距离上。将哈翠杂交种的两条特异性条带切出和分离提纯后，进行DNA测序。通过序列比较，杂交种的两条DNA片段和各自对应的父母本序列相同。特别是短的片段，即父本来源含有18-19个(GA)重复；而长的片段即母本来源含有36-39个(GA)重复。其它区域的序列完全或大部分相同。因此，可以看出，杂交种同时拥有父本和母本的核苷酸序列。
实施例4
由于育种方式的原因，商业化的栽培品种在父本间或者母本间仍存在一定的多样性，因此，单个父母本间扩增出的差异条带并不一定说明是父母本间的稳定的差异条带。
鉴于此，本发明参照G.Li et.al(2000)和Jianshe Wanget.al(2008),陈芸等(2010)提到的10对SRAP正向引物与10对SRAP反向引物相互组合的100对引物组，按以下方式进行扩增，具体如下：
分别取哈翠母本种子、哈翠父本种子和哈翠种子，分别剥去种皮，利用CTAB法分别提取得到哈翠父本种子基因组、哈翠母本种子基因组和哈翠种子基因组；
将得到的基因组分别采用引物进行PCR扩增，反应体系为10μl，包括以下成分：基因组15-25ng，浓度为10μM上下游引物各0.12μl，1.25μM的dNTPs 1.2μl，10×bμffer 1μl，15mM MgCl2,1％Triton X-1001.4μl，5U/L的Taq DNA聚合酶0.12μl，无菌重蒸水补齐至10μl；
其中，10×buffer中含有500mM KCl,100mM Tris-HCl，Tris-HCl在25℃的pH为9.0；
引物a20b37的PCR扩增程序为：94℃预变性3-5分钟，94℃变性1分钟、35℃退火1分钟、72℃延伸1分钟，5个循环，94℃预变性1分钟、50℃退火1分钟、72℃延伸1分钟，35个循环，72℃延伸10分钟，产物4℃保存；
将得到的PCR产物在6％非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，功率额定100W，直至溴酚蓝跑至另一端；银染在胶片观察灯上照相；最终选定1对在多个父母本间稳定扩增出互补型的差异条带的引物a20b37，结果如图3所示。
图4中，F为父本基因组扩增条带；M为母本基因组扩增条带；1-20为不同哈翠种子基因组扩增条带。从图4可以看出，引物a20b37在哈翠种子中能稳定地扩增出与父本一致的差异条带。
将引物a20b37分别在父本基因组和母本基因组进行扩增，结果见图5。图5中，1-9为不同的父本基因组；10-17为不同的母本基因组。从图5可以看出，引物a20b37能够在父本基因组稳定扩增出特异性条带，在母本基因组中不能扩增出与父本一致的条带。
此外，本发明将引物CMAGN75和引物a20b37同时用于哈翠种子的纯度鉴定，引物CMAGN75鉴定的方法同实施例2，引物a20b37鉴定的方法同实施例3，将得到的哈翠种子种植，经性状以及其他观察，鉴定的准确率为100％。
本发明特定选用引物CMAGN75和引物a20b37鉴定哈翠种子的纯度，很好的区分出杂交种子、父本种子和母本种子，检测方便易行，准确率达到百分百，很好的解决了目前主要依赖田间性状观察，既耗工又耗时的方法。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.甜瓜品种哈翠种子纯度的快速检测方法，其特征在于，以父本序列SEQ ID 1-2和母本序列SEQ ID 3-5为特异性片段进行检测哈翠种子的纯度；
其中，父本序列SEQ ID 1-2为：
TGGGTTTTCTTCTACTACTGTAATAATAAACAATTGAGTTTCTATTTTCTCAAAAATCATATTATCTGAAACA—(GA)18-19–GTGTTTTTTGTTTATTTTATTTTTGAGTTGAATGAGAGTAAAAGCA；
母本序列SEQ ID 3-5为：
TGGGTTTTCTTCTACTACTGTAATAATAAACAATTGAGTTTCTATTTTCTCAAAAATCATATTATCTGAAACACA—(GA)36-39—GTGTTTTTTGTTTATTTTTATTTTTGAGTTGAATGAGAGTAAAAGCA。
2.根据权利要求1所述的甜瓜品种哈翠种子纯度的快速检测方法，其特征在于，以引物CMAGN75分别对哈翠种子基因组、哈翠父本种子基因组和哈翠母本种子基因组进行PCR扩增来检测哈翠种子纯度；
其中，所述引物CMAGN75为：
F：5’-TGGGTTTTCTTCTACTACTG-3’
R：5’-TGCTTTTACTCTCATTCAAC-3’。
3.根据权利要求2所述的甜瓜品种哈翠种子纯度的快速检测方法，其特征在于，哈翠种子基因组、哈翠父本种子基因组和哈翠母本种子基因组均通过CTAB法进行提取；优选地，提取基因组前将种子去除种皮。
4.根据权利要求2所述的甜瓜品种哈翠种子纯度的快速检测方法，其特征在于，引物CMAGN75的PCR反应体系为10μl，包括以下成分：基因组15-25ng,浓度为10μM上下游引物各0.2μl；1.25μM的dNTPs 2.75μl，10×buffer 1μl,15mM MgCl2,1％TritonX-1002μl，5U/L的Taq DNA聚合酶0.1μl，无菌双蒸水补齐至10μl；
其中，10×buffer中含有500mM KCl,100mM Tris-HCl，Tris-HCl在25℃的pH为9.0。
5.根据权利要求4所述的甜瓜品种哈翠种子纯度的快速检测方法，其特征在于，引物CMAGN75的PCR扩增程序为：95℃预变性3-5分钟；94℃变性1分钟；54℃退火45秒；72℃延伸1分钟；35个循环；72℃延伸5-10分钟；产物4℃保存。
6.根据权利要求2所述的甜瓜品种哈翠种子纯度的快速检测方法，其特征在于，还包括以引物a20b37分别对哈翠种子基因组、哈翠父本种子基因组和哈翠母本种子基因组进行PCR扩增来检测哈翠种子纯度；
所述引物a20b37为：
F：5’-TGAGTCCAAACCGGCAT-3’
R：5’-GACTGCGTACGAATTGCA-3’。
7.根据权利要求6所述的甜瓜品种哈翠种子纯度的快速检测方法，其特征在于，引物a20b37的反应体系为10μl，包括以下成分：基因组15-25ng，浓度为10μM上下游引物各0.12μl，1.25μM的dNTPs 1.2μl，10×bμffer 1μl，15mM MgCl2,1％Triton X-1001.4μl，5U/L的Taq DNA聚合酶0.12μl，无菌重蒸水补齐至10μl；
其中，10×buffer中含有500mM KCl,100mM Tris-HCl，Tris-HCl在25℃的pH为9.0。
8.根据权利要求7所述的甜瓜品种哈翠种子纯度的快速检测方法，其特征在于，引物a20b37的PCR扩增程序为：94℃预变性3-5分钟，94℃变性1分钟、35℃退火1分钟、72℃延伸1分钟，5个循环，94℃预变性1分钟、50℃退火1分钟、72℃延伸1分钟，35个循环，72℃延伸10分钟，产物4℃保存。
9.根据权利要求2-5任一项所述的甜瓜品种哈翠种子纯度的快速检测方法，其特征在于，引物CMAGN75的PCR产物用1.8-2.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。
10.根据权利要求6-8任一项所述的甜瓜品种哈翠种子纯度的快速检测方法，其特征在于，引物a20b37的PCR产物用5-7％非变性聚丙烯酰胺凝胶检测。
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