CN104334732B - 表达人λ免疫球蛋白轻链可变结构域的动物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了产生嵌合人‑非人抗体和嵌合抗体链的方法，如此产生的抗体和抗体链及其衍生物，包括完全人源化抗体；包含所述抗体、抗体链和衍生物的组合物，以及适用于所述方法的细胞、非人哺乳动物和载体。
Description
背景
本发明特别涉及被工程化而含有外源DNA如人免疫球蛋白基因DNA的非人动物及细胞，它们在医学及疾病研究中的应用，产生非人动物及细胞的方法，以及由这种动物产生的抗体和抗体链及其衍生物。
为了解决人源化抗体的问题，一些公司开始产生具有人类免疫系统的小鼠。所用策略是敲除ES细胞中的重链和轻链基因座，并用设计用于表达人重链和轻链基因的转基因补偿这些遗传损害。尽管完全人抗体可以被产生，但是这些模型具有一些主要限制：
(i)重链和轻链基因座的大小(各几Mb)使得不能将完整基因座导入这些模型。结果是恢复的转基因品系具有非常有限的V区库集(repertoire)，大部分恒定区缺失并且重要的远端增强子区未包括在转基因中。
(ii)产生大插入转基因品系的非常低的效率以及将这些转基因杂交到重链和轻链敲除品系并使它们再次纯和的复杂性和所需时间，限制了可以分析用于优化表达的转基因品系的数量。
(iii)个体抗体亲和性极少达到可得自完整(非转基因)动物的抗体的亲和性。
WO2007117410揭示了用于表达嵌合抗体的嵌合构建体。
WO2010039900揭示了具有编码嵌合抗体的基因组的敲入(knock in)细胞和哺乳动物。
本发明特别提供了在非人哺乳动物中产生包含人Ig可变区的抗体的方法，进一步提供了用于产生这种抗体的非人动物模型。
发明概述
除非另有说明，所有小鼠的核苷酸坐标均相应于NCBI m37针对小鼠C57BL/6J品系，例如April 2007ENSEMBL Release 55.37h,例如NCBI37July 2007(NCBI build 37)(例如UCSC版本mm9，参见World Wide Web(www)genome.ucsc.edu和World Wide Web(www)genome.ucsc.edu/FAQ/FAQreleases.html)。除非另有说明，人类核苷酸坐标相应于GRCh37(例如UCSC版本hg 19,World Wide Web(www)genome.ucsc.edu/FAQ/FAQreleases.html),Feb 2009ENSEMBL Release55.37，或者相应于NCBI36,Ensemble release 54。除非另有说明，大鼠核苷酸相应于RGSC 3.4Dec 2004ENSEMBL release 55.34w，或者Baylor Collegeof Medicine HGSC v3.4Nov 2004(例如UCSC rn4,参见World Wide Web(www)genome.ucsc.edu和World Wide Web(www)genome.ucsc.edu/FAQ/FAQreleases.html)。
在本发明中，揭示了在非人哺乳动物例如小鼠中构建嵌合人重链和轻链基因座的方法。本文参照小鼠的工作仅为举例，参照小鼠包括参照所有非人哺乳动物，除非从揭示中看出明显不是，小鼠是优选的非人哺乳动物。
在一个方面中，本发明涉及非人哺乳动物，其基因组包含：
(a)位于宿主非人哺乳动物恒定区上游的多个人IgH V区、一或多个人D区及一或多个人J区；及
(b)任选地，位于宿主非人哺乳动物κ恒定区上游的一或多个人Ig轻链κV区及一或多个人Ig轻链κJ区和/或位于宿主非人哺乳动物λ恒定区上游的一或多个人Ig轻链λV区及一或多个人Ig轻链λJ区；
其中所述非人哺乳动物能够产生具有非人哺乳动物恒定区和人可变区的嵌合抗体、或嵌合轻链或重链的库集。
在一个方面，本发明涉及非人哺乳动物，其基因组包含：
(a)位于宿主非人哺乳动物κ恒定区上游的多个人Ig轻链κV区及一或多个人Ig轻链κJ区和/或位于宿主非人哺乳动物λ恒定区上游的多个人Ig轻链λV区及一或多个人Ig轻链λJ区；及
(b)任选地，位于宿主非人哺乳动物恒定区上游的一或多个人IgH V区、一或多个人D区及一或多个人J区；
其中所述非人哺乳动物能够产生具有非人哺乳动物恒定区和人可变区的嵌合抗体、或者嵌合轻链或重链的库集。
在一个方面，本发明涉及非人哺乳动物细胞，其基因组包含：
(a)位于宿主非人哺乳动物恒定区上游的多个人IgH V区、一或多个人D区及一或多个人J区；及
(b)任选地，位于宿主非人哺乳动物κ恒定区上游的一或多个人Ig轻链κV区及一或多个人Ig轻链κJ区和/或位于宿主非人哺乳动物λ恒定区上游的一或多个人Ig轻链λV区及一或多个人Ig轻链λJ区。
在一个方面，本发明涉及非人哺乳动物细胞，其基因组包含：
(a)位于宿主非人哺乳动物κ恒定区上游的多个人Ig轻链κV区及一或多个人Ig轻链κJ区和/或位于宿主非人哺乳动物λ恒定区上游的多个人Ig轻链λV区及一或多个人Ig轻链λJ区；及
(b)任选地，位于宿主非人哺乳动物恒定区上游的一或多个人IgH V区、一或多个人D区及一或多个人J区。
在进一步方面，本发明涉及产生非人细胞或哺乳动物的方法，包括在非人哺乳动物细胞基因组如ES细胞基因组中分别插入：
(a)位于宿主非人哺乳动物恒定区上游的多个人IgH V区、一或多个人D区及一或多个人J区；及
(b)任选地，位于宿主非人哺乳动物κ恒定区上游的一或多个人Ig轻链κV区及一或多个人Ig轻链κJ区和/或位于宿主非人哺乳动物λ恒定区上游的一或多个人Ig轻链λV区及一或多个人Ig轻链λJ区；所述插入使得非人细胞或哺乳动物能够产生具有非人哺乳动物恒定区和人可变区的嵌合抗体的库集，其中步骤(a)和(b)可以以任何顺序进行并且步骤(a)和(b)的每一个可以以逐步方式进行或者单步进行。插入可以通过同源重组进行。
在进一步方面中，本发明涉及产生特异于希望抗原的抗体或抗体链的方法，所述方法包括用希望抗原免疫本文揭示的转基因非人哺乳动物，及回收抗体或抗体链。
在进一步方面中，本发明涉及产生完全人源化抗体的方法，包括用希望抗原免疫本文揭示的转基因非人哺乳动物，回收抗体或者产生抗体的细胞，然后用人恒定区置换非人哺乳动物恒定区，例如通过蛋白质或DNA工程进行。
在进一步方面中，本发明涉及根据本发明产生的人源化抗体和抗体链，其为嵌合(例如小鼠-人)及完全人源化形式，以及所述抗体和抗体链的片段和衍生物，所述抗体、抗体链和片段在医学包括诊断中的应用。
在进一步方面中，本发明涉及本文描述的非人哺乳动物作为模型测试药物和疫苗的应用。
在一个方面中，本发明涉及非人哺乳动物，其基因组包含：
(a)位于宿主非人哺乳动物恒定区上游的多个人IgH V区、一或多个人D区及一或多个人J区；及
(b)任选地，位于宿主非人哺乳动物κ恒定区上游的一或多个人Ig轻链κV区及一或多个人Ig轻链κJ区和/或位于宿主非人哺乳动物λ恒定区上游的一或多个人Ig轻链λV区及一或多个人Ig轻链λJ区；
其中非人哺乳动物能够产生具有非人哺乳动物恒定区和人可变区的嵌合抗体和抗体链的库集。
在进一步方面中，本发明涉及非人哺乳动物，其基因组包含：
(a)位于宿主非人哺乳动物κ恒定区上游的多个人Ig轻链κV区及一或多个人Ig轻链κJ区和/或位于宿主非人哺乳动物λ恒定区上游的多个人Ig轻链λV区及一或多个人Ig轻链λJ区；及
(b)任选地，位于宿主非人哺乳动物恒定区上游的一或多个人IgH V区、一或多个人D区及一或多个人J区；
其中非人哺乳动物能够产生具有非人哺乳动物恒定区和人可变区的嵌合抗体的库集。
任选地，非人哺乳动物基因组被修饰以防止完全宿主物种特异性抗体的表达。
在一个方面中，插入的人DNA包含至少50％的人重链可变(V)基因，如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％及在一个方面全部人V基因。
在一个方面中，插入的人DNA包含至少50％的人重链多样性(D)基因，如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％及在一个方面全部人D基因。
在一个方面中，插入的人DNA包含至少50％的人重链连接(J)基因，如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％及在一个方面全部人J基因。
在一个方面中，插入的人DNA包含至少50％的人轻链可变(V)基因，如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％及在一个方面全部人轻链V基因。
在一个方面中，插入的人DNA包含至少50％的人轻链连接(J)基因，如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％及在一个方面全部人轻链J基因。
插入的人基因可以衍生自相同个体或不同个体，或者是合成的或者代表人共有序列。
尽管人类个体中V D和J区的数目是可变的，在一个方面，认为在重链上有51个人V基因、27个D基因和6个J基因，在κ轻链上有40个人V基因和5个J基因，及在λ轻链上有29个人V基因和4个J基因(Janeway and Travers,Immunobiology,Third edition)。
在一个方面，插入到非人哺乳动物中的人重链基因座含有人V、D和J区的全部库集，其在基因组与非人哺乳动物恒定区功能排列，由此可以产生人可变区和非人哺乳动物恒定区之间的功能嵌合抗体。总插入人重链遗传材料在本文中称为人IgH VDJ区，包含来自人基因组的编码全部编码人V、D和J部分的外显子及合适地还有相关内含子的DNA。类似地，本文所称人Ig轻链κV和J区是指包含人基因组的编码V和J区的全部外显子及合适地还有相关内含子的人DNA。本文所称人Ig轻链λV和J区是指包含人基因组的编码V和J区的全部外显子及合适地还有相关内含子的人DNA。
人可变区合适地插入非人哺乳动物恒定区上游，后者包含编码全部恒定区或者足以允许形成能特异性识别抗原的有效嵌合抗体的恒定区部分所需的全部DNA。
在一个方面中，嵌合抗体或抗体链具有一部分宿主恒定区，足以提供在宿主哺乳动物中天然存在的抗体中可见的一或多个效应子功能，例如它们能够与Fc受体相互作用，和/或结合补体。
因此，本文所称具有宿主非哺乳动物恒定区的嵌合抗体或抗体链不限于完整恒定区，也包括具有全部宿主恒定区或者其足以提供一或多个效应子功能的部分的嵌合抗体或抗体链。这也适用于本发明的非人哺乳动物和细胞和方法，其中人可变区DNA可以插入宿主基因组中，由此其与宿主恒定区的全部或部分形成嵌合抗体链。在一个方面，全部宿主恒定区与人可变区DNA可操纵地连接。
本文宿主非人哺乳动物恒定区优选是位于野生型基因座的内源性宿主野生型恒定区，重链或轻链也是如此。例如，人重链DNA合适地插入小鼠染色体12上，合适地邻近小鼠重链恒定区。
在一个方面，人DNA如人VDJ区的插入靶向小鼠基因组IgH基因座中的J4外显子和Cμ基因座之间的区域，及在一个方面，插入在坐标114,667,090和114,665,190之间，或者插入在114,667,090之后的坐标114,667,091。在一个方面，人DNA如人轻链κVJ的插入靶向小鼠染色体6坐标70,673,899和70,675,515之间，合适地在位置70,674,734，或者在染色体16上的λ小鼠基因座中的等价位置。
在一个方面中，用于形成嵌合抗体的宿主非人哺乳动物恒定区可以是在不同的(非内源性)染色体基因座。在这种情况中，插入的人DNA如人可变VDJ或VJ区可以然后插入到非人基因组中远离天然发生的重链或轻链恒定区的位点。天然恒定区可以在不同于天然位置的染色体基因座处插入基因组中或者在基因组内复制，由此其与人可变区呈功能排列，由此本发明的嵌合抗体仍可以产生。
在一个方面中，人DNA插入在位于野生型基因座的内源性宿主野生型恒定区，在宿主恒定区和宿主VDJ区之间。
位于非人哺乳动物恒定区上游的可变区位置是指抗体的两个部分可变区和恒定区有合适的相对位置，以允许可变区和恒定区在哺乳动物体内形成嵌合抗体或抗体链。因此，插入的人DNA和宿主恒定区互相功能排列以用于抗体或抗体链产生。
在一个方面，插入的人DNA能够通过同种型转换而与不同的宿主恒定区一起表达。在一个方面，同种型转换不需要或不涉及反式转换。人可变区DNA插入在与相关宿主恒定区相同染色体上是指无需反式转换而产生同种型转换。
如以上解释，用于现有技术模型的转基因基因座是人来源的，因此即使在转基因能互补小鼠基因座从而小鼠产生产生完全人抗体的B细胞的情况中，个体抗体亲和性极少达到可以得自完整(非转基因)动物的那些抗体的亲和性。其主要原因(除了上述库集和表达水平以外)是基因座的控制元件是人的。因此，例如激活高亲和性抗体的高变和选择的信号传导元件被削弱。
相反，在本发明中，宿主非人哺乳动物恒定区被保持，优选至少一种非人哺乳动物增强子或其它控制序列如转换区被保持与非人哺乳动物恒定区功能排列，由此在宿主哺乳动物中可见的增强子或其它控制序列的作用在转基因动物中全部或部分发挥。
上述这个途径设计用于允许被取样的人基因座的完全多样性，允许实现由非人哺乳动物控制序列如增强子实现的相同高表达水平，并且在B细胞中的信号传导，例如使用转换重组位点的同种型转换，仍使用非人哺乳动物序列。
具有这种基因组的哺乳动物将产生具有人可变区和非人哺乳动物恒定区的嵌合抗体，但是这些抗体可以容易例如在克隆步骤中人源化。另外，这些嵌合抗体的体内功效可以在这些相同动物中评估。
在一个方面中，插入的人IgH VDJ区包含种系构型中的来自人的全部V、D和J区及间插序列。
在一个方面中，800-1000kb的人IgH VDJ区被插入到非人哺乳动物IgH基因座，在一个方面中，940、950或960kb的片段被插入。合适地，这包括来自染色体14的碱基105,400,051至106,368,585。
在一个方面中，插入的IgH人片段由来自染色体14的碱基105,400,051至106,368,585组成。在一个方面中，插入的人重链DNA，如由来自染色体14的碱基105,400,051至106,368,585组成的DNA，被插入到小鼠染色体12中在小鼠J4区末端和Eμ区之间，合适地在坐标114,667,090和114,665,190之间，或者在114,667,090之后的坐标114,667,091处。在一个方面中，插入是在坐标114,667,089和114,667,090之间(坐标参照NCBIm37，针对小鼠C57BL/6J品系)，或者在另一非人哺乳动物基因组中的等价位置。
在一个方面中，插入的人κVJ区包含种系构型中的来自人的全部V和J区及间插序列。合适地，这包括来自人染色体2的碱基88,940,356至89,857,000，合适地大约917kb。在进一步方面，轻链VJ插入序列可以包含仅V区段和J区段的近端簇(proximal clusters)。这种插入序列大约为473kb。在一个方面中，人轻链κDNA如来自人染色体2的碱基88,940,356至89,857,000的人IgK片段合适地插入小鼠染色体6中坐标70,673,899和70,675,515之间，合适地在位置70,674,734。这些坐标参照针对人基因组的NCBI36，针对小鼠基因组的ENSEMBL Release 54和NCBIM37，涉及小鼠品系C57BL/6J。
在一个方面中，人λVJ区包含种系构型中的来自人的全部V和J区及间插序列。
合适地，这包括来自人染色体2的类似于针对κ片段所选择的碱基。
在一个实施方案中，本发明的细胞或非人哺乳动物包含人重链可变区DNA的插入，所述插入在小鼠染色体2的坐标114,666,183和114,666,725之间，如在114666283和114666625之间，任选在坐标114,666,335和114,666,536之间，任选在114,666,385和114,666,486之间，或者在114,666,425和114,666,446之间，或者在114,666,435和114,666,436之间，坐标参照涉及小鼠品系C57BL/6J的针对小鼠基因组的NCBIM37，或者来自不同小鼠品系的小鼠染色体12的等价位置或者在另一种非人脊椎动物例如大鼠的基因组中的等价位置。在涉及小鼠品系C57BL/6J的坐标114,666,435和114,666,436之间的插入等价于参照登录号NT114985.2的129/SvJ基因组序列的染色体12上的坐标1207826和1207827之间的插入。插入可以在另一基因组如另一小鼠基因组的等价位置进行。在这个实施方案的一个例子中，本发明的细胞或哺乳动物包含人IgHVDJ区，其包含或者由人染色体14上的核苷酸106,328,851-107,268,544、如核苷酸106,328,901-107,268,494、如核苷酸106,328,941-107,268,454、如核苷酸106,328,951-107,268,444组成，坐标参照GRCH37/hg19序列数据库，或者来自不同人序列或数据库的染色体14的等价核苷酸的插入。人插入可以在上述区域之间进行。
在一个实施方案中，本发明的细胞或哺乳动物包含人κVJ区的插入，其合适地在种系构型中包含或由来自人的全部V和J区及间插序列组成，所述人DNA的插入是在小鼠染色体6的坐标70,673,918-70,675,517之间进行，如在坐标70,674,418和70 675,017之间，如在坐标70,674,655–70,674,856之间，如在坐标70,674,705–70,674,906之间，如在坐标70,674,745–70,674,766之间，如在坐标70,674,755和70,674,756之间，编号参照针对小鼠基因组的NCBIM37，其涉及小鼠品系C57BL/6J，或者插入在另一基因组如另一小鼠基因组的等价位置。在这个实施方案的一个例子中，本发明的细胞或哺乳动物包含插入参照GRCH37/hg19序列数据库的人染色体2的核苷酸89,159,079-89,630,437和/或89,941,714-90,266,976(或者来自不同人序列或数据库的染色体2的等价核苷酸)，如插入无间插序列的这两个独立片段，或者插入完整的89,159,079-90,266,976区域。
所述插入可以包含或者由以下组成：
(i)核苷酸89,158,979-89,630,537，如89,159,029-89,630,487，如89,159,069-89,630,447，如89,159,079-89,630,437，任选地在下述片段(ii)之外
(ii)核苷酸89,941,614-90,267,076,如89,941,664-90,267,026,如89,941,704-90,266,986,如89,941,714-90,266,976；任选地在片段(i)之外
(iii)核苷酸89,158,979-90,267,076，如核苷酸89,159,079-90,266,976。
人插入可以在上述区域之间进行。
在一个实施方案中，本发明的细胞或哺乳动物包含插入人λ区，其包含至少一个人Jλ区(例如种系区)和至少一个人Cλ区(例如种系区)，任选地包含Cλ6和/或Cλ7。例如，所述细胞或哺乳动物包含多个人Jλ区，任选地包含Jλ1、Jλ2、Jλ6和Jλ7的两或更多个，任选地包含Jλ1、Jλ2、Jλ6和Jλ7全部。在一个实例中，所述细胞或哺乳动物包含至少一个人Jλ-Cλ簇，任选地包含至少Jλ7-Cλ7。
在一个方面中，人JC簇插入在最后一个内源性Jλ的3’或者插入在最后一个内源性Jκ区的3’，合适地插入在这些序列的立即3’，或者这些序列的基本上立即3’(substantially immediately 3')。
在一个方面中，插入在小鼠λ基因座是在内源性C1基因区段的下游，例如当有3'J1C1簇时，合适地插入在C1区段的立即3’，或者所述区段的基本上立即3’。
在一个方面(例如细胞或非人哺乳动物)中，人JC簇被插入κ基因座，任何产生的细胞或动物在该基因座是杂合的，由此细胞具有其中人λDNA插入到κ基因座的一条染色体，及在内源性κ基因座具有人κDNA的另一条染色体。
在一个实施方案中，本发明的细胞或哺乳动物包含人Eλ增强子。
本发明细胞或哺乳动物包含插入的人λVJ区，其合适地包含或由种系构型的来自人的全部V和J区及间插序列组成，插入区包含或由如下核苷酸组成：参考GRCH37/hg19序列数据库的来自人染色体22的核苷酸22,375,509-23,327,984，如核苷酸22,375,559-23,327,934，如核苷酸22,375,599-23,327,894，如核苷酸22,375,609-23,327,884，或者来自另一人序列或数据库的等价DNA。在小鼠基因组中的插入可以在小鼠染色体16的坐标19,027,763和19,061,845之间，如坐标19,037,763和19,051,845之间，如坐标19,047,451和19,047,652之间，如坐标19,047,491和19,047,602之间，如19,047,541和19,047,562之间，如坐标19,047,551和19,047,552之间(参考小鼠基因组的NCBIM37，涉及小鼠品系C57BL/6J，等价于序列文件NT_039630.4中的129SvJ基因组序列的坐标1,293,646-1,293,647)，或者可以在其它基因组如另一小鼠基因组中的等价位置的插入。人λ核酸在小鼠基因组中的插入或者可以在小鼠染色体6的坐标70,673,918和70,675,517之间进行，如坐标70,674,418和70675,017之间，如坐标70,674,655和70,674,856之间，如坐标70,674,705和70,674,806之间，如坐标70,674,745和70,674,766之间，如坐标70,674,755和70,674,756之间(参考小鼠基因组的NCBIM37，涉及小鼠品系C57BL/6J)或者另一基因组等价位置。人插入可以在上述区域之间进行。
上述所有具体人片段长度可以变化，例如可以比上述定义的更长或更短，如500碱基、1KB、2K、3K、4K、5KB、10KB、20KB、30KB、40KB或50KB或更多，其合适地包含全部或部分人V(D)J区，同时如果合适，如上所述，优选保持要求最终插入序列包含编码完整重链区和轻链区的人遗传材料。
在一个方面，上述人插入序列的5’末端长度增加。当插入序列以逐步方式产生时，长度的增加通常相对于上游(5’)克隆。
在一个方面，最后插入的人基因、通常待插入的最后一个人J基因的3’末端距离人-小鼠连接区小于2kb，优选小于1kb。
在一个方面，非人哺乳动物包含一些或全部本文所述的人轻链κVJ区，但非人轻链λVJ区。
在一个方面，细胞或非人哺乳动物包含完全人λ基因座(来自人的λVJC区)、嵌合κ基因座(人κVJ区可操纵地连接于宿主κ恒定区)及具有可操纵地连接于宿主重链恒定区的人VDJ区的嵌合重链基因座。
在进一步的方面，基因组包含在重链基因座和一个轻链基因座或者在重链基因座和两个轻链基因座的本文所述V、D(仅重链)和J基因的插入。优选基因组在一个或两个或全部三个基因座是纯合的。
在另一方面，基因组可以在一或多个所述基因座是杂合的，例如对于编码嵌合抗体链和天然(宿主细胞)抗体链的DNA是杂合的。在一个方面，基因组可以对能够编码2种不同的本发明抗体链的DNA是杂合的，例如包含2个不同嵌合重链或2个不同嵌合轻链。
在一个方面，本发明涉及非人哺乳动物或细胞，及生产所述哺乳动物或细胞的方法，如本文所述，其中插入的人DNA如人IgH VDJ区和/或轻链V，J区仅在所述哺乳动物或细胞的一个等位基因而非两个等位基因上发现。在这方面，哺乳动物或细胞具有表达内源性宿主抗体重或轻链及嵌合重或轻链的潜力。
在本发明进一步方面，人VDJ区或轻链VJ区不是完整使用，而是可以使用来自其它物种的等价人VDJ或VJ区的部分，如外显子，如来自其它物种的一或多个V、D或J外显子，或者来自其它物种的调节序列。在一个方面，用于替代人序列的序列是非人的或非小鼠的。在一个方面，所用序列可以是来自啮齿类或灵长类如黑猩猩。例如，来自非人的灵长类的1、2、3、4或更多个或者全部J区可以用于替代本发明细胞和哺乳动物的VDJ/VJ区中的1、2、3、4或更多个或全部人J外显子。
在进一步方面，插入的人DNA如人IgH VDJ区和/或轻链VJ区可以被插入，由此它们在基因组中与来自非人非小鼠物种如啮齿类或灵长类序列如大鼠序列的mu恒定区可操纵地连接。
可以在本发明中使用的DNA元件所来自的其它非人非小鼠物种包括兔、美洲驼、单峰骆驼、羊驼、骆驼和鲨鱼。
在一个方面，插入的人DNA如人VDJ或VJ区不与内源性宿主mu序列而是与非宿主mu序列可操纵地连接。
可操纵的连接合适地允许产生包含人可变区的抗体重链或轻链。
在一个方面，插入的人DNA如人IgH VDJ区(和/或轻链VJ区)可以与mu恒定区核酸一起插入宿主染色体，所述mu恒定区核酸不是宿主mu恒定区核酸，优选是来自非小鼠非人物种的mu恒定区。合适地，插入的人DNA如人VDJ区(和/或轻链VJ区)与非人非小鼠mu可操纵地连接，并且能形成嵌合抗体重链或轻链。在另一方面，非小鼠非人mu可以在独立于人可变区的遗传元件上插入宿主染色体，或者插入基因组不同位置，合适地与可变区可操纵地连接，由此可以形成嵌合抗体重链或轻链。
在另外方面，本发明涉及非人哺乳动物或细胞，其基因组包含位于宿主非人哺乳动物轻链恒定区上游的多个人IgH V区、一或多个人D区及一或多个人J区，其排列是使得所述细胞或哺乳动物能表达嵌合抗体链。本发明还涉及非人哺乳动物或细胞，其基因组额外或作为替代包含位于宿主非人哺乳动物重链恒定区上游的多个人Ig轻链V区及一或多个人J区，由此所述细胞或哺乳动物能表达嵌合抗体链。所述细胞或哺乳动物能表达具有重链和轻链的抗体，包括如上所述至少一个嵌合抗体链。
插入的人重链可变区可以是本文描述的任何，并且可以插入上述用于插入λ和κ恒定区的5’的位置。类似地，插入的人轻链可变区可以是上述那些，可以插入上述用于插入重链恒定区的5’的位置。
例如，本发明的基因组或细胞或非人哺乳动物可以编码抗体，所述抗体包含具有位于小鼠轻链恒定区上游的人重链可变区的抗体链，或者具有位于小鼠重链恒定区上游的人轻链可变区的抗体链，与下列之一组合：
完全人抗体轻链；
完全人抗体重链；
非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)抗体轻链；
非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)抗体重链；
嵌合非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)-人抗体链；
具有位于非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)轻链恒定区上游的人重链可变区的抗体链；
具有位于非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)重链恒定区上游的人轻链可变区的抗体链。
本发明还涉及转基因，任选地包含在载体中，所述转基因编码位于宿主非人哺乳动物轻链恒定区上游的多个人IgH V区、一或多个人D区及一或多个人J区。
本发明还涉及转基因，任选地包含在载体中，所述转基因编码位于宿主非人哺乳动物重链恒定区上游的多个人Ig轻链V区及一或多个人轻链J区。
在一个方面，本发明涉及细胞或非人哺乳动物，其基因组包含：位于全部或部分人κ恒定区上游的一或多个人Ig轻链κV区及一或多个人Ig轻链κJ区。
在另一个方面，本发明涉及细胞或非人哺乳动物，其基因组包含：位于全部或部分人λ恒定区上游的一或多个人Ig轻链λV区及一或多个人Ig轻链λJ区。
合适地，轻链VJ和C区能在体内形成能与抗原特异性反应的抗体链。
在本发明一个方面，在插入的轻链区没有非人编码序列。
在这些方面，人κ和/或λ区被插入基因组中，与重链VDJ区或其部分的插入组合，如本文揭示位于宿主重链恒定区上游。
本发明的细胞或非人哺乳动物可以包含：
(a)位于宿主非人哺乳动物恒定区上游的多个人IgH V区、一或多个人D区及一或多个人J区；及
(b)位于全部或部分非人κ恒定区上游的一或多个人Ig轻链κV区及一或多个人Ig轻链κJ区，
其中所述非人哺乳动物能产生具有包含非人哺乳动物恒定区和人可变区的抗体链的抗体的库集。
本发明的细胞或非人哺乳动物可以包含：
(a)位于宿主非人哺乳动物恒定区上游的多个人IgH V区、一或多个人D区及一或多个人J区；及
(b)位于宿主非人哺乳动物λ恒定区上游的一或多个人Ig轻链λV区及一或多个人Ig轻链λJ区；
其中所述非人哺乳动物能产生具有包含非人哺乳动物恒定区和人可变区的抗体链的抗体的库集。
合适地，如上所述人VJC轻链DNA或其部分的插入是在等价的小鼠基因座进行的。在一个方面，人轻链κVJC DNA或其部分插入到小鼠κVJC区的立即上游或下游。在一个方面，人轻链λVJC区或其部分插入到小鼠λVJC区的立即上游或下游。在一个方面，仅人κVJC基因座插入而非人λVJC基因座。在一个方面，仅人λVJC基因座插入而非人κVJC基因座。插入可以用本文揭示的技术进行，合适地不从基因组除去宿主序列。在一个方面，非人哺乳动物宿主VJC序列可以通过突变或倒位或通过插入人可变区DNA或通过任何其它方式而失活。在一个方面，本发明的细胞或非人哺乳动物可包含完整人VJC区的插入。
人κ可变区DNA可以插入基因组中与λ恒定区功能排列，例如插入λ恒定区上游。或者，人λ可变区DNA可以插入与κ恒定区功能排列，例如插入κ恒定区上游。
在一个方面，一或多个非人哺乳动物控制序列如增强子序列保持在非人哺乳动物Mu恒定区上游，合适地相对于距恒定区的距离在其天然位置。
在一个方面，一或多个非人哺乳动物控制序列如增强子序列保持在非人哺乳动物Mu恒定区下游，合适地相对于距恒定区的距离在其天然位置。
在一个方面，非人哺乳动物转换序列、合适地内源性转换序列保持在非人哺乳动物Mu恒定区上游，合适地相对于距恒定区的距离在其天然位置。
在这种位置，宿主增强子或转换序列在体内与宿主恒定区序列是可操纵的。
在一个方面，转换序列既不是人的，也不是非人哺乳动物中天然的，例如在一个方面，非人哺乳动物转换序列不是小鼠或人转换序列。转换序列可以是例如啮齿类或灵长类序列或者合成序列。特别地，当非人哺乳动物是小鼠时，转换序列可以是大鼠序列。举例而言，小鼠或人mu恒定区序列可以置于来自大鼠或黑猩猩的转换序列或其它转换序列的控制下，合适地能允许同种型转换在体内发生。
在一个方面，本发明的转换序列是包含重复序列GGGCT的3、4、5、6或更多个(直至82个)连续重复的转换序列(SEQ ID no 46–50)，如大鼠转换序列。本文中“大鼠转换序列”是指所述转换序列是野生型转换序列，相应于来自大鼠基因组的转换序列或衍生自这种转换序列。
在一个方面，本发明的转换序列是包含如下重复的大鼠转换序列：GAGCT(296个重复；SEQ ID No 18),GGGGT(50个重复；SEQ ID No 19),和GGGCT(83个重复；SEQ ID No 20)。
在一个实例中，大鼠转换序列包含或由SEQ ID no 1的序列组成。
在这些实施方案中，当非人哺乳动物是小鼠或者细胞是小鼠细胞时，转换序列任选是本文所述的大鼠转换序列。
或者，存在于本发明细胞或哺乳动物中的转换序列是小鼠转换序列，例如来自小鼠如小鼠129品系或小鼠C57品系，或者来自其衍生的品系，任选地包含或由SEQ ID no 4或5的序列组成。“小鼠转换序列”是指转换序列是相应于来自小鼠基因组的转换序列的野生型转换序列或者衍生自这种转换序列。在这个实施方案中，当非人哺乳动物是小鼠或者细胞是小鼠细胞时，小鼠转换序列任选是内源性转换序列或者是来自另一小鼠品系的小鼠转换序列。
本发明的细胞或哺乳动物可以因此包含人或非人哺乳动物转换序列及人或非人哺乳动物增强子区。它们可以在人或非人哺乳动物恒定区上游。优选地，控制序列能够指导抗体的表达或者另外控制所述抗体的产生，所述抗体包含与其相关的恒定区。所预见的一个组合是在小鼠细胞中的大鼠转换序列与小鼠增强子序列及小鼠恒定区。
在一个方面，本发明涉及细胞、优选非人细胞，或者非人哺乳动物，其包含具有来自3个或更多个物种的DNA的免疫球蛋白重链或轻链基因座。例如，所述细胞或动物可以包含宿主细胞恒定区DNA、一或多个人V、D或J编码序列及一或多个能控制免疫球蛋白基因座的非人非宿主DNA区，如能够控制Ig DNA的体内表达或同种型转换的转换序列、启动子或增强子。在一个方面，所述细胞或动物是小鼠并且额外包含来自人Ig基因座的人DNA及额外包含能调节小鼠或人DNA的非小鼠DNA序列如大鼠DNA序列。
在另一方面，本发明涉及细胞、优选非人细胞，或者非人哺乳动物，其包含具有来自2个或更多个不同人基因组的DNA的免疫球蛋白重链或轻链基因座。例如，其可以在重链或轻链内包含来自一个以上人基因组的重链V(D)J序列，或者来自一个基因组的重链VDJDNA及来自不同基因组的轻链VJ序列。
在一个方面，本发明涉及DNA片段或细胞或非人哺乳动物，其包含具有来自2个或更多个物种的DNA的免疫球蛋白重链或轻链基因座或其部分，其中一个物种贡献非编码区如调节区，其它物种贡献编码区如V、D、J或恒定区。
在一个方面，在人VDJ插入小鼠基因组后，与不同人V、D或J区相关的人启动子和/或其它控制元件被保持。
在进一步的方面，人区域如人V区的一或多个启动子元件或其它控制元件被优化以与非人哺乳动物的转录机构相互作用。
合适地，人编码序列可以置于合适的非人哺乳动物启动子的控制下，其使得人DNA在合适的非人哺乳动物细胞中有效转录。在一个方面，人区域是人V区编码序列，人V区置于非人哺乳动物启动子控制下。
人启动子或其它控制区域被非人哺乳动物启动子或控制区域的功能置换可以用重组工程或其它重组DNA技术进行，以将人Ig区域的一部分(如人V区)插入含有非人Ig区的载体(如BAC)中。重组工程/重组技术合适地用人Ig区置换非人(例如小鼠)DNA的部分，由此将人Ig区置于非人哺乳动物启动子或其它控制区域的控制下。合适地，编码人V区的人编码区置换小鼠V区编码序列。合适地，编码人D区的人编码区置换小鼠D区编码序列。合适地，编码人J区的人编码区置换小鼠J区编码序列。以此方式，人V、D或J区可以置于非人哺乳动物启动子如小鼠启动子的控制下。
在一个方面，插入到非人哺乳动物细胞或动物中的唯一人DNA是V、D或J编码区，它们被置于宿主调节序列或其它(非人非宿主)序列的控制下。在一个方面，提及人编码区包括人内含子和外显子，或者在另一方面仅指外显子而无内含子，其可以是cDNA形式。
也可以使用重组工程或其它重组DNA技术将非人哺乳动物(例如小鼠)启动子或其它控制区例如用于V区的启动子插入含有人Ig区的BAC中。重组工程步骤然后将人DNA部分置于小鼠启动子或其它控制区控制下。
本文描述的方法也可以用于将来自人重链的一些或全部V、D和J区插入轻链恒定区的上游而非重链恒定区的上游。类似地，人轻链V和J区的一些或全部可以插入重链恒定区的上游。插入可以是在内源性恒定区基因座，例如位于内源性恒定区和J区之间，并且可以单独是一些或全部V、D或J基因，不包括启动子或增强子序列，或者可以是具有一或多个或全部各自启动子或增强子序列的一些或全部V、D或J基因。在一个方面，呈种系方向的V、D或J片段的全部库集可以插入宿主恒定区上游并呈功能排列。
因此，本发明允许来自人或任何物种的V和/或D和/或J区插入到来自不同物种的细胞的包含恒定区的染色体中，使得嵌合抗体链表达。
在一个方面，本发明仅需要一些人可变区DNA插入非人哺乳动物基因组中与在内源性重链恒定区基因座的区域的一些或全部人重链恒定区呈可操纵排列，由此可以产生抗体链。在本发明这个方面及当人轻链DNA被额外插入时，轻链DNA插入可以在完全人构建体形式中，具有人可变区DNA和人恒定区DNA，或者具有人可变区DNA和来自非人非宿主物种的恒定区DNA。其它变化也是可能的，例如插入轻链人可变区和宿主基因组恒定区。另外，所述轻链转基因的插入无需在等价内源性基因座中，可以在基因组的任何地方。在这种情况下，细胞或哺乳动物可产生嵌合重链(包含人可变区DNA和小鼠恒定区DNA)和包含人可变区和人恒定区DNA的轻链。因此，在本发明的一个方面，λ和/或κ人可变区DNA可以插入内源性基因座的上游或下游，或者在不同于内源性基因座的不同染色体上，并且与或不与恒定区DNA一起插入。
除了人轻链DNA插入宿主非人哺乳动物恒定区上游，本发明进一步方面涉及一或两个轻链人可变区插入等价内源性基因座恒定区下游或基因组其它位置。
通常，优选人可变区DNA插入到受体基因组中的等价内源性基因座或其附近，例如在宿主免疫球蛋白基因座边界(上游或下游)的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10kb之内。
因此，在一个方面，本发明可以涉及细胞或非人哺乳动物，其基因组包含：
(a)位于宿主非人哺乳动物恒定区上游的多个人IgH V区、一或多个人D区及一或多个人J区；和
(b)一或多个人Ig轻链κV区及一或多个人Ig轻链κJ区，和/或，一或多个人Ig轻链λV区及一或多个人Ig轻链λJ区；
其中所述非人哺乳动物能产生具有非人哺乳动物恒定区和人可变区的嵌合抗体或嵌合轻链或重链的库集。
在一个特定方面，所述细胞或非人哺乳动物的基因组包含：
位于宿主非人哺乳动物恒定区上游的多个人IgH V区、一或多个人D区及一或多个人J区；
位于宿主非人哺乳动物κ恒定区上游的一或多个人Ig轻链κV区及一或多个人Ig轻链κJ区，以及
位于宿主非人哺乳动物λ恒定区下游的一或多个人Ig轻链λV区及一或多个人Ig轻链λJ区，
任选地，其中人λ可变区可以插入内源性宿主λ基因座的上游或下游，与人λ恒定区可操纵连接，由此所述非人哺乳动物或细胞可以产生完全人抗体轻链和嵌合重链。
在本发明进一步的不同方面，使用本发明方法允许通过依次插入以逐步方式建立基因座，因此允许人可变区DNA与人或非人恒定区DNA插入到非人宿主细胞基因组的任何合适位置。例如，本发明方法可以用于将人免疫球蛋白可变区DNA与来自宿主基因组的恒定区DNA一起插入非人宿主细胞基因组中的任何地方，使得嵌合抗体链从非内源性重链区的位点产生。上述任何人重链或轻链DNA构建体可以用本文所述技术插入到非人宿主细胞基因组中的任何希望位置。本发明因此还涉及具有包含这种插入的基因组的细胞和哺乳动物。
本发明还涉及载体如BAC，其包含与非人哺乳动物启动子或其它控制序列呈功能排列的人V、D或J区，由此人V、D或J区的表达在非人哺乳动物细胞如ES细胞中在非人哺乳动物启动子的控制下，特别是当插入到该细胞基因组中时。
本发明还涉及细胞和含有所述细胞的非人哺乳动物，所述细胞或哺乳动物具有与非人哺乳动物启动子或其它控制序列呈功能排列的人V、D或J区，由此人V、D或J区的表达在所述细胞或哺乳动中在非人哺乳动物启动子的控制下。
通常，本发明一个方面因此涉及能在宿主启动子或控制区控制下表达人V、D或J编码序列的非人哺乳动物宿主细胞，所述表达能产生具有人可变结构域和非人哺乳动物恒定区的人源化抗体。
在一个方面，本发明涉及细胞如非哺乳动物细胞如ES细胞，其基因组包含：
(a)位于宿主非人哺乳动物恒定区上游的多个人IgH V区、一或多个人D区及一或多个人J区；及
(b)任选地，位于宿主非人哺乳动物κ恒定区上游的一或多个人Ig轻链κV区及一或多个人Ig轻链κJ区和/或位于宿主非人哺乳动物λ恒定区上游的一或多个人Ig轻链λV区及一或多个人Ig轻链λJ区。
在另一方面，本发明涉及细胞如非人哺乳动物细胞如ES细胞，其基因组包含：
(a)位于宿主非人哺乳动物κ恒定区上游的多个人Ig轻链κV区及一或多个人Ig轻链κJ区和/或位于宿主非人哺乳动物λ恒定区上游的多个人Ig轻链λV区及一或多个人Ig轻链λJ区；及
(b)任选地，位于宿主非人哺乳动物恒定区上游的一或多个人IgH V区、一或多个人D区及一或多个人J区。
在一个方面，所述细胞是ES细胞，能够发育成能产生嵌合抗体库集的非人哺乳动物，所述嵌合抗体具有非人哺乳动物恒定区和人可变区。任选地，细胞的基因组被修饰以防止完全宿主物种特异性抗体的表达。
在一个方面，所述细胞是诱导的多能干细胞(iPS cell).
