CN104758947B - 二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯‑透明质酸及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯‑透明质酸及其制备方法和应用，本发明是将生物相容性差、靶向性差的疏水性光敏剂二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯接到透明质酸上得到两亲分子，通过自组装得到二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯‑透明质酸的纳米粒子，这种纳米颗粒除了具有良好的水溶性，生物相容性以及CD44特异靶向性外，还具有以下优点：1)实现被动靶向性，提高光敏剂到达肿瘤部位的准确性，实现光动力治疗肿瘤；2)实现光敏剂纳米颗粒是否准确达到肿瘤部位的智能监测；3)当纳米颗粒进入细胞后，自组装发生解离，光照下活性氧物种恢复，智能控制活性氧物种的产生，解决临床光动力治疗肿瘤给药需要避光的缺点。
Description
技术领域
本发明属于生物材料领域，具体涉及一种新型CD44特异靶向性光敏剂二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸及其合成和其智能光动力抗肿瘤治疗的应用。
背景技术
癌症又称为恶性肿瘤，是威胁人类健康与生命的重大疾病之一。在各种疾病中，恶性肿瘤的死亡率高居第二位，仅次于心脑血管病。随着医疗技术的不断发展，以手术和放、化疗为主的治疗手段有了长足进展，但由于恶性肿瘤发病机理复杂、治疗难度大，寻找高效低毒的治疗恶性肿瘤的药物和方法一直是当今治疗领域的难点和热点。
光动力治疗是一种氧分子参与的伴随生物效应的光敏化反应，是一种有着重要意义的肿瘤治疗新方法，其基本原理是借助富集在肿瘤组织中的光敏剂在特点波长光的激发下发生光化学反应：处于基态(S0)的光敏剂吸收激发光子的能量跃迁到单重激发态(S1)，随后系间窜越到三重激发态(T1)。三重激发态寿命比较长，可通过不同的光致敏化机理敏化氧气生成单线态氧(1O2)或者超氧自由基(O2 ·)等活性氧物质(Reactive Oxygen Species,ROS)来破坏肿瘤组织中的生物大分子，导致肿瘤细胞死亡，达到肿瘤治疗目的。
光敏剂是光动力治疗的核心部分，设计合成高效的光敏剂是提高光动力抗肿瘤性能得到关键所在。然而，当前商品化和临床试验的光敏剂存在的主要问题有：1)光敏剂固有的疏水性导致其在缓冲溶液或者血液循环中团聚，使活性氧物种淬灭；2)主动靶向性差，无法区分正常细胞和肿瘤细胞，在光光动力治疗过程中选择性差，副作用大；3)在临床和实际应用过程中，给药后需要避光以减少光敏剂对人体正常器官的副作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型CD44特异靶向性光敏剂二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸，并将其有效应用于智能化光动力抗肿瘤中。
本发明的目的是通过以下方式实现的：
一种二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸(DBHA)，其结构式如下：
上述二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸的制备方法是将二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯通过酯化反应接到透明质酸分子链上，具体是将具有近红外吸收的二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯通过酯化反应接到水溶性透明质酸分子链上。进一步具体是在惰性气体保护下，化合物二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯和透明质酸在无水无氧四氢呋喃存在下，40℃温度下搅拌混合72小时，旋干反应所得混合相，加入超纯水超声、溶解，用0.45微米水相滤膜抽滤得到滤液，用分子量为3500KD的透析袋透析48小时后冷冻干燥，得到淡蓝色固体二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸。
上述二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸的合成方法合成步骤如下：
(ⅰ)3,-溴-1-丙醇和对羟基苯甲醛反应得到4-(3-羟基-1-丙氧基)-1-苯甲醛；
(ⅱ)苯甲酰氯和2,4-二甲基吡咯反应得到氟化硼二吡咯；
(ⅲ)氟化硼二吡咯再与N-碘代丁二酰亚胺合成得到二碘代氟化硼二吡咯；
(ⅳ)二碘代氟化硼二吡咯和4-(3-羟基-1-丙氧基)-1-苯甲醛合成得到二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯；
(ⅴ)二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯通过酯化反应接到水溶性透明质酸分子链上。
步骤(ⅰ)即4-(3-羟基-1-丙氧基)-1-苯甲醛的合成中，3,-溴-1-丙醇和对羟基苯甲醛的摩尔比为0.5-4，反应温度范围为40-80℃。优选反应温度60℃，3,-溴-1-丙醇和对羟基苯甲醛的摩尔比为1-1.5，最优选摩尔比为1.1。
步骤(ⅱ)即氟化硼二吡咯的合成步骤中，苯甲酰氯和2,4-二甲基吡咯在20℃-30℃下搅拌反应12-36小时，优选搅拌24小时，在冰浴下分别缓慢加入三乙胺和三氟化硼乙醚溶液，滴加结束后，恢复到30-50℃后继续搅拌6-24小时，优选恢复到40℃后继续搅拌12小时，用饱和食盐水洗涤；苯甲酰氯和2,4-二甲基吡咯的摩尔比为1：1.5-4，优选苯甲酰氯和2,4-二甲基吡咯的摩尔比为1：2.5。
步骤(ⅲ)即二碘代氟化硼二吡咯的合成步骤中，氟化硼二吡咯与N-碘代丁二酰亚胺的摩尔比是1：5-10，优选氟化硼二吡咯与N-碘代丁二酰亚胺的摩尔比是1：10。
步骤(ⅳ)即二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯的合成步骤中：二碘代氟化硼二吡咯和4-(3-羟基-1-丙氧基)-1-苯甲醛分别溶于N,N-二甲基甲酰胺中，依次加入冰醋酸和哌啶，在微波条件下，100-180℃反应2-10分钟，优选150℃反应5分钟。二碘代氟化硼二吡咯和4-(3-羟基-1-丙氧基)-1-苯甲醛的摩尔比为1：1-4，优选二碘代氟化硼二吡咯和4-(3-羟基-1-丙氧基)-1-苯甲醛的摩尔比为1：2-3。
步骤(ⅴ)即二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸的合成包括以下步骤：
在惰性气体保护下，二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯和透明质酸进行酯化反应，反应溶剂为无水无氧四氢呋喃，反应时间为48-96小时，优选反应时时间为72小时。二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯和透明质酸摩尔比为1：5-15，优选二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯和透明质酸摩尔比为1：12.5。
