CN104374847A - 一种大黄药材的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于中药材质量检测领域，具体涉及一种大黄药材的检测方法，该检测方法包括土大黄苷的鉴别、没食子酸和儿茶素的含量测定和农药残留量检测。本发明不仅检测的准确度高，方法简单、快速，而且可一次性将大黄药材中常见的农药种类进行一次性的有效检测，可同时完成多个检测指标，更有利于对大黄药材质量的控制，有助于提高该药物使用的安全性和稳定性。

Description

一种大黄药材的检测方法

技术领域

本发明属于中药材质量检测领域，具体涉及一种大黄药材的质量检测方法。

背景技术

大黄为蓼科植物药用大黄Rheum officinale Baill.、掌叶大黄RheumpalmatumL.或唐古特大黄Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.的干燥根及根茎。味苦性寒，归脾、胃、大肠、肝、心包经；《千金方》记载为锦纹大黄；《吴普本草》记载为黄良、火参、肤如；李当之《药录》记载为“将军”；而《中药材手册》则记载为川军；主要功效：泻下积滞、清热泻火、凉血解毒、逐癖通经。主要产于青海、甘肃、四川等地区,有野生也有栽培，药材以质地坚实、断面“锦纹”(异形维管束)明显、红综色、稍有油性、气清香、味苦而微涩、嚼之粘牙者为佳。有关大黄的药效和临床使用，历代本草、医籍很多都有记载。《神农本草经》载：“味苦寒，归胃、肝大肠经。主下癖血，血闭寒热，留饮宿食，荡涤肠胃，推陈致新，通利水谷，调中化食，安和五脏”；《名医别录》载：“大寒，无毒。平胃下气，除痰实，肠间结热，心腹胀满，女子寒血闭胀，小腹痛，诸老血留结”；《药性论》载：“使，去寒热，忌冷水，味苦，甘。消食，涤五藏，通女子经候，利水肿，能破痰实，冷热结聚宿食，利大小肠贴热毒肿。主小儿寒热，时疾烦热，饮脓，破留血”；《药性赋》载：“味苦，气寒，无毒。其性沉而不浮，其用走而不守。夺土郁而无拥滞，定祸乱而致太平，名之日将军”；《本草纲目》载：“通宣一切气，调血脉，利关节”；《本草备要》载：“大泻血分湿热，下有形积滞”。

中药材的质量直接影响中药产品的品质及药效，衡量中药材质量标准除中药自身的有效成分外，还包括化学农药及重金属的污染情况。近年来，中药领域的大力发展以及中药材需求量的加大，导致大量伪劣药材的上市，其中不少伪品的农药残留量严重超标，给大黄药材的质量、用药的安全性及有效性造成了很大的冲击。药材农药残留问题日益引起世界各国的重视，国际上从1970年起开始研究药材农药残留量问题，1980年世界卫生组织将农药残留测定单独列为检测项目，近年来成为世界性的研究热点。

但是，现存的大黄药材的检测方法或者只进行有效成分的含量测定，或者只测定其农药残留量，检测指标比较单一，而且对农药的检测也大多借鉴于其他产品的检测方法，并没有针对大黄药材常见农药的一次性检出方法，导致对于大黄药材常见农药的检测需要多次检测才能完全，不利于大黄药材的质量控制以及大黄使用的安全性和稳定性。因此，建立一种快速、全面、针对性强的大黄药材的质量检测方法具有重要的意义。

发明内容

为此，本发明所要解决的技术问题在于现有技术中大黄药材检测指标单一，不利于大黄药材的质量控制，进而提供一种快速、全面、针对性强的大黄药材的检测方法。

为解决上述技术问题，本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明的大黄药材的检测方法，该检测方法包括如下有效成分的鉴别及含量测定步骤以及农药残留量检测的步骤，其中，

