CN104387412A

CN104387412A - 埃罗替尼修饰的氟硼二吡咯衍生物及其制备和应用

Info

Publication number: CN104387412A
Application number: CN201410780416.XA
Authority: CN
Inventors: 刘见永; 卢源; 朱春晖; 叶发荣; 薛金萍
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2014-12-17
Filing date: 2014-12-17
Publication date: 2015-03-04
Anticipated expiration: 2034-12-17
Also published as: CN104387412B

Abstract

本发明公开了埃罗替尼修饰的氟硼二吡咯衍生物及其制备和应用。本发明利用埃罗替尼这种已上市的小分子抑制剂作为肿瘤靶点，将其通过点击反应共价连接到可用于光动力治疗的氟硼二吡咯光敏剂上，从而得到了可用于靶向治疗的第三代抗癌光敏剂：双埃罗替尼修饰的氟硼二吡咯衍生物和单埃罗替尼修饰的氟硼二吡咯衍生物。同时本发明以埃罗替尼修饰的氟硼二吡咯衍生物为研究对象，分别以人体肝癌细胞HepG2和人胚肺成纤维细胞HELF为受试细胞株，展开了其体外抗癌活性研究，筛选出适合于分子靶向治疗的前药，为埃罗替尼修饰的氟硼二吡咯衍生物应用于靶向治疗癌症奠定了基础。且此类化合物合成方法比较简单，原料易得，成本低，副反应少，产率较高，易提纯，有利于工业化生产。

Description

埃罗替尼修饰的氟硼二吡咯衍生物及其制备和应用

技术领域

本发明属于抗癌药物设计、合成领域，具体涉及埃罗替尼修饰的氟硼二吡咯衍生物及其制备和应用。

背景技术

肿瘤是目前世界上死亡率最高的疾病之一，光动力治疗（Photodynamic Therapy，简称PDT）是一种新型医疗技术，在治疗肿瘤及非肿瘤疾病方面展现出了独特优势，受到研究人员的广泛关注。而光敏剂是影响光动力治疗效果的关键因素，其可以选择性富集在肿瘤组织中，降低对周围正常组织的损伤，产生理想的生物学效应。卟啉、叶绿素类、竹红菌素等是传统光敏剂，这类光敏剂组成成分不确定，最大吸收波长在短波长附近，组织穿透能力较弱，光动力治疗时容易造成皮肤光毒性，不是理想的光敏剂。氟硼二吡咯类化合物因其具有确定的化学组成，化学性质稳定，最大吸收波长在可见及近红外区，而成为一类具有一定应用前景的第二代抗癌光敏剂。

靶向癌症治疗 (targeted cancer therapy) 是一种利用肿瘤发生中所涉及的特定异常分子和基因而设计的靶向药物对肿瘤组织进行选择性治疗的方法，其疗效取决于药物的自身特性和肿瘤内是否存在其作用的分子靶点。相对于传统化学治疗对肿瘤细胞的非特异性杀伤、耐药性、疗效提高不明显、毒副反应明显、对某些类型肿瘤的治疗力不从心等缺点，靶向药物对肿瘤相关分子靶点的选择性作用可以选择性杀伤肿瘤细胞，具有更高的疗效，且不存在耐药性问题。肿瘤靶向药物可分为信号传导类药物、抗肿瘤单抗药物、新生血管抑制药物等。

信号传导类药物作用机理是通过阻断肿瘤细胞内与肿瘤发生有关的信号传导途径，从而抑制肿瘤细胞的生长；其作用靶点通常有蛋白酪氨酸激酶、蛋白激酶C、丝裂原活化蛋白激酶等。而埃罗替尼（Erlotinib），俗名为特罗凯 (Tarceva)，就属于信号传导类药物。它是一种EGFR小分子酪氨酸激酶抑制剂，能特异性地直接抑制EGFR酪氨酸激酶并削弱EGFR自身的磷酸化作用，进而导致细胞停止生长直至凋亡。