在一个方面，所述细胞是分离的非人哺乳动物细胞。
在一个方面，本文揭示的细胞优选是非人哺乳动物细胞。
在一个方面，所述细胞是来自选自如下的小鼠品系的细胞：C57BL/6、M129如129/SV、BALB/c及C57BL/6、M129如129/SV或BALB/c的任何杂种。
本发明还涉及细胞系，其生长自或另外方式衍生自本文所述细胞，包括永生化细胞系。细胞系可以包含本文所述的插入的人V、D或J基因，这些基因是种系构型或者在体内成熟后重排之后。细胞可以通过与肿瘤细胞(例如P3X63-Ag8.653(可得自LGC Standards；CRL-1580)、SP2/0-Ag14(可得自ECACC),NSI或NS0)融合(例如电融合或用PEG根据标准程序融合)而永生化，以提供抗体产生细胞和细胞系，或者通过直接细胞永生化而制备。
本发明还涉及用于本发明的载体。在一个方面，这种载体是BAC(细菌人工染色体)。应理解本发明中可以使用其它克隆载体，因此本文提及BAC通常是指任何合适载体。
在一个方面，用于产生待插入的人DNA如VDJ或VJ区的BAC被修剪，由此在非人哺乳动物中的最终人VDJ或VJ或其部分中，与最初人基因组序列相比没有序列被重复或丢失。
在一个方面，本发明涉及包含插入序列的载体，优选包含来自一些人VDJ或VJ基因座的人DNA区并且其侧翼是非来自该基因座的DNA。所述侧翼DNA可以包含一或多个选择标记或者一或多个位点特异性重组位点。在一个方面，载体包含2个或更多个如3个异种特异性和不相容位点特异性重组位点。在一个方面，位点特异性重组位点可以是loxP位点或其变体，或者FRT位点或其变体。在一个方面，载体包含一或多个转座子ITR(末端反向重复)序列。
在一个方面，本发明的非人动物合适地不产生任何完全人源化抗体。在一个方面，这是因为没有来自人恒定区的DNA被插入。或者在基因组中没有能与插入的人可变区DNA成分联合形成抗体的人恒定区DNA，例如是由于在任何人恒定区DNA内的突变或者远离任何恒定区人DNA和人可变区DNA。
在一个方面，人轻链恒定区DNA可以包括在细胞基因组中，由此可以产生完全人λ或κ人抗体链，但是这仅能与嵌合重链形成抗体，并且不产生具有人可变区和恒定区的完全人抗体。
在一个方面，非人哺乳动物基因组被修饰以防止完全宿主物种特异性抗体的表达。完全宿主物种特异性抗体是具有来自宿主生物体的可变区和恒定区二者的抗体。在这个上下文中，术语“特异性”不是涉及本发明细胞或动物产生的抗体的结合，而是涉及编码那些抗体的DNA的来源。
在一个方面，非人哺乳动物基因组被修饰以通过失活宿主非人哺乳动物Ig基因座的全部或部分而防止哺乳动物中天然(完全宿主物种特异性)抗体的表达。在这个上下文中，内源性抗体或基因区段使用的失活或防止(使用本文描述任何失活技术)是例如基本上完全失活或防止(基本上100％，即基本上无(例如小于10％、5％、4％、3％、2％、1％或0.5％)内源性抗体链(例如无内源性重链)的表达)。这可以例如通过评估非人脊椎动物、哺乳动物产生的抗体库集在抗体链(蛋白质)水平上确定，或者通过例如用RACE评估抗体链基因座的mRNA转录物在核苷酸水平上确定。在一个实施方案中，失活是超过50％(即50％或更少的抗体或转录物是内源性抗体链的)、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。例如，在一个实施方案中，内源性重链表达基本上被失活，由此不超过85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的脊椎动物(哺乳动物)重链库集是由内源性重链提供的。例如，内源性重链表达被基本上失活，由此基本上没有脊椎动物(哺乳动物)的重链库集是由内源性重链提供的。例如，在一个实施方案中，内源性重链表达被基本上失活，由此不超过85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的脊椎动物(哺乳动物)κλ链库集是由内源性κ链提供的。例如，内源性κ链表达被基本上失活，由此基本上没有脊椎动物(哺乳动物)的κ链库集是由内源性κ链提供的。例如，在一个实施方案中，内源性重链表达被基本上失活，由此不超过85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的脊椎动物(哺乳动物)λ链库集是由内源性λ链提供的。例如，内源性λ链表达被基本上失活，由此基本上没有脊椎动物(哺乳动物)的λ链库集是由内源性λ链提供的。
在一个方面，这通过全部或部分非人哺乳动物VDJ区或VJ的倒位而实现，任选通过在基因组中插入一或多个位点特异性重组酶位点，然后使用这些位点进行全部或部分非人哺乳动物Ig基因座的重组酶介导的切除或倒位进行。在一个方面，可以采用双倒位(doubleinversion)，第一个倒位从内源性基因座除去V(D)J，然后更局部倒位使得它们呈正确方向。在一个方面，使用单个loxP位点使非人哺乳动物VDJ区倒位到着丝粒基因座或端粒基因座。
在一个实例中，本发明的小鼠或小鼠细胞包含倒位的内源性重链基因区段(例如VH、D和JH，如完整内源性重链VDJ区)，其位于内源性小鼠染色体12上的位置119753123、119659458或120918606的立即3’。任选地，小鼠或细胞的基因组对于所述染色体12是纯合的。
本发明还提供了：
用于内源性非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)抗体链基因区段倒位和失活的盒，所述区段是非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)细胞(例如ES细胞)染色体上抗体链基因座的部分，其中所述序列在其3’末端的侧翼为位点特异性重组位点(例如lox、rox或frt)，所述盒包含编码可表达标记或选择标记的核苷酸序列和相容的位点特异性重组位点(例如lox、rox或frt)，其侧翼为5’和3’同源臂，其中所述同源臂相应于或同源于细胞基因组中不同染色体上或所述染色体上距离所述内源性基因区段至少10、15、20、25、30、35、40、45或50mb的相邻序列段。
本发明还提供了：
用于内源性小鼠抗体链基因区段倒位和失活的盒，所述区段是小鼠细胞(例如ES细胞)的染色体12上的重链基因座序列的部分，其中所述序列在其3’末端的侧翼为位点特异性重组位点(例如lox、rox或frt)，所述盒包含编码可表达标记或选择标记的核苷酸序列和相容的位点特异性重组位点(例如lox、rox或frt)，侧翼为5’和3’同源臂，其中所述同源臂相应于或同源于小鼠细胞基因组中不同染色体上或染色体12上距离所述内源性基因区段至少10、15、20、25、30、35、40、45或50mb的相邻序列段。
本发明提供了：
用于内源性小鼠抗体重链基因区段倒位和失活的盒，所述区段是小鼠细胞(例如ES细胞)的染色体12上的重链基因座序列的部分，其中所述序列在其3’末端的侧翼为位点特异性重组位点(例如lox、rox或frt)，所述盒包含编码可表达标记或选择标记的核苷酸序列和相容的位点特异性重组位点(例如lox、rox或frt)，侧翼为5’和3’同源臂，其中(i)5’同源臂是从坐标119753124至坐标119757104的小鼠染色体12DNA，3’同源臂是从坐标119749288至坐标119753123的小鼠染色体12DNA；或者(ii)5’同源臂是从坐标119659459至坐标119663126的小鼠染色体12DNA，3’同源臂是从坐标119656536至坐标119659458的小鼠染色体12DNA；或者(iii)5’同源臂是从坐标120918607至坐标120921930的小鼠染色体12DNA，3’同源臂是从坐标120915475至坐标120918606的小鼠染色体12DNA。
实施方案(i)导致小鼠染色体12从坐标119753123至坐标114666436的倒位。
实施方案(ii)导致小鼠染色体12从坐标119659458至坐标114666436的倒位。
实施方案(iii)导致小鼠染色体12从坐标12091806至坐标114666436的倒位。
因此，本发明提供了小鼠或小鼠细胞，其基因组包含染色体12的倒位，其中所述倒位包含倒位的内源性重链基因区段(例如VH、D和JH，如完整内源性重链VDJ区)；其中小鼠包含转基因重链基因座，该转基因重链基因座包含可操纵连接于内源性恒定区(例如C mu)上游的多个人VH基因区段、多个人D区段及多个人JH区段，由此，小鼠或细胞(任选地在分化为B细胞之后)能表达包含序列来自人基因区段的可变区的抗体；及其中所述倒位是(i)小鼠染色体12从坐标119753123至坐标114666436的倒位；(ii)小鼠染色体12从坐标119659458至坐标114666436的倒位；或(iii)小鼠染色体12从坐标12091806至坐标114666436的倒位。
在一个实施方案中，所述内源性基因区段是来自129衍生的小鼠细胞(例如来自AB2.1细胞的区段)并且同源臂是等基因DNA(即与上述(i)至(iii)所述相应坐标界定的129衍生的内源性序列相同)。因此，用这些同源臂同源重组不产生新序列。在另一实施方案中，所述臂来自不同于内源性品系的小鼠品系。位点特异性重组位点互相相容及互相倒位，由此，在表达相关重组酶(例如Cre、Dre或Flp)时，进行插入的倒位盒中的位点与内源性基因区段侧翼的位点之间的重组，由此倒位并移动内源性基因区段至与它们在重链基因座中原始位置相隔很远的上游(5’)。这失活内源性重链表达。类似地，轻链失活可以通过选择倒位盒的同源臂而进行，所述选择是参考与内源性轻链基因座间隔至少10、15、20、25、30、35、40、45或50mb的染色体区，后者包含与倒位盒中的位点相容的位点特异性重组位点。
在一个实施方案中，可表达标记是荧光标记，例如GFP或其变体(例如YFP、CFP或RFP)。因此，使用标记替代选择标记，如赋予抗性允许选择转化体的选择标记。
本发明提供了失活内源性抗体基因座的基因区段的方法，所述方法包括：
(i)提供非人脊椎动物细胞(例如ES细胞，例如小鼠ES细胞)，其基因组包含抗体链基因座，所述抗体链基因座包含内源性可变区基因区段；
(ii)靶向位点特异性重组位点以位于所述内源性基因区段的最3’-(3’-most)的3’侧翼；
(iii)靶向第二个位点特异性重组位点，距所述内源性基因区段至少10mb，所述第二个位点与第一个位点相容并且相对于第一个位点是倒位的；
(iv)表达与所述位点相容的重组酶以实现所述位点之间的位点特异性重组，由此倒位并移动所述基因区段离开所述基因座，其中所述内源性基因区段被失活；及
(v)任选地，使细胞发育为后代细胞或脊椎动物(例如小鼠或大鼠)，其基因组对于所述倒位是纯合的。
后代细胞或脊椎动物的基因组可以包含转基因重链和/或轻链基因座，各自能表达包含人可变区的抗体链。任选地，内源性重链和κ轻链表达通过根据本发明方法倒位内源性重链和κ可变区基因区段而失活。任选地，内源性λ链表达也以这种方式失活。
在本发明方法及倒位盒的替代形式中，代替仅倒位和移动可变区基因区段，内源性基因座的其它部分可以替代地或者额外地倒位和移动以实现失活。例如，一或多个内源性调节元件(例如Smu和/或Emu)和/或一或多个内源性恒定区(例如Cmu和/或Cgamma)可以被倒位和移动。
在本发明上述上下文中“侧翼”的位点可以被提供，由此位点特异性重组位点在内源性序列的立即侧翼，或者与其在3’方向间隔例如不超过250、200、250、100、50或20kb。
在一个方面，其中插入人DNA的非人哺乳动物基因组包含内源性V、(D)和J区，所述内源性序列未被缺失。
本发明包括将多个DNA片段插入DNA靶的方法，合适地形成连续插入，其中插入的片段直接连接在一起而无间插序列。上述方法特别适用于将大DNA片段插入宿主染色体中，其可以以逐步方式进行。
在一个方面，上述方法包括将第一个DNA序列插入靶中，上述序列具有DNA载体部分和第一个感兴趣序列(X1)；将第二个DNA序列插入第一个序列的载体部分，上述第二个DNA序列具有第二个感兴趣序列(X2)和第二个载体部分；然后切除分隔X1和X2的任何载体序列DNA以在靶内提供连续的X1X2或X2X1序列。任选地，将进一步一或多个DNA序列插入之前一个DNA序列的载体部分，每个DNA序列具有进一步的感兴趣序列(X3,…)和进一步的载体部分，以在靶中建立连续的DNA片段。
用于插入第一个DNA序列的DNA靶可以是特定细胞基因组中的特异性位点或者任何位点。
本文根据插入人VDJ区的元件而描述了一般方法，其适用于插入来自任何生物体的任何DNA区，特别是插入>100kB、如100–250kb或甚至更大的大DNA片段，如TCR或HLA的DNA片段。本文根据VDJ插入描述的特征和方法可以同样适用于所揭示的任何方法。
在一个方面，插入的DNA是人DNA，如人VDJ或VJ区，使用针对每个重链或轻链区的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20个或更多个独立插入以逐步方式建立在细胞如ES细胞的基因组中。片段合适地插入在相同或基本上相同的细胞基因座，例如ES细胞基因座，一个接着一个，以形成完整VDJ或VJ区或其部分。本发明还涉及包含所述过程中的中间体的细胞和非人动物，其基因组可包含仅部分VDJ区，如仅人可变区DNA。
在进一步方面，产生转基因非人哺乳动物的方法包括将人VDJ或VJ区以多个片段逐步插入经同源重组插入到宿主非人哺乳动物恒定区的上游，优选地使用重复方法。合适地，来自人VDJ和VJ基因座的大约100KB片段被插入，在本文所述插入过程的最后一次重复后，合适地形成部分或完整VDJ或VJ区。
在一个方面，插入过程在其中初始盒已被插入细胞如ES细胞基因组中的位点起始，提供独特的靶向区域。在一个方面，初始盒被插入非人哺乳动物重链基因座，用于插入人重链DNA。类似地，初始盒可以插入非人哺乳动物轻链基因座，用于插入人轻链VJ DNA。初始盒合适地包含载体骨架序列，具有在相同骨架序列中的人DNA片段的载体可以与其重组以将人DNA插入细胞(例如ES)细胞基因组中，合适地包含选择标记，如阴性选择标记。合适地，载体骨架序列是BAC文库的序列，以允许BAC用于构建ES细胞和哺乳动物。然而，所述载体骨架序列可以是作为靶位点的任何序列，其中可以例如通过同源重组例如RMCE插入同源序列，优选不是编码任何VDJ或恒定区的DNA。
在一个方面，第一个DNA片段插入到初始盒中之后是第二个DNA片段插入到第一个DNA片段的一部分中，合适地是第二个DNA片段的载体骨架部分。在一个方面，插入的DNA片段包含侧翼为不是来自人VDJ区的5’和/或3’序列的人VDJ区的一部分。在一个方面，所述5’和/或3’侧翼序列可以各自含有一或多个选择标记，或者能在插入基因组中时产生选择系统。在一个方面，一或两个侧翼序列可以体外从基因组除去或者在插入后体内从基因组除去。在一个方面，所述方法包括插入DNA片段，然后选择人VDJ DNA侧翼的插入片段的5’和3’末端。在一个方面，通过将DNA片段插入前一个插入片段的5’末端而进行重复插入，就此可以在体内缺失分隔插入的人DNA序列的载体DNA，以提供连续的人DNA序列。
在一个方面，可以实现人VDJ DNA插入到基因组中，在基因组中不留下任何侧翼DNA，例如通过转座酶介导的DNA切除实现。一种合适的转座酶是Piggybac转座酶。
在一个方面，第一个人可变区片段经同源重组插入到初始盒骨架序列中，然后任何阴性选择标记和初始盒的DNA随后通过重组酶靶序列之间的重组而除去，例如用于本例中的FRT，FLPase表达。通常，重复靶向插入(例如BAC)骨架初始序列及随后通过重组酶靶序列之间的重排而除去被重复，以构建位于宿主非哺乳动物恒定区上游的完整人VDJ区。
在一个方面，选择标记或系统可以用于所述方法中。所述标记可以在DNA片段插入基因组中时产生，例如与已存在于基因组中的DNA元件结合形成选择标记。
在一个方面，细胞(例如ES细胞)基因组在上述过程中在同一时间不含2个相同的选择标记。可以看到插入和选择的重复过程可以用仅2个不同选择标记进行，如本文实施例所揭示，并且例如第三个选择标记可以与第一个标记相同，因为在将第三个载体片段插入时，第一个载体片段和第一个标记已被去除。
在一个方面，在任何多步骤克隆过程的下一步之前证实正确插入事件，例如证实BAC结构，用高密度基因组阵列筛选ES细胞以鉴别具有完整BAC插入的那些，测序及PCR验证。
初始盒(也称为“着陆垫(landing pad”)
本发明还涉及多核苷酸'着陆垫'序列，所述多核苷酸包含与靶基因组区域同源的核酸区域，以允许通过同源重组插入靶基因组，以及包含允许核酸经重组酶驱动插入着陆垫的核酸位点。本发明还涉及本发明的载体、细胞和哺乳动物，其包含插入细胞基因组中的本文揭示的着陆垫。
所述着陆垫任选包含非内源性S-mu，例如大鼠S-mu转换序列。
所述着陆垫任选包含(5’至3’方向)小鼠Eμ序列、非人非小鼠(例如大鼠)转换序列μ和至少一部分小鼠Cμ或完整小鼠Cμ。
大鼠转换序列任选包含或由SEQ ID NO 1组成。
所述着陆垫任选包含SEQ ID NO 6的5’同源臂。
所述着陆垫任选具有SEQ ID 2或SEQ ID NO 3的序列。
在一个实施方案中，所述着陆垫包含可表达标记。例如上述标记是荧光标记，例如GFP或其变体(例如YFP、CFP或RFP)。因此，使用标记而非选择标记(如赋予抗性以允许选择转化体的选择标记)。
在一个实施方案中，着陆垫包含5’和3’同源臂用于用同源重组插入细胞基因组中。同源臂可以是等基因DNA(例如当使用129衍生的ES细胞时，与129衍生的内源性序列相同)。因此，使用这些同源臂经同源重组不产生新序列。在另一个实施方案中，同源臂来自不同于内源性品系(ES细胞株)的小鼠品系。
本发明方法包括其中着陆垫序列包含本文揭示的任何构型或序列的方法。
本发明的另一个方法包括将着陆垫通过同源重组插入小鼠染色体中小鼠J1-4和小鼠C mu序列之间的步骤。
本发明的另一个方法包括将着陆垫通过同源重组插入小鼠染色体12中小鼠J1-4和小鼠E mu之间的步骤。
在一个方面，所述方法使用位点特异性重组将一或多个载体插入细胞如ES细胞基因组中。位点特异性重组酶系统是本领域公知的，并且可包括Cre-lox和FLP/FRT或其组合，其中重组发生在具有序列同源性的2个位点之间。
除了本文描述的任何特定Cre/Lox或FLP/FRT系统，额外或者另外地可以用于本发明的其它重组酶和位点包括Dre重组酶、rox位点和PhiC31重组酶。
合适的BAC可得自Sanger centre,参见"A genome-wide,end-sequenced129SvBAC library resource for targeting vector construction".Adams DJ,Quail MA,CoxT,van der Weyden L,Gorick BD,Su Q,Chan WI,Davies R,Bonfield JK,Law F,HumphrayS,Plumb B,Liu P,Rogers J,Bradley A.Genomics.2005 Dec；86(6):753-8.Epub 2005Oct 27.The Wellcome Trust Sanger Institute,Hinxton,Cambridgeshire CB10 1SA,UK。含有人DNA的BAC也可以得自例如InvitrogenTM。合适的文库如Osoegawa K et al,Genome Research 2001.11:483-496所述。
在一个方面，本发明方法特别包含：
(1)将第一个DNA片段插入非人ES细胞，所述片段含有人VDJ或VJ区DNA的第一部分和含有第一选择标记的第一载体部分；
(2)任选地，缺失第一载体部分的一部分；
(3)将第二个DNA片段插入含有第一个DNA片段的非人ES细胞中，插入发生在第一个载体部分之内，所述第二个DNA片段含有人VDJ或VJ区的第二部分和含有第二选择标记的第二载体部分；
(4)优选地通过重组酶作用，缺失所述第一选择标记和第一载体部分；
(5)将第三个DNA片段插入含有第二个DNA片段的非人ES细胞中，插入发生在第二个载体部分之内，所述第三个DNA片段含有人VDJ或VJ区的第三部分和含有第三选择标记的第三载体部分；
(6)缺失第二选择标记和第二载体部分；及
(7)按需要，对于人VDJ或VJ人区的第四个和进一步的片段重复插入和缺失步骤，以产生具有如本文揭示插入的部分或全部人VDJ或VJ区的ES细胞，并且合适地除去ES细胞基因组内的全部载体部分。
在另一方面，本发明包括：
(1)将形成初始盒的DNA插入细胞基因组中；
(2)将第一个DNA片段插入初始盒，所述第一个DNA片段包含人DNA的第一部分和含有第一选择标记或在插入时产生选择标记的第一载体部分；
(3)任选地，除去部分载体DNA；
(4)将第二个DNA片段插入第一个DNA片段的载体部分，所述第二个DNA片段含有人DNA的第二部分和第二载体部分，所述第二载体部分含有第二选择标记或者在插入时产生第二选择标记；
(5)任选地，除去任何载体DNA以允许第一个和第二个人DNA片段形成连续序列；及
(6)按需要重复人VDJ DNA插入和载体DNA除去步骤，以产生具有全部或部分人VDJ或VJ区的细胞，足以产生与宿主恒定区组合的嵌合抗体,
其中插入一或多个或全部DNA片段使用位点特异性重组。
在一个方面，非人哺乳动物能产生多样性为至少1X106不同的功能嵌合免疫球蛋白序列组合。
在一个方面，靶向是在衍生自小鼠C57BL/6N、C57BL/6J、129S5或129Sv品系的ES细胞中进行的。
在一个方面，非人动物如小鼠是在RAG-1缺陷或RAG-2缺陷背景或者防止成熟宿主B或T淋巴细胞产生的其它合适遗传背景中产生的。
在一个方面，非人哺乳动物是啮齿类，合适地是小鼠，本发明的细胞是啮齿类细胞或ES细胞，合适地是小鼠ES细胞。
本发明的ES细胞可以用于使用本领域熟知技术产生动物，其包括将ES细胞注射进胚泡中，随后将嵌合胚泡植入雌性以产生后代，后代可以被繁殖并选择具有所需插入的纯合重组体。在一个方面，本发明涉及包含ES细胞衍生的组织和宿主胚胎衍生的组织的嵌合动物。在一个方面，本发明涉及遗传改变的后续世代动物，其包括具有对于VDJ和/或VJ区是纯合重组体的动物。
在进一步的方面，本发明涉及产生特异于希望抗原的抗体的方法，所述方法包括用希望抗原免疫上述转基因非人哺乳动物，及回收抗体(参见例如Harlow,E.&Lane,D.1998,5th edition,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLab.Press,Plainview,NY；和Pasqualini and Arap,Proceedings of the NationalAcademy of Sciences(2004)101:257-259)。合适地，输送免疫原性量的抗原。本发明还涉及检测靶抗原的方法，包括用第二检测剂检测如上所述产生的抗体，所述第二检测剂识别该抗体的一部分。
在进一步的方面，本发明涉及产生完全人源化抗体的方法，包括用希望抗原免疫上述转基因非人哺乳动物，回收抗体或表达抗体的细胞，然后用人恒定区置换非人哺乳动物恒定区。这可以用标准克隆技术在DNA水平进行，以用合适人恒定区DNA序列置换非人哺乳动物恒定区，参见例如Sambrook,J and Russell,D.(2001,3’d edition)MolecularCloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Lab.Press,Plainview,NY)。
在进一步的方面，本发明涉及根据本发明产生的嵌合和完全人源化形式的人源化抗体及抗体链，及所述抗体在医药学中的应用。本发明还涉及包含这种抗体和药物学可接受载体或其它赋形剂的药物组合物。
含有人序列的抗体链如嵌合人-非人抗体链在本文中被认为是人源化的，因为存在人蛋白质编码区。完全人源化抗体可以从编码本发明嵌合抗体链的DNA出发用标准技术产生。
用于产生单克隆抗体和多克隆抗体的方法是本领域熟知的，本发明涉及在本发明非人哺乳动物中应答抗原攻击产生的嵌合或完全人源化抗体的多克隆和单克隆抗体。
在进一步的方面，本发明产生的嵌合抗体或抗体链可以合适地在DNA水平操作，以产生具有抗体样性质或结构的分子，如来自缺乏恒定区的重链或轻链的人可变区，例如结构域抗体；或者具有来自相同或不同物种的重链或轻链的任何恒定区的人可变区；或者具有非天然发生的恒定区的人可变区；或者与任何其它融合配偶体一起的人可变区。本发明涉及所有这种衍生自本发明定义的嵌合抗体的嵌合抗体衍生物。
在进一步的方面，本发明涉及本发明动物在分析药物和疫苗在拟人抗体库集(quasi-human antibody repertoire)中的可能作用中的用途。
本发明还涉及鉴别或验证药物或疫苗的方法，所述方法包括将疫苗或药物输送给本发明的哺乳动物，并监测下列之一或多种：免疫应答，安全性谱；对疾病的作用。
本发明还涉及试剂盒，其包含本文揭示的抗体或抗体衍生物以及这种抗体的使用指导或者合适的实验室试剂，如缓冲液、抗体检测试剂。
本发明还涉及制备抗体或其部分的方法，所述方法包括提供：
(i)编码根据本发明获得的抗体或其部分的核酸；或者
(ii)序列信息，从这些信息编码根据本发明获得的抗体或其部分的核酸可以被表达以允许产生抗体。
本发明还涉及嵌合抗体，其包含人可变区和非人脊椎动物或哺乳动物(任选地大鼠或小鼠)恒定区(任选地C gamma或C mu)，其中所述抗体由相应于细胞(任选地B细胞、ES细胞或杂交瘤)的嵌合重链基因座的核苷酸序列的核苷酸序列编码，所述基因座包含非人脊椎动物恒定区核苷酸序列和重排的VDJ核苷酸序列，所述重排的VDJ核苷酸序列由人V区、人D区和人J区的体内重排产生，所述V区选自V1-3区、V2-5区、V4-4区、V1-2区或V6-1区之一，任选地选自V1-3或V6-1区段。任选地，J区是JH1、JH2、JH3、JH4、JH5或JH6之任一，并且在一个方面是JH4或JH6。D区在一个方面是D3-9、D3-10、D6-13或D6-19之任一。在一个实例中，重排的VDJ核苷酸序列由人V1-3和JH4(任选地和D3-9、D3-10、D6-13或D-19)的体内重排产生；或者由V1-3和JH6(任选地和D3-9、D3-10、D6-13或D-19)的体内重排产生；或者由V6-1和JH4(任选地和D3-9、D3-10、D6-13或D-19)的体内重排产生；或者由V6-1和JH6(任选地和D3-9、D3-10、D6-13或D-19)的体内重排产生。在一个实例中，重排的VDJ核苷酸序列由人V6-1DH3-10、V1-3 DH3-10、V1-3 DH6-19、V1-3 Dh3-9或V6-1DH6-19的体内重排产生。在一个方面，抗体包含本文实施例和附图中示出的任何组合。任选地，体内重排是在细胞(例如B细胞或ES细胞)中进行，该细胞衍生自与恒定区序列相同的非人脊椎动物物种(例如小鼠B细胞或ES细胞)。本发明还涉及非人脊椎动物或哺乳动物细胞(例如B细胞或ES细胞或杂交瘤)，其基因组包含本段落中上述嵌合重链基因座。本发明还涉及非人脊椎动物或哺乳动物(例如小鼠或大鼠)，其基因组包含本段落中上述嵌合重链基因座。
本发明还涉及非人脊椎动物或哺乳动物，其具有编码嵌合抗体的基因组，所述嵌合抗体包含人可变区和非人脊椎动物或哺乳动物(任选地大鼠或小鼠)恒定区(任选地Cgamma或C mu)，所述哺乳动物：
表达V1-3抗体多于V2-5、V4-4、V1-2或V6-1抗体；和/或
表达V1-3 JH4或V1-3 JH6抗体多于V1-3 JH1、V1-3 JH2、V1-3 JH3或V1-3 JH5各抗体之任一；和/或
表达V6-1 JH4或V6-1 JH6抗体多于V6-1 JH1、V6-1 JH2、V6-1 JH3或V6-1 JH5各抗体之任一；和/或
表达V1-3 DH3-10抗体大大多于具有任何其它D区的抗体V1-3。抗体表达可以通过本领域技术人员容易获得的并且是本领域常规的方法评估。例如，表达可以如下述实施例所述在mRNA水平评估。
本发明还涉及包含人可变区和非人脊椎动物或哺乳动物(任选地大鼠或小鼠)恒定区(任选地轻链恒定区)的嵌合抗体，其中所述抗体可得自哺乳动物(任选地大鼠或小鼠)，所述哺乳动物基因组包含抗体链基因座，所述抗体链基因座包含种系人κV1-8和种系人κJ1序列，及其中所述抗体可通过在所述哺乳动物中V1-8和J1序列的体内重组而获得，并且其中所述抗体具有与种系人κV1-8和种系人κJ1序列编码的序列不同的可变区序列。因此，在本发明这个方面，人种系序列可以经历生产性重排(productive rearrangement)形成编码序列，所述编码序列与非人恒定区序列一起可以被表达为具有至少完整人可变区和非人恒定区的嵌合抗体链。这与不提供抗体编码序列(因为包括终止密码子)的种系人κV1-8和种系人κJ1序列本身的组合不同(如以下实施例所示)。在一个方面，嵌合抗体的重排的序列是体细胞高变的结果。在一个方面，所述抗体是κ抗体；在另一方面，所述抗体包含非人重链恒定区(例如大鼠或小鼠C gamma或C mu)。抗体序列任选包含X1X2 T F G Q，其中X1X2＝PR、RT或PW(SEQ ID No 21)；任选地包含X1X2 T F G Q G T K V E I K R A D A(SEQ IDNo 22)基序。如实施例所示，这种基序在种系序列中的等价位置未发现。本发明还涉及非人脊椎动物或哺乳动物细胞(例如B细胞或ES细胞或杂交瘤)，其基因组包含本段落上述嵌合抗体链基因座。本发明还涉及非人脊椎动物或哺乳动物(例如小鼠或大鼠)，其基因组包含本段落上述嵌合抗体链基因座。