A、土大黄苷的鉴别包括以下步骤：

(1)取土大黄苷对照品，加甲醇制成每1mL含0.3mg土大黄苷的溶液，作为对照品溶液；

(2)另取待测药材粉末0.5g，加甲醇15mL，加热回流、放冷并滤过，滤液作为供试品溶液；

(3)照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液和对照品溶液各2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比100：30：2：3的三氯甲烷-甲醇-甲酸-水为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；

B、没食子酸和儿茶素的含量测定包括以下步骤：

(1)精密称取没食子酸与儿茶素对照品适量，用50％甲醇溶解，制成含没食子酸0.106mg/mL与儿茶素0.115mg/mL的混合对照；

(2)精密称取待测药材细粉0.5g，置锥形瓶中，精密加入25mL20％甲醇溶液，超声40分钟，滤过，取续滤液，用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液作为供试溶液；

(3)照高效液相色谱法试验，以waters C18柱为色谱柱，以甲醇为流动相A，以体积浓度0.1％的磷酸为流动相B，控制流速1mL/分钟进行梯度洗脱，具体梯度洗脱程序如下：从0-10分钟，流动相A：流动相B的体积比为8％：92％；从10-30分钟，流动相A：流动相B的体积比由8％：92％→30％：70％；从30-35分钟，流动相A：流动相B的体积比由30％：70％→40％：60％；从35-40分钟，流动相A：流动相B的体积比由40％：60％→8％：92％；从40-50分钟，流动相A：流动相B的体积比为8％：92％；

精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μL，注入高效液相色谱仪，于280nm波长下测定；

C、农药残留量检测包括以下步骤：

(1)精密称取三苯基磷酸酯适量，加丙酮制成每1mL含100μg三苯基磷酸酯的溶液，作为内标贮备液；

分别精密量取各农药对照品贮备溶液1mL及上述内标贮备液1mL，加丙酮定容至100mL，作为混合对照品贮备溶液；分别精密量取适量，加乙腈定容制成20-1000ng/mL的不同浓度的溶液，作为混合对照品溶液；

另取核糖酸内酯适量，加乙腈溶解制成每1mL含20mg核糖酸内酯的溶液，另取山梨醇适量，加水溶解制成每1mL含山梨醇10mg的溶液；分别精密量取上述核糖酸内酯、山梨醇溶液各1mL混匀，加乙腈定容至10mL，作为分析保护剂；

(2)精密称取待测药材细粉10g，并加入氯化钠1g混匀，精密加入丙酮100mL，冰浴超声处理30分钟，离心，将上清液迅速移入装有1g无水硫酸钠的具塞锥形瓶中，放置30分钟；随后精密量取上述溶液60mL减压浓缩至近干，并加入体积比为1：1的环已烷-乙酸乙酯溶液溶解样品并定容至10mL，过滤后取滤液经GPC凝胶渗透色谱净化，以体积比为1：1的环已烷-乙酸乙酯溶液为流动相洗脱，收集洗脱液，移入KD瓶中，减压浓缩至近干；

向上述样品中加入体积比为1：1的乙酸乙酯-丙酮混合溶液5mL溶解，并转移至石墨碳-氨基混合固相萃取小柱上，以体积比为1：1的乙酸乙酯-丙酮混合溶液15mL洗脱，收集洗脱液，氮吹至近干，随后加入上述内标贮备液5μL，加乙腈定容至1mL，作为供试品溶液；

(3)精密量取上述各浓度混合对照品溶液及供试品溶液各400μL，并分别加入上述分析保护剂100μL混匀，随后分别精密吸取1μL，进行气相色谱-质谱联用仪测定；其中，

气相色谱分析条件为：取规格为30m×0.25mm×0.25um的弹性石英毛细管柱DB17ms，以高纯氦气为载气，柱流速1.3mL/分钟，进样量1μL，采用高压不分流进样，设置进样口温度为230℃，升温程序具体为：初始温度60℃，以30℃/分钟升至120℃、以10℃/分钟升至200℃、以2℃/分钟升至230℃、以30℃/分钟升至300℃，并保持7分钟；