分子靶向药物与其它治疗方法共同使用时常具有更好的疗效。研究发现单抗联合化疗或放疗时具有更好地效果，如Rituximab独立治疗早期淋巴瘤的疗效仅有将Rituximab联合标准化疗时的一半，而且联合治疗能显著延长反应时间；更重要的是，单抗和化疗具有协同作用且相互独立，疗效提高但联合治疗副作用却未增加。因此有理由将靶向性治疗与其它疗法进行联合。基于此，我们将光动力治疗与靶向性癌症治疗相结合，试图发展小分子靶向光动力治疗肿瘤的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供埃罗替尼修饰的氟硼二吡咯衍生物及其制备和应用，通过将小分子抑制剂埃罗替尼引入至光敏剂氟硼二吡咯上，从而增加肿瘤组织对光敏剂的靶向性摄取，得到了一种具有较高生物相容性，较好靶向性，毒副作用小的新药；本发明合成的化合物结构单一，不存在异构体，产品容易提纯；合成方法比较简单，副反应少，产率较高，原料易得，成本低，有利于工业化生产。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种埃罗替尼修饰的氟硼二吡咯衍生物，其为双埃罗替尼-氟硼二吡咯轭合物，化学结构式为：。

一种埃罗替尼修饰的氟硼二吡咯衍生物，其为单埃罗替尼-氟硼二吡咯轭合物，化学结构式为：。

一种制备双埃罗替尼-氟硼二吡咯轭合物的方法，具体步骤为：

（1）将对羟基苯甲醛、化合物和K₂CO₃溶于20 mL DMF（N，N-二甲基甲酰胺）中， N₂保护下90℃反应过夜，反应结束后旋转蒸发除去DMF；反应结束后用CH₂Cl₂和H₂O萃取；有机层用无水Na₂SO₄干燥后减压浓缩；然后以二氯甲烷为洗脱剂，硅胶柱层析分离得浅黄色黏稠液体化合物1，其结构式为：；

（2）将化合物、化合物1按摩尔比1:4加入到干燥的甲苯溶液中，再将体积比为1:1.2的冰乙酸、哌啶，以及催化量的高氯酸镁加入到反应混合液中，装上分水器，回流2-4小时；反应结束后用CH₂Cl₂和H₂O萃取；有机层用无水Na₂SO₄干燥后减压旋干；然后以二氯甲烷-乙酸乙酯为洗脱剂，硅胶柱层析分离得到化合物2，其结构式为：；

（3）将化合物2、按摩尔比1:2.5加入至7 mL CHCl₃、乙醇和水的混合液中，然后再将0.1-1当量的CuSO₄·5H₂O、0.2-2当量的抗坏血酸钠加入至混合液中，室温下剧烈搅拌8-30小时；反应液用CH₂Cl₂和水萃取；有机层经无水Na₂SO₄干燥后减压旋干；然后以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂，硅胶柱层析分离得到双埃罗替尼-氟硼二吡咯轭合物。

一种制备单埃罗替尼-氟硼二吡咯轭合物的方法，具体步骤为：

（1）将化合物2、按摩尔比1:1加入至7 mL CHCl₃、乙醇和水的混合液中，然后再将0.1-1当量的CuSO₄·5H₂O、0.2-2当量的抗坏血酸钠加入至混合液中，室温下剧烈搅拌8-30小时；反应液用CH₂Cl₂和水萃取；合并有机层并经无水Na₂SO₄干燥后减压旋干；然后以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂，硅胶柱层析分离得到化合物3，其结构式为：；

（2）将化合物3与按摩尔比1:1加入至7 mL CHCl₃、乙醇和水的混合液中，之后再将0.1-1当量的CuSO₄·5H₂O和0.2-2当量的抗坏血酸钠加入至混合液中，室温下剧烈搅拌8-30小时；反应液用CH₂Cl₂和水萃取；有机层用无水Na₂SO₄干燥后减压旋干；然后以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂，硅胶柱层析分离得到单埃罗替尼-氟硼二吡咯轭合物。