本发明还涉及包含人可变区和非人脊椎动物或哺乳动物(任选地大鼠或小鼠)恒定区(任选地轻链恒定区)的嵌合抗体，其中所述抗体可得自哺乳动物(任选地大鼠或小鼠)，所述哺乳动物基因组包含抗体链基因座，所述抗体链基因座包含种系人κV1-6和种系人κJ1序列，及其中所述抗体可通过在所述哺乳动物中V1-6和J1序列的体内重组而获得，并且其中所述抗体具有与种系人κV1-6和种系人κJ1序列编码的序列不同的可变区序列。因此，在本发明这个方面，人种系序列可以经历生产性重排形成编码序列，所述编码序列与非人恒定区序列一起可以被表达为具有至少完整人可变区和非人恒定区的嵌合抗体链。这与不提供抗体编码序列(因为包括终止密码子)的种系人κV1-6和种系人κJ1序列本身的组合不同(如以下实施例所示)。在一个方面，嵌合抗体的重排的序列是体细胞高变的结果。在一个方面，所述抗体是κ抗体；在另一方面，所述抗体包含非人重链恒定区(例如大鼠或小鼠Cgamma或C mu)。抗体序列任选包含X3X4 T F G Q，其中X3X4＝PR或PW(SEQ ID No 23)；任选地包含X3X4 T F G Q G T K V E I K R A D A(SEQ ID No 24)基序。如实施例所示，这种基序在种系序列中的等价位置未发现。本发明还涉及非人脊椎动物或哺乳动物细胞(例如B细胞或ES细胞或杂交瘤)，其基因组包含本段落上述嵌合抗体链基因座。本发明还涉及非人脊椎动物或哺乳动物(例如小鼠或大鼠)，其基因组包含本段落上述嵌合抗体链基因座。
本发明还涉及包含人可变区和非人(任选地大鼠或小鼠)恒定区(任选地C gamma或C mu或C kappa)的嵌合抗体，其中所述抗体可得自哺乳动物(任选地大鼠或小鼠)，所述哺乳动物基因组包含抗体链基因座，所述抗体链基因座包含种系人κV1-5和种系人κJ1序列，及其中所述抗体可通过在所述哺乳动物中V1-5和J1序列的体内重组而获得。本发明还涉及非人脊椎动物或哺乳动物细胞(例如B细胞或ES细胞或杂交瘤)，其基因组包含本段落上述嵌合抗体链基因座。本发明还涉及非人脊椎动物或哺乳动物(例如小鼠或大鼠)，其基因组包含本段落上述嵌合抗体链基因座。
本发明还涉及包含人可变区和非人(任选地大鼠或小鼠)恒定区(任选地C gamma或C mu或C kappa)的嵌合抗体，其中所述抗体可得自哺乳动物(任选地大鼠或小鼠)，所述哺乳动物基因组包含抗体链基因座，所述抗体链基因座包含种系人κV1-5和种系人κJ4序列，及其中所述抗体可通过在所述哺乳动物中V1-5和J4序列的体内重组而获得。本发明还涉及非人脊椎动物或哺乳动物细胞(例如B细胞或ES细胞或杂交瘤)，其基因组包含本段落上述嵌合抗体链基因座。本发明还涉及非人脊椎动物或哺乳动物(例如小鼠或大鼠)，其基因组包含本段落上述嵌合抗体链基因座。
本发明的抗体可以是分离的，在一个方面，分离自它们在其中被表达的细胞或生物体。
一种非人哺乳动物，其基因组包含：
(a)位于宿主非人哺乳动物恒定区上游的人IgH VDJ区；及
(b)位于宿主非人哺乳动物κ恒定区上游的人Ig轻链κV和J区和/或位于宿主非人哺乳动物λ恒定区上游的人Ig轻链λV和J区；
其中所述非人哺乳动物能够产生具有非人哺乳动物恒定区和人可变区的嵌合抗体库集，
并且任选地，其中所述非人哺乳动物基因组被修饰以防止完全宿主物种特异性抗体的表达。
一种非人哺乳动物ES细胞，其基因组包含：
(a)位于非人哺乳动物恒定区上游的人IgH V、D和J区；及
(b)位于宿主非人哺乳动物κ恒定区上游的人Ig基因座轻链κV和J区和/或位于宿主非人哺乳动物λ恒定区上游的人Ig基因座轻链λV和J区，
其中所述ES细胞能发育成非人哺乳动物，所述非人哺乳动物能产生具有非人哺乳动物恒定区和人可变区的嵌合抗体库集。
产生转基因非人哺乳动物的方法，所述转基因非人哺乳动物能产生嵌合抗体库集，所述抗体具有非人哺乳动物恒定区和人可变区，所述方法包括通过同源重组在非人哺乳动物ES细胞基因组中插入
(a)位于宿主非人哺乳动物重链恒定区上游的人IgH VDJ区；及
(b)分别位于宿主非人哺乳动物λ或κ链恒定区上游的λ或κ链的人IgLVJ区，
由此，所述非人哺乳动物能产生具有非人哺乳动物恒定区和人可变区的嵌合抗体库集，其中步骤(a)和(b)可以以任何顺序进行，并且步骤(a)和(b)的每一个可以以逐步方式进行或者单步进行。
在一个方面，人VDJ或VJ区插入到宿主非人哺乳动物恒定区上游是通过同源重组以逐步方式插入多个片段而实现的。
在一个方面，逐步方式插入在其中初始盒已被插入ES细胞基因组中的位点开始，其提供了由BAC骨架序列和阴性选择标记组成的独特靶向区域。
在一个方面，第一个人可变区片段经同源重组插入初始盒BAC骨架序列中，所述阴性选择标记和初始盒随后通过重组酶靶序列之间的重组而除去。
在一个方面，在BAC骨架初始序列的重复靶向插入及后续的通过重组酶靶序列之间的重排而除去骨架被重复进行，以构建位于宿主非哺乳动物恒定区上游的完整人VDJ区。
人可变区基因区段的插入精确位于内源性小鼠JH4-Cmu内含子中。
本发明进一步提供了细胞或非人哺乳动物，其中所述哺乳动物是小鼠或者细胞是小鼠细胞，及其中人重链DNA的插入是在小鼠基因组中小鼠染色体12的坐标114,667,091和114,665,190之间进行。
本发明进一步提供了细胞或非人哺乳动物，其中人重链DNA的插入是在坐标114,667,091。
本发明进一步提供了细胞或非人哺乳动物，其中人IgH VDJ区包含来自人染色体14的核苷酸105,400,051至106,368,585(坐标参考人基因组的NCBI36)。
本发明进一步提供了方法、细胞或非人哺乳动物，其中人编码区DNA序列与非人哺乳动物控制区呈功能排列，由此人DNA的转录由非人哺乳动物控制序列控制。在一个实例中，初始盒插入小鼠J4和C alpha外显子之间。进一步提供了用于所述方法中的初始盒，其包含载体骨架序列和选择标记。
本发明提供了下述方面(从方面编号103开始)：
103.根据上述任一构型、实例、实施方案或方面的细胞或非人哺乳动物，其中所述哺乳动物是小鼠或者细胞是小鼠细胞，及其中人重链DNA的插入是在小鼠基因组中小鼠染色体12的坐标114,667,091和114,665,190之间。
104.根据上述任一构型、实例、实施方案或方面的细胞或非人哺乳动物，其中人重链DNA的插入是在坐标114,667,091。
105.根据上述任一构型、实例、实施方案或方面的细胞或哺乳动物，其中人IgHVDJ区包含来自人染色体14的核苷酸105,400,051至106,368,585(坐标参考人基因组的NCBI36)。
106.根据上述任一构型、实例、实施方案或方面的方法、细胞或哺乳动物，其中人编码区DNA序列与非人哺乳动物控制序列呈功能排列，由此人DNA的转录由非人哺乳动物控制序列控制。
107.方面106的方法，其中初始盒插入小鼠J4和C alpha外显子之间。
108.适用于方面107的方法中的初始盒，其包含载体骨架序列和选择标记。
内源性抗体链表达通过插入人抗体可变区基因区段而失活
109.非人脊椎动物(任选地小鼠或大鼠)或非人脊椎动物细胞(任选地小鼠或大鼠细胞)，其基因组
(i)包含转基因抗体链基因座，其能表达包含人可变区的抗体链(任选在抗体基因重排后)；及
(ii)内源性非人脊椎动物抗体链表达被失活；
其中转基因基因座包含
(iii)DNA序列，所述DNA序列包含插入在内源性抗体可变区基因区段和内源性抗体恒定区之间的多个人抗体可变区基因区段，由此内源性抗体链表达被失活。
转基因基因座是重链或轻链基因座。
在非人脊椎动物如小鼠和大鼠中的内源性重链表达失活涉及缺失全部或部分内源性重链VDJ区(包括基因区段之间的序列)。ADAM6基因存在于内源性小鼠VDJ区中。在小鼠中，有两个拷贝的ADAM6(ADAM6a,ADAM6b)位于染色体12的IgH基因座中的VH和D基因区段之间(在小鼠VH5-1和D1-1基因区段之间的间插区中)。这两个相邻的无内含子ADAM6基因具有95％核苷酸序列相同性和90％氨基酸相同性。在人和大鼠中，仅有一个ADAM6基因。小鼠ADAM6表达模式分析示出其仅在睾丸中表达[1]。尽管ADAM6转录物可以在淋巴细胞中检测到，但是其限于核，提示ADAM6基因的转录特别是由于从D区的转录通读而非主动信使RNA产生[2]。在大鼠中，ADAM6是在染色体6上。
成熟ADAM6蛋白位于精子头部的顶体和后部区域。显著地，ADAM6与ADAM2和ADAM3形成复合物，是小鼠受精所需的[3]。参考文献[4]暗示ADAM6在其中ADAM6被TPST2硫酸化之后这个蛋白质与ADAM3相互作用的模型中，ADAM6的硫酸化对于稳定性和/或涉及ADAM6和ADAM3的复合物形成是关键的，因此ADAM6和ADAM3从无Tpst2的精子中丧失。这个研究观测到Tpst2缺陷的小鼠具有雄性不育，精子活动性缺陷及精子-卵膜相互作用中的可能异常。
因此，在精子中ADAM6表达的维持对于生育力是关键的。因此，据信其中ADAM6基因已被缺失的转基因雄性小鼠和大鼠不是能生育的。这妨碍了群体的繁殖并且妨碍了这种小鼠作为转基因抗体产生平台的用途。希望的是提供改良的能生育的产生非人转基因抗体的脊椎动物。
[1].Choi I,et.al.,Characterization and comparative genomic analysisof intronless Adams with testicular gene expression.Genomics.2004Apr；83(4):636-46.
[2].Featherstone K,Wood AL,Bowen AJ,Corcoran AE.The mouseimmunoglobulin heavy chain V-D intergenic sequence contains insulators thatmay regulate ordered V(D)J recombination.J Biol Chem.2010 Mar 26；285(13):9327-38.Epub 2010 Jan 25.
[3].Han C,et.al.,Comprehensive analysis of reproductive ADAMs:relationship of ADAM4 and ADAM6 with an ADAM complex required forfertilization in mice.Biol Reprod.2009 May；80(5):1001-8.Epub 2009 Jan 7.
[4].Marcello et al,Lack of tyrosylprotein sulfotransferase-2 activityresults in altered sperm-egg interactions and loss of ADAM3 and ADAM6 inepididymal sperm,J Biol Chem.2011 Apr 15；286(15):13060-70.Epub 2011Feb 21.
根据本发明的方面109，失活不涉及VDJ区或其包括ADAM6的部分的缺失，而是通过插入而失活使得保留内源性ADAM6，因此没有不育问题风险。
得自所述方法的最终小鼠(或者衍生自由所述方法产生的细胞的小鼠)在一个实施方案中是雄性的，由此本发明改良了由于基因组操作而不育的现有技术雄性转基因小鼠。可育小鼠产生精子，所述精子可以受精来自雌性小鼠的卵。生育力可以例如通过成功繁殖产生胚胎或幼鼠而容易地确定。在另一个实施方案中，本发明方法产生最终雌性小鼠。这种雌性小鼠当然可用于繁殖产生携带ADAM6并且可育的雄性后代。
在方面109的一个实施方案中，基因组对于转基因基因座是纯合的。例如，基因组对于内源性ADAM6基因是纯合的。
在方面109的一个实施方案中，基因组的内源性重链和κ(及任选地还有λ)链的表达被失活。
在一个实施方案中，在方面109的部分(iii)中，所述DNA包含人VH、D和JH基因区段或者人VL和JL基因区段(例如Vκ和Jκ基因区段)。在一个实例中，所述DNA包含具有选择标记的着陆垫和/或启动子，所述选择标记例如HPRT基因、新霉素抗性基因或者嘌呤霉素抗性基因。
在一个实施方案中，在方面109的部分(iii)中，内源性基因区段是重链基因座的完整内源性VDJ区，和/或内源性恒定区是Cmu或Cgamma。
在一个实施方案中，在方面109的部分(iii)中，内源性基因区段是κ链基因座的完整内源性VJ区，和/或内源性恒定区是Cκ。
在一个实施方案中，在方面109的部分(iii)中，内源性基因区段是λ链基因座的完整内源性VJ区，和/或内源性恒定区是Cλ。
非人脊椎动物细胞可以是杂交瘤、B细胞、ES细胞或IPS细胞。当细胞是ES细胞或IPS细胞时，内源性抗体链表达在细胞分化成后代B细胞后被失活(例如在非人脊椎动物的B细胞中)。
本发明还提供了：-
110.根据方面109的脊椎动物或细胞，其中所述多个人抗体基因区段包含至少11个人V区段和/或至少6个人J区段，例如至少11个人VH基因区段和至少6个人JH区段及任选地还有至少27个人D区段；任选地具有人基因区段间间插序列。在一个实施方案中，人抗体基因区段通过人染色体14的一段DNA序列提供，包含种系构型的基因区段和间插序列。
111.根据方面109或110的脊椎动物或细胞，其中所述插入的DNA序列包含人核苷酸序列，所述人核苷酸序列包含所述抗体基因区段，其中所述核苷酸序列是至少110、130、150、170、190、210、230、250、270或290kb。在一个实施方案中，所述核苷酸序列相应于人染色体14的一段DNA序列，包含种系构型的基因区段和间插序列，例如至少相应于人染色体14的坐标106328951至坐标106601551的核苷酸序列的序列，例如在GRCH37/hg19序列数据库中的序列。
112.根据方面109的脊椎动物或细胞，其中所述转基因基因座是轻链κ基因座以及所述人抗体基因区段是在最3’(3’-most)内源性Jk基因区段和内源性Ck之间；任选地，其中人抗体基因区段包含5个功能性人Jλ-Cλ簇和至少一个人Vλ基因区段，例如至少相应于在人染色体22上发现的λ基因座的坐标23217291至23327884的核苷酸序列的序列。
113.根据方面109-112任一项的脊椎动物或细胞，其中所述转基因基因座是重链基因座以及所述人抗体基因区段在最3’内源性JH基因区段(例如在小鼠基因组中的JH4)和内源性Cmu之间。
114.根据方面109-113任一项的脊椎动物或细胞，其中所述基因组对于所述转基因基因座是纯合的。
115.根据方面109-114任一项的小鼠或小鼠细胞或者大鼠或大鼠细胞。
116.制备非人脊椎动物细胞(任选地小鼠或大鼠细胞)的方法，所述方法包括：
(a)提供非人ES细胞，其基因组包含内源性抗体链基因座，所述内源性抗体链基因座包含内源性抗体可变区基因区段和内源性抗体恒定区；及
(b)通过将包含多个人抗体可变区基因区段的DNA序列插入所述内源性基因座的所述内源性抗体可变区基因区段与所述内源性恒定区之间而制备转基因抗体链基因座，由此所述人抗体可变区基因区段可操纵连接所述内源性恒定区上游，
其中非人脊椎动物ES细胞被产生，其能产生后代细胞，其中内源性抗体表达被失活并且其中所述后代能表达包含人可变区的抗体；及
(c)任选地，将所述ES细胞分化成所述后代细胞或者包含所述后代细胞的非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)。
117.根据方面116的方法，其中所述多个人抗体基因区段包含至少11个人V区段。
118.根据方面116或117的方法，其中所述多个人抗体基因区段包含至少6个人J区段。
119.根据方面116、117或118的方法，其中人核苷酸序列在步骤(b)中被插入，所述核苷酸序列包含所述抗体基因区段，其中所述核苷酸序列是至少110kb。
120.根据方面110-113任一项的方法，其中所述内源性基因座是重链基因座以及所述人抗体基因区段是在最3’内源性JH基因区段和内源性Cmu之间。
121.根据方面116-120任一项的方法，其中后代细胞对于所述转基因基因座是纯合的。
在方面116的方法的一个实施方案中，所述方法包括失活基因组的内源性重链和κ(及任选地还有λ)链的表达。
在方面116的方法的一个实施方案中，在部分(b)中，所述DNA序列包含人VH、D和JH基因区段或者人VL和JL基因区段(例如Vκ和Jκ基因区段)。在一个实例中，所述DNA包含具有选择标记的着陆垫和/或启动子，所述选择标记例如HPRT基因、新霉素抗性基因或者嘌呤霉素抗性基因。
在一个实施方案中，在方面116的部分(b)中，内源性基因区段是重链基因座的完整内源性VDJ区，和/或内源性恒定区是Cmu或Cgamma。
在一个实施方案中，在方面116的部分(b)中，内源性基因区段是κ链基因座的完整内源性VJ区，和/或内源性恒定区是Cκ。
在一个实施方案中，在方面116的部分(b)中，内源性基因区段是λ链基因座的完整内源性VJ区，和/或内源性恒定区是Cλ。
非人脊椎动物细胞可以是杂交瘤、B细胞、ES细胞或IPS细胞。当细胞是ES细胞或IPS细胞时，内源性抗体链表达在细胞分化成后代B细胞后被失活(例如在非人脊椎动物的B细胞中)。
本发明进一步提供了：
根据方面116的方法，其中所述插入的DNA序列包含人核苷酸序列，所述人核苷酸序列包含所述人抗体基因区段，其中所述核苷酸序列是至少110、130、150、170、190、210、230、250、270或290kb。在一个实施方案中，所述核苷酸序列相应于人染色体14的一段DNA序列，包含种系构型的基因区段和间插序列，例如至少相应于人染色体14的坐标106328951至坐标106601551的核苷酸序列的序列，例如在GRCH37/hg19序列数据库中的序列。
根据方面116的方法，其中所述转基因基因座是轻链κ基因座以及所述人抗体基因区段是在最3’内源性Jk基因区段和内源性Ck之间；任选地，其中人抗体基因区段包含5个功能性人Jλ-Cλ簇和至少一个人Vλ基因区段，例如至少相应于在人染色体22上发现的λ基因座的坐标23217291至23327884的核苷酸序列的序列。
根据方面116的方法，其中所述转基因基因座是重链基因座以及所述人抗体基因区段插入在最3’内源性JH基因区段(例如在小鼠基因组中的JH4)和内源性Cmu之间。
122.根据方面116-121任一项的方法，其包括制备对于所述转基因基因座是纯合的后代的基因组。
从本发明的转基因非人脊椎动物分离抗体&治疗相关亲和性的有用的抗原特异性抗体
123.分离结合预定抗原的抗体的方法，所述方法包括：
(a)提供根据上述任一项构型、实例、实施方案或方面的脊椎动物(任选地哺乳动物；任选地小鼠或大鼠)；
(b)用所述抗原免疫所述脊椎动物(任选地，其中所述抗原是感染性疾病病原体的抗原)；
(c)从所述脊椎动物取B淋巴细胞，选择表达结合所述抗原的抗体的一或多个B淋巴细胞；
(d)任选地，永生化所述选择的B淋巴细胞或其后代，任选地通过从其产生杂交瘤而进行永生化；及
(e)分离由B细胞表达的抗体(例如IgG类型抗体)。
124.方面123的方法，包括从所述B淋巴细胞分离编码结合所述抗原的所述抗体的核酸的步骤；任选地用编码人或人源化重链恒定区的核苷酸序列交换所述抗体的重链恒定区核苷酸序列，及任选地亲和性成熟所述抗体的可变区；及任选地将所述核酸插入表达载体和任选地插入宿主。
125.方面123或124的方法，进一步包括制备由方面122或123的方法产生的抗体的突变体或衍生物。
如以下实施例证实，本发明的非人脊椎动物能够产生50nM以下(sub-50nM)亲和性的抗原特异性抗体，其CDR3区具有人序列。因此，本发明进一步提供了：
126.抗体或其片段(例如Fab或Fab2)，包含以由表面等离子共振测定的50nM以下亲和性(任选地40、30、20、10、1、0.1或0.01nM以下)特异性结合预定抗原的可变区，其中所述抗体从根据上述任一项构型、实例、实施方案或方面的非人脊椎动物(任选地哺乳动物；任选地小鼠或大鼠)分离并且包含由所述脊椎动物的重排的VDJ编码的重链CDR3(如Kabat定义)，其中所述VDJ是所述脊椎动物的重链基因座的人JH基因区段与D(任选地所述基因座的人D基因区段)和VH基因区段的体内重排的产物。
在一个实施方案中，表面等离子共振(SPR)在25℃进行。在另一个实施方案中，SPR在37℃进行。
在一个实施方案中，SPR在生理pH进行，如大约pH7或pH7.6(例如使用Hepes缓冲的盐水pH7.6(也称为HBS-EP))。
在一个实施方案中，SPR在生理盐水平进行，例如150mM NaCl。
在一个实施方案中，SPR在不超过0.05％(体积)的去污剂水平进行，例如在0.05％P20(聚山梨醇酯20；例如,Tween-20TM)和3mM EDTA存在下。
在一个实施方案中，SPR在25℃或37℃在缓冲液pH7.6,150mM NaCl,0.05％去污剂(例如P20)和3mM EDTA中进行。缓冲液可以含有10mM Hepes。在一个实例中，SPR在25℃或37℃在HBS-EP中进行。HBS-EP可得自Teknova Inc(California；目录号H8022)。
在一个实例中，抗体亲和性用SPR如下确定
1.将抗小鼠(或其它相关非人脊椎动物)IgG(例如Biacore BR-1008-38)偶联于生物传感器芯片(例如GLM芯片)，如通过伯胺偶联；
2.将抗小鼠IgG(非人脊椎动物抗体)暴露于测试IgG抗体以捕获芯片上的测试抗体；
3.以1024nM、256nM、64nM、16nM、4nM、0nM(即仅缓冲液)将测试抗原通过芯片的捕获表面；及
4.用表面等离子共振例如在上述讨论的SPR条件下(例如在25℃在生理缓冲液中)确定测试抗体与测试抗原的结合亲和性。SPR可以用任何标准SPR装置进行，例如用BiacoreTM或使用ProteOn XPR36TM()。
捕获表面的再生可以用10mM甘氨酸pH1.7进行。这除去捕获抗体并使得表面被用于另一个相互作用。结合数据可以使用标准技术例如使用ProteOn XPR36TM分析软件的固有模型拟合至1:1固有模型。
本发明还涉及scFV、双抗体或其它抗体片段，其包含来自方面126的抗体或片段的VH和VL结构域(任选地在亲和性成熟之后，例如噬菌体展示)
在一个实施方案中，抗原是丝氨酸蛋白酶抑制蛋白，例如卵白蛋白、抗凝血酶或抗胰蛋白酶。丝氨酸蛋白酶抑制蛋白是一组具有相似结构的蛋白质，其最初被鉴别为能抑制蛋白酶的蛋白质集合。丝氨酸蛋白酶抑制蛋白最初被定名是因为许多丝氨酸蛋白酶抑制蛋白抑制糜蛋白酶样丝氨酸蛋白酶(丝氨酸蛋白酶抑制剂)。丝氨酸蛋白酶抑制蛋白超家族最先被深入研究的成员是人血浆蛋白质抗凝血酶和抗胰蛋白酶，它们分别在控制凝血和炎症中起关键作用。最初，研究集中于它们在人类疾病中的作用：抗凝血酶缺陷导致血栓，抗胰蛋白酶缺陷导致肺气肿。在1980年Hunt和Dayhoff做出了令人惊奇的发现，这些分子与鸡蛋清中的主要蛋白卵白蛋白有显著氨基酸序列相似性，他们建议了新的蛋白质超家族。
127.与方面126的抗体或其衍生物(任选地其恒定区是人的衍生物和/或亲和性成熟的衍生物)相同的抗体或片段，其以由表面等离子共振测定的50nM以下的亲和性特异性结合所述抗原。
128.药物组合物，其包含方面126或127的抗体或片段以及药物学可接受的稀释剂、赋形剂或载体。
129.编码方面126或127的抗体或片段的重链可变区的核苷酸序列，任选地作为载体(例如表达载体)的一部分。
130.方面129的核苷酸序列，其中所述序列是衍生自分离出方面126的抗体的脊椎动物的B细胞的cDNA，或者与这种cDNA相同。
131.分离的宿主细胞(例如杂交瘤或CHO细胞或HEK293细胞)，其包含方面129或130的核苷酸序列。
132.分离结合预定抗原的抗体的方法，所述方法包括：
(a)提供根据上述任一项构型、实例、实施方案或方面的脊椎动物(任选地哺乳动物；任选地小鼠或大鼠)
(b)用所述抗原免疫所述脊椎动物；
(c)从所述脊椎动物取B淋巴细胞，选择表达以nM以下(sub-nM)亲和性结合所述抗原的抗体的B淋巴细胞，其中所述抗体是根据方面126的抗体；
(d)任选地，永生化所述选择的B淋巴细胞或其后代，任选地通过从其产生杂交瘤而永生化；及
(e)分离由所述B淋巴细胞表达的抗体(例如IgG型抗体)。
133.方面132的方法，包括从所述B淋巴细胞分离编码结合所述抗原的所述抗体的核酸的步骤；任选地，用编码人或人源化重链恒定区的核苷酸序列交换所述抗体的重链恒定区核苷酸序列，及任选地亲和性成熟所述抗体的可变区；及任选地将所述核酸插入表达载体和任选地插入宿主。
134.方面132或133的方法，进一步包括制备由方面132或133的方法产生的抗体的突变体或衍生物。
通过内源性VDJ倒位至基因组荒漠区而失活
135.小鼠或小鼠细胞，其包含在内源性小鼠染色体12上位置119753123、119659458或120918606的立即3’的倒位的内源性重链基因区段(例如VH、D和JH，如完整内源性重链VDJ区)，其中所述小鼠包含转基因重链基因座，所述基因座包含可操纵连接在内源性恒定区(例如C mu)多个人VH基因区段、多个人D区段及多个人JH区段，由此所述小鼠或细胞(任选地在分化成B细胞后)能表达包含可变区的抗体，所述可变区包含衍生自所述人基因区段的序列。
136.方面135的小鼠或细胞，其中所述小鼠或细胞的基因组对于所述染色体12是纯合的。
137.用于内源性非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)抗体链基因区段的倒位和失活的盒，所述区段是非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)细胞(例如ES细胞)的染色体上的抗体链基因座序列的一部分，其中所述序列在其3’末端的侧翼为位点特异性重组位点(例如lox、rox或frt)，所述盒包含编码可表达标记或选择标记的核苷酸序列和相容的位点特异性重组位点(例如lox、rox或frt)，侧翼为5’和3’同源臂，其中所述同源臂相应于或同源于细胞基因组中不同染色体上或所述染色体上距离所述内源性基因区段至少10mb的相邻序列段。
138.用于内源性小鼠抗体重链基因区段的倒位和失活的盒，所述区段是小鼠细胞(例如ES细胞)的染色体12上的重链基因座序列的一部分，其中所述序列在其3’末端的侧翼是位点特异性重组位点(例如lox、rox或frt)，所述盒包含编码可表达标记或选择标记的核苷酸序列和相容的位点特异性重组位点(例如lox、rox或frt)，侧翼为5’和3’同源臂，其中(i)5’同源臂是从坐标119753124至坐标119757104的小鼠染色体12DNA，3’同源臂是从坐标119749288至坐标119753123的小鼠染色体12DNA；(ii)5’同源臂是从坐标119659459至坐标119663126的小鼠染色体12DNA，3’同源臂是从坐标119656536至坐标119659458的小鼠染色体12DNA；或者(iii)5’同源臂是从坐标120918607至坐标120921930的小鼠染色体12DNA，3’同源臂是从坐标120915475至坐标120918606的小鼠染色体12DNA。
139.失活内源性抗体基因座的基因区段的方法，所述方法包括
(i)提供非人脊椎动物细胞(例如ES细胞，例如小鼠ES细胞)，其基因组包含抗体链基因座，所述基因座包含内源性可变区基因区段；
(ii)将位点特异性重组位点靶向于所述内源性基因区段的最3’-(3’-most)的3’侧翼；
(iii)将第二个位点特异性重组位点靶向于距所述内源性基因区段至少10mb，所述第二个位点与第一个位点相容并且相对于第一个位点是倒位的；
(iv)表达与所述位点相容的重组酶以实现所述位点之间的位点特异性重组，由此倒位并移动所述基因区段离开所述基因座，其中所述内源性基因区段被失活；及
(v)任选地，使细胞发育为后代细胞或脊椎动物(例如小鼠或大鼠)，其基因组对于所述倒位是纯合的。
140.小鼠或小鼠细胞，其基因组包含染色体12的倒位，其中所述倒位包含倒位的内源性重链基因区段(例如VH、D和JH，如完整内源性重链VDJ区)；其中所述小鼠包含转基因重链基因座，所述基因座包含可操纵连接在内源性恒定区(例如C mu)上游的多个人VH基因区段、多个人D区段及多个人JH区段，由此小鼠或细胞(任选地分化成B细胞后)能表达包含可变区的抗体，所述可变区包含衍生自人基因区段的序列；及其中所述倒位是(i)小鼠染色体12从坐标119753123至坐标114666436的倒位；(ii)小鼠染色体12从坐标119659458至坐标114666436的倒位；或者(iii)小鼠染色体12从坐标12091806至坐标114666436的倒位。
其它方面包括：
产生特异于希望抗原的抗体的方法，所述方法包括用希望抗原免疫本文所述非人哺乳动物，及回收抗体或产生抗体的细胞。
产生完全人源化抗体的方法，包括免疫本文所述非人哺乳动物，然后用人恒定区置换与抗原特异性反应的抗体的非人哺乳动物恒定区，合适地通过编码抗体的核酸的工程化进行。
如本文所述的方法、细胞或哺乳动物，其中人编码区DNA序列与非人哺乳动物控制序列功能性排列，由此DNA的转录由非人哺乳动物控制序列控制。在一个方面，人编码区V、D或J区与小鼠启动子序列功能性排列。
本发明还涉及根据本文所述任何方法产生的人源化抗体及如此产生的人源化抗体在医药学中的应用。
内源性轻链失活&人λ可变区在转基因非人脊椎动物和细胞中的高表达