EI源质谱测定的条件为：设置电子能量70eV，离子源温度230℃，接口温度250℃。

本发明的大黄药材的检测方法，农药残留量检测中，上述GPC凝胶渗透色谱净化步骤的条件具体为：填料为Bio-Beads S-X3200-400目，净化柱为2.5mm×40cm，具体洗脱参数为净化去杂900s，目标物收集1200s，柱子清洗300s。

本发明的大黄药材的检测方法，农药残留量检测中，上述农药对照品包括敌敌畏、甲胺磷、乙酰甲胺磷、四氯硝基苯、六氯苯、α-六六六、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六、氧化乐果、二嗪磷、五氯硝基苯、久效磷、地虫硫磷、磷胺I、乐果、七氯、五氯苯胺、百菌清、甲基毒死蜱、艾氏剂、克菌丹、磷胺II、甲基对硫磷、甲基嘧啶磷、甲基五氯苯基硫醚、甲霜灵、三唑酮、毒死蜱、马拉硫磷、杀螟硫磷、对硫磷、二甲戊灵、顺式环氧七氯、反式环氧七氯、三唑醇A、三唑醇B、反式氯丹、顺式硫丹、顺式氯丹、反式硫丹、pp'-DDE、PP'-DDD、OP'-DDT、PP'-DDT、狄氏剂、杀扑磷、异狄氏剂、乙硫磷、三苯基磷酸酯、联苯菊酯、硫丹硫酸酯、异菌脲、甲氰菊酯、三氯杀螨醇、氯氟氰菊酯、甲氧DDT、三氯杀螨砜、伏杀硫磷、氯菊酯1、氯菊酯2、氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯。

本发明的大黄药材的检测方法，没食子酸和儿茶素的含量测定中，上述供试品制备的超声条件为功率200W，频率40kHz。

本发明的大黄药材的检测方法，农药残留量检测中，上述待测药材的粒径为180-2000μm。

本发明通过对大黄药材所含的有效成分的鉴别、有效成分含量的测定以及对大黄药材农药残留量的检测，进行大黄药材真伪优劣的判定标准。本发明上述方法通过薄层色谱法鉴别土大黄苷、高效液相色谱法检测没食子酸和儿茶素的含量，不仅准确且简单易行。本发明通过气相色谱-质谱联用的方式检测药材的残留农药量，不仅检测的准确度高，方法简单、快速，而且通过对检测条件的特定筛选，可一次性将大黄药材中常见的农药种类进行一次性的有效检测，可同时完成多个检测指标，上述方法准确率及实用效果均较好，更有利于对大黄药材质量的控制，有助于提高该药物使用的安全性和稳定性。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中：

图1为实施例1中各样品薄层色谱图，其中化合物1-3为正品大黄，化合物S为土大黄苷对照品，化合物4-7为河套大黄；

图2(a)为实施例2中大黄对照品的HPLC图，图2(b)为实施例2中大黄供试品的HPLC图，其中A为混合对照品，B为供试品，1为没食子酸，2为儿茶素；

图3为实施例3中农药标准品的全扫描气相色谱图；

图4为实施例3中农药标准品的0-10分钟扫描气相色谱图；

图5为实施例3中农药标准品的10-20分钟全扫描气相色谱图；

图6为实施例3中农药标准品的20-40分钟全扫描气相色谱图。

具体实施方式

下述实施例用于进一步说明本发明但不限于本发明。

实施例1大黄药材中土大黄苷的鉴别

本实施例按照如下方法对正品大黄、伪品大黄(河套大黄)进行比较鉴别：

1、供试品溶液的制备

取土大黄苷对照品，加甲醇制成每1mL含0.3mg的溶液，作为对照品溶液。

2、对照品溶液的制备

另取各待测药材粉末0.5g，加甲醇15mL，加热回流30分钟，放冷，滤过，滤液作为供试品溶液。

3、测定法

照薄层色谱法(中国药典附录ⅥB)试验，吸取上述对照品溶液和供试品溶液各2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比100：30：2：3的三氯甲烷-甲醇-甲酸-水为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视。