二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸的合成方法具体包括以下步骤：
(ⅰ)反应温度为40-80℃范围条件下，3-溴-1-丙醇和对羟基苯甲醛在丙酮中反应，然后用硅胶柱层析法进行分离得到产物1；3-溴-1-丙醇和对羟基苯甲醛的摩尔比是0.5-4；
(ⅱ)在惰性气体保护下，苯甲酰氯和2,4-二甲基吡咯在20℃-30℃下搅拌反应12-36小时，冰浴下分别加入缓慢加入三乙胺和三氟化硼乙醚溶液，滴加结束后，恢复到30-50℃后继续搅拌6-24小时，用饱和食盐水洗涤；苯甲酰氯和2,4-二甲基吡咯的摩尔比是1：1.5-4；
(ⅲ)将化合物2氟化硼二吡咯和N-碘代丁二酰亚胺分别溶于四氢呋喃中，室温下搅拌后，用饱和硫代硫酸钠洗涤，分离得到产物3；化合物2氟化硼二吡咯和N-碘代丁二酰亚胺摩尔比是1：5-10；
(ⅳ)在氮气保护下，将二碘代氟化硼二吡咯和4-(3-羟基-1-丙氧基)-1-苯甲醛分别溶于N,N-二甲基甲酰胺中，随后加入冰醋酸和哌啶，微波条件下，100-180℃温度下反应2-10分钟，减压蒸馏除去N,N-二甲基甲酰胺，分离得到产物4；二碘代氟化硼二吡咯和4-(3-羟基-1-丙氧基)-1-苯甲醛的摩尔比为1：1-4；
(ⅴ)在氮气保护下，二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯和透明质酸在无水无氧四氢呋喃中反应，旋干反应粗产物后，加水溶解抽滤得到滤液，水中透析两天后，冷冻干燥得到化合物二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸。二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯和透明质酸摩尔比为1：5-15。
二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸自组装制备纳米颗粒的方法是将二碘代苯乙
烯型氟化硼二吡咯-透明质酸溶于少量的超纯水中(超纯水的用量使二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸完全溶解即可)，在超声下逐滴加到大量(是溶解用水体积的50-200倍)的超纯水中，滴加结束后，冷冻干燥，得到自组装的二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒。二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸可在制备抗肿瘤的光敏剂中应用。
二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸以二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒的形式应用，应用方法：二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒分别在细胞内和活体内的荧光成像，主要包括：分析二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒CD44特异靶向性；验证二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒进入肿瘤细胞的过程；对比二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒进入肿瘤细胞前后以及进入裸鼠体内前后荧光从无到有的过程。
其中，分析二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒CD44特异靶向性是在相同条件下，将二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒分别与HCT-116细胞(CD44表达过度)和A2780细胞(CD44表达相对较少)培养后，利用荧光共聚焦显微镜拍摄荧光成像图以及相应的荧光强度。
其中，验证二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒进入肿瘤细胞的过程是先用透明质酸直接跟HCT-116细胞培养4小时后，用培养液洗掉透明质酸，再加入二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒的PBS缓冲溶液，通过荧光共聚焦显微镜拍摄其荧光成像图，并分析其荧光强度，作为对比组，除了不先加透明质酸外，其他完全一样；
其中，对比二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒进入肿瘤细胞前后荧光从无到有的过程是利用荧光共聚焦显微镜配套的细胞培养装置，将HCT-116细胞养在其中，从加入二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒的PBS缓冲溶液开始，利用荧光共聚焦显微镜实时监测HCT-116细胞内荧光的变化，并对其进行实时拍摄。
其中，对比二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒进入裸鼠体内前后荧光从无到有的过程是将一定量的二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒的PBS缓冲溶液通过尾静脉注射法注入裸鼠体内，利用活体荧光成像仪，观察二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒在血液循环过程中在各脏器内以及肿瘤部位的荧光变化；
相关表征：通过核磁共振(NMR)，气相色谱质谱联用仪(GC-MS)，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)对二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸及其合成中间体结构予以表征；通过紫外-可见吸收光谱(UV-Vis)，荧光发射光谱(PL)，透射电子显微镜(TEM)，动态光散射(DLS)对二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒的光物理特性和形貌结构等进行表征；通过荧光共聚焦显微镜对二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒在细胞内荧光成像进行表征；通过MTT分析法分析二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒对肿瘤细胞的光照毒性；通过活体荧光成像仪对二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒进入裸鼠体内荧光成像进行表征。