所述的CHCl₃、乙醇和水混合液中：CHCl₃、乙醇和水的体积比为12:1:1。

所述的埃罗替尼修饰的的氟硼二吡咯衍生物，用于制备具有主动靶向的抗癌光敏剂，用于光动力治疗。

光动力治疗（Photodynamic Therapy，PDT)是一种新型的肿瘤治疗方法。其基本要素包括光敏剂、可见光和氧。光敏剂作为能量的载体与反应的桥梁，在光动力治疗中起着决定性的作用。理想的光敏剂最好满足以下几条：组分单一，结构明确，性质稳定；特异靶向性强，能在到达靶组织后迅速达到最高浓度；体内清除时间短，在光照时具有较强的光毒性，而在黑暗情况下无毒副作用；光敏化能力强，单线态氧量子产率高；最长激发波长位于近红外区，在光动力治疗窗口（650-800 nm）有较强吸收。氟硼二吡咯衍生物因具有优良的光物理、光化学性质（较高的摩尔消光系数和荧光量子产率，对化学环境较不敏感，无漂白活性等）而成为理想的光敏剂之一。本发明合成了两个在近红外区具有较强吸收的氟硼二吡咯衍生物，母体通过用碘修饰从而增加了其单线态氧量子产率和光毒性。

本发明的显著优点在于：

（1）埃罗替尼是一种小分子抑制剂，能特异性靶向肿瘤细胞促进癌细胞对药物的摄取，当其连接到光敏剂上能有效增强癌细胞对光敏剂的选择性摄取，提高光动力治疗的效果；

（2）经埃罗替尼修饰后的氟硼二吡咯衍生物的最大吸收和发射位于红光区，组织穿透能力较强，光动力治疗时不易造成皮肤光毒性，是较为理想的光敏剂；

（3）目标化合物结构单一，不存在异构体，产物容易纯化；

（4）合成方法简单，只需要几个步骤就可以完成，副反应少，原料易得，成本低，有利于工业化生产。

具体实施方式

具有靶向光动力抗癌活性的双埃罗替尼修饰的氟硼二吡咯衍生物的具体制备过程包括：

（1）将对羟基苯甲醛、化合物和K₂CO₃溶于20 mL DMF（N，N-二甲基甲酰胺）中， N₂保护下90℃反应过夜，反应结束后旋转蒸发除去DMF；加水用CH₂Cl₂萃取，合并有机相，有机层用无水Na₂SO₄干燥后减压浓缩；然后以二氯甲烷为洗脱剂，硅胶柱层析分离得浅黄色黏稠液体化合物1，其结构式为：，产率95%；

（2）将化合物和化合物1按摩尔比1:4加入到干燥的甲苯溶液中，再将体积比为1:1.2的冰乙酸、哌啶，以及催化量的高氯酸镁加入到反应混合液中，装上分水器，回流2-4小时；反应结束后用CH₂Cl₂和H₂O萃取；有机层用无水Na₂SO₄干燥后减压旋干；然后以二氯甲烷-乙酸乙酯为洗脱剂，硅胶柱层析分离得到化合物2，其结构式为：，产率60%；

（3）将化合物2和按摩尔比1:2.5，以及0.1-1当量的CuSO₄·5H₂O和0.2-2当量的抗坏血酸钠加入至7 mL CHCl₃、乙醇和水的混合液中，其中，CHCl₃、乙醇和水的体积比为12:1:1，室温下剧烈搅拌8-30小时；反应液用CH₂Cl₂和水萃取；有机层用Na₂SO₄干燥后减压旋干；然后以二氯甲烷-甲醇15:1为洗脱剂，硅胶柱层析分离得到双埃罗替尼-氟硼二吡咯轭合物，产率82%。

具有靶向光动力抗癌活性的单埃罗替尼修饰的氟硼二吡咯衍生物的具体制备过程包括：

将化合物和化合物2按摩尔比1:1，以及0.1-1当量的CuSO₄·5H₂O和0.2-2当量的抗坏血酸钠加入至7 mL CHCl₃、乙醇和水的混合液中，其中，CHCl₃、乙醇和水的体积比为12:1:1，室温下剧烈搅拌8-30小时；反应液用CH₂Cl₂和水萃取；有机层用无水Na₂SO₄干燥后减压旋干；然后以二氯甲烷-甲醇20:1为洗脱剂，硅胶柱层析分离得到前驱体：