鉴别检测的结果见图1所示。正品大黄供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，不得显相同的颜色荧光斑点。土大黄苷为土大黄(大黄伪品)的特征斑点。在s(土大黄苷)相对应的位置，1-3号大黄样品未出现斑点。可知该鉴别方法科学、准确、简便。

实施例2没食子酸和儿茶素的含量测定

1仪器与试药

1.1仪器

高效液相色谱仪(717plus Autosampler，515HPLC Pump，2487紫外检测器；waters公司)，超声波清洗器(HS10260D型，昆山市超声仪器有限公司)

1.2试药

没食子酸对照品(0831-9501)和儿茶素对照品(877-200001)均由中国食品药品检定研究院提供；甲醇为色谱纯，水为纯净水。

供试品为选自不同产地的大黄药材，共计21批次。

2方法与结果

2.1对照品溶液制备

精密称取没食子酸与儿茶素对照品适量，用50％甲醇溶解，定容，制成含没食子酸0.106mg/mL与儿茶素0.115mg/mL的混合对照溶液。

2.2供试品溶液制备

精密称取各批次待测大黄药材细粉0.5g，置锥形瓶中，精密加入25mL20％甲醇溶液，超声40分钟，滤过，取续滤液，用0.45μm微孔滤膜过滤，即得。

2.3色谱条件

照高效液相色谱法试验，以waters C18柱为色谱柱，以甲醇为流动相A，以体积浓度0.1％的磷酸为流动相B，控制流速1mL/分钟进行梯度洗脱，具体梯度洗脱程序如下：从0-10分钟，流动相A：流动相B的体积比为8％：92％；从10-30分钟，流动相A：流动相B的体积比由8％：92％→30％：70％；从30-35分钟，流动相A：流动相B的体积比由30％：70％→40％：60％；从35-40分钟，流动相A：流动相B的体积比由40％：60％→8％：92％；从40-50分钟，流动相A：流动相B的体积比为8％：92％；

精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μL，注入高效液相色谱仪，于280nm波长下测定。

2.4标准曲线绘制

取2.1中制备的混合对照溶液，依次进样2、5、10、15、20、30μL，注入高效液相色谱仪，按2.3项下色谱条件测定峰面积；用峰面积Y对进样体积X进行线性回归，得没食子酸与儿茶素的回归方程分别为Y＝1.0748X+4.6544(r＝0.9999)；Y＝1.0698X+4.0741(r＝0.9999)。没食子酸在0.212-3.183μg、儿茶素在0.230-3.451μg范围内线性关系良好。

2.5方法学验证

2.5.1精密度实验

精密吸取质量浓度为0.106mg·mL^-1和0.115mg·mL^-1的没食子酸与儿茶素的混合对照品溶液5μL，按上述色谱条件重复进样6次，没食子酸的RSD为1.22％，儿茶素的RSD为0.74％。

2.5.2稳定性实验

取同一份供试品溶液，在0、4、8、12、16、20、24h按2.1项下色谱条件进样，按峰面积计算，没食子酸的RSD为4.01％，儿茶素为4.52％，表明供试品溶液在24h内稳定。

2.5.3重复性实验

取同一批要样品按2.3供试品溶液制备方法平行制备5份，按上述色谱条件测定，得没食子酸RSD＝3.63％，儿茶素RSD＝2.21％。

2.5.4加样回收率实验

精密称取同一批样品称取5份，每份约0.25g，精密加入没食子酸对照品1.958g，儿茶素对照品5.810g，按上述方法制备供试品溶液，再按上述条件测定，结果见表1。

表1  加样回收率(n＝5)