这种二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒无论合成还是自组装都简单易行。除了能解决二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯作为光敏剂的水溶性差、生物相容性差、无靶向性等问题外，还可以通过自组装及解离实现智能光动力治疗肿瘤，一方面可以很好的确定光敏剂是否准确到达肿瘤部位，另一方面为解决临床光敏剂需要避光给药的缺点提供指导。
二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒与CD44过度表达的HCT-116细胞有很好的特异靶向性；
所述的二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒通过“自组装-解离”实现荧光“从无到有”的智能过程：二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒自组装后荧光消失，而当其到达肿瘤部位纳米颗粒破坏后，其荧光特性恢复，证明二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒进入肿瘤细胞前后荧光从无到有的过程，实现对光敏剂是否准确到达肿瘤部位的实时监测；
所述的二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒在裸鼠体内荧光“从无到有”的智能过程，通过尾静脉注射后可以实现荷瘤鼠体内荧光从无到有的过程，通过其荧光从无到有确定二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒是否准确到达肿瘤部位。
所述的二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒在体外杀死肿瘤细胞的应用：二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒在光照条件下能够很好地杀死肿瘤细胞HCT-116，表现出较强的体外光照抗肿瘤毒性。
所述的二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒在体内抗肿瘤的应用：通过与生理空白组对比，二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒在光照条件下能够更好地抑制肿瘤细胞的生长，表现出较强的体内光动力抗肿瘤特性。
与现有技术比较本发明的有益效果：本发明DBHA将生物相容性差、靶向性差的疏水性光敏剂二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯接到透明质酸上得到的两亲分子。通过自组装得到二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸的纳米粒子，这种纳米颗粒除了具有良好的水溶性，生物相容性以及CD44特异靶向性外，还具有以下优点：1)自组装后的二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒直径约60nm，通过肿瘤“EPR效应”可以实现被动靶向性，结合二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸固有的CD44靶向性，提高光敏剂到达肿瘤部位的准确性，实现光动力治疗肿瘤；2)二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒中二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯所固有的荧光会因自组装发生淬灭，当其进入肿瘤细胞后，肿瘤内的酶和酸会使自组装粒子解离，使二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯荧光恢复，从而实现光敏剂纳米颗粒是否准确达到肿瘤部位的智能监测；3)自组装还会导致光照下活性氧物种的淬灭，当纳米颗粒进入细胞后，自组装发生解离，光照下活性氧物种恢复，智能控制活性氧物种的产生，解决临床光动力治疗肿瘤给药需要避光的缺点，其在肿瘤的智能化光动力治疗领域有很好的应用。
附图说明
图1是本发明实施例二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸和透明质酸的核磁1HNMR对比图(氘代水，400MHz),横坐标为化学位移，纵坐标为强度。
图2是本发明实施例二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸和透明质酸在PBS缓冲溶液中的紫外-可见吸收光谱图。
图3是本发明实施例二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸分别在PBS缓冲溶液、PBS和DMSO混合溶液(体积比，1:1)中的荧光发射光谱图。
图4是本发明实施例二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒的透射电子显微镜图，其中插图为其动态散射粒径分布图。
图5是通过MTT法研究本发明实施例二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸和透明质酸纳米颗粒和透明质酸在光照和非光照下杀死HCT-116和A2780细胞的性能对比图。
图6是通过流式细胞仪分析不同浓度(0.25mg/ml，0.5mg/ml和1mg.ml)下细胞凋亡机理图。
图7是通过荧光共聚焦显微镜对比分析验证本发明实施例二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒CD44特异靶向性以及细胞内吞过程图。
图8是通过共聚焦荧光显微镜实时观察本发明实施例二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒进入细胞前后荧光变化及通过活体成像仪实时观察二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸通过尾静脉注射进入裸鼠体内后的荧光变化图。
具体实施方式
下面通过实施例来进一步说明本发明的技术方案，以便较好的理解本发明的内容。
实施例1：
(1)4-(3-羟基-1-丙氧基)-1-苯甲醛的合成
对羟基苯甲醛(0.1mol,12.2g)，3-溴-1-丙醇(0.11mol,15.2g)和碳酸钾(0.3mol,40g)加入丙酮(200ml)中。60℃下不断搅拌，直至对羟基苯甲醛完全反应后停止反应，反应时间12小时。反应混合物抽滤得到滤液，旋干后经硅胶层析用石油醚：乙酸乙酯＝1:2做淋洗液淋洗，得到的黄色液体化合物14-(3-羟基-1-丙氧基)-1-苯甲醛(10.32g)，产率约为68％。1HNMR(400Hz,CD3OD)δ9.75(s,1H),7.73-7.70(m,2H),6.93-6.89(m,2H),4.13-4.09(m,2H),3.80-3.76(m,2H),2.01-1.97(m,2H)；ESI-MS:166.45[M+].