，产率54%；再将该前驱体与化合物按摩尔比1:1，以及0.1-1当量的CuSO₄·5H₂O和0.2-2当量的抗坏血酸钠加入至7 mL CHCl₃、乙醇和水的混合液中，其中，CHCl₃、乙醇和水的体积比为12:1:1，室温下剧烈搅拌8-30小时；反应液用CH₂Cl₂和水萃取；有机层用无水Na₂SO₄干燥后减压旋干；然后以二氯甲烷-甲醇15:1为洗脱剂，硅胶柱层析分离得到单埃罗替尼修饰的氟硼二吡咯衍生物：，产率89%。

以下几个实施例进一步阐述本发明，但是本发明不仅限于此。

实施例1

（1）将对羟基苯甲醛（2.50 g，20 mmol）、化合物（7.00 g，25 mmol）和K₂CO₃（8.28 g，60 mmol）溶于20 mL DMF中，N₂保护下90℃反应过夜。反应结束后旋转蒸发除去DMF，加水用CH₂Cl₂（3×50 mL）萃取三次、合并有机层并经无水Na₂SO₄干燥后减压旋蒸浓缩，以CH₂Cl₂为洗脱剂，硅胶柱层析分离得浅黄色黏稠液体化合物1：（5.80 g，95%）。¹H NMR (400 MHz，CDCl₃)：δ 9.98 (s，1 H，CHO)，7.82 (d，J = 8.4 Hz，2 H，ArH)，7.02 (d，J = 8.4 Hz，2 H，ArH)，4.22 (t，J = 4.8 Hz，2 H，OCH₂)，3.90 (t，J = 4.8 Hz，2 H，OCH₂)，3.67-3.76 (m，6 H，OCH₂)，3.38 (t，J = 4.8 Hz，2 H，CH₂N)；¹³C NMR (100.6 MHz，CDCl₃)：δ 190.44 163.61，131.62，129.79，114.65，70.60，70.40，69.79，69.24，67.54，50.39；HRMS (ESI)：m/z calculated for C₁₃H₁₈N₃O₄ [M+H]⁺：280.1297，found 280.1291 and C₁₃H₁₇N₃NaO₄[M+Na]⁺：302.1117，found 302.1111。

（2）将化合物（0.31 g，0.5 mmol）和化合物1(0.58 g，2.0 mmol) 按摩尔比1:4加入到干燥的40 mL甲苯溶液中，再把0.5 mL冰乙酸、0.6 mL哌啶（v/v=1:1.2）、高氯酸镁（催化量）加入到反应混合液中，装上分水器，回流2-4小时；反应结束后用CH₂Cl₂和H₂O萃取；有机层用无水Na₂SO₄ 干燥后减压旋干；然后以二氯甲烷-乙酸乙酯1:3为洗脱剂，硅胶柱层析分离得到化合物2：

(350 mg，60%)。

¹H NMR (400 MHz，CDCl₃)：δ 8.13 (d，J = 16.8 Hz，2 H，CH=CH)，7.60 (d，J = 8.8 Hz， 4 H，ArH)，7.59 (d，J = 16.8 Hz，2 H，CH=CH)，7.17 (d，J = 8.8 Hz，2 H，ArH)，7.04 (d， J = 8.8 Hz，2 H，ArH)，6.97 (d，J = 8.4 Hz，4 H，ArH)，4.20 (t，J = 4.8 Hz，4 H，OCH₂)， 3.88-3.92 (m，7 H，OCH₂+OCH₃)，3.75-3.79 (m，4 H，OCH₂)，3.67-3.73 (m，8 H，OCH₂)， 3.40 (t，J = 4.8 Hz，4 H，CH₂N₃)，1.50 (s，6 H，CH₃)；¹³C NMR (100.6 MHz，CDCl₃)：δ 160.55， 159.96，150.33，145.77，138.96，138.71，133.30，129.77，129.65，129.23，127.21，116.85， 115.04，114.86，82.70，70.93，70.75，70.11，69.79，67.59，55.43，50.73，17.74；HRMS (ESI)： m/z calculated for C₄₆H₄₉BF₂I₂N₈NaO₇ [M+Na]⁺：1151.1775，found 1151.1773。