2.6测定法

取上述对照品溶液与各待测药材的供试品溶液各5μL，注入高效液相色谱仪，依法测定，结果见图2(a)、图2(b)和表2。

表2  大黄中没食子酸和儿茶素的含量测定结果(％)

3测定结果与分析

对超声和加热回流的提取方法进行比较试验，结果两种方法提取率相差不多，又因为超声方法简单快速，所以选用超声提取方法。根据文献报道和和没食子酸与儿茶素的溶解性选用纯水、20％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、甲醇进行了比较试验，结果表明提取溶媒为20％甲醇时没食子酸与儿茶素的含量都很高。并对超声提取30min、40min、50min进行了比较试验，结果表明以40min超声提取率最高。确定选用20％甲醇超声提取40min为最佳。

采用DAD检测器考察了不同波长下没食子酸与儿茶素的峰形及峰面积，发现检测波长为280nm时，没食子酸与儿茶素的紫外吸收较强，因此，选择280nm作为含量测定波长。

本发明建立的大黄药材中没食子酸和儿茶素含量测定方法简便、快速、实用，为大黄质量控制提供了新的选择方法。

实施例3大黄药材中农药残留量检测

1仪器与试药

1.1仪器

Clarus600气相色谱-质谱联用仪(美国PE公司)，HS10260D超声提取器(昆山市超声仪器有限公司)，RE-52A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。

1.2试药

敌敌畏、甲胺磷、乙酰甲胺磷、四氯硝基苯、六氯苯、α-六六六、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六、氧化乐果、二嗪磷、五氯硝基苯、久效磷、地虫硫磷、磷胺I、乐果、七氯、五氯苯胺、百菌清、甲基毒死蜱、艾氏剂、克菌丹、磷胺II、甲基对硫磷、甲基嘧啶磷、甲基五氯苯基硫醚、甲霜灵、三唑酮、毒死蜱、马拉硫磷、杀螟硫磷、对硫磷、二甲戊灵、顺式环氧七氯、反式环氧七氯、三唑醇A、三唑醇B、反式氯丹、顺式硫丹、顺式氯丹、反式硫丹、pp'-DDE、PP'-DDD、OP'-DDT、PP'-DDT、狄氏剂、杀扑磷、异狄氏剂、乙硫磷、三苯基磷酸酯、联苯菊酯、硫丹硫酸酯、异菌脲、甲氰菊酯、三氯杀螨醇、氯氟氰菊酯、甲氧DDT、三氯杀螨砜、伏杀硫磷、氯菊酯1、氯菊酯2、氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯等64种农药对照品对照品纯品贮备溶液，购自中国食品药品检定研究院提供。

三苯基磷酸酯、丙酮、乙腈、环已烷、乙酸乙酯为进口农残级；核糖酸内酯、山梨醇、氯化钠、无水硫酸钠为优级纯。

1.3样品

大黄等道地批样品购买于不同产地，均为原药材，以下按不同批次予以编号检测。

2方法与结果

2.1内标贮备液及分析保护剂的配制

精密称取三苯基磷酸酯适量，加丙酮制成每1mL含100μg的溶液，即得内标贮备液。

分析保护剂的配制：取核糖酸内酯适量，加乙腈溶解并制成每1mL含20mg的溶液；另取山梨醇适量，加水溶解并制成每1mL含10mg的溶液。分别精密量取上述核糖酸内酯、山梨醇溶液各1mL，至同一10mL量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2混合对照品溶液的制备

分别精密量取各农药对照品贮备溶液1mL及内标贮备液1mL，置100mL量瓶中，用丙酮稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品贮备溶液(1μg/mL)。分别精密量取适量，加乙腈制成20-1000ng/mL不同浓度系列的混合对照品溶液，即得。