如以下实施例进一步解释，本发明人惊奇地观察到来自转基因轻链基因座的包含人λ可变区(至少70％或80％人Vλ)的轻链的非常高的表达水平，所述基因座通过将人λ基因区段靶向插入内源性非人脊椎动物轻链基因座而产生。甚至在脊椎动物基因组中存在内源性非人脊椎动物V和J基因区段时这也是可能的。另外，当人λ基因区段插入内源性κ或λ基因座时实现令人惊奇的高表达水平。这种通过靶向插入导致的高水平迄今在本领域中未公开。
本发明人还惊奇地观测到内源性κ链表达可以通过人λ基因序列靶向插入到内源性κ基因座中而完全失活，如实施例中进一步解释。
人基因区段靶向插入到内源性Ig基因座中是有利的，因为其使得插入的人Ig序列相对于内源性Ig恒定区和内源性控制区如增强子和其它基因座控制区是可操纵的位置。因此，靶向插入使得可以利用在Ig基因区段重组、等位基因排除、亲和性成熟、类别转换、Ig表达水平和B细胞区室的希望发育之一或多项中重要的内源性控制。因此，靶向插入优于现有技术中产生转基因Ig基因座和表达的早期尝试，所述尝试依赖于将载体如携带人Ig基因区段的YAC导入非人脊椎动物细胞。YAC随机整合进脊椎动物细胞基因组中，由此很难实现由靶向插入提供的控制及在利用内源性控制机制方面带来的伴随益处。另外，随机插入通常导致插入的人Ig基因区段在异源控制元件的控制下和/或外遗传染色体修饰如甲基化和染色质确认(chromatin confirmation)，这两者对于正确Ig基因区段重组、等位基因排除、亲和性成熟、类别转换、Ig表达水平和B细胞区室的希望发育都是有害的。随机插入典型产生导入的转基因的2个或更多个拷贝，其可以导致染色体不稳定，因此在对正确Ig基因区段重组、等位基因排除、亲和性成熟、类别转换、Ig表达水平和B细胞区室的希望发育的有害作用之外，还导致动物繁殖性能不良。因此现有技术中使用随机插入的尝试易于导致不良的B细胞发育，相对较小的B细胞区室和差的Ig表达，并且伴随分离具有希望特征的抗体有困难。
本发明进一步提供了如下方面：
人λ可变区的表达
1.非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)，其基因组包含由人Ig基因区段靶向插入一或多个内源性Ig基因座产生的Ig基因区段库集，所述基因组包含位于恒定区上游的人Vλ和Jλ基因区段，其中所述人Vλ和Jλ基因区段通过插入脊椎动物的内源性轻链基因座而被提供，其中所述脊椎动物表达包含λ可变区的免疫球蛋白轻链(λ轻链)，其中所述λ轻链包含免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链包含衍生自人Vλ和Jλ基因区段重组的λ可变区。
非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)，其基因组包含由人Ig基因区段靶向插入一或多个内源性Ig基因座产生的Ig基因区段库集，所述基因组包含位于恒定区上游的人Vλ和Jλ基因区段，其中所述人Vλ和Jλ基因区段通过插入脊椎动物的内源性轻链基因座而被提供，其中所述脊椎动物表达包含λ可变区的免疫球蛋白轻链(λ轻链)，并且其中由所述脊椎动物表达的至少70或80％的λ轻链可变区衍生自人Vλ和Jλ基因区段的重组。这在以下实施例中证实。
例如，由所述脊椎动物表达的至少70、75、80、84、85、90、95、96、97、98或99％或100％的λ轻链可变区衍生自人Vλ和Jλ基因区段的重组。这在以下实施例中证实。
在实施方案中，提供了：
非人脊椎动物ES细胞(例如小鼠ES细胞或大鼠ES细胞)，其基因组包含由人Ig基因区段靶向插入一或多个内源性Ig基因座产生的Ig基因区段库集，所述基因组包含位于恒定区上游的人Vλ和Jλ基因区段，其中所述人Vλ和Jλ基因区段通过插入脊椎动物细胞的内源性轻链基因座而被提供，其中所述细胞可以发育成表达包含λ可变区的免疫球蛋白轻链(λ轻链)的脊椎动物，其中所述λ轻链包含免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链包含衍生自人Vλ和Jλ基因区段的重组的λ可变区。
非人脊椎动物ES细胞(例如小鼠ES细胞或大鼠ES细胞)，其基因组包含由人Ig基因区段靶向插入一或多个内源性Ig基因座产生的Ig基因区段库集，所述基因组包含位于恒定区上游的人Vλ和Jλ基因区段，其中所述人Vλ和Jλ基因区段通过插入脊椎动物细胞的内源性轻链基因座而被提供，其中所述细胞可以发育成表达包含λ可变区的免疫球蛋白轻链(λ轻链)的脊椎动物，并且其中由所述脊椎动物表达的至少70或80％(例如至少70、75、80、84、85、90、95、96、97、98或99％或100％)的λ轻链可变区衍生自人Vλ和Jλ基因区段的重组。
在一个实例中，令人惊奇地，甚至当基因组包含内源性非人脊椎动物λ可变区基因区段(例如内源性Vλ和/或Jλ基因区段，任选地完整内源性Vλ和Jλ基因区段库集)时，也实现包含衍生自人Vλ和Jλ基因区段的重组的λ可变区的免疫球蛋白轻链的表达。因此，在一个实例中，所述基因组包含内源性非人脊椎动物λ可变区基因区段(例如内源性Vλ和/或Jλ基因区段，任选地完整内源性Vλ和Jλ基因区段库集)。在另一个实例中，这种内源性基因区段不存在于基因组中。
2.方面1的脊椎动物或细胞，任选地其中人Vλ和Jλ插入至少包含功能性人V和J基因区段(任选地还有人Cλ)，其包含在人λ链Ig基因座从Vλ2-18至Cλ7中。在一个实例中，所述插入还包含λ基因间区段序列。这些是人序列或者它们可以是非人脊椎动物物种的序列(例如，当脊椎动物是小鼠时，可以使用相应的小鼠λ基因区段之间的序列)。
3.方面1或2的脊椎动物或细胞，任选地其中所述基因组对于人Vλ和Jλ基因区段插入是纯合的，及所述脊椎动物中的内源性κ链表达基本上或完全失活。在一个实例中，小于10、5、4、3、2、1或0.5％的轻链由内源性κ链(即，其可变区衍生自非人脊椎动物V和J基因区段的重组的κ链)提供。
4.前述任一方面的脊椎动物或细胞，任选地其中内源性基因座是内源性κ基因座。
5.前述任一方面的脊椎动物或细胞，任选地其中内源性基因座是内源性λ基因座。
≥60％的全部轻链具有人λV区
6.非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)，其基因组包含由人Ig基因区段靶向插入一或多个内源性Ig基因座产生的Ig基因区段库集，所述基因组包含(i)位于恒定区上游的人Vλ和Jλ基因区段，其中所述人Vλ和Jλ基因区段通过插入脊椎动物的内源性轻链基因座而被提供，及(ii)位于恒定区上游的κV基因区段，其中所述脊椎动物表达包含人λ可变区的免疫球蛋白轻链(人λ轻链)，并且其中由所述脊椎动物表达的至少60％的轻链由所述人λ轻链提供。这在以下实施例中证实。
例如，由所述脊椎动物表达的至少65、70、80、84、85、90、95、96、97、98或99％或100％的轻链由所述人λ轻链提供。例如，由所述脊椎动物表达的至少84％的轻链由所述人λ轻链提供。例如，由所述脊椎动物表达的至少95％的轻链由所述人λ轻链提供。这在以下实施例中证实。
在一个实施方案中，提供了非人脊椎动物ES细胞(例如小鼠ES细胞或大鼠ES细胞)，其基因组包含由人Ig基因区段靶向插入一或多个内源性Ig基因座产生的Ig基因区段库集，所述基因组包含(i)位于恒定区上游的人Vλ和Jλ基因区段，其中所述人Vλ和Jλ基因区段通过插入脊椎动物的内源性轻链基因座而被提供，及(ii)位于恒定区上游的κV基因区段，其中所述细胞可以发育成表达包含人λ可变区的免疫球蛋白轻链(人λ轻链)的脊椎动物，并且其中由所述脊椎动物表达的至少60％的轻链由所述人λ轻链提供。
7.非人脊椎动物或非人脊椎动物细胞(例如小鼠、大鼠、小鼠细胞或大鼠细胞)，其基因组包含由人Ig基因区段靶向插入一或多个内源性Ig基因座产生的Ig基因区段库集，所述基因组包含靶向插入到内源性非人脊椎动物κ或λ链基因座中内源性VL和JL基因区段下游的人免疫球蛋白Vλ和Jλ基因区段，用于表达包含人λ可变区的轻链；其中所述人Vλ和Jλ插入至少包含功能性人V和J(及任选地还有功能性人Cλ)基因区段，其包含在人λ链Ig基因座从Vλ2-18至Cλ7中。
如实施例中证实，来自所述基因座的内源性轻链表达被失活，并且人λ可变区表达比内源性λ可变区表达占优势(dominate over)。
“下游”是指同一染色体上基因区段的3’。在一个实例中，内源性V和J基因区段针对人基因区段是倒位的并任选地移出内源性轻链基因座。在一个实例中，所述人基因区段在所述κ或λ基因座的全部内源性V和J区段的下游。保留内源性V-J序列及基因间序列的可能性是有利的，因为包埋的控制区和/或基因被保留，这在脊椎动物中可能是希望的。
任选地，插入还包含λ基因间区段序列。这些是人序列或者它们可以是非人脊椎动物物种的序列(例如，当脊椎动物是小鼠时，可以使用相应的小鼠λ基因区段之间的序列)。
VJCλ链的表达
8.非人脊椎动物或非人脊椎动物细胞(例如小鼠、大鼠、小鼠细胞或大鼠细胞)，其基因组包含由人Ig基因区段靶向插入一或多个内源性Ig基因座产生的Ig基因区段库集，所述基因组包含靶向插入到内源性非人脊椎动物κ或λ轻链基因座中内源性非人脊椎动物κ或λ恒定区上游的人免疫球蛋白Vλ、Jλ和Cλ基因，用于表达人VJC轻链；任选地其中所述人VJC插入至少包含功能性人V、J和C基因区段，其包含在人λ链Ig基因座从Vλ3-1至Cλ7中(例如包含在人λ链Ig基因座从2-18至Cλ7中)。
如实施例中证实，人λ可变区表达比内源性κ可变区表达占优势。内源性基因座的内源性κ链表达可以被失活。
任选地，插入还包含λ基因间区段序列。这些是人序列或者它们可以是非人脊椎动物物种的序列(例如，当脊椎动物是小鼠时，可以使用相应的小鼠λ基因区段之间的序列)。
9.非人脊椎动物或非人脊椎动物细胞(例如小鼠、大鼠、小鼠细胞或大鼠细胞)，其基因组包含由人Ig基因区段靶向插入一或多个内源性Ig基因座产生的Ig基因区段库集，所述基因组包含靶向插入到内源性非人脊椎动物κ轻链基因座中小鼠Vκ和Jκ基因区段下游的包含在人λ链Ig基因座从Vλ3-1至Cλ7(任选地从Vλ2-18至Cλ7)中的至少功能性人Vλ和Jλ(及任选地人功能性Cλ)基因区段，用于表达包含人λ可变区的轻链；由此在所述插入存在下，衍生自所述小鼠Vκ和Jκ基因区段的内源性κ轻链的表达基本上或完全失活。
在一个实例中，小于10、5、4、3、2、1或0.5％的轻链由内源性κ链(即，其可变区衍生自非人脊椎动物Vκ和Jκ基因区段的重组的κ链)提供。
任选地，插入还包含λ基因间区段序列。这些是人序列或者它们可以是非人脊椎动物物种的序列(例如，当脊椎动物是小鼠时，可以使用相应的小鼠λ基因区段之间的序列)。
10.非人脊椎动物或非人脊椎动物细胞(例如小鼠、大鼠、小鼠细胞或大鼠细胞)，其中在其基因组中小鼠IgK-VJ已被移动离开小鼠Eκ增强子，由此失活内源性IgK-VJ区。这在实施例中证实。
11.方面10的脊椎动物或细胞，任选地其中通过将人VL和JL基因区段插入到小鼠IgK-VJ和Eκ增强子之间将IgK-VJ移动离开小鼠Eκ增强子；任选地其中所述插入是前述方面1-9任一项中描述的插入或者人Vκ和Jκ基因区段的插入。
12.前述任一方面的脊椎动物或细胞，任选地其中人Vλ和Jλ基因区段已被插入在内源性非人脊椎动物轻链增强子的100、75、50、40、30、20、15、10或5kb之内。在一个实例中，当插入在内源性λ基因座中时，所述增强子是λ增强子(例如小鼠Eλ2-4、Eλ4-10或Eλ3-1)。在一个实例中，当插入在内源性κ基因座中时，所述增强子是κ增强子(例如iEκ或3’Eκ)。
13.前述任一方面的脊椎动物或细胞，任选地其中通过将至少10个人Vλ基因区段与人Jλ基因区段靶向插入到所述轻链基因座的内源性非人脊椎动物轻链恒定区上游，而使人Vλ和Jλ基因区段提供在基因组中。例如，人基因区段通过如下插入而提供，插入从Vλ2-18至Vλ3-1的至少一部分人Igλ链基因座；或者插入与Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6和Jλ7一起插入的从Vλ2-18至Vλ3-1的至少一部分人Igλ链基因座；或者插入从Vλ2-18至Cλ7的至少一部分人Igλ链基因座(任选地不包括Jλ4Cλ4和/或Jλ5Cλ5)。
任选地，至少2、3、4或5个人Jλ被插入。在一个实施方案中，插入的Jλ彼此不相同。例如，人Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6和Jλ7被插入，任选地作为各自人JλCλ簇的一部分。
任选地，人轻链增强子例如Eλ被插入。例如，人Eλ插入在人Jλ区段和内源性恒定区之间；或者插入在人Cλ基因区段(当它们被插入时)和内源性恒定区之间。
14.前述任一方面的脊椎动物或细胞，任选地其中λ轻链提供人λ可变区库集，其衍生自已通过靶向插入到所述轻链基因座而提供在基因组中的人Vλ基因区段Vλ3-1及任选地Vλ2-18、Vλ3-16、V2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8和Vλ4-3之一或多个。
这是有用的，因为Vλ3-1是在人中高度使用的λ基因区段(图59；Ignatovich et al1997)，因此希望的是本发明的细胞和脊椎动物包括基于这个基因区段的λ可变区用于针对抗原进行选择，特别是用于开发人用抗体治疗剂。
15.前述任一方面的脊椎动物或细胞，任选地其中λ轻链提供人λ可变区库集，其衍生自已通过靶向插入到所述轻链基因座而提供在基因组中的人Vλ基因区段Vλ2-14以及Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3和Vλ3-1之一或多个。
这是有用的，因为Vλ2-14是在人中高度使用的λ基因区段，因此希望的是本发明的细胞和脊椎动物包括基于这个基因区段的λ可变区用于针对抗原进行选择，特别是用于开发人用抗体治疗剂。
前述任一方面的脊椎动物或细胞，任选地其中λ轻链提供人λ可变区库集，其衍生自已通过靶向插入到所述轻链基因座而提供在基因组中的人Vλ基因区段Vλ2-8以及Vλ2-18、Vλ3-16、V2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3和Vλ3-1之一或多个。
这是有用的，因为Vλ2-8是在人中高度使用的λ基因区段，因此希望的是本发明的细胞和脊椎动物包括基于这个基因区段的λ可变区用于针对抗原进行选择，特别是用于开发人用抗体治疗剂。
前述任一方面的脊椎动物或细胞，任选地其中λ轻链提供人λ可变区库集，其衍生自已通过靶向插入到所述轻链基因座而提供在基因组中的人Vλ基因区段Vλ3-10以及Vλ2-18、Vλ3-16、V2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ2-14、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3和Vλ3-1之一或多个。
这是有用的，因为Vλ3-10是在人中高度使用的λ基因区段，因此希望的是本发明的细胞和脊椎动物包括基于这个基因区段的λ可变区用于针对抗原进行选择，特别是用于开发人用抗体治疗剂。
16.前述任一方面的脊椎动物或细胞，任选地其中人Vλ基因区段包含功能性Vλ，该功能性Vλ包含在人λ链Ig基因座从Vλ2-18至Vλ3-1中。
例如，所述人Vλ基因区段包含至少人V基因区段Vλ3-1或者至少区段Vλ2-18、Vλ3-16、V2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3和Vλ3-1。
17.前述任一方面的脊椎动物，任选地其中所述脊椎动物表达λ链比κ链多。λ链包含衍生自Vλ和Jλ基因区段重组的可变区-例如与λ恒定区一起表达。κ链包含衍生自Vκ和Jκ基因区段重组的可变区-例如与κ恒定区一起表达。
18.前述任一方面的脊椎动物，任选地其中所述脊椎动物不表达内源性κ链。例如，内源性κ链表达可以通过本文描述的任一种方法失活，如通过全部或部分内源性κVJ区的倒位或者通过将标记(例如neo)或者其它干扰序列插入内源性κ基因座(不包含本发明的人λ基因区段的基因座)。
19.前述任一方面的脊椎动物，任选地其中所述脊椎动物中的κ链表达基本上或完全失活。在一个实例中，小于10、5、4、3、2、1或0.5％的轻链由κ链提供。
20.前述任一方面的脊椎动物或细胞，任选地其中人Eλ增强子插入在所述内源性非人脊椎动物基因座中。例如，插入种系构型的人5’MAR和人Eλ(和任选地人3’MAR)。例如，插入相应于人Jλ7-Cλ7立即3’并且包括至少人Eλ(和任选地还有人3’MAR)的人λ内含子区的序列-任选地包括人Eλ3’的至少30kb的内含子区。
21.前述任一方面的脊椎动物或细胞，其中任选地除了其它人基因区段之外还插入至少人JC基因区段Jλ1-Cλ1、Jλ2-Cλ2、Jλ3-Cλ3、Jλ6-Cλ6和Jλ7-Cλ7。
22.前述任一方面的脊椎动物或细胞，其中任选地插入的人基因区段是种系构型；任选地具有人基因间区段序列或者相应的内源性非人脊椎动物基因间区段序列。
23.前述任一方面的脊椎动物或细胞，其中任选地内源性非人脊椎动物轻链增强子保留在内源性基因座中；任选地呈种系构型。例如，内源性基因座是κ基因座时，内源性κ增强子被保留。这可以是iEK和/或3’EK，任选地相对于内源性轻链恒定区呈种系构型。这可以用于帮助控制在非人脊椎动物或细胞中的轻链表达。
24.前述任一方面的脊椎动物或细胞，任选地其中基因组对于内源性基因座中的人λ插入是杂合的。例如，对于在内源性κ(例如小鼠或大鼠κ)基因座中的人VJ或VJC插入是杂合的。这帮助和简化了脊椎动物的繁殖，因为其它内源性基因座(例如其它κ基因座)可以用于提供不同的转基因Ig基因座，如包含位于内源性小鼠κ恒定区上游或者人κ恒定区上游的人κV和J基因区段的转基因κ基因座。在这种情况中，κ增强子(iEk和/或3’EK)可以被保留在该κ基因座中以帮助使用内源性控制机制在脊椎动物中进行表达。
在另一个实施方案中，提供了根据前述任一方面的非人脊椎动物或细胞，其中
(a)所述内源性基因座是内源性λ基因座(例如在小鼠中)，所述基因组对于λ基因座的插入是杂合的，因此λ基因座的一个等位基因包含如上所述的人Vλ和Jλ基因区段插入(任选地具有人Cλ基因区段插入；任选地具有人Eλ插入)；
(b)另一个内源性λ等位基因包含位于恒定区(例如所述非人脊椎动物物种的κ恒定区；人κ恒定区；内源性λ恒定区；或人λ恒定区)上游的多个人Vκ基因区段及一或多个人Jκ基因区段；任选地具有一或多个κ增强子(例如所述非人脊椎动物物种的iEk和/或3’Ek)；及
(c)内源性λ和κ链表达已被失活。
因此，没有包含衍生自内源性V和J区的重组的可变区的轻链表达，但是有来自内源性λ基因座的等位基因的人λ和人κ轻链的表达。这是有益的，因为该设计大大帮助了脊椎动物的构建和繁殖，避免了在内源性λ和κ基因座均提供转基因基因座的需求。内源性κ基因座(及因此内源性κ链表达)可以通过倒位、κ基因区段(例如内源性V和/或J和/或Cκ)的缺失和/或通过将间断序列如标记(例如neo)插入内源性κ基因座而失活。
人κ区段插入到内源性λ中可以例如通过插入相应于人κ基因座一部分的序列而进行，所述序列包含种系构型的全部功能性人Vκ和Jκ(即任选地不包括假基因和ORF；见IMGT数据库)；及任选地还有人iEκ。
25.方面24的脊椎动物或细胞，任选地其中基因组包含在一个内源性非人脊椎动物κ基因座等位基因的所述人λ基因区段插入，及其中另一个内源性κ基因座等位基因包含在内源性非人脊椎动物κ恒定区上游的人κ免疫球蛋白V和J基因的插入；任选地其中内源性κ轻链增强子保留在一或两个κ基因座中；任选地呈种系构型。
方面24的脊椎动物或细胞，任选地其中基因组包含在一个内源性非人脊椎动物λ基因座等位基因的所述人λ基因区段插入，及其中另一个内源性λ基因座等位基因包含在内源性非人脊椎动物κ恒定区上游的人κ免疫球蛋白V和J基因的插入；任选地其中内源性λ轻链增强子保留在一或两个λ基因座中；任选地呈种系构型。
26.权利要求24的脊椎动物或细胞，任选地其中基因组包含在一个内源性非人脊椎动物λ基因座等位基因的所述人λ基因区段插入，及其中另一个内源性λ基因座等位基因包含在内源性非人脊椎动物κ恒定区上游的人κ免疫球蛋白V和J基因的插入；任选地其中内源性λ轻链增强子保留在一或两个κ基因座中；任选地呈种系构型。
27.方面1-23任一项的脊椎动物或细胞，任选地其中基因组对于在内源性非人脊椎动物基因座的人λ插入是纯合的。
28.方面1-23任一项的脊椎动物或细胞，任选地其中基因组对于在内源性非人脊椎动物κ和λ基因座的人λ基因区段插入是纯合的。
29.方面1-23和28任一项的脊椎动物或细胞，任选地其中基因组对于在内源性非人脊椎动物λ基因座的人λ基因区段插入是纯合的，一个内源性κ基因座等位基因包含人λ基因区段插入，另一个内源性κ基因座等位基因包含在Cκ区上游的多个人Vκ和Jκ基因区段的插入，用于表达包含人κ可变区的κ轻链。人κ可变区是衍生自人Vκ和Jκ的重组的那些。
30.方面27或28的脊椎动物或细胞，任选地其中在κ和λ基因座的人λ基因区段插入是人λ基因区段的相同库集的插入。
31.方面27或28的脊椎动物或细胞，任选地其中在κ基因座的人λ基因区段插入不同于在λ基因座的人λ基因区段插入。这对于扩增可变区潜在库集用于后续针对抗原的选择是有用的。
32.非人脊椎动物或非人脊椎动物细胞(例如小鼠、大鼠、小鼠细胞或大鼠细胞)，其基因组包含由人Ig基因区段靶向插入一或多个内源性Ig基因座产生的Ig基因区段库集，所述基因组包含下述轻链基因座排列：
(a)在一个内源性κ链等位基因的L及在另一个内源性κ链等位基因的K；或者
(b)在一个内源性λ链等位基因的L及在另一个内源性λ链等位基因的K；或者
(c)在两个内源性κ链等位基因的L；
(d)在两个内源性λ链等位基因的L；
(e)在一个内源性κ链等位基因的L及另一个内源性κ链等位基因被失活；或者
(f)在一个内源性λ链等位基因的L及另一个内源性λ链等位基因被失活；
其中
L代表包含在人λ链Ig基因座从Vλ3-1至Cλ7(例如包含在人λ链Ig基因座从2-18至Cλ7)中的至少功能性人Vλ和Jλ(任选地还有Cλ基因区段)的人λ基因区段插入；及
K代表人Vκ和Jκ插入；
其中在基因组中，人基因区段插入在恒定区上游，以用于表达包含衍生自人V和J基因区段的重组的可变区的轻链。
33.方面32的脊椎动物或细胞，任选地其中基因组包含排列：
(a)和在一或两个内源性λ链等位基因的L；或者
(a)和在一或两个内源性λ链等位基因的K；或者
(a)和在一个内源性λ链等位基因的L及在另一个内源性λ链等位基因的K；或者
(b)和在一或两个内源性κ链等位基因的L；或者
(b)和在一或两个内源性κ链等位基因的K；或者
(b)和在一个内源性κ链等位基因的L及在另一个内源性κ链等位基因的K；或者
(c)和在一或两个内源性λ链等位基因的K；或者
(c)和在一或两个内源性λ链等位基因的L；或者
(c)和在一个内源性λ链等位基因的L及在另一个内源性λ链等位基因的K；或者
(c)和两个内源性λ链等位基因均被失活；或者
(d)和在一或两个内源性κ链等位基因的L；或者
(d)和在一或两个内源性κ链等位基因的K；或者
(d)和在一个内源性κ链等位基因的L及在另一个内源性κ链等位基因的K；或者
(d)和两个内源性κ链等位基因均被失活。
34.方面32或33的脊椎动物或细胞，任选地其中内源性κ链表达被基本上或完全失活。内源性κ链是包含衍生自内源性(非人脊椎动物)Vκ和Jκ基因区段的重组的可变区的κ轻链。
35.方面32、33或34的脊椎动物或细胞，任选地其中内源性λ链表达被基本上或完全失活。内源性λ链是包含衍生自内源性(非人脊椎动物)Vλ和Jλ基因区段的重组的可变区的λ轻链。
36.方面32-35任一项的脊椎动物或细胞，任选地其中每个L插入均位于内源性λ或κ恒定区的上游。
37.方面32-36任一项的脊椎动物或细胞，任选地其中每个L插入到λ基因座中均位于内源性λ恒定区的上游。
38.方面32-36任一项的脊椎动物或细胞，任选地其中每个L插入到κ基因座中均位于内源性κ恒定区的上游。
39.方面32-35任一项的脊椎动物或细胞，任选地其中每个L插入到λ基因座中均位于人λ恒定区的上游。
40.方面32-35任一项的脊椎动物或细胞，任选地其中每个L插入到κ基因座中均位于人κ恒定区的上游。
41.方面32-40任一项的脊椎动物或细胞，任选地其中每个K插入均位于内源性λ或κ恒定区的上游。
42.方面32-41任一项的脊椎动物或细胞，任选地其中每个K插入到λ基因座均位于内源性λ恒定区的上游。
43.方面32-42任一项的脊椎动物或细胞，任选地其中每个K插入到κ基因座中均位于内源性κ恒定区的上游。
44.方面32-40任一项的脊椎动物或细胞，任选地其中每个K插入到λ基因座均位于人λ恒定区的上游。
45.方面32-40和44任一项的脊椎动物或细胞，任选地其中每个K插入到κ基因座中均位于人κ恒定区的上游。
46.方面32-45任一项的脊椎动物或细胞，任选地其中所述插入是根据方面1-9、11-16和20-31任一项。
47.方面32-46任一项的脊椎动物或细胞，任选地其中每个人λ插入是根据方面1-9、11-16和20-31任一项。
48.方面32-47任一项的脊椎动物或细胞，任选地其中每个人κ插入是根据方面1-9、11-16和20-31任一项。
49.方面32-48任一项的脊椎动物或细胞，任选地其中每个人λ插入包含人Vλ和Jλ(及任选地Cλ)基因区段的库集。
50.方面32-48任一项的脊椎动物或细胞，任选地其中进行第一个和第二个(及任选地第三个)人λ插入，所述插入包含人Vλ和Jλ(及任选地Cλ)基因区段的不同库集。
51.方面32-50任一项的脊椎动物或细胞，任选地其中每个人κ插入包含人Vκ和Jκ(及任选地Cκ)基因区段的库集。
52.方面32-50任一项的脊椎动物或细胞，任选地其中进行第一个和第二个(及任选地第三个)人κ插入，所述插入包含人Vκ和Jκ(及任选地Cκ)基因区段的不同库集。
53.前述任一方面的脊椎动物或细胞，任选地其中基因组包含免疫球蛋白重链基因座，所述基因座包含人VH基因区段，例如本文描述的包含人V、D和J基因区段的重链基因座。
54.产生包含特异于希望抗原的λ可变区的抗体或轻链的方法，所述方法包括用希望抗原免疫前述任一方面的脊椎动物，及回收抗体或轻链或者回收产生抗体或轻链的细胞。
55.产生完全人源化抗体或抗体轻链的方法，包括进行方面54的方法，以获得包含λ链非人脊椎动物恒定区的抗体或轻链，及用人恒定区置换非人脊椎动物恒定区，任选地通过编码所述抗体或轻链的核酸的工程化进行。
56.根据方面54产生的人源化抗体或抗体轻链或其衍生物；任选地用于医药学。
57.根据方面54产生的人源化抗体或链或其衍生物在医药学中的应用。
58.失活非人脊椎动物或非人脊椎动物细胞(例如小鼠、大鼠、小鼠细胞或大鼠细胞)的基因组中的内源性Ig-VJ区的方法，其中所述方法包括将人免疫球蛋白基因区段(例如V和J基因区段)插入基因组中内源性Ig-VJ和内源性增强子或内源性恒定区之间，以移动内源性Ig-VJ离开所述增强子或恒定区，由此失活内源性Ig-VJ区。
在一个实施方案中，所述内源性Ig-VJ是重链基因区段，增强子是内源性重链增强子，恒定区是内源性重链恒定区，人Ig基因区段包含人VH、DH和JH基因区段。
在一个实施方案中，所述内源性Ig-VJ是λ轻链基因区段，增强子是内源性λ链增强子，恒定区是内源性λ链恒定区，人Ig基因区段包含人Vλ和Jλ基因区段。
在一个实施方案中，所述内源性Ig-VJ是κ轻链基因区段，增强子是内源性κ链增强子，恒定区是内源性κ链恒定区，人Ig基因区段包含人Vκ和Jκ基因区段。
失活非人脊椎动物或非人脊椎动物细胞(例如小鼠、大鼠、小鼠细胞或大鼠细胞)的基因组中的内源性IgK-VJ区的方法，其中所述方法包括将人免疫球蛋白基因区段插入基因组中内源性IgK-VJ和Eκ增强子之间，以移动所述IgK-VJ离开Eκ增强子，由此失活内源性IgK-VJ区。
59.方面58的方法，其中任选地所述人基因区段包含人VL和JL基因区段；任选地其中所述插入是方面1-9、11-16和20-31任一项中描述的插入或者人Vκ和Jκ基因区段的插入。
60.在非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)中表达免疫球蛋白轻链的方法，所述轻链包含λ可变区(λ轻链)，其中由所述脊椎动物表达的至少70或80％(例如至少70、75、80、84、85、90、95、96、97、98或99％)的λ轻链的可变区衍生自人Vλ和Jλ基因区段的重组，所述方法包括在脊椎动物基因组中提供通过将人Ig基因区段靶向插入一或多个内源性Ig基因座而产生的Ig基因区段库集，所述基因组包含位于恒定区上游的人Vλ和Jλ基因区段，其中所述方法包括将至少包含在人λ链Ig基因座从Vλ2-18至Cλ7中的功能性人Vλ和Jλ(任选地还有Cλ)基因区段(及任选地基因间区段序列)插入脊椎动物的内源性轻链基因座中，其中由所述脊椎动物表达的至少70或80％(例如至少70、75、80、84、85、90、95、96、97、98或99％)的λ轻链的可变区衍生自人Vλ和Jλ基因区段的重组；所述方法包括在脊椎动物中表达所述轻链及任选地分离一或多个所述轻链(例如作为4-链抗体的部分)。
在一个实施方案中，所述方法进一步包括从所述脊椎动物分离包含衍生自人Vλ和Jλ基因区段的重组的可变区的λ轻链。在一个实例中，所述方法包括在分离λ轻链之前用抗原(例如人抗原)免疫小鼠。在一个实例中，所述轻链是抗体例如特异性结合所述抗原的抗体的一部分。