(2)氟化硼二吡咯的合成
在惰性气体保护下，苯甲酰氯(1g,7.86mmol)和2,4-二甲基吡咯(2.0mL,19.65mmol)溶于二氯甲烷(100mL)中。室温下，搅拌一天后。在冰浴下，分别加入三乙胺(10mL)和三氟化硼乙醚溶液(10mL)。恢复到室温后继续保持一天。反应结束后，用水洗涤反应粗产物三次，无水硫酸钠干燥后旋干，旋干后经硅胶层析用石油醚：乙酸乙酯＝50:1做淋洗液淋洗，得到的橙黄色固体为化合物2氟化硼二吡咯(1.08g)，产率为42.4％。1HNMR(400Hz,CD3OD)δ7.50-7.45(m,3H),7.29-7.26(m,2H),5.98(s,2H),2.56(s,6H),1.37(s,6H)；ESI-MS:324.55[M+].
(3)二碘代氟化硼二吡咯的合成
将化合物2氟化硼二吡咯(0.324g,1mmol)和N-碘代丁二酰亚胺(2.25g,10mmol)溶于二氯甲烷(20mL)中，室温下搅拌至化合物2完全反应后，用饱和硫代硫酸钠洗涤三次，无水硫酸钠干燥后旋干，经硅胶层析柱用纯石油醚将产物冲下来，得到的红色固体为化合物3二碘代氟化硼二吡咯(0.5g)，产率为87.0％。1HNMR(400Hz,CD3OD)δ7.54-7.50(m,3H),7.27-7.23(m,2H),2.65(s,6H),1.38(s,6H)；MDLDI-TOF：574.50[M+].
(4)二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯的合成
化合物1(1.15mmol,0.21g)和化合物3(0.52mmol,0.3g)分别加入15ml N,N-二甲基甲酰胺(15ml)中，搅拌至完全溶解后，依次加入冰醋酸(30滴)和哌啶(30滴)，氮气保护下，放入微波反应器中，不断搅拌，150℃下保持5分钟后结束反应，减压蒸馏下除去反应溶剂N,N-二甲基甲酰胺。用水洗涤三次后，无水硫酸钠干燥，旋干后经硅胶层析用石油醚：乙酸乙酯＝1:1做淋洗液淋洗，得到的墨绿色粉末为化合物4二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯(0.204g)，产率为43.6％。1HNMR(400Hz,CD3OD)δ8.02-7.87(M,2H),7.73-7.59(m,2H),7.59-7.54(m,4H),7.49-7.28(m,4H),4.12-4.05(m,4H),3.60-3.53(m,4H),1.91-1.83(m,4H),1.59-1.11(m,6H)；MDLDI-TOF：900.32[M+].