（3）将化合物2（98 mg，0.25 mmol)和(113 mg，0.1 mmol)按摩尔比1:2.5，加入至7 mL CHCl₃、乙醇和水的混合液中，其中CHCl₃-EtOH-H₂O (12:1:1，v/v/v，7 mL)，搅拌均匀后加入碾碎的CuSO₄·5H₂O (15 mg，0.06 mmol) 和抗坏血酸钠 (24 mg，0.12 mmol) 粉末，避光搅拌反应24 h；反应液用CH₂Cl₂和水萃取；有机层用无水Na₂SO₄干燥后减压旋干；然后以二氯甲烷-甲醇15:1为洗脱剂，硅胶柱层析分离得到绿色固体产物即双埃罗替尼修饰的氟硼二吡咯衍生物：

(157 mg，82%)。

¹H NMR (400 MHz，CDCl₃)：δ 8.56 (s，2 H，pyrimidine-H)，8.18 (br s，2 H，NH)，8.12 (s，2 H，ArH)，7.97 (d，J = 16.4 Hz，2 H，CH=CH)，7.94 (s，2 H，triazole-H)，7.87 (d，J = 7.6 Hz，2 H，ArH)，7.53 (d，J = 16.4 Hz，2 H，CH=CH)，7.46 (d，J = 7.6 Hz，2 H，ArH)， 7.38 (s，2 H，ArH)，7.36 (d，J = 8.8 Hz，4 H，ArH)，7.33 (t，J = 8.0 Hz，2 H，ArH)，7.22 (d， J = 8.4 Hz，2 H，ArH)，7.16 (s，2 H，ArH)，7.06 (d，J = 8.4 Hz，2 H，ArH)，6.65 (d，J = 8.4 Hz，4 H，ArH)，4.50 (t，J = 4.8 Hz，4 H，OCH₂)，4.20 (t，J = 4.8 Hz，4 H，OCH₂)，4.13 (t， J = 4.8 Hz，4 H，OCH₂)，4.01 (t，J = 4.8 Hz，4 H，OCH₂)，3.91 (s，3 H，OCH₃)，3.86 (t，J = 4.8 Hz，4 H，OCH₂)，3.76-3.81 (m，8 H，OCH₂)，3.62-3.71 (m，12 H，OCH₂)，3.42 (s，6 H，OCH₃)，3.36 (s，6 H，OCH₃)，1.47 (s，6 H，CH₃)；¹³C NMR(100.6 MHz，CDCl₃)：δ 160.63， 159.77，156.52，154.16，153.41，150.25，148.67，147.46，147.02，145.90，139.77，139.10， 138.72，133.19，131.25，129.79，129.48，129.38，129.11，127.09 (two overlapping signals)， 121.41，121.38，120.94，118.75，116.60，114.85，109.52，108.40，102.60，82.57，70.75，70.52 (two overlapping signals)，70.49，69.60，69.35，68.79，68.28，67.48，59.21，59.17，55.46，50.34，17.70；HRMS (ESI)：m/z calculated for C₉₀H₉₆BF₂I₂N₁₄O₁₅ [M+H]⁺：1915.5338， found 1915.5357 and C₉₀H₉₇BF₂I₂N₁₄O₁₅ [M+2H]²⁺：958.2706，found 958.2726。

实施例2

（1）将化合物(10.2 mg，0.1 mmol)和化合物2 (113 mg，0.1 mmol)按摩尔比1:1，加入至7 mL CHCl₃、乙醇和水的混合液中，其中CHCl₃-EtOH-H₂O (12:1:1，v/v/v，7 mL)，搅拌均匀后加入碾碎的CuSO₄·5H₂O (15 mg，0.06 mmol) 和抗坏血酸钠 (24 mg，0.12 mmol) 粉末，避光搅拌反应24 h；反应液用CH₂Cl₂和水萃取；有机层用无水Na₂SO₄干燥后减压旋干；然后以二氯甲烷-甲醇20:1为洗脱剂，硅胶柱层析分离得到绿色化合物：（66 mg，80%）。