在一个实施方案中，应用进一步包括从小鼠分离脾组织(例如脾)；任选地随后从所述组织分离至少一个抗原特异性B细胞，其中所述B细胞表达所述λ轻链。例如，所述λ轻链由特异性结合预定抗原(例如人抗原)的抗体提供。在一个实例中，应用包括在分离脾组织或λ轻链之前用抗原(例如人抗原)免疫小鼠。在一个实例中，应用包括分离由B细胞(或由B细胞与骨髓瘤细胞融合产生的杂交瘤)产生的λ轻链。在一个实例中，应用包括从分离自脾组织的B细胞制备杂交瘤，其中所述杂交瘤表达所述λ轻链或其衍生物。任选地，应用包括制备所述分离的抗体或λ轻链的衍生物。(根据本文任一方面的)衍生物抗体的例子是与所述分离的抗体相比具有一或多个突变的抗体(例如用于改良抗原结合亲和性和/或增强或失活Fc功能)。这种突变体特异性结合所述抗原。产生衍生物的突变或适应包括例如产生Fc增强或失活的突变。衍生物可以是与毒性有效负载(payload)或报道分子或标记或其它活性部分缀合后的抗体。在另一个实例中，分离自本发明的脊椎动物的细胞的嵌合抗体链或抗体通过用相应人恒定区置换其一或全部人恒定区而修饰。例如，分离自这种细胞或脊椎动物的抗体的全部恒定区用人恒定区置换以产生完全人抗体(即包含人可变区和恒定区)。这种抗体可用于给予人类患者以减少患者的抗抗体反应。
61.在非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)中表达免疫球蛋白轻链的方法，其中由所述脊椎动物表达的至少60％(例如至少65、70、80、84、85、90、95、96、97、98或99％)的轻链由人λ轻链提供，所述方法包括在脊椎动物基因组中提供通过将人Ig基因区段靶向插入一或多个内源性Ig基因座而产生的Ig基因区段库集，所述基因组包含(i)位于恒定区上游的人Vλ和Jλ基因区段，其中所述人Vλ和Jλ基因区段是通过将至少包含在人λ链Ig基因座从Vλ2-18至Cλ7中的功能性人Vλ和Jλ(任选地还有人Cλ)基因区段(及任选地基因间区段序列)插入脊椎动物的内源性轻链基因座中而提供，及(ii)位于恒定区上游的κV基因区段，其中所述脊椎动物表达包含人λ可变区的免疫球蛋白轻链(人λ轻链)，由所述脊椎动物表达的至少60％(例如至少65、70、80、84、85、90、95、96、97、98或99％)的轻链由所述人λ轻链提供；所述方法包括在脊椎动物中表达所述轻链，及任选地分离一或多个所述轻链(例如作为4-链抗体的部分)。
在一个实施方案中，所述方法进一步包括从所述脊椎动物分离包含衍生自人Vλ和Jλ基因区段的重组的可变区的λ轻链。在一个实例中，所述方法包括在分离λ轻链之前用抗原(例如人抗原)免疫小鼠。在一个实例中，所述轻链是抗体例如特异性结合所述抗原的抗体的部分。
在一个实施方案中，应用进一步包括从小鼠分离脾组织(例如脾)；任选地随后从所述组织分离至少一个抗原特异性B细胞，其中所述B细胞表达所述λ轻链。例如，所述λ轻链由特异性结合预定抗原(例如人抗原)的抗体提供。在一个实例中，应用包括在分离脾组织或λ轻链之前用抗原(例如人抗原)免疫小鼠。在一个实例中，应用包括分离由B细胞(或由B细胞与骨髓瘤细胞融合产生的杂交瘤)产生的λ轻链。在一个实例中，应用包括从分离自脾组织的B细胞制备杂交瘤，其中所述杂交瘤表达所述λ轻链或其衍生物。任选地，应用包括制备所述分离的抗体或λ轻链的衍生物。(根据本文任一方面的)衍生物抗体的例子是与所述分离的抗体相比具有一或多个突变的抗体(例如用于改良抗原结合亲和性和/或增强或失活Fc功能)。这种突变体特异性结合所述抗原。
62.在非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)中表达人免疫球蛋白VJC轻链的方法，所述方法包括在脊椎动物基因组中提供通过将人Ig基因区段靶向插入一或多个内源性Ig基因座而产生的Ig基因区段库集，其中所述方法包括将至少包含在人λ链Ig基因座从Vλ3-1至Cλ7(例如包含在人λ链Ig基因座从2-18至Cλ7)中的功能性人Vλ、Jλ和Cλ基因区段(及任选地基因间区段序列)插入内源性非人脊椎动物κ轻链基因座中内源性非人脊椎动物κ恒定区上游，以用于表达人VJC轻链；所述方法包括在所述脊椎动物中表达所述轻链，及任选地分离一或多个所述轻链(例如作为4-链抗体的部分)。
在一个实施方案中，所述方法进一步包括从所述脊椎动物分离包含衍生自人Vλ和Jλ基因区段的重组的可变区的λ轻链。在一个实例中，所述方法包括在分离λ轻链之前用抗原(例如人抗原)免疫小鼠。在一个实例中，所述轻链是抗体例如特异性结合所述抗原的抗体的部分。
在一个实施方案中，应用进一步包括从小鼠分离脾组织(例如脾)；任选地随后从所述组织分离至少一个抗原特异性B细胞，其中所述B细胞表达所述λ轻链。例如，所述λ轻链由特异性结合预定抗原(例如人抗原)的抗体提供。在一个实例中，应用包括在分离脾组织或λ轻链之前用抗原(例如人抗原)免疫小鼠。在一个实例中，应用包括分离由B细胞(或由B细胞与骨髓瘤细胞融合产生的杂交瘤)产生的λ轻链。在一个实例中，应用包括从分离自脾组织的B细胞制备杂交瘤，其中所述杂交瘤表达所述λ轻链或其衍生物。任选地，应用包括制备所述分离的抗体或λ轻链的衍生物。(根据本文任一方面的)衍生物抗体的例子是与所述分离的抗体相比具有一或多个突变(例如用于改良抗原结合亲和性和/或增强或失活Fc功能)的抗体。这种突变体特异性结合所述抗原。
63.方面38-40任一项的方法，任选地其中脊椎动物是根据任一其它方面的脊椎动物。
64.根据方面58-63任一项的方法分离的抗体轻链或其衍生物，或包含这种轻链或衍生物的抗体；任选地用于医药学。
65.根据方面58-63任一项的方法分离的抗体轻链或其衍生物(或包含这种轻链或衍生物的抗体)在医药学中的应用。
66.根据方面1-53任一项的非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)，用于表达包含λ可变区的轻链(λ轻链)，其中由脊椎动物表达的至少70或80％(例如至少70、75、80、84、85、90、95、96、97、98或99％或100％)的λ轻链可变区衍生自人Vλ和Jλ基因区段的重组。
表达包含λ可变区的轻链(λ轻链)的根据方面1-53任一项的非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)，其中由脊椎动物表达的至少70或80％(例如至少70、75、80、84、85、90、95、96、97、98或99％或100％)的λ轻链可变区衍生自人Vλ和Jλ基因区段的重组。
67.根据方面1-53任一项的非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)，用于表达的轻链，其中由脊椎动物表达的至少60％(例如超过65、70、80、84、85、90、95、96、97、98或99％或100％)的轻链由人λ轻链提供。
表达轻链的根据方面1-53任一项的非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)，其中由脊椎动物表达的至少60％(例如超过65、70、80、84、85、90、95、96、97、98或99％或100％)的轻链由人λ轻链提供。
68.根据方面7的非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)，用于表达包含λ可变区的轻链(λ轻链)，其中包含人λ可变区的λ轻链的表达比包含内源性非人脊椎动物λ可变区的λ轻链的表达占优势；及任选地用于失活内源性非人脊椎动物λ可变区从内源性轻链基因座的表达。
表达包含λ可变区的轻链(λ轻链)的根据方面7的非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)，其中包含人λ可变区的λ轻链的表达比包含内源性非人脊椎动物λ可变区的λ轻链的表达占优势；及任选地用于失活内源性非人脊椎动物λ可变区从内源性轻链基因座的表达。
69.根据方面7、8、9或10的非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)，用于失活内源性非人脊椎动物λ可变区从内源性轻链基因座的表达。
抗体链的表达百分比或表达水平可以在B细胞(例如外周血淋巴细胞)中的轻链mRNA转录物水平确定。或者或额外地，表达百分比在脊椎动物血清或血液中的抗体轻链水平确定。额外或或者，表达可以通过B细胞的FACS(荧光激活细胞分选)分析确定。例如，当人λ可变区分别与小鼠Cκ或人Cλ区一起表达时，评估细胞表面上的小鼠Cκ或人Cλ表达。
这些方面中的术语“λ轻链”是指包含衍生自Vλ和Jλ基因区段的重组的可变区序列(在RNA或氨基酸水平)的轻链。因此，例如“人λ可变区”是衍生自人Vλ和Jλ基因区段的重组的可变区。恒定区可以是κ或λ恒定区，例如人或小鼠恒定区。
这些方面中的脊椎动物是例如首次用于实验的()(即未用预定抗原免疫的，如本领域对此术语的理解；例如，被保持在由用于R&D的动物房提供的相对无菌环境中的这种脊椎动物)。在另一个实例中，脊椎动物用预定抗原免疫，例如携带人表位的抗原。
“功能性”人基因区段是指，在人Igλ基因座中，一些V基因区段是非功能性假基因(例如Vλ3-17、Vλ3-15、Vλ3-13、Vλ3-7、Vλ3-6、Vλ2-5、Vλ3-4、Vλ3-2；见IMGT数据库：WorldWide Web(www)imgt.org/IMGTrepertoire/index.php？section＝LocusGenes&repertoire＝locus&sp ecies＝human&group＝IGL。另外，Jλ4-Cλ4和Jλ5-Cλ5在人中不是功能性的。术语“功能性”当指基因区段时不包括假基因。功能性人Vλ基因区段的例子是Vλ2-18、Vλ3-16、V2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3和Vλ3-1。功能性人Jλ基因区段的例子是Jλ1、Jλ2和Jλ3；或者Jλ1、Jλ2和Jλ7；或者Jλ2、Jλ3和Jλ7；或者Jλ1、Jλ2、Jλ3和Jλ7。功能性人Cλ基因区段的例子是Cλ1、Cλ2和Cλ3；或者Cλ1、Cλ2和Cλ7；或者Cλ2、Cλ3和Cλ7；或者Cλ1、Cλ2、Cλ3和Cλ7。
在一个实施方案中，λ轻链与在本发明细胞或脊椎动物中表达的重链一起形成抗体。重链可以从本文所述转基因重链基因座表达。例如，细胞或脊椎动物的基因组包含重链基因座，其是嵌合免疫球蛋白重链基因座，包含位于所述非人物种的mu恒定区上游的一或多个人V基因区段、一或多个人D基因区段及一或多个人J基因区段；内源性重链表达已被基本上失活；以及所述重链基因座包含所述非人脊椎动物物种的Eμ增强子。
在脊椎动物或细胞的一个实施方案中，全部内源性增强子从插入人基因区段的内源性基因座缺失。因此，当人增强子(例如Eλ)被插入时，其在缺乏其它内源性增强子(例如κ增强子，如果所述基因座是内源性κ增强子)的作用时控制转基因基因座。这可以用于避免非人脊椎动物样κ:λ表达率(例如在小鼠中引导表达至更高的κ:λ比率)。
当内源性轻链(例如κ或λ)表达基本上无活性或如本文被失活时，小于10、5、4、3、2、1或0.5％的这种内源性轻链被表达或可表达。在一个实例中，完全失活，因此没有这种轻链被表达或可表达。
任选地本发明的脊椎动物是首次用于实验的。因此，所述脊椎动物未被预定抗原免疫。
当例如本发明细胞是ES细胞或其它IPS干细胞或其它多能干细胞时，所述细胞可以发育成本发明的脊椎动物。例如，所述细胞可以移植到来自代孕母体的胚泡中，并且根据标准技术发育成胚胎和动物。
在一个实施方案中，当人κ基因区段被插入时，每个插入包含人κ基因区段
(i)Vκ1-5、Vκ1-6、Vκ1-8和Vκ1-9(及任选地Vκ5-2和Vκ4-1)；或者
(ii)Vκ1-5、Vκ1-6、Vκ1-8、Vκ1-9、Vκ3-11、Vκ1-12、Vκ3-15、Vκ1-16、Vκ1-17、Vκ3-20(及任选地Vκ2-24和/或Vκ1-13)；或者
(iii)Vκ1-5、Vκ1-6、Vκ1-8、Vκ1-9、Vκ3-11、Vκ1-12、Vκ3-15、Vκ1-16、Vκ1-17、Vκ3-20、Vκ2-24、Vκ1-27、Vκ2-28、Vκ2-30和Vκ1-33(及任选地Vκ2-29和/或Vκ2-40和/或Vκ1-39)；
及任选地
(iv)Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4和Jκ5。
在一个实施方案中，人κ插入还包含在所述基因座中人J基因区段下游的人iEκ和/或人3’Eκ。
基本上专门表达人重链可变区的本发明转基因小鼠发育正常脾和BM区室&正常Ig
表达，其中所述Ig包含人重链可变区
本发明人在表达具有人重链可变区的抗体、基本上不存在内源性重链和κ链表达的本发明转基因小鼠中惊奇地观测到正常Ig亚型表达&B细胞发育。见下述实施例16。
发明人观测到令人惊奇地在存在人可变区表达时内源性重链可变区表达的失活不改变脾区室(图66)或骨髓B祖细胞区室(图67)的B细胞比率，血清中的免疫球蛋白水平是正常的，并且正确的Ig亚型被表达(图68)。这些数据证实根据本发明的插入的人重链基因区段(例如插入至少人VH基因区段VH2-5、7-4-1、4-4、1-3、1-2、6-1，及全部人D和JH基因区段D1-1、2-2、3-3、4-4、5-5、6-6、1-7、2-8、3-9、5-12、6-13、2-15、3-16、4-17、6-19、1-20、2-21、3-22、6-25、1-26和7-27；以及J1、J2、J3、J4、J5和J6)对于来自转基因重链基因座的VDJ基因区段重排、B细胞受体(BCR)信号传导和正确的B细胞成熟均是完全功能性的。
本发明因此提供了下述方面(编号起自方面70)：
70.表达或用于表达包含人可变区的免疫球蛋白重链的小鼠，其中由所述小鼠表达的重链基本上专门是所述包含人可变区的重链；并且包含人可变区的所述重链作为小鼠中血清IgG1、IgG2b和IgM(及任选地IgG2a)抗体的部分而表达；
包含免疫球蛋白重链基因座的小鼠，所述免疫球蛋白重链基因座包含位于小鼠恒定区(例如C-mu和/或C-delta和/或C-gamma；如(在5’至3’方向)小鼠C-mu和小鼠C-delta和小鼠C-gamma)上游的人VH、DH和JH基因区段，其中
(a)所述小鼠能表达包含人可变区的免疫球蛋白重链，由所述小鼠表达的重链基本上专门是所述包含人可变区的重链；及
(b)所述小鼠表达包含所述重链的血清IgG1、IgG2b和IgM(及任选地IgG2a)抗体。
Ig同种型可以例如用同种型匹配工具抗体确定，本领域技术人员熟悉所述抗体(如实施例16所示)。
在一个实施方案中，所述小鼠是首次用于实验的。
71.方面70的小鼠，用于表达正常相对比例的血清IgG1、IgG2a、IgG2b和IgM抗体。
“正常”是指与仅表达小鼠抗体链的小鼠(例如首次用于实验的小鼠)相当，例如与其基因组仅包含野生型功能性Ig重链和轻链基因座的小鼠、例如野生型小鼠相当。
72.方面70或71的小鼠，其中所述小鼠表达正常相对比例的血清IgG1、IgG2a、IgG2b和IgM抗体。
“正常”是指与仅表达小鼠抗体链的小鼠(例如首次用于实验的小鼠)、例如其基因组仅包含野生型功能性Ig重链和轻链基因座的小鼠、例如野生型小鼠相当。
73.方面70-72任一项的小鼠，用于在小鼠中表达
(i)浓度为大约25-350μg/ml的血清IgG1；
(ii)浓度为大约0-200μg/ml的血清IgG2a；
(iii)浓度为大约30-800μg/ml的血清IgG2b；及
(iv)浓度为大约50-300μg/ml的血清IgM；
或者
(i)浓度为大约10-600μg/ml的血清IgG1；
(ii)浓度为大约0-500μg/ml的血清IgG2a；
(iii)浓度为大约20-700μg/ml的血清IgG2b；及
(iv)浓度为大约50-700μg/ml的血清IgM；
如在平板上Ig捕获、随后与抗小鼠同种型特异性标记的抗体保温(例如在RT 1小时，例如在20℃1小时)及用标记定量Ig而确定(例如使用各自缀合于辣根过氧化物酶的抗小鼠Ig同种型特异性抗体，在具有0.1％TweenTM的PBS中以1/10000比率缀合，随后用四甲基联苯胺底物(TMB)在室温(例如20℃)黑暗中显色标记4-5分钟，加入硫酸终止标记显色，及在450nm读数标记)。
例如，方面70-72任一项的小鼠，用于在小鼠中表达
(i)浓度为大约25-150μg/ml的血清IgG1；
(ii)浓度为大约0-200μg/ml的血清IgG2a；
(iii)浓度为大约30-300μg/ml的血清IgG2b；及
(iv)浓度为大约50-200μg/ml的血清IgM；
或者
(i)浓度为大约10-200μg/ml的血清IgG1；
(ii)浓度为大约0-500μg/ml的血清IgG2a；
(iii)浓度为大约20-400μg/ml的血清IgG2b；及
(iv)浓度为大约50-700μg/ml的血清IgM；
如在平板上Ig捕获、随后与抗小鼠同种型特异性标记的抗体保温(例如在RT 1小时，例如在20℃1小时)及用标记定量Ig而确定(例如使用各自缀合于辣根过氧化物酶的抗小鼠Ig同种型特异性抗体，在具有0.1％TweenTM的PBS中以1/10000比率缀合，随后用四甲基联苯胺底物(TMB)在室温(例如20℃)黑暗中显色标记4-5分钟，加入硫酸终止标记显色，及在450nm读数标记)。
方面70-72任一项的小鼠，用于在小鼠中表达相对比例如下的Ig
(i)浓度为大约25-350μg/ml的血清IgG1；
(ii)浓度为大约0-200μg/ml的血清IgG2a；
(iii)浓度为大约30-800μg/ml的血清IgG2b；及
(iv)浓度为大约50-300μg/ml的血清IgM；
或者
(i)浓度为大约10-600μg/ml的血清IgG1；
(ii)浓度为大约0-500μg/ml的血清IgG2a；
(iii)浓度为大约20-700μg/ml的血清IgG2b；及
(iv)浓度为大约50-700μg/ml的血清IgM；
如在平板上Ig捕获、随后与抗小鼠同种型特异性标记的抗体保温(例如在RT 1小时，例如在20℃1小时)及用标记定量Ig而确定(例如使用各自缀合于辣根过氧化物酶的抗小鼠Ig同种型特异性抗体，在具有0.1％TweenTM的PBS中以1/10000比率缀合，随后用四甲基联苯胺底物(TMB)在室温(例如20℃)黑暗中显色标记4-5分钟，加入硫酸终止标记显色，及在450nm读数标记)。
例如，方面70-72任一项的小鼠，用于在小鼠中表达相对比例如下的Ig
(i)浓度为大约25-150μg/ml的血清IgG1；
(ii)浓度为大约0-200μg/ml的血清IgG2a；
(iii)浓度为大约30-300μg/ml的血清IgG2b；及
(iv)浓度为大约50-200μg/ml的血清IgM；
或者
(i)浓度为大约10-200μg/ml的血清IgG1；
(ii)浓度为大约0-500μg/ml的血清IgG2a；
(iii)浓度为大约20-400μg/ml的血清IgG2b；及
(iv)浓度为大约50-700μg/ml的血清IgM；
如在平板上Ig捕获、随后与抗小鼠同种型特异性标记的抗体保温(例如在RT 1小时，例如在20℃1小时)及用标记定量Ig而确定(例如使用各自缀合于辣根过氧化物酶的抗小鼠Ig同种型特异性抗体，在具有0.1％TweenTM的PBS中以1/10000比率缀合，随后用四甲基联苯胺底物(TMB)在室温(例如20℃)黑暗中显色标记4-5分钟，加入硫酸终止标记显色，及在450nm读数标记)。
74.方面70-73任一项的小鼠，其中所述小鼠表达
(i)浓度为大约25-350μg/ml的血清IgG1；
(ii)浓度为大约0-200μg/ml的血清IgG2a；
(iii)浓度为大约30-800μg/ml的血清IgG2b；及
(iv)浓度为大约50-300μg/ml的血清IgM；
或者
(i)浓度为大约10-600μg/ml的血清IgG1；
(ii)浓度为大约0-500μg/ml的血清IgG2a；
(iii)浓度为大约20-700μg/ml的血清IgG2b；及
(iv)浓度为大约50-700μg/ml的血清IgM；
如在平板上Ig捕获、随后与抗小鼠同种型特异性标记的抗体保温(例如在RT 1小时，例如在20℃1小时)及用标记定量Ig而确定(例如使用各自缀合于辣根过氧化物酶的抗小鼠Ig同种型特异性抗体，在具有0.1％TweenTM的PBS中以1/10000比率缀合，随后用四甲基联苯胺底物(TMB)在室温(例如20℃)黑暗中显色标记4-5分钟，加入硫酸终止标记显色，及在450nm读数标记)。
例如，方面70-73任一项的小鼠，其中所述小鼠表达
(i)浓度为大约25-150μg/ml的血清IgG1；
(ii)浓度为大约0-200μg/ml的血清IgG2a；
(iii)浓度为大约30-300μg/ml的血清IgG2b；及
(iv)浓度为大约50-200μg/ml的血清IgM；
或者
(i)浓度为大约10-200μg/ml的血清IgG1；
(ii)浓度为大约0-500μg/ml的血清IgG2a；
(iii)浓度为大约20-400μg/ml的血清IgG2b；及
(iv)浓度为大约50-700μg/ml的血清IgM；
如在平板上Ig捕获、随后与抗小鼠同种型特异性标记的抗体保温(例如在RT 1小时，例如在20℃1小时)及用标记定量Ig而确定(例如使用各自缀合于辣根过氧化物酶的抗小鼠Ig同种型特异性抗体，在具有0.1％TweenTM的PBS中以1/10000比率缀合，随后用四甲基联苯胺底物(TMB)在室温(例如20℃)黑暗中显色标记4-5分钟，加入硫酸终止标记显色，及在450nm读数标记)。
方面70-73任一项的小鼠，其中所述小鼠表达相对比例如下的Ig
(i)浓度为大约25-350μg/ml的血清IgG1；
(ii)浓度为大约0-200μg/ml的血清IgG2a；
(iii)浓度为大约30-800μg/ml的血清IgG2b；及
(iv)浓度为大约50-300μg/ml的血清IgM；
或者
(i)浓度为大约10-600μg/ml的血清IgG1；
(ii)浓度为大约0-500μg/ml的血清IgG2a；
(iii)浓度为大约20-700μg/ml的血清IgG2b；及
(iv)浓度为大约50-700μg/ml的血清IgM；
如在平板上Ig捕获、随后与抗小鼠同种型特异性标记的抗体保温(例如在RT 1小时，例如在20℃1小时)及用标记定量Ig而确定(例如使用各自缀合于辣根过氧化物酶的抗小鼠Ig同种型特异性抗体，在具有0.1％TweenTM的PBS中以1/10000比率缀合，随后用四甲基联苯胺底物(TMB)在室温(例如20℃)黑暗中显色标记4-5分钟，加入硫酸终止标记显色，及在450nm读数标记)。
例如，方面70-72任一项的小鼠，其中所述小鼠表达相对比例如下的Ig
(i)浓度为大约25-150μg/ml的血清IgG1；
(ii)浓度为大约0-200μg/ml的血清IgG2a；
(iii)浓度为大约30-300μg/ml的血清IgG2b；及
(iv)浓度为大约50-200μg/ml的血清IgM；
或者
(i)浓度为大约10-200μg/ml的血清IgG1；
(ii)浓度为大约0-500μg/ml的血清IgG2a；
(iii)浓度为大约20-400μg/ml的血清IgG2b；及
(iv)浓度为大约50-700μg/ml的血清IgM；
如在平板上Ig捕获、随后与抗小鼠同种型特异性标记的抗体保温(例如在RT 1小时，例如在20℃1小时)及用标记定量Ig而确定(例如使用各自缀合于辣根过氧化物酶的抗小鼠Ig同种型特异性抗体，在具有0.1％TweenTM的PBS中以1/10000比率缀合，随后用四甲基联苯胺底物(TMB)在室温(例如20℃)黑暗中显色标记4-5分钟，加入硫酸终止标记显色，及在450nm读数标记)。
75.方面70-74任一项的小鼠，用于在例如由FACS确定产生正常比例或百分比的成熟脾B细胞的小鼠中从脾B细胞表达所述重链。
“正常”是指与仅表达小鼠抗体链的小鼠(例如首次用于实验的小鼠)、例如其基因组仅包含野生型功能性Ig重链和轻链基因座的小鼠、例如野生型小鼠中成熟脾B细胞产生相当。
例如，至少40、50、60或70％的由本发明小鼠产生的总脾B细胞是成熟B细胞。脾B细胞是B220+并且如本领域技术人员所知以相对高水平表达B220。成熟脾B细胞表达B220和IgD，两者均在相对高水平，如本领域技术人员所知。IgM表达在成熟脾B细胞中相对低，同样是本领域已知的。例如见J Exp Med.1999 Jul 5；190(1):75-89；“B cell development inthe spleen takes place in discrete steps and is determined by the quality ofB cell receptor-derived signals”；Loder F et al.。
任选地，所述小鼠产生正常比率的T1、T2和成熟脾B细胞，如通过FACS确定。例如，本发明的小鼠产生大约40-70％成熟脾B细胞，15-35％脾T1细胞；及5-10％脾T2细胞(百分比参考总脾B220阳性(高)群)。例如，大约40-60％成熟脾B细胞，15-30％脾T1细胞；及5-10％脾T2细胞。“正常”是指与仅表达小鼠抗体链的小鼠(例如首次用于实验的小鼠)、例如其基因组仅包含野生型功能性Ig重链和轻链基因座的小鼠、例如野生型小鼠中的T1/T2/成熟脾B细胞比例相当。
76.方面70-75任一项的小鼠，其中所述小鼠产生正常比例或百分比的成熟脾B细胞，如通过FACS确定。
77.表达或用于表达包含人可变区的免疫球蛋白重链的小鼠，其中由所述小鼠表达的重链基本上专门是所述包含人可变区的重链并且在产生正常比例或百分比的成熟脾B细胞(如通过FACS确定)的小鼠中表达；所述小鼠包含免疫球蛋白重链基因座，所述免疫球蛋白重链基因座包含位于小鼠恒定区(例如C-mu和/或C-delta和/或C-gamma；如(在5’至3’方向)上游的人VH、DH和JH基因区段，其中所述小鼠产生正常比例或百分比的成熟脾B细胞。
“正常”是指与仅表达小鼠抗体链的小鼠(例如首次用于实验的小鼠)、例如其基因组仅包含野生型功能性Ig重链和轻链基因座的小鼠、例如野生型小鼠中的成熟脾B细胞产生相当。
例如，至少40、50、60或70％的由本发明小鼠产生的总脾B细胞是成熟B细胞。脾B细胞是B220+并且如本领域技术人员所知以相对高水平表达B220。成熟脾B细胞表达B220和IgD，两者均在相对高水平，如本领域技术人员所知。IgM表达在成熟脾B细胞中相对低，同样是本领域已知的。例如见J Exp Med.1999 Jul 5；190(1):75-89；“B cell development inthe spleen takes place in discrete steps and is determined by the quality ofB cell receptor-derived signals”；Loder F et al.。
任选地，所述小鼠产生正常比率的T1、T2和成熟脾B细胞，如通过FACS确定。例如，本发明的小鼠产生大约40-70％成熟脾B细胞，15-35％脾T1细胞；及5-10％脾T2细胞(百分比参考总脾B220阳性(高)群)。例如，大约40-60％成熟脾B细胞，15-30％脾T1细胞；及5-10％脾T2细胞。“正常”是指与仅表达小鼠抗体链的小鼠(例如首次用于实验的小鼠)、例如其基因组仅包含野生型功能性Ig重链和轻链基因座的小鼠、例如野生型小鼠中的T1/T2/成熟脾B细胞比例相当。
78.方面70-77任一项的小鼠，用于在产生正常比例或百分比的骨髓B细胞祖细胞(如通过FACS确定)的小鼠中表达所述重链。
在一个实施方案中，小鼠用于在产生正常比例或百分比的骨髓前B细胞、原B细胞(pro-B cell)和前原B细胞(prepro-B cell)(如通过FACS确定)的小鼠中表达所述重链。关于祖细胞更多讨论参见J Exp Med.1991May 1；173(5):1213-25；“Resolution andcharacterization of pro-B and pre-pro-B cell stages in normal mouse bonemarrow”；Hardy RR et al。
“正常”是指与仅表达小鼠抗体链的小鼠(例如首次用于实验的小鼠)、例如其基因组仅包含野生型功能性Ig重链和轻链基因座的小鼠、例如野生型小鼠中的骨髓B细胞产生相当。
79.方面70-78任一项的小鼠，其中小鼠产生正常比例或百分比的骨髓B细胞祖细胞(如通过FACS确定)。
在一个实施方案中，所述小鼠产生正常比例或百分比的骨髓前B细胞、原B细胞和前原B细胞(如通过FACS确定)。
“正常”是指与仅表达小鼠抗体链的小鼠(例如首次用于实验的小鼠)、例如其基因组仅包含野生型功能性Ig重链和轻链基因座的小鼠、例如野生型小鼠中的骨髓B细胞产生相当。
80.表达或用于表达包含人可变区的免疫球蛋白重链的小鼠，其中由所述小鼠表达的重链基本上专门是所述包含人可变区的重链并且在产生正常比例或百分比的骨髓B细胞祖细胞(如通过FACS确定)的小鼠中表达；所述小鼠包含免疫球蛋白重链基因座，所述免疫球蛋白重链基因座包含位于小鼠恒定区(例如C-mu和/或C-delta和/或C-gamma；如(在5’至3’方向)上游的人VH、DH和JH基因区段，其中所述小鼠产生正常比例或百分比的骨髓B细胞祖细胞。
在一个实施方案中，所述小鼠用于在产生正常比例或百分比的骨髓前B细胞、原B细胞和前原B细胞(如通过FACS确定)的小鼠中表达所述重链。
“正常”是指与仅表达小鼠抗体链的小鼠(例如首次用于实验的小鼠)、例如其基因组仅包含野生型功能性Ig重链和轻链基因座的小鼠、例如野生型小鼠中的骨髓B细胞产生相当。