(5)二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸的合成
在惰性气体保护下，将化合物4二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯(0.04mmol,36mg)和透明质酸(0.5mmol,61mg)分别加入100ml单口瓶中，然后加入无水无氧四氢呋喃(30ml)，40℃下搅拌72小时后结束反应。旋干反应所得混合相，加入超纯水超声、溶解后，用0.45微米水相滤膜抽滤得到滤液，分子量为3500KD的透析袋透析48小时后冷冻干燥得到淡蓝色固体二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸(70.33mg)，产率：72.5％。
(6)二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒的制备
20mg二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸溶于1ml超纯水中，随后在超声下逐滴加入100ml中，滴加结束后，冷冻干燥，得到二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸。
实施例2：
将二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒和透明质酸分别溶于D2O中，然后进行核磁氢谱测试以确定二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯接到透明质酸上后氢化学位移的变化。如图1所示，通过对比二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒和透明质酸的核磁氢谱可以看出，化学位移在7到8之间，二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒出现了峰，而纯透明质酸没有，这是由于透明质酸上引入二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯后苯环的化学位移，可以确定二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯成功接到透明质酸上。
实施例3：
采用岛津UV-3150紫外可见光谱仪和RF-530XPC荧光光谱仪测试二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒的紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱。图2为其紫外-可见吸收光谱图，二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒在600nm处有吸收，而纯透明质酸没有，这是二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯接到透明质酸上后二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯的紫外-可见吸收；
图3为二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒分别在PBS溶液、PBS和DMSO混合溶液(体积比，1:1)中的荧光发射谱图，对比两者可以发现D二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒在PBS溶液里面的荧光发射非常微弱，这是由于其自组装后荧光猝灭导致的；然而在相同条件下，将溶剂PBS溶液换成PBS和DMSO混合溶液(体积比，1:1)后，其荧光显著增强，这是由于DBHA纳米颗粒在PBS和DMSO混合溶液(体积比，1:1)中自组装会被解离，解离后的DBHA荧光猝灭减弱，其荧光强度显著增强。因此，通过荧光谱图对比分析可以看出，这种二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒的荧光随着自组装聚集猝灭消失，而自组装解离恢复。
实施例4：
通过透射电子显微镜和动态散射粒径分布测试二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒的尺寸大小。如图4所示，自组装后的DBHA纳米颗粒为直径在60nm左右的纳米球体，通过插图中DLS粒径测试进可以一步确定其直径约为60nm。
实施例5：
MTT法分析二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒和透明质酸HA在不同条件下杀死不同肿瘤的性能。具体的操作步骤是通过细胞复苏传代后，将细胞点到六孔板上，随后加入二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒的PBS溶液或者透明质酸的PBS溶液后，培养4小时后光照(7min，强度为48J/cm2)，随后继续培养12小时后分析细胞存活率。如图5所示，纯透明质酸在光照条件下没有细胞毒性；而对比二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒，以及将其应用光动力抗肿瘤领域纳米颗粒在光照与不光照下的细胞毒性可以看出，二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒的暗光毒性较小，而光照毒性较大，符合理想光敏剂的要求；同时，相同条件下，二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒对HCT-116细胞的光照毒性大于A2780细胞，这是由于HCT-116细胞CD44表达过度而A2780细胞CD44表达相对较少，这也突出了DBHA纳米颗粒对CD44表达过度的肿瘤的特异靶向性。
实施例6：
将不同浓度(0.25mg/ml，0.5mg/ml和1mg.ml)的二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒PBS溶液分别与HCT-116细胞培养后，光照4小时后，继续培养12小时，随后对其进行染色，放入流式细胞仪内分析其凋亡机理，由图6可知，二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒对HCT-116肿瘤细胞的破坏机制既有凋亡也有坏死。除此之外，不同浓度的流式细胞仪结果图反应了随着二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒剂量增加，肿瘤细胞死亡率增加的趋势，这一趋势与MTT分析的结果一致。
实施例7：
二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒的CD44特异靶向性是通过将二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒分别于HCT-116细胞(CD44表达过度)和A2780细胞(CD44表达相对较少)培养后通过荧光共聚焦显微镜观察得到的，如图7所示，相同条件下，HCT-116细胞内荧光明显强于A2780细胞，说明相同条件下，二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒与CD44表达过度的HCT-116细胞结合的更多，突出其CD44靶向性。