2.3供试品溶液的制备

精密称取各批次供试品细粉10g，置100mL锥形瓶中，加入1g氯化钠，精密加入丙酮100mL，冰浴超声处理30分钟，离心，将上清液迅速移入装有1g无水硫酸钠的具塞锥形瓶中，放置30分钟。精密量取60mL减压浓缩至近干，加入少量的环已烷：乙酸乙酯(1：1)溶液溶解样品并定量稀释至10mL，混匀，滤过，滤液经凝胶渗透色谱(GPC)净化，进样5mL，(GPC主要参数：填料Bio-Beads S-X3200--400目，净化柱2.5mm×40cm，洗脱参数：pre run900s,main run1200s,tail run300s)，以环已烷：乙酸乙酯(1：1)为流动相洗脱，收集洗脱液，移入KD瓶中，减压浓缩至近干。

2.4供试品溶液的净化

加乙酸乙酯-丙酮(1：1)混合溶液5mL溶解并定量转移至石墨碳(500mg)-氨基(500mg)混合固相萃取小柱上,以乙酸乙酯-丙酮(1：1)混合溶液15mL洗脱，收集洗脱液，氮吹至近干，残渣加乙腈溶解，并加内标贮备液5μL，乙腈定容至1mL，即得。

2.5气-质联用分析

气相色谱分析条件：弹性石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25um)DB17ms，载气为高纯氦气，柱流速1.3mL/min；进样口温度为230℃，进样量1μL，高压不分流进样。

具体升温程序：初始温度60℃，以30℃/min升至120℃，以10℃/min升至200℃，以2℃/min升至230℃，以30℃/min升至300℃，保持7min。

质谱(EI源)测定条件：70eV，离子源温度230℃，接口温度250℃。

各待测品SIM条件见表3，各个农药标准品的全扫描气相色谱图及0-10分钟、10-20分钟、20-40分钟扫描气相色谱图分别见图3、4、5和6所示。

表3  GC-MS检测指标及SIM测定条件

2.6方法学验证

2.6.1精密度试验

精密吸取稀释后混合标准溶液1μL，重复进样5次，计算RSD值，见表4。

表4  64种农药的精密度试验

2.6.2加样回收率试验

在样品中分别加入一定的混合标准溶液，形成3种添加水平3份样品，按选定方法提取挣化和检测，扣除本底计算各种农药在样品中的回收率，结果见表5。

表5  64种农药的加样回收率试验

2.6.3检出限测定

将农药标准品溶液稀释成不同浓度，进行测定组分的最低检出量，结果见表6。

表6  64种农药的检出限

2.6.4线性关系

将农药标准品溶液稀释成不同浓度，进行测定组分的线性范围，结果见表7。

表7  64种农药的线性方程

2.7测定法

分别精密量取混合对照品溶液、供试品溶液各400μL，加分析保护剂100μL，混匀，分别精密吸取1μL，注入气相色谱质谱联用仪，测定，计算，即得，结果见表8。

表8  大黄样品中农药残留检测结果(mg/kg)

表8  大黄样品中农药残留检测结果(mg/kg)(续表)

表8  大黄样品中农药残留检测结果(mg/kg)(续表)

表8  大黄样品中农药残留检测结果(mg/kg)(续表)

在16批样品全部检出农药残留，检出率为100％，大黄中农药残留现状比较普遍。涉及有机氯类、有机磷类和拟虫菊酯类共20种不同的农药。具体农药残留批次有:磷胺3批、狄氏剂1批、甲氰菊酯1批、三唑醇A2批、三唑醇B1批，乙酰甲胺磷1批、五氯硝基苯2批、甲基毒死蜱1批、甲霜灵5批、氯氟氰菊酯3批、溴氰菊酯1批、PP'-DDT4批、六氯苯1批、五氯苯胺1批、甲基毒死蜱1批、甲基对硫磷1批、甲基嘧啶磷1批、甲基五氯苯基硫醚1批、对硫磷1批、顺式氯丹2批。

大黄药材中农药残留数有差别，少数品种为1种农药残留，多数为2～3种农药残留，个别品种达到4种农药残留。受到环境、种植技术、加工和储藏等因素影响，造成中药材农药残留的原因比较复杂。