81.方面70-80任一项的小鼠，其中至少90％的重链是包含人可变区的重链。
例如，至少90、95、96、97、98、99或99.5％或100％的重链包含人可变区，即衍生自人VH与人D和JH基因区段的重组的可变区。
82.方面70-81任一项的小鼠，其中小鼠恒定区包含小鼠C-mu区、C-delta区和C-gamma区。
在一个实施方案中，每个C区均是内源性小鼠C区。在一个实施方案中，至少C-mu和C-delta区是小鼠C区。这对于利用参与脾和骨髓中多种B细胞类型和祖细胞的发育的内源性控制机制是有用的。
在一个实施方案中，C-gamma区是人C-gamma区。这对于在其中基本上全部表达的重链具有人可变区和人恒定区的小鼠中产生类别转换的γ型重链是有益的。
83.方面70-82任一项的小鼠，其中在人基因区段和小鼠恒定区之间有小鼠重链增强子。这对于利用内源性小鼠抗体和B细胞发育控制机制是有用的。
84.方面70-83任一项的小鼠，其中在人基因区段和小鼠恒定区之间有小鼠S-mu转换序列。
85.方面70-84任一项的小鼠，其中小鼠基因组包含位于人基因区段上游的内源性小鼠重链基因座V、D和J基因区段。
86.方面85的小鼠，其中小鼠V、D和J基因区段与内源性基因间区段序列一起存在。
87.方面85或86的小鼠，其中小鼠基因区段以倒位方向插入。因此，它们相对于小鼠基因组的野生型方向是倒位的。它们因此相对于小鼠恒定区方向是倒位的。
88.方面70-87任一项的小鼠，其中小鼠表达包含人可变区的轻链(例如包含人κ可变区的κ轻链)。因此，所述人可变区衍生自人VL和JL基因区段例如人Vκ和人Jκ之间的重组。
89.方面88的小鼠，包含位于小鼠CL(例如内源性Cκ)上游的人Vκ和Jκ基因区段；任选地其中所述人Vκ和Jκ基因区段包含Vκ2-24、Vκ3-20、Vκ1-17、Vκ1-16、Vκ3-15、Vκ1-13、Vκ1-12、Vκ3-11、Vκ1-9、Vκ1-8、Vκ1-6、Vκ1-5、Vκ5-2、Vκ4-1、Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4和Jκ5。
90.方面70-89任一项的小鼠，其中人VH、DH和JH基因区段包含人VH基因区段VH2-5、7-4-1、4-4、1-3、1-2、6-1、及全部人D和JH基因区段D1-1、2-2、3-3、4-4、5-5、6-6、1-7、2-8、3-9、5-12、6-13、2-15、3-16、4-17、6-19、1-20、2-21、3-22、6-25、1-26和7-27；及J1、J2、J3、J4、J5和J6。例如，人VH、DH和JH基因区段包含人VH基因区段VH2-5、7-4-1、4-4、1-3、1-2、6-1、及全部人D和JH基因区段D1-1、2-2、3-3、4-4、5-5、6-6、1-7、2-8、3-9、3-10、4-11、5-12、6-13、1-14、2-15、3-16、4-17、5-18、6-19、1-20、2-21、3-22、4-23、5-24、6-25、1-26和7-27；及J1、J2、J3、J4、J5和J6。
91.方面70-90任一项的小鼠用于表达包含人可变区的免疫球蛋白重链的应用，其中由所述小鼠表达的重链基本上专门是所述包含人可变区的重链；并且所述包含人可变区的重链作为小鼠中血清IgG1、IgG2b和IgM(及任选地IgG2a)抗体的部分而表达。所述应用是非治疗、非诊断和非手术应用。
在一个实施方案中，所述应用包括用抗原(例如人抗原)免疫小鼠及分离特异性结合所述抗原的IgG1抗体。
在一个实施方案中，所述应用包括用抗原(例如人抗原)免疫小鼠及分离特异性结合所述抗原的IgG2a抗体。
在一个实施方案中，所述应用包括用抗原(例如人抗原)免疫小鼠及分离特异性结合所述抗原的IgG2b抗体。
任选地，所述应用包括制备所述分离的抗体的衍生物。(根据本文任一方面的)衍生物抗体的例子是与所述分离的抗体相比具有一或多个突变的抗体(例如用于改良抗原结合亲和性和/或增强或失活Fc功能)。这种突变体特异性结合所述抗原。
92.方面70-90任一项的小鼠用于表达包含人可变区的免疫球蛋白重链的应用，其中由所述小鼠表达的重链基本上专门是所述包含人可变区的重链并且在产生正常比例或百分比的成熟脾B细胞的小鼠中表达。所述应用是非治疗、非诊断和非手术应用。
在一个实施方案中，所述应用进一步包括从小鼠分离脾组织(例如脾)；任选地随后从所述组织分离至少一个抗原特异性B细胞，其中所述B细胞表达特异性结合预定抗原的抗体。在一个实例中，所述应用包括在分离脾组织之前用抗原免疫小鼠。在一个实例中，所述应用包括分离由B细胞(或由B细胞与骨髓瘤细胞融合产生的杂交瘤)产生的抗体。任选地，所述应用包括制备所述分离的抗体的衍生物。(根据本文任一方面的)衍生物抗体的例子是与所述分离的抗体相比具有一或多个突变的抗体(例如用于改良抗原结合亲和性和/或增强或失活Fc功能)。这种突变体特异性结合所述抗原。
93.方面70-90任一项的小鼠用于表达包含人可变区的免疫球蛋白重链的应用，其中由所述小鼠表达的重链基本上专门是所述包含人可变区的重链并且在产生正常比例或百分比的骨髓B细胞祖细胞的小鼠中表达。所述应用是非治疗、非诊断和非手术应用。
94.方面70-90任一项的小鼠用于方面70、71、73、75和78之一或多项中描述的目的。
Ig的表达(例如表达百分比或表达比例或水平)可以在B细胞(例如外周血淋巴细胞)中的抗体链mRNA转录物水平确定。或者或额外地，表达百分比在脊椎动物血清或血液中的抗体水平确定。额外地或或者，表达可以经B细胞的FACS分析确定。
在这些方面中，“包含人可变区的重链”是指可变区衍生自人VH、D和JH基因区段的重组。
“基本上专门(Essentially exclusively)”表达的重链包含人可变区，即仅有相对非常低的或者甚至无内源性小鼠重链可变区表达。例如，至少90、95、96、97、98、99或99.5％或100％的重链是包含人可变区的重链。在一个实施方案中，至少90％的重链是包含人可变区的重链。表达百分比可以在B细胞(例如外周血淋巴细胞)中的重链mRNA转录物水平确定。或者或额外地，表达百分比在小鼠血清或血液中的重链或抗体水平确定。额外地或或者，表达可以经B细胞的FACS分析确定。
小鼠可以包含其中存在如本文所述的人V、D和J基因区段的任何内源性重链基因座。在一个实例中，小鼠基因组包含小鼠重链基因座，其中至少人VH基因区段VH2-5、7-4-1、4-4、1-3、1-2、6-1、及全部人D和JH基因区段D1-1、2-2、3-3、4-4、5-5、6-6、1-7、2-8、3-9、5-12、6-13、2-15、3-16、4-17、6-19、1-20、2-21、3-22、6-25、1-26和7-27；及J1、J2、J3、J4、J5和J6位于小鼠恒定区的上游。
这些方面中的脊椎动物是例如首次用于实验的(即未用预定抗原免疫的，如本领域对此术语的理解；例如，被保持在由用于R&D的动物房提供的相对无菌环境中的这种脊椎动物)。在另一个实例中，脊椎动物用预定抗原例如携带人表位的抗原免疫。
在一个实施方案中，重链与在本发明小鼠中表达的轻链一起形成抗体(Ig)。轻链可以从本文所述转基因轻链基因座表达。例如，小鼠基因组包含重链基因座，其是嵌合免疫球蛋白重链基因座，包含位于所述非人物种的mu恒定区上游的一或多个人V基因区段、一或多个人D基因区段及一或多个人J基因区段；内源性重链表达已被基本上失活；以及所述重链基因座包含所述非人脊椎动物物种的Eμ增强子。
在任何方面的一个实施方案中，内源性轻链(例如κ或λ)表达基本上无活性或用本文所述方法失活。在这种情况中，小于10、5、4、3、2、1或0.5％的这种内源性λ轻链被表达或可表达。额外或或者，小于10、5、4、3、2、1或0.5％的这种内源性κ轻链被表达或可表达。在一个实例中，内源性κ和/或λ表达完全失活，因此没有这种轻链被表达或可表达。
在一个实施方案中，小鼠基因组包含人κ基因区段：
(i)Vκ1-5、Vκ1-6、Vκ1-8和Vκ1-9(及任选地Vκ5-2和Vκ4-1)；或者
(ii)Vκ1-5、Vκ1-6、Vκ1-8、Vκ1-9、Vκ3-11、Vκ1-12、Vκ3-15、Vκ1-16、Vκ1-17、Vκ3-20(及任选地Vκ2-24和/或Vκ1-13)；或者
(iii)Vκ1-5、Vκ1-6、Vκ1-8、Vκ1-9、Vκ3-11、Vκ1-12、Vκ3-15、Vκ1-16、Vκ1-17、Vκ3-20、Vκ2-24、、Vκ1-27、Vκ2-28、Vκ2-30和Vκ1-33(及任选地Vκ2-29和/或Vκ2-40和/或Vκ1-39)；
及任选地
(iv)Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4和Jκ5。
在一个实施方案中，基因组还包含(i)至少人VH基因区段VH2-5、7-4-1、4-4、1-3、1-2、6-1、及全部人D和JH基因区段D1-1、2-2、3-3、4-4、5-5、6-6、1-7、2-8、3-9、5-12、6-13、2-15、3-16、4-17、6-19、1-20、2-21、3-22、6-25、1-26和7-27；及J1、J2、J3、J4、J5和J6及(ii)至少人基因区段Vκ2-24、Vκ3-20、Vκ1-17、Vκ1-16、Vκ3-15、Vκ1-13、Vκ1-12、Vκ3-11、Vκ1-9、Vκ1-8、Vκ1-6、Vκ1-5、Vκ5-2、Vκ4-1、Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4和Jκ5。如实施例16证实，这种小鼠在重排、BCR信号传导和B细胞成熟方面是完全功能性的。大于90％的由小鼠表达的抗体包含人重链可变区和人κ轻链可变区。这些小鼠因此对于在用人抗原免疫小鼠后选择具有特异性结合人抗原的人可变区的抗体非常有用。在分离这种抗体后，本领域技术人员可以用常规技术用人恒定区置换小鼠恒定区，以获得完全人抗体，其可以用作候选药物给予人类(任选地在突变和适应以产生进一步的例如具有Fc增强或失活的衍生物之后，或者在缀合于毒性有效负载或报道分子或标记或其它活性部分之后)。
在一个实施方案中，所述基因组还包含位于基因座中人J基因区段下游的人iEκ和/或人3’Eκ。
本发明还包括如下条款：
条款1.表达含有人可变区的免疫球蛋白重链的小鼠，
其中所述小鼠包含的基因组包括免疫球蛋白重链基因座，所述免疫球蛋白重链基因座包含位于小鼠恒定区上游的人VH、DH和JH基因区段；
其中所述小鼠表达免疫球蛋白重链，特征在于至少90％的由所述小鼠表达的免疫球蛋白重链包含人可变区；及
其中所述小鼠表达包含所述含人可变区的重链的血清IgG1、IgG2b和IgM抗体。
条款2.表达含有人可变区的免疫球蛋白重链的小鼠，
其中所述小鼠包含的基因组包括免疫球蛋白重链基因座，所述免疫球蛋白重链基因座包含位于小鼠恒定区上游的人VH、DH和JH基因区段；
其中所述小鼠表达免疫球蛋白重链，特征在于至少90％的由所述小鼠表达的免疫球蛋白重链包含人可变区；及
其中所述小鼠产生正常比例的成熟脾B细胞；
其中所述正常比例是由表达含有小鼠可变区的免疫球蛋白重链并且不表达含有人可变区的免疫球蛋白重链的小鼠产生的成熟脾B细胞的比例。
条款3.表达含有人可变区的免疫球蛋白重链的小鼠，
其中所述小鼠包含的基因组包括免疫球蛋白重链基因座，所述免疫球蛋白重链基因座包含位于小鼠恒定区上游的人VH、DH和JH基因区段；
其中所述小鼠表达免疫球蛋白重链，特征在于至少90％的由所述小鼠表达的免疫球蛋白重链包含人可变区；及
其中所述小鼠产生正常比例的骨髓B细胞祖细胞；
其中所述正常比例是由表达含有小鼠可变区的免疫球蛋白重链并且不表达含有人可变区的免疫球蛋白重链的小鼠产生的骨髓B细胞祖细胞的比例。
条款4.前述任一条款的小鼠，其中在得自所述小鼠的血清样品中所述小鼠表达正常比例的IgG1、IgG2b和IgM；
其中所述正常比例是由表达含有小鼠可变区的免疫球蛋白重链并且不表达含有人可变区的免疫球蛋白重链的小鼠产生的比例。
条款5.前述任一条款的小鼠，其中所述小鼠恒定区是C-mu、C-delta、和/或C-gamma。
条款6.条款5的小鼠，其中所述小鼠恒定区是至少C-mu、C-delta和C-gamma。
条款7.前述任一条款的小鼠，其中所述小鼠恒定区是内源性小鼠C区。
条款8.前述任一条款的小鼠，其中所述小鼠表达人C-gamma区。
条款9.前述任一条款的小鼠，其中所述小鼠是初次用于实验的小鼠。
条款10.条款1的小鼠，其中所述小鼠表达包含所述含有人可变区的重链的血清IgG2a。
条款11.前述任一条款的小鼠，其中所述小鼠表达Ig亚型，相对比例为：
(i)浓度为大约25-350μg/ml的血清IgG1；
(ii)浓度为大约0-200μg/ml的血清IgG2a；
(iii)浓度为大约30-800μg/ml的血清IgG2b；及
(iv)浓度为大约50-300μg/ml的血清IgM；
或者
(i)浓度为大约10-600μg/ml的血清IgG1；
(ii)浓度为大约0-500μg/ml的血清IgG2a；
(iii)浓度为大约20-700μg/ml的血清IgG2b；及
(iv)浓度为大约50-700μg/ml的血清IgM；
如通过在平板上免疫球蛋白捕获、随后与各包含标记的抗小鼠同种型特异性抗体保温及基于每个标记水平定量每个免疫球蛋白而确定。
条款12.前述任一条款的小鼠，其中所述小鼠表达Ig亚型，相对比例为
(i)浓度为大约200-2500μg/ml的总血清IgG和IgM；及
(ii)浓度为大约100-800μg/ml的血清IgM；
如通过在平板上免疫球蛋白捕获、随后与各包含标记的抗小鼠同种型特异性抗体保温及基于每个标记水平定量每个免疫球蛋白而确定。
条款13.前述任一条款的小鼠，其中所述小鼠表达来自脾B细胞的所述免疫球蛋白重链及其中所述小鼠产生在包含成熟B细胞和脾T1和T2细胞的总脾细胞中正常比例的成熟脾B细胞。
条款14.前述条款1-3任一项的小鼠，其中至少95、96、97、98、99或99.5％的由所述小鼠表达的免疫球蛋白重链是包含人可变区的免疫球蛋白重链。
条款15.前述任一条款的小鼠，其中小鼠免疫球蛋白重链增强子位于所述小鼠重链免疫球蛋白基因座中人VH、DH和JH基因区段和小鼠恒定区之间。
条款16.前述任一条款的小鼠，其中小鼠S-mu转换序列位于所述小鼠重链免疫球蛋白基因座中人VH、DH和JH基因区段和小鼠恒定区之间。
条款17.前述任一条款的小鼠，其中内源性小鼠免疫球蛋白重链V、D和J基因区段位于所述小鼠重链免疫球蛋白基因座中人VH、DH和JH基因区段的上游。
条款18.条款17的小鼠，其中所述小鼠免疫球蛋白重链V、D和J基因区段存在于具有内源性基因间区段序列的所述小鼠重链免疫球蛋白基因座中。
条款19.条款17或18的小鼠，其中所述小鼠免疫球蛋白重链V、D和J基因区段位于所述小鼠重链免疫球蛋白基因座中相对于其天然内源性方向是倒位的方向。
条款20.前述任一条款的小鼠，其中所述小鼠表达含有人κ可变区的轻链。
条款21.条款20的小鼠，其中所述小鼠表达衍生自Vκ与人Jκ重组的免疫球蛋白轻链。
条款22.前述任一条款的小鼠，其中所述小鼠表达含有人λ可变区的轻链。
条款23.条款22的小鼠，其中所述小鼠表达衍生自Vλ与人Jλ重组的免疫球蛋白轻链。
条款24.条款21的小鼠，其包含基因组，该基因组包括位于所述小鼠重链免疫球蛋白基因座中小鼠CL上游的人Vκ和Jκ基因区段。
条款25.条款24的小鼠，其中所述小鼠CL是内源性Cκ。
条款26.条款24或25的小鼠，其中人Vκ和Jκ基因区段包含Vκ2-24、Vκ3-20、Vκ1-17、Vκ1-16、Vκ3-15、Vκ1-13、Vκ1-12、Vκ3-11、Vκ1-9、Vκ1-8、Vκ1-6、Vκ1-5、Vκ5-2、Vκ4-1、Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4和Jκ5。
条款27.前述任一条款的小鼠，其中人VH、DH和JH基因区段含有
人VH基因区段：VH2-5、7-4-1、4-4、1-3、1-2、6-1；
人DH基因区段：D1-1、2-2、3-3、4-4、5-5、6-6、1-7、2-8、3-9、5-12、6-13、2-15、3-16、4-17、6-19、1-20、2-21、3-22、6-25、1-26和7-27；及
人JH基因区段：J1、J2、J3、J4、J5和J6。
条款28.获得一或多个含有人可变区的免疫球蛋白重链的方法，包括提供前述任一条款的小鼠，及分离一或多个免疫球蛋白重链。
条款29.条款28的方法，其中每个免疫球蛋白重链包括在抗体中。
条款30.条款29的方法，其中所述重链和/或所述含有所述重链的抗体在所述分离后被修饰。
条款31.条款28的方法，其中用抗原免疫小鼠的步骤在分离免疫球蛋白重链的步骤之前进行。
条款31a.条款30的方法，其中所述抗原是人抗原。
条款32.条款30、31或31a的方法，其中免疫球蛋白重链包括在特异性结合抗原的IgG1抗体、抗体片段或抗体衍生物中。
条款33.条款30、31或31a的方法，其中免疫球蛋白重链包括在特异性结合抗原的IgG2a抗体、抗体片段或抗体衍生物中。
条款34.条款30、31或31a的方法，其中免疫球蛋白重链包括在特异性结合抗原的IgG2b抗体、抗体片段或抗体衍生物中。
条款35.条款30、31或31a的方法，其中免疫球蛋白重链包括在特异性结合抗原的IgM抗体、抗体片段或抗体衍生物中。
条款36.在条款28-35任一项的方法中分离的抗体或免疫球蛋白重链，或者所述抗体或重链的抗原结合片段或衍生物。
条款37.药物组合物，包含条款36的抗体、抗体片段或抗体衍生物及药物学可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
条款38.分离脾组织的方法，包括提供条款1-27的小鼠，
从小鼠收集脾或其部分，及
从所述脾或部分获得组织。
条款39.条款38的方法，进一步包括从脾组织分离至少一个抗原特异性B细胞，其中所述B细胞表达含有人可变区的重链。
条款40.条款38或39的方法，其中用抗原免疫小鼠的步骤在从小鼠收集脾的步骤之前进行。
条款41.条款40的方法，其中所述抗原是人抗原。
条款42.条款40或41的方法，其中所述至少一个抗原特异性B细胞产生包含所述重链的IgG1、IgG2a、IgG2b或IgM抗体，其中所述抗体特异性结合所述抗原。
条款43.条款38-42的方法，其中产生所述重链的所述至少一个抗原特异性B细胞与永生的骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤细胞。
条款44.条款38-43的方法，进一步包括从所述B细胞或杂交瘤细胞分离免疫球蛋白重链的步骤。
条款45.在条款44的方法中分离的抗体或免疫球蛋白重链，或所述抗体或重链的抗原结合片段或衍生物。
条款46.药物组合物，包含条款45的抗体、抗体片段或抗体衍生物及药物学可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
条款47.获得人源化抗体的方法，包括
选择表达含有人可变区的免疫球蛋白重链的小鼠,
其中所述小鼠包含基因组，所述基因组包括免疫球蛋白重链基因座，所述基因座包含位于小鼠恒定区上游的人VH、DH和JH基因区段，
其中所述小鼠表达免疫球蛋白重链，特征在于至少90％的由所述小鼠表达的免疫球蛋白重链是含有人可变区的免疫球蛋白重链，
其中所述小鼠表达包含所述含有人可变区的重链的血清IgG1、IgG2b、和IgM抗体，
其中所述小鼠产生正常比例的成熟脾B细胞，
其中所述小鼠产生正常比例的骨髓B细胞祖细胞，及
其中在得自所述小鼠的血清样品中所述小鼠表达正常比例的IgG1、IgG2a、IgG2b和IgM，及
其中每个所述正常比例是由表达含有小鼠可变区的免疫球蛋白重链但不表达含有人可变区的免疫球蛋白重链的小鼠产生的比例；
从所述小鼠收集血清；及
从血清获得包含IgG1、IgG2b和IgM抗体的人源化抗体库。
条款48.条款47的方法，包括在从所述小鼠收集血清的步骤之前用抗原免疫小鼠的步骤。
条款49.条款48的方法，进一步包括步骤：
将所述人源化抗体库与所述抗原接触；
用所述人源化抗体库中的人源化抗体结合所述抗原；及
分离结合所述抗原的人源化抗体。
条款50.条款49的方法，进一步包括步骤：
将结合所述抗原的人源化抗体与同种型特异性抗体接触，其中所述同种型特异性抗体识别IgG1、IgG2a、IgG2b或IgM；及
分离结合所述同种型特异性抗体的人源化抗体。
条款51.条款48的方法，进一步包括步骤：
从所述小鼠收集脾或其组织，
从脾组织分离B细胞，
将所述B细胞与永生骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤细胞，表达包含来自血清的IgG抗体的人源化抗体库，其中所述抗体库用于条款48的方法中。
条款52.条款47-51任一项的方法，其中所述选择的小鼠包含小鼠免疫球蛋白重链V、D和J基因区段，其位于所述小鼠重链免疫球蛋白基因座中相对于其天然内源性方向是倒位的方向。
条款53.条款47-52任一项的方法，其中所述小鼠表达Ig亚型，相对比例为：
(i)浓度为大约25-350μg/ml的血清IgG1；
(ii)浓度为大约0-200μg/ml的血清IgG2a；
(iii)浓度为大约30-800μg/ml的血清IgG2b；及
(iv)浓度为大约50-300μg/ml的血清IgM；
或者
(i)浓度为大约10-600μg/ml的血清IgG1；
(ii)浓度为大约0-500μg/ml的血清IgG2a；
(iii)浓度为大约20-700μg/ml的血清IgG2b；及
(iv)浓度为大约50-700μg/ml的血清IgM；
如通过在平板上免疫球蛋白捕获、随后与各包含标记的抗小鼠同种型特异性抗体保温及基于每个标记水平定量每个免疫球蛋白而确定。
条款54.前述条款47-53任一项的方法，其中至少95、96、97、98、99或99.5％的由所述小鼠表达的免疫球蛋白重链是包含人可变区的免疫球蛋白重链。
条款55.前述条款47-54任一项的方法，其中小鼠免疫球蛋白重链增强子位于所述小鼠重链免疫球蛋白基因座中人VH、DH和JH基因区段和小鼠恒定区之间。
条款56.前述条款47-55任一项的方法，其中小鼠S-mu转换序列位于所述小鼠重链免疫球蛋白基因座中人VH、DH和JH基因区段和小鼠恒定区之间。
条款57.前述条款47-56任一项的方法，其中内源性小鼠免疫球蛋白重链V、D和J基因区段位于所述小鼠重链免疫球蛋白基因座中人VH、DH和JH基因区段的上游。
条款58.条款57的方法，其中所述小鼠免疫球蛋白重链V、D和J基因区段存在于具有内源性基因间区段序列的所述小鼠重链免疫球蛋白基因座中。
条款59.条款57或58的方法，其中所述小鼠免疫球蛋白重链V、D和J基因区段位于所述小鼠重链免疫球蛋白基因座中相对于其天然内源性方向是倒位的方向。
条款60.条款47-59任一项的方法，其中所述小鼠表达含有人κ可变区的轻链。
条款61.条款60的方法，其中所述小鼠表达含有人Jκ的免疫球蛋白轻链。
条款62.条款47-51任一项的方法，其中所述小鼠表达含有人λ可变区的轻链。
条款63.条款62的方法，其中所述小鼠表达含有人Jλ的免疫球蛋白轻链。
条款64.条款61的方法，其包含基因组，所述基因组包括位于所述小鼠重链免疫球蛋白基因座中小鼠CL上游的人Vκ和Jκ基因区段。
条款65.条款64的方法，其中所述小鼠CL是内源性Cκ。
条款66.条款64或65的方法，其中人Vκ和Jκ基因区段包含Vκ2-24、Vκ3-20、Vκ1-17、Vκ1-16、Vκ3-15、Vκ1-13、Vκ1-12、Vκ3-11、Vκ1-9、Vκ1-8、Vκ1-6、Vκ1-5、Vκ5-2、Vκ4-1、Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4和Jκ5。
条款67.条款47-51任一项的方法，其中人VH、DH和JH基因区段含有
人VH基因区段：VH2-5、7-4-1、4-4、1-3、1-2、6-1；
人DH基因区段：D1-1、2-2、3-3、4-4、5-5、6-6、1-7、2-8、3-9、5-12、6-13、2-15、3-16、4-17、6-19、1-20、2-21、3-22、6-25、1-26和7-27；及
人JH基因区段：J1、J2、J3、J4、J5和J6。
本发明还包括下述属性
属性1.分离的非人脊椎动物、任选地哺乳动物细胞，其基因组包含Ig H链基因座，所述基因座在5’至3’转录方向包含V区、J区、D区、大鼠转换序列和C区，其中C区不是大鼠C区。
属性1a.分离的非人脊椎动物、任选地哺乳动物、细胞，其基因组包含Ig H链基因座，所述基因座在5’至3’转录方向包含V区、J区、D区、大鼠转换序列，
其中所述基因座包含人-大鼠和/或小鼠-大鼠序列连接(junction)，及
其中大鼠序列由大鼠转换序列提供。
属性2.分离的非人脊椎动物、任选地哺乳动物细胞，其基因组包含Ig H链基因座，所述基因座在5’至3’转录方向包含V区、J区、D区、大鼠转换序列和C区，其中大鼠转换序列是包含重复序列GGGCT的至少3个连续重复的大鼠S-mu序列(SEQ ID No.46–50)。
属性3.分离的非人脊椎动物、任选地哺乳动物细胞，其基因组包含Ig H链基因座，所述基因座在5’至3’转录方向包含V区、J区、D区、大鼠转换序列和C区，其中大鼠转换序列是包含GAGCT(296个重复)、GGGGT(50个重复)和/或GGGCT(83个重复)的大鼠S-mu序列。
属性4.非人脊椎动物生物体、任选地哺乳动物，其基因组包含Ig H链基因座，所述基因座在5’至3’转录方向包含V区、J区、D区、大鼠转换序列和C区，其中C区不是大鼠C区。
属性4a.非人脊椎动物生物体、任选地哺乳动物，其基因组包含Ig H链基因座，所述基因座在5’至3’转录方向包含V区、J区、D区、大鼠转换序列，
其中所述基因座包含人-大鼠和/或小鼠-大鼠序列连接(junction)，及
其中大鼠序列由大鼠转换序列提供。
属性5.非人脊椎动物生物体、任选地哺乳动物，其基因组包含Ig H链基因座，所述基因座在5’至3’转录方向包含V区、J区、D区、大鼠转换序列和C区，其中大鼠转换序列是包含重复序列GGGCT的至少3个连续重复的大鼠S-mu序列(SEQ ID No.46–50)。
属性6.非人脊椎动物生物体、任选地哺乳动物，其基因组包含Ig H链基因座，所述基因座在5’至3’转录方向包含V区、J区、D区、大鼠转换序列和C区，其中大鼠转换序列是包含GAGCT(296个重复)、GGGGT(50个重复)和/或GGGCT(83个重复)的大鼠S-mu序列。
属性7.分离的非人脊椎动物细胞或生物体，任选地哺乳动物，其基因组包含Ig H链基因座，所述Ig H链基因座包含来自3个或更多个脊椎动物物种的DNA序列，所述Ig H链基因座在5’至3’转录方向至少包含V区、J区、D区、增强子、大鼠转换序列和C区。
属性8.属性1-7任一项的非人脊椎动物细胞或生物体，其中所述细胞或生物体的基因组进一步包含Ig L链基因座，所述Ig L链基因座包含来自3个或更多个脊椎动物物种的DNA序列，且其中所述Ig L链基因座在5’至3’转录方向至少包含人V区、人J区和C区。
属性9.属性7或8的非人脊椎动物细胞或生物体，其中所述3个或更多个脊椎动物物种是小鼠、人和大鼠。
属性10.属性1-9任一项的非人脊椎动物细胞或生物体，其中所述C区是所述细胞或生物体内源性的，且所述V、D和/或J区是人的。
属性11.属性1-10任一项的非人脊椎动物细胞或生物体，其中所述IgH链基因座包含多个V区、一或多个D区及一或多个J区和/或其中所述IgL链基因座包含多个V区及一或多个J区。
属性12.属性1-11任一项的非人脊椎动物细胞或生物体，其中所述V区是人的或所述多个V区是人的。
属性13.属性1-11任一项的非人脊椎动物细胞或生物体，其中所述D区是人的或所述一或多个D区是人的。
属性14.属性1-11任一项的非人脊椎动物细胞或生物体，其中所述J区是人的或所述一或多个J区是人的。
属性15.属性11-14任一项的非人脊椎动物细胞或生物体，其中所述V区是人的或所述多个V区是人的，所述D区是人的或所述一或多个D区是人的，及所述J区是人的或所述一或多个J区是人的。
属性16.属性1、1a、4a、4、7-11和15任一项的非人脊椎动物细胞或生物体，其中所述大鼠转换序列是大鼠S-mu。
属性17.属性1、4、7-11和15任一项的非人脊椎动物细胞或生物体，进一步包括位于所述大鼠转换序列上游并与该序列可操纵相关的小鼠增强子序列。
属性18.属性16的非人脊椎动物细胞或生物体，进一步包括位于所述大鼠S-mu序列上游并与该序列可操纵相关的小鼠增强子序列。
属性19.属性1-4、7-15任一项的非人脊椎动物细胞或生物体，其中C区是小鼠C区或人C区之一。
属性20.属性19的非人脊椎动物细胞或生物体，其中C区是CH1。
属性21.属性19的非人脊椎动物细胞或生物体，其中小鼠C区是C-mu或C-gamma之一或多个。
属性22.属性21的非人脊椎动物细胞或生物体，其中小鼠C区是C-mu和C-gamma。
属性23.属性7的非人脊椎动物细胞或生物体，其中细胞是小鼠细胞，或者脊椎动物是小鼠，并且其中小鼠C区是内源性小鼠C区。
属性24.属性1、1a、4a、4和7任一项的非人脊椎动物细胞或生物体，其中大鼠S-mu序列包含重复序列GGGCT的至少3个、直至83个连续重复(SEQ ID NO.46–50)。
属性25.属性1、1a、2、4、4a、5和7任一项的非人脊椎动物细胞或生物体，包含大鼠S-mu序列，该序列包含基序GAGCT的296个重复。