二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒进入细胞为细胞内吞过程。先用透明质酸直接跟HCT-116细胞培养4小时后，用培养液洗掉透明质酸，再加入二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒的PBS缓冲溶液，通过荧光共聚焦显微镜拍摄其荧光成像图，并分析其荧光强度，作为对比组，除了不先加透明质酸外，其他完全一样；如图7所示，先用透明质酸与HCT-116培养后，再加入二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒，HCT-1116细胞的荧光明显弱于不先加透明质酸的。
因此二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒与HCT-116细胞的作用过程主要包括两个：首先是二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒与HCT-116细胞过度表达的CD44受体特异性结合，随后发生细胞内吞，二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒进入HCT-116细胞内。具体见附图7中的示意图。
实施例8：
通过荧光共聚焦显微镜实时监控细胞内光敏剂荧光从无到有的过程(时间点分别为0min,10min,30min,60min)。将HCT-116细胞复苏传代后，点在共聚焦培养皿中，加入二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米的PBS溶液后，利用共聚焦荧光显微镜实时观察细胞内荧光的变化过程。如图8所示，刚加入二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒的PBS溶液，细胞内无荧光，随着时间的增加，细胞内光敏剂二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸的荧光逐渐增强，这是由于当二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒被肿瘤细内吞后被肿瘤内的酸或者酶解离，荧光恢复。这一结果与二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒分别在PBS溶液、PBS和DMSO混合溶液(体积比，1:1)中的荧光发射结果一致。
通过活体成像仪观察光敏剂进入荷瘤鼠体内后荧光从无到有的过程(时间点分别为1h，4h，8h，24h)。通过尾静脉注射法将二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒PBS溶液注入荷瘤鼠体内，利用活体荧光成像仪观测不同时间点下肿瘤内药物的荧光变化情况。如图8所示，与一般的荧光探针不一样，二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒进入裸鼠体内后，并没有发出荧光(1h，4h,8h)，而当24h，二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒到达肿瘤部位后，肿瘤处有很强的荧光。这是由于二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒通过血液循环进入其他脏器(心、肝、脾、肺、肾等)，二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒的自组装无法被解离，荧光依旧猝灭，只有当其进入肿瘤，被肿瘤细胞内酸或者酶打断而发生解离，荧光恢复。这一过程与上述荧光光谱和细胞内荧光成像过程相对应，实现对光敏剂是否达到肿瘤部位的智能监控。
实施例9：
(1)4-(3-羟基-1-丙氧基)-1-苯甲醛的合成
对羟基苯甲醛(0.1mol)，3-溴-1-丙醇(0.13mol)和碳酸钾(45g)加入丙酮(200ml)中。80℃下不断搅拌，直至对羟基苯甲醛完全反应后停止反应。反应混合物抽滤得到滤液，旋干后经硅胶层析用石油醚：乙酸乙酯＝1:2做淋洗液淋洗，得到的黄色液体化合物14-(3-羟基-1-丙氧基)-1-苯甲醛，产率约为65％。
1HNMR(400Hz,CD3OD)δ9.75(s,1H),7.73-7.70(m,2H),6.93-6.89(m,2H),4.13-4.09(m,2H),3.80-3.76(m,2H),2.01-1.97(m,2H)；ESI-MS:166.45[M+].
(2)氟化硼二吡咯的合成
在惰性气体保护下，苯甲酰氯(7.86mmol)和2,4-二甲基吡咯(23.58mmol)溶于二氯甲烷(100mL)中。室温下，搅拌一天后。在冰浴下，分别加入三乙胺(10mL)和三氟化硼乙醚溶液(10mL)。恢复到室温后继续保持一天。反应结束后，用水洗涤反应粗产物三次，无水硫酸钠干燥后旋干，旋干后经硅胶层析用石油醚：乙酸乙酯＝50:1做淋洗液淋洗，得到的橙黄色固体为化合物2氟化硼二吡咯，产率为41.5％。
1HNMR(400Hz,CD3OD)δ7.50-7.45(m,3H),7.29-7.26(m,2H),5.98(s,2H),2.56(s,6H),1.37(s,6H)；ESI-MS:324.55[M+].
(3)二碘代氟化硼二吡咯的合成
将化合物2氟化硼二吡咯(1mmol)和N-碘代丁二酰亚胺(5mmol)溶于二氯甲烷(15mL)中，室温下搅拌至化合物2完全反应后，用饱和硫代硫酸钠洗涤三次，无水硫酸钠干燥后旋干，经硅胶层析柱用纯石油醚将产物冲下来，得到的红色固体为化合物3二碘代氟化硼二吡咯，产率为86.0％。
1HNMR(400Hz,CD3OD)δ7.54-7.50(m,3H),7.27-7.23(m,2H),2.65(s,6H),1.38(s,6H)；MDLDI-TOF：574.50[M+].
(4)二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯的合成
化合物1(1.5mmol,0.21g)和化合物3(0.5mmol,0.3g)分别加入20ml N,N-二甲基甲酰胺中，搅拌至完全溶解后，依次加入冰醋酸(30滴)和哌啶(30滴)，氮气保护下，放入微波反应器中，不断搅拌，150℃下保持5分钟后结束反应，减压蒸馏下除去反应溶剂N,N-二甲基甲酰胺。用水洗涤三次后，无水硫酸钠干燥，旋干后经硅胶层析用石油醚：乙酸乙酯＝1:1做淋洗液淋洗，得到的墨绿色粉末为化合物4二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯，产率为42.9％。
1HNMR(400Hz,CD3OD)δ8.02-7.87(M,2H),7.73-7.59(m,2H),7.59-7.54(m,4H),7.49-7.28(m,4H),4.12-4.05(m,4H),3.60-3.53(m,4H),1.91-1.83(m,4H),1.59-1.11(m,6H)；MDLDI-TOF：900.32[M+].