¹H NMR (400 MHz，CDCl₃)：δ 8.13 (d，J = 16.8 Hz，2 H，CH=CH)，8.04 (s，1 H，triazole-H)，7.60 (d，J = 8.8 Hz，4 H，ArH)，7.59 (d，J = 16.8 Hz，2 H，CH=CH)，7.40 (d，J = 7.2 Hz，2 H，ArH)，7.30-7.22(m，3 H，ArH)，7.17 (d，J = 8.8 Hz，2 H，ArH)，7.04 (d，J = 8.8 Hz， 2 H，ArH)，6.97 (d，J = 8.4 Hz，4 H，ArH)，4.20 (t，J = 4.8 Hz，4 H，OCH₂)，3.88-3.92 (m， 7 H，OCH₂+OCH₃)，3.75-3.79 (m，4 H，OCH₂)，3.67-3.73 (m，8 H，OCH₂)，3.40 (t，J = 4.8 Hz，4 H，CH₂N₃)，1.50 (s，6 H，CH₃)；¹³C NMR (100.6 MHz，CDCl₃)：δ 160.55，159.96， 150.33，145.77，138.96，138.71，136.34，135.21，133.30，129.77，129.65，129.23，127.21， 116.85，115.04，114.86，82.70，70.93，70.75，70.11，69.79，67.59，55.43，50.73，17.74； HRMS (ESI)：m/z calculated for C₅₄H₅₅BF₂I₂N₈NaO₇ [M+Na]⁺：1253.2242，found 1253.2239。

（2）将化合物 (152 mg，

0.1 mmol)与化合物(39 mg，0.1 mmol)按摩尔比1:1，加入至7 mL CHCl₃、乙醇和水的混合液中，其中CHCl₃-EtOH-H₂O (12:1:1，v/v/v，7 mL)，搅拌均匀后加入碾碎的CuSO₄·5H₂O (15 mg，0.06 mmol) 和抗坏血酸钠(24 mg，0.12 mmol)粉末，避光搅拌反应24 h；反应液用CH₂Cl₂和水萃取；有机层用Na₂SO₄干燥后减压旋干；然后以二氯甲烷-甲醇15:1为洗脱剂，硅胶柱层析分离得到绿色固体产物单埃罗替尼修饰的氟硼二吡咯衍生物：

(145 mg，89%)。

¹H NMR (400 MHz，CDCl₃)：δ 8.61 (s，1 H，pyrimidine-H)，8.31 (s，1 H，ArH)，8.07 (d， J = 16.8 Hz，1 H，CH=CH)，8.04 (s，1 H，triazole-H)，7.97 (s，1 H，triazole-H)，7.95 (d，J = 16.8 Hz，1 H，CH=CH)，7.87 (d，J = 8.8 Hz，1 H，ArH)，7.79 (vd，J = 7.6 Hz，2 H，ArH)， 7.73 (br s，1 H，ArH)，7.59 (d，J = 16.8 Hz，1 H，CH=CH)，7.56 (d，J = 16.8 Hz，1 H，CH=CH)， 7.45-7.51 (m，3 H，ArH)，7.38 (d，J = 7.2 Hz，2 H，ArH)，7.36 (d，J = 7.2 Hz，2 H，ArH)， 7.30 (d，J = 7.2 Hz，1 H，ArH)，7.22 (d，J = 8.4 Hz，2 H，ArH)，7.19 (br s，1 H，ArH)，7.06 (d，J = 8.8 Hz，2 H，ArH)，6.78 (d，J = 8.8 Hz，2 H，ArH)，6.68 (d，J = 8.8 Hz，2 H，ArH)， 4.58 (t，J = 4.8 Hz，2 H，OCH₂)，4.56 (t，J = 4.8 Hz，2 H，OCH₂)，4.26 (t，J = 4.8 Hz，2 H， OCH₂)，4.07 (vt，J = 4.4 Hz，4 H，OCH₂)，4.03 (t，J = 4.8 Hz，2 H，OCH₂)，3.87-3.94 (m， 7 H，OCH₃+OCH₂)，3.85 (t，J = 4.4 Hz，2 H，OCH₂)，3.76-3.82 (m，4 H，OCH₂)，3.62-3.73 (m，10 H，OCH₂)，3.48 (s，3 H，OCH₃)，3.41 (s，3 H，OCH₃)，1.51 (s，3 H，CH₃)，1.46 (s， 3 H，CH₃)；HRMS (ESI)：m/z calculated for C₇₆H₇₉BF₂I₂N₁₁O₁₁[M+H]⁺：1624.4104，found 1624.4084 and C₇₆H₈₀BF₂I₂N₁₁O₁₁[M+2H]²⁺：812.7095，found 812.7074。