属性26.属性1、1a、2、4、4a、5和7任一项的非人脊椎动物细胞或生物体，包含大鼠S-mu序列，该序列包含基序GGGGT的50个重复。
属性27.属性1、1a、2、4、4a、5和7任一项的非人脊椎动物细胞或生物体，包含大鼠S-mu序列，该序列包含基序GGGCT的83个重复。
属性28.前述任一属性的非人脊椎动物细胞或生物体，其中大鼠S-mu序列包含SEQID NO 1。
属性29.前述任一属性的非人脊椎动物细胞，其中所述细胞是ES细胞、造血干细胞或杂交瘤。
属性30.前述任一属性的非人脊椎动物细胞或生物体，其中所述细胞或生物体分别是小鼠ES细胞或小鼠。
属性31.属性1-10任一项的非人脊椎动物细胞或生物体，其中所述IgH链基因座包含与大鼠S-mu序列可操纵相关的人JH、人DH和人VH2-5。
属性32.属性1-10任一项的非人脊椎动物细胞或生物体，其中所述IgH链基因座包含与大鼠S-mu序列可操纵相关的人JH1-5、人DH和人。
属性33.属性1-10任一项的非人脊椎动物细胞或生物体，其中所述细胞是小鼠细胞或所述生物体是小鼠；
其中所述Ig H链基因座包含位于大鼠转换序列上游并与该序列可操纵相关的小鼠增强子，所述大鼠转换序列是大鼠S-mu，及
其中所述C区是小鼠恒定区。
属性34.属性33的非人脊椎动物细胞或生物体，其中所述Ig H链V、D和J区是人的和/或所述Ig L链V和J区是人的。
属性35.属性1-10的非人脊椎动物细胞或生物体，其中所述Ig H链基因座包含重排的VDJ区。
属性36.属性35的非人脊椎动物细胞或生物体，其中所述重排的VDJ区是人的。
属性37.属性1-10任一项的非人脊椎动物细胞或生物体，其中所述细胞或生物体包含基因组，所述基因组包含位于宿主非人哺乳动物恒定区上游的人DNA，该人DNA包含多个人IgH V区、一或多个人D区及一或多个人J区，并且其中所述人IgH VDJ区包含来自人染色体14的核苷酸105,400,051至106,368,585(坐标参照人基因组NCBI36，ENSEMBLRelease54)，或者来自另一人类的等价人区域。
属性38.属性37的非人脊椎动物细胞或生物体，其中人DNA位于非人哺乳动物恒定区和任何其它非人J区3’远端的非人哺乳动物J区之间。
属性39.属性37的非人脊椎动物细胞或生物体，当所述细胞是小鼠细胞或者所述生物体是小鼠时，所述V、D和J区是人的并且位于小鼠染色体12的坐标114,667,091和114,665,190之间(坐标参照小鼠C57BL/6J品系的NCBI m37)，或者在另一非人哺乳动物基因组的等价位置。
属性40.属性39的非人脊椎动物细胞或生物体，当所述细胞是小鼠细胞或者所述生物体是小鼠时，所述V、D和J区是人的并且位于坐标114,667,089和114,667,090之间(坐标参照小鼠C57BL/6J品系的NCBI m37)，或者在另一非人哺乳动物基因组的等价位置。
属性41.属性37的非人脊椎动物细胞或生物体，其中所述细胞是小鼠细胞或者所述生物体是小鼠，并且其中所述V、D和J区是人的并且位于小鼠染色体12的坐标114,666,183和114,666,725之间、如在坐标114,666,283和114,666,625之间、任选地在坐标114,666,335和114,666,536之间、任选地在坐标114,666,385和114,666,486之间、任选地在坐标114,666,425和114,666,446之间、如在坐标114,666,435和114,666,436之间，坐标参照小鼠品系C57BL/6J的小鼠基因组NCBI m37或者来自不同小鼠品系的小鼠染色体12的等价位置或者在另一非人脊椎动物基因组的等价位置。
属性42.属性1-10任一项的非人脊椎动物细胞或生物体，其中所述细胞是小鼠细胞或者所述生物体是小鼠并且其中所述Ig H链V、D和J区或者所述Ig L链V和J区是人的。
属性43.属性1-10任一项的非人脊椎动物细胞或生物体，其中所述V、D和J区是人的并且包含或由人染色体14的核苷酸106,328,851-107,268,544、如核苷酸106,328,901-107,268,494、如核苷酸106,328,941-107,268,454、如核苷酸106,328,951-107,268,444组成，位置参照GRCH37/hg19序列数据库，或者来自不同人序列或数据库的涉及染色体14的等价核苷酸。
属性44.属性1-10任一项的非人脊椎动物细胞或生物体，包含人κVJ区DNA，所述DNA包含来自人的种系构型的全部V和J区及间插序列。
属性45.属性44的非人脊椎动物细胞或生物体，其中人κVJ区DNA位于小鼠染色体6的坐标70,673,918-70,675,517之间，如坐标70,674,418-70675,017之间，如坐标70,674,655-70,674,856之间，如坐标70,674,705–70,674,906之间，如坐标70,674,745–70,674,766之间，如坐标70,674,755和70,674,756之间(参照与小鼠品系C57BL/6J相关的小鼠基因组NCBI m37)，或者在另一基因组的等价位置。
属性46.属性45的非人脊椎动物细胞或生物体，其中人κVJ区DNA包含或由来自人染色体2、编号参照GRCH37/hg19序列数据库或来自不同人序列或数据库的涉及染色体2的等价核苷酸的片段组成，所述片段选自如下1或多个：(i)核苷酸89,158,979-89,630,537，如89,159,029-89,630,487，如89,159,069-89,630,447，如89,159,079-89,630,437，任选地还有片段(ii)；(ii)核苷酸89,941,614-90,267,076，如89,941,664-90,267,026，如89,941,704-90,266,986，如89,941,714-90,266,976；任选地还有片段(i)；及(iii)核苷酸89,158,979-90,267,076，如核苷酸89,159,079-90,266,976。
属性47.属性1-10任一项的非人脊椎动物细胞或生物体，包含人λ区DNA，所述DNA包含至少一个人Jλ区和至少一个人Cλ区，任选地Cλ6和/或Cλ7。
属性48.属性47的非人脊椎动物细胞或生物体，包含多个人Jλ区，任选地Jλ1、Jλ2、Jλ6和Jλ7中的二或更多个，任选地全部Jλ1、Jλ2、Jλ6和Jλ7。
属性49.属性47的非人脊椎动物细胞或生物体，包含至少一个人Jλ-Cλ簇，任选地至少Jλ7-Cλ7。
属性50.属性1-10任一项的非人脊椎动物细胞或生物体，包含人Eλ增强子。
属性51.属性1-10任一项的非人脊椎动物细胞或生物体，包含人λVJ区DNA，所述DNA包含来自人的种系构型的全部V和J区及间插序列。
属性52.属性51的非人脊椎动物细胞或生物体，其中人λVJ区DNA包含或由来自人染色体22的核苷酸22,375,509-23,327,984、如核苷酸22,375,559-23,327,934、如核苷酸22,375,599-23,327,894、如核苷酸22,375,609-23,327,884组成，核苷酸位置参照GRCH37/hg19序列数据库或者来自不同人序列或数据库的与人染色体22相关的等价核苷酸。
属性53.属性1-10任一项的非人脊椎动物细胞或生物体，其中非小鼠DNA位于小鼠基因组中小鼠染色体16的坐标19,027,763和19,061,845之间，如坐标19,037,763和19,051,845之间，如坐标19,047,451和19,047,652之间，如坐标19,047,491和19,047,602之间，如坐标19,047,541和19,047,562之间，如坐标19,047,551和19,047,552之间，所述坐标参照小鼠基因组NCBI m37，或者在另一基因组的等价位置。
属性54.属性1-10任一项的非人脊椎动物细胞或生物体，其中非人DNA位于小鼠基因组中小鼠染色体6的坐标70,673,918和70,675,517之间，如坐标70,674,418和70,675,017之间，如坐标70,674,655和70,674,856之间，如坐标70,674,705和70,674,806之间，如坐标70,674,745和70,674,766之间，如坐标70,674,755和70,674,756之间，所述坐标参照与小鼠品系C57BL/6J相关的小鼠基因组NCBI m37，或者在另一基因组的等价位置。
属性55.属性1-10任一项的非人脊椎动物细胞或生物体，其中所述V、D和J区是人的并且人轻链κVJC DNA或其部分插入在小鼠κVJC区的立即上游。
属性56.属性1-10任一项的非人脊椎动物细胞或生物体，其中所述细胞或生物体的基因组被修饰以防止或降低完全宿主物种特异性抗体的表达。
属性57.属性56的非人脊椎动物细胞或生物体，其中所述细胞或生物体的基因组被全部或部分非人哺乳动物VDJ区或VJ区的倒位而修饰。
属性58.属性56的非人脊椎动物细胞或生物体，其中所述细胞或生物体的基因组包含人DNA和非人DNA，并且所述非人DNA包含内源性V和J区或者未被缺失的V、D和J区。
属性59.属性1-10任一项的非人脊椎动物生物体，其在防止成熟宿主B和T淋巴细胞产生的遗传背景中产生。
属性60.属性59的非人脊椎动物生物体，其在Rag-1或Rag-2缺陷背景中产生。
属性61.属性29的非人脊椎动物细胞，其是能发育成非人哺乳动物的ES细胞或造血干细胞，所述非人哺乳动物能产生嵌合抗体或抗体链库集，所述嵌合抗体或抗体链具有非人哺乳动物恒定区和人可变区。
属性62.属性29的非人脊椎动物细胞，其是能有助于非人哺乳动物组织或器官的ES细胞或造血干细胞，所述非人哺乳动物组织或器官能产生嵌合抗体或抗体链库集，所述嵌合抗体或抗体链具有非人哺乳动物恒定区和人可变区。
属性63.属性1-10任一项的非人脊椎动物细胞或生物体，包含来自至少人重链和人轻链的人可变区DNA。
属性64.属性1-10任一项的非人脊椎动物细胞或生物体，其中所述细胞或生物体在一个、两个或全部三个免疫球蛋白基因座对于编码嵌合抗体链的DNA是纯合的。
属性65.属性1-10任一项的非人脊椎动物细胞或生物体，其中所述细胞或生物体在一个、两个或全部三个免疫球蛋白基因座对于编码嵌合重链或轻链的DNA是杂合的。
属性66.属性1-10的非人脊椎动物细胞或生物体，其中所述细胞或生物体的基因组不包含来自另一细胞或生物体的恒定区DNA。
属性67.属性29的非人脊椎动物细胞，其是永生化的。
属性68.属性67的非人脊椎动物细胞，其是ES细胞系AB2.1，或者是来自选自C57BL/6、M129、129/SV、BALB/c以及C57BL/6、M129、129/SV BALB/c的任何杂种的小鼠品系的细胞。
属性69.获得包含人免疫球蛋白可变区的免疫球蛋白重链的方法，
包括提供属性1a、4、4a、5-28、30-60和63-66任一项的小鼠，及
分离包含免疫球蛋白重链的多肽，所述重链包含所述人可变区。
属性69a.属性69的方法，其中所述免疫球蛋白重链是二链或四链抗体的重链。
属性69b.根据属性69的方法分离的抗体。
属性69c.药物组合物，其包含属性69b的抗体及药物学可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
属性69d.属性69或69a的方法，其中在分离免疫球蛋白重链的步骤之前进行用抗原免疫小鼠的步骤。
属性69e.属性69d的方法，其中所述抗原是人抗原。
属性69f.属性69或69a的方法，其中所述免疫球蛋白重链是同种型IgG1、IgG2、IgG3和IgM之一，所述人可变区特异性结合所述抗原。
属性69g.属性69f的方法，其中所述免疫球蛋白重链是二链或四链抗体的重链，并且所述抗体特异性结合所述抗原。
属性70.多核苷酸着陆垫序列，所述多核苷酸包含与靶染色体区域同源的核酸区域以允许通过同源重组插入靶染色体，并且包含允许重组酶驱动的核酸插入进着陆垫的核酸位点，其中所述多核苷酸序列包含如下之一或多个：(i)大鼠转换序列，任选地大鼠S-mu转换序列，其任选地是SEQ ID NO 1的序列；(ii)在5'至3'方向，小鼠Eμ序列、大鼠转换序列和小鼠Cμ；和/或(iii)具有SEQ ID NO 6的序列的3'同源臂。
属性71.包含已被插入细胞基因组中的属性70的着陆垫序列的非人脊椎动物生物体、任选地哺乳动物。
属性72.非人脊椎动物细胞或生物体、任选地哺乳动物，或属性70或71的着陆垫，其中大鼠转换序列包含序列GGGCT的3、4、5、6或更多个连续重复，任选地是SEQ ID NO 1。
属性73.非人脊椎动物细胞或生物体、任选地哺乳动物，或属性70-72任一项的着陆垫，其中着陆垫序列包含SEQ ID NO 2的序列。
属性74.非人脊椎动物细胞或生物体、任选地哺乳动物，或属性70-73任一项的着陆垫，其中着陆垫序列包含SEQ ID NO 3的序列。
属性75.产生分离的非人脊椎动物细胞、任选地哺乳动物细胞的方法，包括：
将一或多个非天然DNA构建体插入非人哺乳动物细胞基因组，
由此产生细胞，其基因组包括Ig H链基因座，该基因座在5’至3’转录方向具有V区、J区、D区、大鼠转换序列和C区，其中C区不是大鼠C区。
属性76.产生分离的非人脊椎动物细胞、任选地哺乳动物细胞的方法，包括：
将一或多个非天然DNA构建体插入非人哺乳动物细胞基因组，
由此产生细胞，其基因组包括Ig H链基因座，该基因座在5’至3’转录方向具有V区、J区、D区、大鼠转换序列和C区，其中大鼠转换序列是大鼠S-mu序列，其包含重复序列GGGCT的至少3个连续重复(SEQ ID NO.46–50)。
属性77.产生非人脊椎动物细胞任选地哺乳动物细胞的方法，包括：
将一或多个非天然DNA构建体插入非人哺乳动物细胞基因组，
由此产生细胞，其基因组包括Ig H链基因座，该基因座在5’至3’转录方向具有V区、J区、D区、大鼠转换序列和C区，其中大鼠转换序列是大鼠S-mu序列，其包含GAGCT(296个重复)、GGGGT(50个重复)和/或GGGCT(83重复)。
属性78.产生非人脊椎动物生物体任选地哺乳动物的方法，包括：
将一或多个非天然DNA构建体插入非人哺乳动物细胞基因组，
由此产生包括Ig H链基因座的基因组，该基因座在5’至3’转录方向具有V区、J区、D区、大鼠转换序列和C区，其中C区不是大鼠C区。
属性79.产生非人脊椎动物生物体任选地哺乳动物的方法，包括：
将一或多个非天然DNA构建体插入非人哺乳动物细胞基因组，
由此产生包括Ig H链基因座的基因组，该基因座在5’至3’转录方向具有V区、J区、D区、大鼠转换序列和C区，其中大鼠转换序列是大鼠S-mu序列，其包含重复序列GGGCT的至少3个连续重复(SEQ ID NO.46–50)。
属性80.产生非人脊椎动物生物体任选地哺乳动物的方法，包括：
将一或多个非天然DNA构建体插入非人哺乳动物细胞基因组，
由此产生包括Ig H链基因座的基因组，该基因座在5’至3’转录方向具有V区、J区、D区、大鼠转换序列和C区，其中大鼠转换序列是大鼠S-mu序列，其包含GAGCT(296个重复)、GGGGT(50个重复)和/或GGGCT(83个重复)。
属性81.产生分离的非人脊椎动物细胞或生物体任选地哺乳动物的方法，包括：
将一或多个非天然DNA构建体插入非人哺乳动物细胞基因组，
由此产生包括具有来自三个或更多个哺乳动物物种的DNA的Ig H链基因座的基因组，其中所述Ig H链基因座在5’至3’转录方向包括至少V区、D区、J区、增强子、大鼠转换序列和C区。
属性82.属性75-81任一项的方法，进一步包括：
将一或多个非天然DNA构建体插入非人哺乳动物细胞基因组，
由此产生包括Ig L链基因座的基因组，所述Ig L链基因座在5’至3’转录方向至少包含人VL区、人JL区和CL区。
属性83.属性81或82的方法，其中所述恒定区(CL)是小鼠或人恒定区。
属性84.属性81或82的方法，其中增强子是小鼠增强子序列。
属性85.属性75、78或81-84任一项的方法，其中所述大鼠转换序列是大鼠S-mu。
属性86.属性75-85任一项的方法，其中所述V、D和/或J区是人的或者V和/或J区是人的。
属性87.属性75-86任一项的方法，其中Ig H基因座C区是小鼠C区或人C区之一。
属性88.属性75-87任一项的方法，其中所述非人哺乳动物细胞基因组然后被修饰以防止天然(完全宿主物种特异性)抗体在细胞或脊椎动物生物体中表达，任选地修饰是通过全部或部分宿主非人哺乳动物Ig基因座的倒位、任选地将一或多个位点特异性重组酶位点插入基因组及然后在重组酶介导的全部或部分宿主非人哺乳动物Ig基因座的切除或倒位中使用这些位点进行。
属性89.属性75-88任一项的方法，其中所述细胞是ES细胞。
属性90.属性75-89任一项的方法，其中插入DNA的步骤是通过同源重组逐步插入多个构建体实现的，并且其中所述DNA插入在宿主非人哺乳动物恒定区的上游。
属性91.属性75-90任一项的方法，其中插入DNA的步骤发生在初始盒已插入ES细胞基因组的位点，由此提供独特的靶向区。
属性92.属性75-91任一项的方法，其中一或多个插入事件利用位点特异性重组。
属性93.属性92的方法，其中所述一或多个插入事件涉及或由Frt位点、Flp重组酶、Dre重组酶、Rox位点或PhiC31重组酶之一或多个介导。
属性94.属性75-93任一项的方法，其中将一或多个非天然DNA构建体插入非人哺乳动物细胞基因组中
包括步骤：
1将形成初始盒(本文也称为着陆垫)的DNA插入细胞基因组中；
2将第一个DNA片段插入到插入位点，所述第一个DNA片段包含人DNA的第一部分和含有第一选择标记或在插入时产生选择标记的第一载体部分；
3任选地除去部分载体DNA；
4将第二个DNA片段插入第一个DNA片段的载体部分，所述第二个DNA片段含有人DNA的第二部分和第二载体部分，所述第二载体部分含有第二选择标记或者在插入时产生第二选择标记；
5除去任何载体DNA以允许第一个和第二个人DNA片段形成连续序列；及
6按需要重复部分人V(D)J DNA插入和载体DNA除去步骤，以产生具有全部或部分人VDJ或VJ区的细胞，足以能够产生与宿主恒定区组合的嵌合抗体，
其中至少一个DNA片段的插入使用位点特异性重组。
属性95.属性75-94任一项的方法，其中着陆垫序列包含SEQ ID NO 6、SEQ IDNO.2或SEQ ID NO.3。
属性96.属性75-95任一项的方法，其中着陆垫通过小鼠J1-4和小鼠C mu序列之间的同源重组插入到小鼠细胞基因组中。
属性97.属性75-96任一项的方法，其中着陆垫通过小鼠J1-4和E mu序列之间的同源重组而重组到小鼠细胞基因组中。
属性98.属性75-97任一项的方法，其中着陆垫包含非宿主S-mu，如大鼠S-mu转换序列。
属性99.属性1-98任一项的方法、细胞或哺乳动物，其中人编码区DNA序列与非人哺乳动物控制序列呈功能排列，由此人DNA的转录由非人哺乳动物控制序列控制。
属性100.产生特异于希望抗原的抗体或抗体重链或轻链的方法，所述方法包括用希望抗原免疫属性4–28、30-60、63-66或71-74中的非人脊椎动物，及回收所述抗体或抗体链，或者回收产生所述抗体或重链或轻链的细胞。
属性101.产生完全人源化抗体或抗体链的方法，包括进行属性100的方法，然后用人恒定区置换回收的抗体或抗体链的非人哺乳动物恒定区，合适地通过编码所述抗体或抗体链的核酸的工程化进行。
属性102.根据属性100或101产生的人源化抗体或抗体链，或其结合希望抗原的衍生物。
属性103.根据属性100或101产生的人源化抗体或抗体链或其结合希望抗原的衍生物在医药学中的应用。
属性104.根据属性100或101产生的人源化抗体或抗体链或其结合希望抗原的衍生物，用于医药学。
属性105.药物组合物，其包含根据属性100或101产生的抗体或抗体链或其结合希望抗原的衍生物及药物学可接受的载体或其它赋形剂。
属性106.根据属性100产生的嵌合抗体的嵌合抗体衍生物，其中所述衍生物结合希望的抗原。
属性107.小鼠，其基因组包含在小鼠染色体12的坐标114,667,090和114,665,190之间、如坐标114,667,089和114,667,090之间的人IgH VDJ DNA的插入，所述插入包含来自人染色体14的核苷酸105,400,051至106,368,585(坐标参照对于人基因组的NCBI36及对于小鼠C57BL/6J品系的NCBI m37，或者分别在另一人染色体14序列中或在另一小鼠基因组中的等价坐标)，所述插入在宿主非人哺乳动物恒定区的上游，由此所述小鼠能产生具有非人哺乳动物恒定区和人可变区的嵌合重链的库集，其中所述哺乳动物也包含完整VJC人轻链区的插入，由此可以产生完全人λ或κ人抗体链，其能与嵌合重链形成抗体。
属性108.小鼠，其基因组包含在小鼠染色体12的坐标114,667,090和114,667,091之间的人IgH VDJ DNA的插入，所述插入包含或由来自人染色体14的核苷酸105,400,051至106,368,585组成(坐标参照对于人基因组的NCBI36及对于小鼠C57BL/6J品系的NCBI m37，或者分别在另一人染色体14序列中或在另一小鼠基因组中的等价坐标)，所述插入在小鼠恒定区的上游，由此所述小鼠能产生具有小鼠恒定区和人可变区的嵌合重链的库集，其中所述小鼠也包含完整VJC人轻链区的插入，由此可以产生完全人λ或κ人抗体链，其能与嵌合重链形成抗体。
属性109.小鼠，其基因组包含在小鼠染色体12的坐标114,667,090和114,665,190之间的人IgH VDJ DNA的插入，其中坐标参照对于小鼠C57BL/6J品系的NCBI m37或者在另一小鼠品系中的等价位置的插入，所述插入包含或由来自人染色体14的核苷酸106,328,951-107,268,444组成，其中坐标参照人类GRCH37/hg19序列数据库或者来自另一人染色体14序列中的等价位置的相同核苷酸，所述插入在宿主小鼠恒定区的上游，由此所述小鼠能产生具有小鼠恒定区和人可变区的嵌合重链的库集，其中所述小鼠也包含完整VJC人轻链区的插入，其对于产生能与嵌合重链形成抗体的完全人λ或κ人抗体链是功能性的。
属性110.属性109的小鼠，其中所述插入在小鼠染色体12的坐标114,666,435和114,666,436之间。
属性116.制备非人脊椎动物细胞、任选地小鼠或大鼠的方法，所述方法包括：
(a)提供属性29、61、62或68的非人ES细胞，及
由此所述非人ES细胞能产生后代细胞，所述后代细胞中内源性抗体表达被失活，并且其中所述后代细胞能表达包含人可变区的抗体；及
(b)任选地将所述非人ES细胞分化成所述后代细胞或者包含所述后代细胞的非人脊椎动物生物体。
属性117.属性116的方法，其中所述多个人抗体基因区段包含至少11个人V区段。
属性118.属性116或117的方法，其中所述多个人抗体基因区段包含至少6个人J区段。
属性119.属性116-118任一项的方法，其中在步骤(b)中插入人核苷酸序列，所述核苷酸序列包含所述抗体基因区段，其中所述核苷酸序列为至少110kb。
属性120.属性116-119任一项的方法，其中内源性基因座是重链基因座，人抗体基因区段是在最3’内源性JH基因区段和内源性C-mu之间。
属性121.属性116-120任一项的方法，其中所述后代细胞对于所述转基因基因座是纯合的。
属性122.分离结合预定抗原的抗体的方法，所述方法包括：
(a)提供属性1a、4、4a、5–28、30-60、63-66或71-74和107-110任一项的脊椎动物生物体、小鼠或哺乳动物、任选地大鼠；
(b)用所述抗原免疫所述脊椎动物生物体、小鼠或哺乳动物(任选地其中所述抗原是感染性疾病病原体的抗原)；
(c)从所述脊椎动物生物体、小鼠或哺乳动物取出B淋巴细胞，选择表达结合所述抗原的抗体的一或多个B淋巴细胞；
(d)任选地永生化所述选择的B淋巴细胞或其后代，任选地通过从其产生杂交瘤而永生化；及
(e)分离由所述B淋巴细胞表达的抗体(例如IgG型抗体)。
属性123.属性122的方法，包括从所述B淋巴细胞分离编码结合所述抗原的所述抗体的核酸的步骤，任选地用编码人或人源化重链恒定区的核苷酸序列交换抗体的重链恒定区核苷酸序列，及任选地亲和性成熟所述抗体的可变区；及任选地将所述核酸插入表达载体和任选地宿主中。
属性124.属性122或123的方法，进一步包括制备由属性122或123的方法产生的抗体的突变体或衍生物。
属性125.抗体或其片段，包含以由表面等离子共振测定的50nM以下亲和性特异性结合预定抗原的可变区，其中所述抗体从根据属性1a、4、4a、5-28、30-60、63-66或71-74和107-110任一项的非人脊椎动物生物体、小鼠或哺乳动物、任选地大鼠分离并且包含由所述非人脊椎动物生物体、小鼠或哺乳动物的重排的VDJ编码的重链CDR3(如Kabat定义)，其中所述VDJ是所述脊椎动物的重链基因座的人JH基因区段与D(任选地所述基因座的人D基因区段)和VH基因区段的体内重排的产物。
属性126.与属性125的抗体或其衍生物(任选地其恒定区是人的衍生物和/或亲和性成熟的衍生物)相同的抗体或片段，其以由表面等离子共振测定的50nM以下的亲和性特异性结合所述抗原。
属性127.药物组合物，其包含属性125或126的抗体或片段以及药物学可接受的稀释剂、赋形剂或载体。
属性128.编码属性125或126的抗体或片段的重链可变区的核苷酸序列，任选地作为载体(例如表达载体)的一部分。
属性129.属性128的核苷酸序列，其中所述序列是衍生自分离出属性125的抗体的脊椎动物的B细胞的cDNA，或者与这种cDNA相同。
属性130.分离的宿主细胞(例如杂交瘤或CHO细胞或HEK293细胞)，其包含属性128或129的核苷酸序列。
属性131.分离结合预定抗原的抗体的方法，所述方法包括：
(a)提供属性1a、4、4a、5-28、30-60、63-66或71-74和107-110任一项的脊椎动物生物体、小鼠或哺乳动物，任选地大鼠；
(b)用所述抗原免疫所述脊椎动物生物体、小鼠或哺乳动物；
(c)从所述脊椎动物生物体、小鼠或哺乳动物取B淋巴细胞，选择表达以nM以下亲和性结合所述抗原的抗体的B淋巴细胞，其中所述抗体是属性125的抗体；
(d)任选地永生化所述选择的B淋巴细胞或其后代，任选地通过从其产生杂交瘤而永生化；及
(e)分离由所述B淋巴细胞表达的抗体(例如IgG型抗体)。
属性132.属性131的方法，包括从所述B淋巴细胞分离编码结合所述抗原的所述抗体的核酸的步骤；任选地用编码人或人源化重链恒定区的核苷酸序列交换所述抗体的重链恒定区核苷酸序列，及任选地亲和性成熟所述抗体的可变区；及任选地将所述核酸插入表达载体和任选地插入宿主中。
属性133.属性131或132的方法，进一步包括制备由属性131或132的方法产生的抗体的突变体或衍生物。
属性137.用于内源性小鼠抗体重链基因区段的倒位和失活的盒，所述区段是小鼠细胞(例如ES细胞)的染色体12上的重链基因座序列的一部分，其中所述序列在其3’末端的侧翼是位点特异性重组位点(例如lox、rox或frt)，所述盒包含编码可表达标记或选择标记的核苷酸序列和相容的位点特异性重组位点(例如lox、rox或frt)，侧翼为5’和3’同源臂，其中(i)5’同源臂是从坐标119,753,124至坐标119,757,104的小鼠染色体12DNA，3’同源臂是从坐标119,749,288至坐标119,753,123的小鼠染色体12DNA；(ii)5’同源臂是从坐标119,659,459至坐标119,663,126的小鼠染色体12DNA，3’同源臂是从坐标119,656,536至坐标119,659,458的小鼠染色体12DNA；或者(iii)5’同源臂是从坐标120,918,607至坐标120,921,930的小鼠染色体12DNA，3’同源臂是从坐标120,915,475至坐标120,918,606的小鼠染色体12DNA。
属性138.小鼠或小鼠细胞，其基因组包含染色体12的倒位，其中所述倒位包含倒位的内源性重链基因区段(例如VH、D和JH，如完整内源性重链VDJ区)；其中所述小鼠或小鼠细胞的基因组包含转基因重链基因座，所述基因座包含在内源性恒定区(例如C mu)上游并与其可操纵连接的多个人VH基因区段、多个人D区段及多个人JH区段，由此所述小鼠或小鼠细胞(任选地分化成B细胞后)能表达包含可变区的抗体，所述可变区包含衍生自人基因区段的序列；及其中所述倒位是(i)小鼠染色体12从坐标119,753,123至坐标114,666,436的倒位；(ii)小鼠染色体12从坐标119,659,458至坐标114,666,436的倒位；或者(iii)小鼠染色体12从坐标120,918,606至坐标114,666,436的倒位。
本发明还包括下述条项
≥70或80％的全部轻链是人Vλ
条项1.非人脊椎动物，其具有包含重组免疫球蛋白轻链基因座的基因组，所述基因座包含位于内源性轻链基因座中的靶向插入序列，
其中所述靶向插入序列包含人λ轻链基因座DNA并且位于λ轻链恒定区上游，
其中所述靶向插入序列包括人Vλ和Jλ基因区段的库集，
其中所述脊椎动物表达包含人λ可变区的免疫球蛋白轻链，及
其中至少70或80％的在所述脊椎动物中表达的免疫球蛋白轻链包含人λ可变区。
条项2.条项1的脊椎动物，其中人Vλ和Jλ插入的库集至少包含功能性人V和J基因区段，所述基因区段包含在人λ链免疫球蛋白基因座从Vλ2-18至Cλ7中。
条项3.条项1的脊椎动物，其中内源性轻链基因座是内源性κ基因座。