(5)二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸的合成
在惰性气体保护下，将化合物4二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯(0.05mmol)和透明质酸(0.5mmol)分别加入100ml单口瓶中，然后加入无水无氧四氢呋喃(50ml)，40℃下搅拌72小时后结束反应。旋干反应所得混合相，加入超纯水超声、溶解后，用0.45微米水相滤膜抽滤得到滤液，分子量为3500KD的透析袋透析48小时后冷冻干燥得到淡蓝色固体二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸，产率：71.1％。
(6)二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒的制备
20mg二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸溶于1ml超纯水中，随后在超声下逐滴加入100ml中，滴加结束后，冷冻干燥，得到二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸。
实施例10：
(1)4-(3-羟基-1-丙氧基)-1-苯甲醛的合成
对羟基苯甲醛(0.1mol)，3-溴-1-丙醇(0.15mol)和碳酸钾(48g)加入丙酮(200ml)中。60℃下不断搅拌，直至对羟基苯甲醛完全反应后停止反应，反应时间12小时。反应混合物抽滤得到滤液，旋干后经硅胶层析用石油醚：乙酸乙酯＝1:2做淋洗液淋洗，得到的黄色液体化合物14-(3-羟基-1-丙氧基)-1-苯甲醛，产率约为67.5％。
1HNMR(400Hz,CD3OD)δ9.75(s,1H),7.73-7.70(m,2H),6.93-6.89(m,2H),4.13-4.09(m,2H),3.80-3.76(m,2H),2.01-1.97(m,2H)；ESI-MS:166.45[M+].
(2)氟化硼二吡咯的合成
在惰性气体保护下，苯甲酰氯(7.5mmol)和2,4-二甲基吡咯(15mmol)溶于二氯甲烷(100mL)中。室温下，搅拌一天后。在冰浴下，分别加入三乙胺(10mL)和三氟化硼乙醚溶液(10mL)。恢复到室温后继续保持一天。反应结束后，用水洗涤反应粗产物三次，无水硫酸钠干燥后旋干，旋干后经硅胶层析用石油醚：乙酸乙酯＝50:1做淋洗液淋洗，得到的橙黄色固体为化合物2氟化硼二吡咯，产率为41.9％。
1HNMR(400Hz,CD3OD)δ7.50-7.45(m,3H),7.29-7.26(m,2H),5.98(s,2H),2.56(s,6H),1.37(s,6H)；ESI-MS:324.55[M+].
(3)二碘代氟化硼二吡咯的合成
将化合物2氟化硼二吡咯(1mmol)和N-碘代丁二酰亚胺(8mmol)溶于二氯甲烷(17mL)中，室温下搅拌至化合物2完全反应后，用饱和硫代硫酸钠洗涤三次，无水硫酸钠干燥后旋干，经硅胶层析柱用纯石油醚将产物冲下来，得到的红色固体为化合物3二碘代氟化硼二吡咯，产率为86.6％。
1HNMR(400Hz,CD3OD)δ7.54-7.50(m,3H),7.27-7.23(m,2H),2.65(s,6H),1.38(s,6H)；MDLDI-TOF：574.50[M+].
(4)二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯的合成
化合物1(1.5mmol)和化合物3(0.75mmol)分别加入20ml N,N-二甲基甲酰胺中，搅拌至完全溶解后，依次加入冰醋酸(30滴)和哌啶(30滴)，氮气保护下，放入微波反应器中，不断搅拌，150℃下保持5分钟后结束反应，减压蒸馏下除去反应溶剂N,N-二甲基甲酰胺。用水洗涤三次后，无水硫酸钠干燥，旋干后经硅胶层析用石油醚：乙酸乙酯＝1:1做淋洗液淋洗，得到的墨绿色粉末为化合物4二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯，产率为42.8％。
1HNMR(400Hz,CD3OD)δ8.02-7.87(M,2H),7.73-7.59(m,2H),7.59-7.54(m,4H),7.49-7.28(m,4H),4.12-4.05(m,4H),3.60-3.53(m,4H),1.91-1.83(m,4H),1.59-1.11(m,6H)；MDLDI-TOF：900.32[M+].