应用实例 1

对埃罗替尼修饰的氟硼二吡咯衍生物

、

的离体光动力抗癌活性进行了研究，该实验能为以后在体实验提供一定的参考价值，具有较重要的意义。光敏剂的细胞毒性实验通常包括光毒性和暗毒性两部分，采用MTT法 (四氮唑盐还原法)测定。检测原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT（3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐）还原为不溶于水的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞中并无琥珀酸脱氢酶，因此不会产生甲瓒。用DMSO（二甲基亚砜）溶解活细胞产生的甲瓒，用酶标仪测定其在570 nm波长处的吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，甲瓒形成的量与活细胞数成正比。

MTT实验：取生长状态良好的人体肝癌细胞HepG2和人胚肺成纤维细胞HELF，用0.25%胰酶消化传代，用RPMI-1640培养基（含10%小牛血清）配制4×10⁴ cells/mL细胞悬液，将每孔200 μl（约含8000个肿瘤细胞）接种于96孔培养板内，置37 ℃、5% CO₂培养箱内培养过夜，贴壁后加药；实验设空白对照组(空白对照组是指对照组除了不加药物溶液外，其他条件与受试样品组一致)和溶剂对照组（溶剂对照组是指对照组不加细胞，其他条件与受试样品组一致）。将埃罗替尼修饰的氟硼二吡咯衍生物分别预先配制为DMSO（含5%蓖麻油）储备液，所有药液配制后均经有机膜过滤（0.22 μm），使用时药物溶液用水稀释为不同浓度，终浓度中 DMSO的含量为1%。每个浓度设定6个平行孔，每孔加入200 μl不同浓度的药物后置于培养箱内孵育。光毒实验：24小时后，去除含药液的培养基，换上100 μl新鲜培养基，然后用激光器对细胞进行照射，激光波长为670 nm，照射能量密度为 1.5 J·cm^-2。光照完毕，将96孔板重置于37 ℃、5% CO₂的培养箱内，继续培养。暗毒实验则在换完新鲜培养基后直接放入培养箱中继续培养，操作过程应避免光照，24 h后，每孔加入MTT的PBS溶液（4 mg·mL^-1）10 μl，37℃孵育4小时，4小时后小心弃去上清液，每孔加入150 μl DMSO溶解甲瓒颗粒，轻度震荡使甲瓒完全溶解后，用酶标仪测定570 nm波长下OD值。

我们采用MTT法测定了实施例1-2制备的埃罗替尼修饰的氟硼二吡咯衍生物，在光照和无光照条件下，对人体肝癌细胞HepG2以及人胚肺成纤维细胞HELF的杀伤效果，光照波长为670 nm，光照能量密度为1.5 J·cm^-2。数据由三次独立的平行实验得到，以Mean±SEM方式处理。由实验数据可知：在无光照条件下，药物浓度达至20 μmol时，埃罗替尼修饰的两个氟硼二吡咯衍生物对两种细胞均没有任何杀伤作用；在光照条件下，两种药物在20 μmol时对人胚肺成纤维细胞HELF亦没有杀伤作用，而它们对人体肝癌细胞HepG2则表现出很强的体外光毒性，其半数抑制浓度（IC₅₀值）分别为1.57 μmol和3.01 μmol（见表1）。该实验结果表明：这两个经埃罗替尼修饰的氟硼二吡咯衍生物对人体肝癌细胞HepG2都表现出一定的靶向光动力抗癌活性。