我国中药材GAP生产中，禁止使用的农药有13类54种。大黄中检出了磷胺、对硫磷、甲基对硫磷、五氯硝基苯、狄氏剂和滴滴涕共6种禁用农药。其他检出农药中属于生产中可以使用的农药。

采用国家标准GB2763-2005食品中农药最大残留限量规定进行分析，检出但没有超过食品最高残留标准：狄氏剂、甲氰菊酯、三唑醇A、三唑醇B、甲基毒死蜱、甲霜灵、溴氰菊酯、甲基对硫磷、甲基嘧啶磷和对硫磷。其中六氯苯、五氯苯胺、甲基五氯苯基硫醚未找到限量标准。超过食品残留标准:磷胺(谷物：0.02mg/kg蔬菜0.05mg/kg水果0.05mg/kg)超标10～21倍；五氯硝基苯(小麦0.01mg/kg、油料及制品0.01mg/kg、蔬菜0.1mg/kg)超标0.4～0.8倍；氯氟氰菊酯(小麦0.05mg/kg、蔬菜0.2～2mg/kg)超标2～8倍；滴滴涕超标0.4倍；顺式氯丹(食品标准规定氯丹，在，谷物、蔬菜0.02mg/kg)超标40～75倍。

综上分析，大黄样品农药的检出率100％，样品中检出禁用农药6种，超标8个样品，属于5种农药超标，样品超标率为50％。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (5)

1.一种大黄药材的检测方法，其特征在于，该检测方法包括如下有效成分的鉴别及含量测定步骤以及农药残留量检测的步骤，其中，

A、土大黄苷的鉴别包括以下步骤：

(1)取土大黄苷对照品，加甲醇制成每1mL含0.3mg土大黄苷的溶液，作为对照品溶液；

(2)另取待测药材粉末0.5g，加甲醇15mL，加热回流、放冷并滤过，滤液作为供试品溶液；

(3)照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液和对照品溶液各2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比100：30：2：3的三氯甲烷-甲醇-甲酸-水为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；

B、没食子酸和儿茶素的含量测定包括以下步骤：

(1)精密称取没食子酸与儿茶素对照品适量，用50％甲醇溶解，制成含没食子酸0.106mg/mL与儿茶素0.115mg/mL的混合对照；

(2)精密称取待测药材细粉0.5g，置锥形瓶中，精密加入25mL20％甲醇溶液，超声40分钟，滤过，取续滤液，用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液作为供试溶液；

(3)照高效液相色谱法试验，以waters C18柱为色谱柱，以甲醇为流动相A，以体积浓度0.1％的磷酸为流动相B，控制流速1mL/分钟进行梯度洗脱，具体梯度洗脱程序如下：从0-10分钟，流动相A：流动相B的体积比为8％：92％；从10-30分钟，流动相A：流动相B的体积比由8％：92％→30％：70％；从30-35分钟，流动相A：流动相B的体积比由30％：70％→40％：60％；从35-40分钟，流动相A：流动相B的体积比由40％：60％→8％：92％；从40-50分钟，流动相A：流动相B的体积比为8％：92％；

精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μL，注入高效液相色谱仪，于280nm波长下测定；

C、农药残留量检测包括以下步骤：

(1)精密称取三苯基磷酸酯适量，加丙酮制成每1mL含100μg三苯基磷酸酯的溶液，作为内标贮备液；

分别精密量取各农药对照品贮备溶液1mL及所述内标贮备液1mL，加丙酮定容至100mL，作为混合对照品贮备溶液；分别精密量取适量，加乙腈定容制成20-1000ng/mL的不同浓度的溶液，作为混合对照品溶液；

另取核糖酸内酯适量，加乙腈溶解制成每1mL含20mg核糖酸内酯的溶液，另取山梨醇适量，加水溶解制成每1mL含山梨醇10mg的溶液；分别精密量取上述核糖酸内酯、山梨醇溶液各1mL混匀，加乙腈定容至10mL，作为分析保护剂；