(5)二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸的合成
在惰性气体保护下，将化合物4二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯(0.01mmol,)和透明质酸(0.15mmol)分别加入100ml单口瓶中，然后加入无水无氧四氢呋喃(30ml)，40℃下搅拌三天后结束反应。旋干反应所得混合相，加入超纯水超声、溶解后，用0.45微米水相滤膜抽滤得到滤液，分子量为3500KD的透析袋透析两天后冷冻干燥得到淡蓝色固体二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸，产率：71.9％。
(6)二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒的制备
20mg二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸溶于1ml超纯水中，随后在超声下逐滴加入100ml中，滴加结束后，冷冻干燥，得到二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸。
实施例11：
荷瘤鼠模型的建立与治疗
取对数生长期的人结肠癌细胞HCT-116，制成细胞悬液。每只裸鼠于背部皮下注射细胞悬液,接种后每2天观察动物1次,约7-10d天可见注射部位皮下有圆形或椭圆形结节样肿物出现。成瘤后，裸鼠被分为四组，即空白组、透明质酸加光照组、DBHA(实施例1方法制备得到的二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸)加光照组和DBHA无光照组。其中，空白组经尾静脉注射生理盐水；透明质酸加光照组经尾静脉注射透明质酸的生理盐水溶液40mg/kg；DBHA加光照组与DBHA无光照组经尾静脉注射DBHA的生理盐水溶液40mg/kg，除DBHA无光照组外，各组24小时后均给予光照治疗，每两天治疗一次(光照时间21min，强度为48J/cm2)。每天观察肿瘤瘤的大小，隔一天用游标卡尺测量两组肿瘤大小，并重复测量两次，计算肿瘤体积(肿瘤体积V＝(长×宽2)/2)。十五天后，空白组、透明质酸加光照组与DBHA无光照组荷瘤鼠出现消瘦情况，部分荷瘤鼠精神萎靡，活动明显减少，食欲下降，瘤体生长迅速；DBHA加光照组荷瘤鼠体重无明显变化，食欲活动均好，肿瘤体积与空白组相比显著缩小(P<0.05)。具体如表1所示：二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸(按照实施例1方法制备得到)通过尾静脉注射进入荷瘤鼠体内后经过光动力治疗后的肿瘤的体积变化数据。
表1裸鼠肿瘤体积(mm3)
注：A组,空白组；B组，透明质酸加光照组；C组：DBHA无光照组；D组：DBHA加光照组。
Claims (9)
1.一种二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸，其结构式如下：
2.一种二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸的制备方法，其特征在于二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯通过酯化反应接到透明质酸分子链上；具体步骤如下：
(ⅰ)3-溴-1-丙醇和对羟基苯甲醛反应得到4-(3-羟基-1-丙氧基)-1-苯甲醛；
(ⅱ)苯甲酰氯和2,4-二甲基吡咯反应得到氟化硼二吡咯；
(ⅲ)氟化硼二吡咯再与N-碘代丁二酰亚胺合成得到二碘代氟化硼二吡咯；
(ⅳ)二碘代氟化硼二吡咯和4-(3-羟基-1-丙氧基)-1-苯甲醛合成得到二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯；
(ⅴ)二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯通过酯化反应接到水溶性透明质酸分子链上。
3.如权利要求2所述的化合物二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸的制备方法，其特征在于步骤(ⅰ)中，3-溴-1-丙醇和对羟基苯甲醛的摩尔比为0.5-4，反应温度范围为40-80℃。
4.如权利要求2所述的化合物二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸的制备方法，其特征在于步骤(ⅱ)中，苯甲酰氯和2,4-二甲基吡咯在20℃-30℃下搅拌反应12-36小时，在冰浴下分别缓慢加入三乙胺和三氟化硼乙醚溶液，滴加结束后，恢复到30-50℃后继续搅拌6-24小时，用饱和食盐水洗涤；苯甲酰氯和2,4-二甲基吡咯的摩尔比为1：1.5-4。
5.如权利要求2所述的化合物二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸的制备方法，其特征在于步骤(ⅲ)中，氟化硼二吡咯与N-碘代丁二酰亚胺的摩尔比是1：5-10。
6.如权利要求2所述的化合物二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸的制备方法，其特征在于步骤(ⅳ)中：二碘代氟化硼二吡咯和4-(3-羟基-1-丙氧基)-1-苯甲醛分别溶于N,N-二甲基甲酰胺中，依次加入冰醋酸和哌啶，在微波条件下，100-180℃反应2-10分钟；二碘代氟化硼二吡咯和4-(3-羟基-1-丙氧基)-1-苯甲醛的摩尔比为1-4。
7.如权利要求2所述的化合物二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸的制备方法，其特征在于步骤(ⅴ)的合成包括以下步骤：
在惰性气体保护下，二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯和透明质酸进行酯化反应，反应溶剂为无水无氧四氢呋喃，反应时间为48-96小时。
8.一种如权利要求1所述的二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸自组装制备纳米颗粒的方法，其特征在于具体制备步骤如下：将二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸溶解于少量的超纯水中，在超声下逐滴加到大量的超纯水中，滴加结束后，冷冻干燥，得到自组装的二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸纳米颗粒。
9.权利要求1所述的化合物二碘代苯乙烯型氟化硼二吡咯-透明质酸在制备抗肿瘤的光敏剂中的应用。
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
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Granted publication date: 20170412 Termination date: 20180407 |