表1 埃罗替尼修饰的氟硼二吡咯衍生物对HepG2细胞的IC₅₀值

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一种埃罗替尼修饰的氟硼二吡咯衍生物，其特征在于：所述的衍生物为双埃罗替尼-氟硼二吡咯轭合物，其化学结构式为：。

2.一种埃罗替尼修饰的氟硼二吡咯衍生物，其特征在于：所述的衍生物为单埃罗替尼-氟硼二吡咯轭合物，其化学结构式为：。

3.一种制备如权利要求1所述的埃罗替尼修饰的氟硼二吡咯衍生物的方法，其特征在于：以化合物、为起始原料，合成双埃罗替尼-氟硼二吡咯轭合物。

4.一种制备如权利要求2所述的埃罗替尼修饰的氟硼二吡咯衍生物的方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）以化合物、为起始原料，合成化合物；

（2）然后以步骤（1）合成的化合物和为起始原料，合成单埃罗替尼-氟硼二吡咯轭合物。

5.根据权利要求3或4所述的埃罗替尼修饰的氟硼二吡咯衍生物的制备方法，其特征在于：所述化合物的合成方法具体包括以下步骤：

（1）以化合物、对羟基苯甲醛和K₂CO₃为起始原料，合成化合物；

（2）接着以化合物、为起始原料，合成化合物。

6.根据权利要求3所述的埃罗替尼修饰的氟硼二吡咯衍生物的制备方法，其特征在于：具体步骤为：

将化合物、按摩尔比1:2.5加入至7 mL CHCl₃、乙醇和水的混合液中，然后再将0.1-1当量的CuSO₄·5H₂O、0.2-2当量的抗坏血酸钠加入至混合液中，室温下剧烈搅拌8-30小时；反应液用CH₂Cl₂和水萃取；有机层经无水Na₂SO₄干燥后减压旋干；然后以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂，硅胶柱层析分离得到双埃罗替尼-氟硼二吡咯轭合物。

7.根据权利要求4所述的埃罗替尼修饰的氟硼二吡咯衍生物的制备方法，其特征在于：具体步骤为：

（1）将化合物、按摩尔比1:1加入至7 mL CHCl₃、乙醇和水的混合液中，然后再将0.1-1当量的CuSO₄·5H₂O、0.2-2当量的抗坏血酸钠加入至混合液中，室温下剧烈搅拌8-30小时；反应液用CH₂Cl₂和水萃取；合并有机层，有机层经无水Na₂SO₄干燥后减压旋干；然后以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂，经硅胶柱层析分离得到化合物；

（2）将化合物与按摩尔比1:1加入至7 mL CHCl₃、乙醇和水的混合液中，再将0.1-1当量的CuSO₄·5H₂O和0.2-2当量的抗坏血酸钠加入至混合液中，室温下剧烈搅拌8-30小时；反应液用CH₂Cl₂和水萃取；有机层用无水Na₂SO₄干燥后减压旋干；然后以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂，硅胶柱层析分离得到单埃罗替尼-氟硼二吡咯轭合物。

8.根据权利要求5所述的埃罗替尼修饰的氟硼二吡咯衍生物的制备方法，其特征在于：所述化合物的具体合成步骤为：

（1）将对羟基苯甲醛、化合物和K₂CO₃溶于20 mL DMF中，N₂保护下90℃反应过夜，反应结束后旋转蒸发除去DMF；产品用CH₂Cl₂和水萃取，合并有机相，有机层用无水Na₂SO₄ 干燥后减压浓缩；然后以二氯甲烷为洗脱剂，经硅胶柱层析分离得浅黄色黏稠液体化合物；

（2）将化合物、按摩尔比1:4加入到干燥的甲苯中，再将体积比为1:1.2的冰乙酸、哌啶，以及催化量的高氯酸镁加入到反应混合液中，装上分水器，回流2-4小时；反应结束后用CH₂Cl₂和水萃取；有机层用无水Na₂SO₄干燥后减压旋干；然后以二氯甲烷-乙酸乙酯为洗脱剂，经硅胶柱层析分离得到产物。

9.一种如权利要求1或2所述的埃罗替尼修饰的的氟硼二吡咯衍生物的应用，其特征在于：作为分子靶向的抗癌光敏剂用于光动力治疗。