(2)精密称取待测药材细粉10g，并加入氯化钠1g混匀，精密加入丙酮100mL，冰浴超声处理30分钟，离心，将上清液迅速移入装有1g无水硫酸钠的具塞锥形瓶中，放置30分钟；随后精密量取上述溶液60mL减压浓缩至近干，并加入体积比为1：1的环已烷-乙酸乙酯溶液溶解样品并定容至10mL，过滤后取滤液经GPC凝胶渗透色谱净化，以体积比为1：1的环已烷-乙酸乙酯溶液为流动相洗脱，收集洗脱液，移入KD瓶中，减压浓缩至近干；

向上述样品中加入体积比为1：1的乙酸乙酯-丙酮混合溶液5mL溶解，并转移至石墨碳-氨基混合固相萃取小柱上，以体积比为1：1的乙酸乙酯-丙酮混合溶液15mL洗脱，收集洗脱液，氮吹至近干，随后加入所述内标贮备液5μL，加乙腈定容至1mL，作为供试品溶液；

(3)精密量取上述各浓度混合对照品溶液及供试品溶液各400μL，并分别加入所述分析保护剂100μL混匀，随后分别精密吸取1μL，进行气相色谱-质谱联用仪测定；其中，

所述气相色谱分析条件为：取规格为30m×0.25mm×0.25um的弹性石英毛细管柱DB17ms，以高纯氦气为载气，柱流速1.3mL/分钟，进样量1μL，采用高压不分流进样，设置进样口温度为230℃，升温程序具体为：初始温度60℃，以30℃/分钟升至120℃、以10℃/分钟升至200℃、以2℃/分钟升至230℃、以30℃/分钟升至300℃，并保持7分钟；

所述EI源质谱测定的条件为：设置电子能量70eV，离子源温度230℃，接口温度250℃。

2.根据权利要求1所述的大黄药材的检测方法，其特征在于，所述农药残留量检测中，所述GPC凝胶渗透色谱净化步骤的条件具体为：填料为Bio-Beads S-X3200-400目，净化柱为2.5mm×40cm，具体洗脱参数为净化去杂900s，目标物收集1200s，柱子清洗300s。

3.根据权利要求1或2所述的大黄药材的检测方法，其特征在于，所述农药残留量检测中，所述农药对照品包括敌敌畏、甲胺磷、乙酰甲胺磷、四氯硝基苯、六氯苯、α-六六六、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六、氧化乐果、二嗪磷、五氯硝基苯、久效磷、地虫硫磷、磷胺I、乐果、七氯、五氯苯胺、百菌清、甲基毒死蜱、艾氏剂、克菌丹、磷胺II、甲基对硫磷、甲基嘧啶磷、甲基五氯苯基硫醚、甲霜灵、三唑酮、毒死蜱、马拉硫磷、杀螟硫磷、对硫磷、二甲戊灵、顺式环氧七氯、反式环氧七氯、三唑醇A、三唑醇B、反式氯丹、顺式硫丹、顺式氯丹、反式硫丹、pp'-DDE、PP'-DDD、OP'-DDT、PP'-DDT、狄氏剂、杀扑磷、异狄氏剂、乙硫磷、三苯基磷酸酯、联苯菊酯、硫丹硫酸酯、异菌脲、甲氰菊酯、三氯杀螨醇、氯氟氰菊酯、甲氧DDT、三氯杀螨砜、伏杀硫磷、氯菊酯1、氯菊酯2、氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯。

4.根据权利要求1-3任一所述的大黄药材的检测方法，其特征在于，所述没食子酸和儿茶素的含量测定中，所述供试品制备的超声条件为功率200W，频率40kHz。

5.根据权利要求1-4任一所述的大黄药材的检测方法，其特征在于，所述农药残留量检测中，所述待测药材的粒径为180-2000μm。