条项4.条项3的脊椎动物，其中基因组对于人Vλ和Jλ基因区段的库集是纯合的，及其中内源性κ链表达是基本上无活性的。
条项5.条项4的脊椎动物，其中内源性κ链表达是完全无活性的。
条项6.条项1的脊椎动物，其中内源性轻链基因座是内源性λ基因座。
条项7.条项6的脊椎动物，其中基因组对于人Vλ和Jλ基因区段的库集是纯合的，及其中内源性λ链表达是基本上无活性的。
条项8.条项7的脊椎动物，其中内源性λ链表达是完全无活性的。
条项9.条项1的脊椎动物，其中靶向插入序列位于内源性V和J轻链基因区段的下游。
条项10.条项1的脊椎动物，其中靶向插入序列包括人λ轻链基因座的恒定区。
条项11.条项10的脊椎动物，其中由所述脊椎动物表达的所述轻链包含衍生自人Vλ、Jλ和Cλ基因区段的重组的V-C区。
条项12.条项1的脊椎动物，其中所述脊椎动物衍生自小鼠ES细胞或大鼠ES细胞。
条项13.条项1的脊椎动物，其中所述脊椎动物是小鼠或大鼠。
条项14.条项1的脊椎动物，其中所述靶向插入序列包含是人λ轻链基因座DNA的基因区段间间插序列，所述间插序列是在人基因座中功能性人V和J轻链基因区段之间，或者所述靶向插入序列包含是λ轻链基因座DNA的基因区段间间插序列，所述间插序列是在内源性非人脊椎动物基因组中相应的λ轻链基因区段之间。
条项15.条项14的脊椎动物，其中所述靶向插入序列包括人λ免疫球蛋白基因区段假基因。
条项16.条项14的脊椎动物，其中所述靶向插入序列没有人λ免疫球蛋白基因区段假基因。
条项17.条项1的脊椎动物，其中至少70、75或80、84、85、90、95、96、97、98或99％或100％的由所述脊椎动物表达的免疫球蛋白轻链包含衍生自人Vλ和Jλ基因区段的重组的人V区。
条项18.条项17的脊椎动物，其中至少90％的由所述脊椎动物表达的免疫球蛋白轻链包含衍生自人Vλ和Jλ基因区段的重组的人V区。
≥60％的全部轻链具有人Vλ区
条项19.非人脊椎动物，其具有包含重组免疫球蛋白轻链基因座的基因组，所述基因座包含位于内源性轻链基因座中的靶向插入序列，
其中所述靶向插入序列包含位于λ轻链恒定区上游的人λ轻链基因座DNA，并且包括人Vλ和Jλ基因区段的库集，
其中所述基因组包含位于轻链恒定区上游的κV基因区段，
其中所述脊椎动物表达包含λ可变区的免疫球蛋白轻链，及
其中至少60％的由所述脊椎动物表达的免疫球蛋白轻链包含人λ可变区。
条项20.条项19的脊椎动物，其中至少65、70、80、84、85、90、95、96、97、98或99％或100％的由所述脊椎动物表达的免疫球蛋白轻链包含衍生自人Vλ和Jλ基因区段的重组的人可变区。
条项21.条项20的脊椎动物，其中至少84％的由所述脊椎动物表达的免疫球蛋白轻链包含衍生自人Vλ和Jλ基因区段的重组的人可变区。
条项22.条项21的脊椎动物，其中至少95％的由所述脊椎动物表达的免疫球蛋白轻链包含衍生自人Vλ和Jλ基因区段的重组的人可变区。
条项23.条项19的脊椎动物，其中所述脊椎动物衍生自小鼠ES细胞或大鼠ES细胞。
条项24.条项19的脊椎动物，其中所述脊椎动物是小鼠或大鼠。
条项25.条项19的脊椎动物或细胞，其中靶向插入序列位于内源性V和J轻链基因区段的下游。
条项25a.条项19的脊椎动物，其中位于轻链恒定区上游的κV基因区段是内源性κV基因区段。
VλJλ进入κ或λ基因座
条项26.非人脊椎动物或细胞，其具有包含重组免疫球蛋白轻链基因座的基因组，所述基因座包含位于内源性V和J轻链基因区段下游的靶向插入序列，
其中所述靶向插入序列包含人免疫球蛋白Vλ和Jλ基因区段，
其中所述人Vλ和Jλ基因区段位于轻链恒定区上游，
其中所述人Vλ和Jλ基因区段至少包含人λ轻链基因座的从Vλ2-18至Cλ7的功能性V和J基因区段，及
其中所述脊椎动物或细胞表达包含人λ可变区的免疫球蛋白轻链。
条项27.条项26的脊椎动物或细胞，其中所述靶向插入序列包括人λ轻链基因座的恒定区。
条项28.条项27的脊椎动物或细胞，其中由所述脊椎动物或细胞表达的所述轻链包含衍生自人Vλ、Jλ和Cλ基因区段的重组的人V-C区。
条项29.条项26的脊椎动物或细胞，其中内源性V和J轻链基因区段是Vκ和Jκ基因区段。
条项30.条项26的脊椎动物或细胞，其中内源性κ链表达是基本上无活性的。
条项31.条项30的脊椎动物或细胞，其中内源性κ链表达是完全无活性的。
条项32.条项26的脊椎动物或细胞，其中内源性V和J轻链基因区段是Vλ和Jλ基因区段。
条项33.条项26的脊椎动物或细胞，其中内源性λ链表达是基本上无活性的。
条项34.条项30的脊椎动物或细胞，其中内源性λ链表达是完全无活性的。
条项35.条项25的脊椎动物或细胞，其中所述靶向插入序列包含是人λ轻链基因座DNA的基因区段间间插序列，所述间插序列是在人基因座中功能性人V和J轻链基因区段之间，或者所述靶向插入序列包含是λ轻链基因座DNA的基因区段间间插序列，所述间插序列是在内源性基因组中相应的λ轻链基因区段之间。
条项36.条项35的脊椎动物或细胞，其中所述靶向插入序列包括假基因。
条项37.条项25的脊椎动物，其中所述脊椎动物衍生自小鼠ES细胞或大鼠ES细胞。
条项38.条项25的脊椎动物，其中所述脊椎动物是小鼠或大鼠。
条项38a.条项25的脊椎动物，其中所述人Vλ和Jλ基因区段位于内源性轻链恒定区的上游。
VJCλ进入κ基因座
条项39.非人脊椎动物或细胞，其具有包含重组免疫球蛋白κ轻链基因座的基因组，所述基因座包含位于内源性κ恒定区上游的人Vλ、Jλ和Cλ基因区段的靶向插入序列，
其中所述脊椎动物或细胞表达包含衍生自人Vλ、Jλ和Cλ基因区段的重组的人V-C区的免疫球蛋白轻链，及
其中所述靶向插入序列至少包含人λ链免疫球蛋白基因座的从Vλ3-1至Cλ7的功能性V、J和C基因区段。
条项40.条项39的脊椎动物或细胞，其中所述靶向插入序列至少包含人λ轻链免疫球蛋白基因座的从Vλ2-18至Cλ7的功能性V、J和C基因区段。
条项41.条项39的脊椎动物或细胞，其中所述靶向插入序列包含是人λ轻链基因座DNA的基因区段间间插序列，所述间插序列是在人基因座中功能性人V和J或者J和C轻链基因区段之间，或者所述靶向插入序列包含是λ轻链基因座DNA的基因区段间间插序列，所述间插序列是在内源性非人脊椎动物基因组中相应的λ轻链基因区段之间。
条项42.条项41的脊椎动物或细胞，其中所述靶向插入序列包括假基因。
条项43.条项39的脊椎动物，其中所述脊椎动物衍生自小鼠ES细胞或大鼠ES细胞。
条项44.条项39的脊椎动物，其中所述脊椎动物是小鼠或大鼠。
条项45.条项39的脊椎动物或细胞，其中内源性κ链表达是基本上无活性的。
条项46.条项45的脊椎动物或细胞，其中内源性κ链表达是完全无活性的。
条项47.条项39的脊椎动物或细胞，其中所述靶向插入序列位于内源性V和J轻链基因区段的下游。
VJλ进入κ基因座
条项48.非人脊椎动物或细胞，其具有包含重组免疫球蛋白κ轻链基因座的基因组，所述基因座包含位于靶向插入序列上游的内源性Vκ和Jκ基因区段，
其中所述靶向插入序列至少包含人λ轻链免疫球蛋白基因座的从Vλ3-1至Cλ7的功能性Vλ和Jλ基因区段，
其中所述脊椎动物或细胞表达包含人λ可变区的免疫球蛋白轻链，及
其中包含衍生自内源性Vκ和Jκ基因区段的重组的内源性κ可变区的轻链的表达是基本上无活性的。
条项49.条项48的脊椎动物，其中所述脊椎动物衍生自小鼠ES细胞或大鼠ES细胞。
条项50.条项48的脊椎动物，其中所述脊椎动物是小鼠或大鼠。
条项51.条项48的脊椎动物或细胞，其中所述靶向插入序列至少包含人λ轻链免疫球蛋白基因座的从Vλ2-18至Cλ7的功能性Vλ和Jλ基因区段。
条项52.条项48的脊椎动物或细胞，其中内源性Vκ和Jκ轻链表达是完全无活性的。
条项53.条项48的脊椎动物或细胞，其中小于10、5、4、3、2、1或0.5％的由所述脊椎动物或细胞表达的免疫球蛋白轻链包含内源性κ可变区。
条项54.条项48的脊椎动物或细胞，其中所述靶向插入序列包含是人λ轻链基因座DNA的基因区段间间插序列，所述间插序列是在人基因座中功能性人V和J基因区段之间，或者所述靶向插入序列包含是λ轻链基因座DNA的基因区段间间插序列，所述间插序列是在内源性基因组中相应的λ轻链基因区段之间。
条项55.非人脊椎动物或细胞，具有重组基因组，所述重组基因组包含内源性免疫球蛋白κ轻链基因座序列，所述序列包含至少一个内源性κ增强子(Eκ)序列、至少一个内源性Vκ基因区段、至少一个内源性Jκ基因区段及至少一个内源性Cκ恒定区，
其中内源性Vκ和Jκ基因区段通过同一染色体上的各自内源性Eκ序列分隔开基本上防止内源性免疫球蛋白κ轻链多肽产生的距离。
条项56.条项55的脊椎动物或细胞，其中内源性Vκ和Jκ基因区段通过各自的内源性Eκ序列分隔开的距离大于在内源性非重组κ轻链基因座中内源性Vκ和Jκ基因区段与各自内源性Eκ序列之间的距离。
条项57.条项55的细胞，其中所述细胞是小鼠细胞或大鼠细胞。
条项57a.条项55的脊椎动物，其中所述脊椎动物衍生自小鼠ES细胞或大鼠ES细胞。
条项58.条项55的脊椎动物，其中所述脊椎动物是小鼠或大鼠。
条项59.条项55的脊椎动物或细胞，其中所述重组基因组包含靶向插入序列，所述靶向插入序列包含一或多个人V轻链基因区段及一或多个人J轻链基因区段，
其中所述靶向插入序列位于所述内源性Vκ和Jκ基因区段和所述各自内源性Eκ序列之间。
条项59a.条项59的脊椎动物或细胞，其中所述重组基因组对于所述靶向插入序列是纯合的。
条项60.条项59的脊椎动物或细胞，其中所述靶向插入序列包含轻链基因区段，所述轻链基因区段包含一或多个人Vκ及一或多个Jκ基因区段。
条项60a.条项60的脊椎动物或细胞，其中所述重组基因组对于所述靶向插入序列是纯合的。
条项61.前述任一条项的脊椎动物或细胞，其中所述靶向插入序列包含人Vλ和Jλ基因区段的库集，并且其中所述靶向插入序列已被插入内源性轻链基因座增强子序列的100kb内。
条项62.前述任一条项的脊椎动物或细胞，其中所述靶向插入序列包含至少10个人Vλ基因或人Jλ基因区段的库集，并且其中所述靶向插入序列位于内源性轻链恒定区的上游。
条项63.条项62的脊椎动物或细胞，其中所述靶向插入序列至少包含人免疫球蛋白λ链基因座从Vλ2-18至Vλ3-1的部分。
条项64.条项62的脊椎动物或细胞，其中所述靶向插入序列包含至少2、3、4或5个人Jλ基因区段。
条项65.条项64的脊椎动物或细胞，其中所述人Jλ基因区段彼此不同。
条项66.条项65的脊椎动物或细胞，其中所述人Jλ基因区段是Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6和Jλ7。
条项67.条项62的脊椎动物或细胞，其中所述靶向插入序列包括至少人免疫球蛋白λ链基因座从Vλ2-18至Cλ7的部分。
条项68.条项62的脊椎动物或细胞，其中所述靶向插入序列不包括人Jλ4Cλ4和/或人Jλ5Cλ5。
条项69.条项62的脊椎动物或细胞，其中所述靶向插入序列包括人轻链增强子。
条项70.条项69的脊椎动物或细胞，其中所述人轻链增强子是Eλ序列，并且其中Eλ序列位于人Jλ基因区段和内源性轻链恒定区之间。.
条项71.条项70的脊椎动物或细胞，其中人Jλ基因区段是人JλCλ簇的一部分。
条项72.前述任一条项的脊椎动物或细胞，其中所述脊椎动物或细胞表达λ免疫球蛋白轻链，所述轻链包含由人Vλ和Jλ基因区段编码的人λ可变区的库集，其中所述人Vλ包括Vλ3-1及任选地Vλ2-18、Vλ3-16、V2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8和Vλ4-3之一或多个，其中所述人Vλ和Jλ基因区段包括在所述靶向插入序列中。
条项73.前述任一条项的脊椎动物或细胞，其中所述脊椎动物或细胞表达λ免疫球蛋白轻链，所述轻链包含由人Vλ和Jλ基因区段编码的人λ可变区的库集，其中所述人Vλ包括Vλ2-14及任选地Vλ2-18、Vλ3-16、V2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3和Vλ3-1之一或多个，其中所述人Vλ和Jλ基因区段包括在所述靶向插入序列中。
条项74.前述任一条项的脊椎动物或细胞，其中所述脊椎动物或细胞表达λ免疫球蛋白轻链，所述轻链包含由人Vλ和Jλ基因区段编码的人λ可变区的库集，其中所述人Vλ包括Vλ2-8及任选地Vλ2-18、Vλ3-16、V2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ4-3和Vλ3-1之一或多个，其中所述人Vλ和Jλ基因区段包括在所述靶向插入序列中。
条项75.前述任一条项的脊椎动物或细胞，其中所述脊椎动物或细胞表达λ免疫球蛋白轻链，所述轻链包含由人Vλ和Jλ基因区段编码的人λ可变区的库集，其中所述人Vλ包括Vλ3-10及任选地Vλ2-18、Vλ3-16、V2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3和Vλ3-11之一或多个，其中所述人Vλ和Jλ基因区段包括在所述靶向插入序列中。
条项76.前述任一条项的脊椎动物或细胞，其中所述靶向插入序列包含人λ轻链基因座从Vλ2-18至Vλ3-1的每个功能性Vλ基因区段。
条项77.前述任一条项的脊椎动物或细胞，其中至少人Vλ3-1包括在所述靶向插入序列中。
条项78.条项77的脊椎动物或细胞，其中至少Vλ2-18、Vλ3-16、V2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3和Vλ3-1包括在所述靶向插入序列中。
条项79.前述任一条项的脊椎动物，其中所述脊椎动物表达λ链比κ链多。
条项80.前述任一条项的脊椎动物，其中所述脊椎动物不表达内源性κ链。
条项81.前述任一条项的脊椎动物，其中内源性κ链表达是基本上无活性的。
条项82.条项81的脊椎动物，其中所述内源性κ链表达是完全无活性的。
条项83.前述任一条项的脊椎动物，其中所述脊椎动物表达免疫球蛋白重链。
条项84.前述任一条项的脊椎动物或细胞，其中所述靶向插入序列包括人λ增强子(Eλ)序列及其中Eλ序列位于所述内源性轻链基因座中。
条项85.条项84的脊椎动物或细胞，其中Eλ序列位于包括在所述靶向插入序列中的最3’下游Cλ区的下游。
条项86.前述任一条项的脊椎动物或细胞，其中至少人JC基因区段Jλ1-Cλ1、Jλ2-Cλ2、Jλ3-Cλ3、Jλ6-Cλ6和Jλ7-Cλ7包括在所述靶向插入序列中。
条项87.前述任一条项的脊椎动物或细胞，其中包括在所述靶向插入序列中的人基因区段是种系构型的。
条项88.条项87的脊椎动物或细胞，其中所述靶向插入包含人轻链基因座的基因区段间序列或者内源性轻链基因座的基因区段间序列。
条项89.前述任一条项的脊椎动物或细胞，其中内源性轻链增强子保留在内源性基因座中。
条项90.条项89的脊椎动物或细胞，其中内源性增强子是种系构型的。
条项91.条项90的脊椎动物或细胞，其中内源性基因座是κ基因座。
条项92.条项90的脊椎动物或细胞，其中存在内源性κ增强子。
条项93.条项92的脊椎动物或细胞，其中内源性增强子是iEκ和/或3’Eκ序列。
条项94.条项90的脊椎动物或细胞，其中种系构型是针对内源性轻链恒定区。
条项95.前述任一条项的脊椎动物或细胞，其中基因组对于所述靶向插入序列是杂合的。
条项96.条项95的脊椎动物或细胞，其中所述靶向插入序列包含人V和J或者人V、J和C轻链基因区段。
条项97.条项96的脊椎动物或细胞，其中所述靶向插入序列位于内源性轻链λ基因座中。
条项98.条项96的脊椎动物或细胞，其中所述靶向插入序列位于内源性轻链κ基因座中。
条项99.条项98的脊椎动物或细胞，其中存在内源性κ增强子，并且其是iEκ和/或3’Eκ序列。
条项100.条项95的脊椎动物，其中所述脊椎动物衍生自小鼠ES细胞或大鼠ES细胞。
条项101.条项95的脊椎动物，其中所述脊椎动物是小鼠或大鼠。
条项102.条项95的脊椎动物或细胞，其中基因组包含第一靶向插入序列和第二靶向插入序列，所述第一靶向插入序列包含人λ基因区段，所述第二靶向插入序列包含人κ免疫球蛋白V和J基因区段，
其中所述第一靶向插入序列位于第一内源性κ基因座中及其中所述第二靶向插入序列位于第二内源性κ基因座中并在内源性κ恒定区的上游。
条项103.条项102的脊椎动物或细胞，其中在第一和/或第二内源性κ基因座中存在内源性κ轻链增强子。
条项104.条项103的脊椎动物或细胞，其中内源性κ基因座任选地是在种系构型中。
条项105.条项95的脊椎动物或细胞，其中基因组包含第一靶向插入序列和第二靶向插入序列，所述第一靶向插入序列包含人λ基因区段，所述第二靶向插入序列包含人κ免疫球蛋白V和J基因区段，
其中所述第一靶向插入序列位于第一内源性λ基因座中及其中所述第二靶向插入序列位于第二内源性λ基因座中并在内源性λ恒定区的上游。
条项106.条项105的脊椎动物或细胞，其中在第一和/或第二内源性λ基因座中存在内源性λ轻链增强子。
条项106.条项105的脊椎动物或细胞，其中内源性κ基因座任选地是在种系构型中。
条项107.前述任一条项的脊椎动物或细胞，其中基因组对于包含人λ基因区段并位于内源性免疫球蛋白轻链基因座中的靶向插入序列是纯合的。
条项108.前述任一条项的脊椎动物或细胞，其中基因组包含两个或更多个包含人λ基因区段并位于内源性κ和/或λ基因座中的靶向插入序列。
条项109.条项108的脊椎动物或细胞，其中基因组对于包含人λ基因区段并位于每个内源性λ基因座中的第一靶向插入序列是纯合的，其中所述脊椎动物或细胞表达包含人λ可变区的λ轻链；
其中包含人λ基因区段的第二靶向插入序列位于第一内源性κ基因座中，
其中包含多个人Vκ和Jκ基因区段的第三靶向插入序列位于第二内源性κ基因座中的内源性Cκ基因区段的上游，及
其中所述脊椎动物或细胞表达包含人κ可变区的κ轻链。
条项110.条项108的脊椎动物或细胞，其中包含λ基因区段并位于内源性κ和λ基因座中的靶向插入序列包含相同的人λ基因区段库集。
条项111.条项109的脊椎动物或细胞，其中第一和第二靶向插入序列包含相同的人λ基因区段库集。
条项112.条项108的脊椎动物或细胞，其中包含λ基因区段的靶向插入序列位于κ基因座中并且位于λ基因座中的靶向插入序列包含不同的人λ基因区段的库集。
条项113.条项109的脊椎动物或细胞，其中所述第一和第二靶向插入序列包含不同的人λ基因区段的库集。
条项114.非人脊椎动物或细胞，其具有包含位于至少一个内源性免疫球蛋白基因座中的一或多个第一和/或第二靶向插入序列的基因组，其中所述一或多个第一和/或第二靶向插入序列均包含人免疫球蛋白基因区段的库集，
所述基因组包含下述轻链基因座排列之一：
(a)位于第一内源性κ链基因座中的L及位于第二内源性κ链基因座中的K；
(b)位于第一内源性λ链基因座中的L及位于第二内源性λ链等位基因中的K；
(c)位于每个内源性κ链基因座中的L；
(d)位于每个内源性λ链基因座中的L；
(e)位于第一内源性κ链基因座中的L及第二内源性κ链基因座是无活性的；或者
(f)位于第一内源性λ链基因座中的L及第二内源性λ链基因座是无活性的；
其中
L代表包含在人λ链免疫球蛋白基因座从Vλ3-1至Cλ7中的至少功能性人Vλ和Jλ基因区段的第一靶向插入序列；
其中
K代表包含人Vκ和Jκ基因区段的第二靶向插入序列；及
其中每个L或K位于恒定区上游，由此可以表达包含衍生自人V和J基因区段的重组的人V区的轻链。
条项115.条项114的脊椎动物，其中所述脊椎动物衍生自小鼠ES细胞或大鼠ES细胞。
条项116.条项114的脊椎动物，其中所述脊椎动物是小鼠或大鼠。
条项117.条项114的脊椎动物或细胞，其中L进一步包含人Cλ区。
条项118.条项114的脊椎动物或细胞，其中L包含从Vλ2-18至Cλ7的功能性人λ链免疫球蛋白基因区段。
条项119.条项114的脊椎动物或细胞，其中基因组包含如下轻链基因座排列之一：
(a)和位于第一和第二内源性λ链基因座中的L；
(a)和位于第一或位于第一和第二内源性λ链基因座中的K；
(a)和位于第一内源性λ链基因座中的L和位于第二内源性λ链基因座中的K；
(b)和位于第一或者第一和第二内源性κ链基因座中的L；
(b)和位于第一或者第一和第二内源性κ链基因座中的K；
(b)和位于第一内源性κ链基因座中的L和位于第二内源性κ链基因座中的K；
(c)和位于第一或者第一和第二内源性λ链基因座中的K；
(c)和位于第一或者第一和第二内源性λ链基因座中的L；
(c)和位于第一内源性λ链基因座中的L和位于第二内源性λ链基因座中的K；
(c)和第一和第二内源性λ链基因座是无活性的；
(d)和位于第一或者第一和第二内源性κ链基因座中的L；
(d)和位于第一或者第一和第二内源性κ链基因座中的K；
(d)和位于第一内源性κ链基因座中的L和位于第二内源性κ链基因座中的K；或者
(d)和第一和第二内源性κ链基因座是无活性的。
条项120.条项114的脊椎动物或细胞，其中内源性κ链表达是基本上无活性的。
条项121.条项120的脊椎动物或细胞，其中内源性κ链表达是完全无活性的。
条项122.条项114的脊椎动物或细胞，其中内源性λ链表达是基本上无活性的。
条项123.条项122的脊椎动物或细胞，其中内源性λ链表达是完全无活性的。
条项124.条项114的脊椎动物或细胞，其中一或多个L位于内源性λ或κ恒定区的上游。
条项125.条项114的脊椎动物或细胞，其中位于λ基因座中的一或多个L位于内源性λ恒定区的上游。
条项126.条项114的脊椎动物或细胞，其中位于κ基因座中的一或多个L位于内源性κ恒定区的上游。
条项127.条项114的脊椎动物或细胞，其中位于λ基因座中的每个L均位于人λ恒定区的上游。
条项128.条项114的脊椎动物或细胞，其中位于κ基因座中的每个L均位于人κ恒定区的上游。
条项129.条项114的脊椎动物或细胞，其中一或多个K位于内源性λ或κ恒定区的上游。
条项130.条项114的脊椎动物或细胞，其中位于λ基因座中的一或多个K位于内源性λ恒定区的上游。
条项131.条项114的脊椎动物或细胞，其中位于κ基因座中的每个K均位于内源性κ恒定区的上游。
条项132.条项114的脊椎动物或细胞，其中位于λ基因座中的每个K均位于人λ恒定区的上游。
条项133.条项114的脊椎动物或细胞，其中位于κ基因座中的每个K均位于人κ恒定区的上游。
条项134.条项114的脊椎动物或细胞，其中基因组包含一个以上L，且每个L包含人Vλ和Jλ基因区段的不同库集。
条项135.条项134的脊椎动物或细胞，其中基因组包含2个L。
条项136.条项134的脊椎动物或细胞，其中基因组包含3个L。
条项137.条项114的脊椎动物或细胞，其中基因组包含一个以上L，且每个L包含人Vλ、Jλ和Cλ基因区段的不同库集。
条项138.条项114的脊椎动物或细胞，其中基因组包含一个以上K，且每个K包含人Vκ和Jκ基因区段的不同库集。
条项139.条项138的脊椎动物或细胞，其中基因组包含2个K。
条项140.条项138的脊椎动物或细胞，其中基因组包含3个K。
条项141.条项114的脊椎动物或细胞，其中基因组包含一个以上L，且每个L包含人Vκ、Jκ和Cκ基因区段的不同库集。
条项141a.条项114的脊椎动物，其中所述脊椎动物衍生自小鼠ES细胞或大鼠ES细胞。
条项142.前述任一条项的脊椎动物或细胞，其中基因组包含免疫球蛋白重链基因座，所述基因座包含人VH基因区段。
条项143.产生包含特异于希望抗原的λ可变区的抗体或轻链的方法，所述方法包括用希望抗原免疫前述任一条项的脊椎动物，及回收所述抗体或轻链或者回收产生所述抗体或轻链的细胞。
条项144.条项143的方法，进一步包括用人恒定区置换非人脊椎动物恒定区的步骤，由此产生人源化抗体或抗体轻链。
条项145.条项144的方法，其中人源化抗体或抗体轻链通过工程化编码完全人源化抗体或轻链的核酸而产生。
条项146.由条项143的方法产生的人源化抗体或抗体轻链。
条项147.条项146的人源化抗体或抗体轻链的衍生物。
条项148.药物组合物，其包含通过条项143的方法产生的人源化抗体或抗体轻链及药物学可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
条项149.失活非人脊椎动物或细胞的基因组中的内源性IgK-VJ基因区段的方法，所述方法将包含人免疫球蛋白基因区段的靶向插入序列定位于基因组中，其中所述靶向插入序列位于内源性IgK-VJ基因区段和Eκ增强子序列之间，其增加内源性IgK-VJ和Eκ增强子之间的物理距离，由此失活内源性IgK-VJ基因区段。
条项150.条项149的方法，其中所述非人脊椎动物是小鼠或大鼠。
条项150a.条项148的方法，其中所述脊椎动物从小鼠ES细胞或大鼠ES细胞发育而来。
条项151.条项149的方法，其中所述细胞是小鼠细胞或大鼠细胞。
条项152.条项149的方法，其中所述人免疫球蛋白基因区段包含人VL和JL基因区段。
条项153.条项152的方法，其中人VL和JL基因区段包含人Vλ和Jλ基因区段和/或人Vκ和Jκ基因区段。
条项154.获得免疫球蛋白轻链库的方法，其中至少70或80％的免疫球蛋白轻链包含人Vλ和Jλ区，所述方法包括：
提供条项1的脊椎动物或细胞，及
分离包含免疫球蛋白轻链的样品。
条项154a.条项154的方法，进一步包括从所述样品分离免疫球蛋白轻链的步骤。
条项154b.条项154a的方法，其中所述样品是血清、脾、胸腺、淋巴结或阑尾。
条项154c.条项154b的方法，其中脾包括含有B细胞的脾组织。
条项154d.条项154c的方法，进一步包括从脾组织分离B细胞的步骤。
条项155.条项154的方法，其中免疫球蛋白轻链包括在抗体或抗体片段中。
条项156.根据条项155的方法分离的抗体或抗体片段。
条项156a.条项156的抗体或抗体片段的衍生物。
条项157.药物组合物，其包含条项156的抗体或抗体片段及药物学可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
条项158.条项154的方法，包括在分离包含免疫球蛋白轻链的样品的步骤之前用抗原免疫脊椎动物的步骤。
条项159.获得免疫球蛋白轻链库的方法，其中至少60％的免疫球蛋白轻链包含人λ轻链，所述方法包括：
提供条项19的脊椎动物或细胞，及
分离包含免疫球蛋白轻链的样品。
条项159a.条项159的方法，进一步包括从所述样品分离免疫球蛋白轻链的步骤。
条项159b.条项159a的方法，其中所述样品是血清、脾、胸腺、淋巴结或阑尾。
条项159c.条项159b的方法，其中脾包括含有B细胞的脾组织。.
条项159d.条项159c的方法，进一步包括从脾组织分离B细胞的步骤。
条项160.条项159的方法，其中免疫球蛋白轻链包括在抗体或抗体片段中。
条项161.根据条项160的方法分离的抗体或抗体片段。
条项161a.条项161的抗体或抗体片段的衍生物。
条项162.药物组合物，其包含条项161的抗体或抗体片段及药物学可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
条项163.条项159的方法，包括在分离包含免疫球蛋白轻链的样品的步骤之前用抗原免疫脊椎动物的步骤。
条项164.在非人脊椎动物中表达人免疫球蛋白VJC轻链的方法，所述方法包括：
提供条项40的脊椎动物或细胞，及
分离包含免疫球蛋白VJC轻链的样品。
条项164a.条项164的方法，其中所述非人脊椎动物从ES细胞发育。
条项164a.条项164的方法，进一步包括从所述样品分离免疫球蛋白轻链的步骤。
条项164b.条项164a的方法，其中所述样品是血清、脾、胸腺、淋巴结或阑尾。
条项164c.条项164b的方法，其中脾包括含有B细胞的脾组织。
条项164d.条项164c的方法，进一步包括从脾组织分离B细胞的步骤。.
条项165.条项164的方法，其中免疫球蛋白VJC轻链包括在抗体或抗体片段中。
条项166.根据条项165的方法分离的抗体或抗体片段。
条项166a.条项166的抗体或抗体片段的衍生物。
条项167.药物组合物，其包含条项166的抗体或抗体片段及药物学可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
条项168.条项164的方法，包括在分离包含免疫球蛋白VJC轻链的样品的步骤之前用抗原免疫脊椎动物的步骤。
条项169.条项164的方法，其中所述脊椎动物从小鼠ES细胞或大鼠ES细胞发育。
条项39N.非人脊椎动物，其具有包含重组免疫球蛋白轻链基因座的基因组，所述基因座包含位于内源性轻链基因座的靶向插入序列，
其中所述靶向插入序列包含人λ轻链基因座DNA并位于λ轻链恒定区的上游，
其中所述靶向插入序列包括人Vλ和Jλ基因区段的库集，
其中所述脊椎动物表达包含人λ可变区的免疫球蛋白轻链，及
其中至少70或80％的在所述脊椎动物中表达的包含λ可变区的免疫球蛋白轻链包含人λ可变区。
条项40N.非人脊椎动物，其具有包含重组免疫球蛋白轻链基因座的基因组，所述基因座包含位于内源性轻链基因座中的靶向插入序列，
其中所述靶向插入序列包含位于λ轻链恒定区的上游的人λ轻链基因座DNA，并且包括人Vλ和Jλ基因区段的库集，
其中所述基因组包含位于轻链恒定区上游的κV基因区段，
其中所述脊椎动物表达包含λ可变区的免疫球蛋白轻链，及
其中至少60％的由所述脊椎动物表达的免疫球蛋白轻链包含人λ可变区。
条项47N.获得免疫球蛋白轻链库的方法，其中至少70或80％的免疫球蛋白轻链包含人Vλ和Jλ区，所述方法包括：
提供条项39N的脊椎动物或细胞，及
分离包含免疫球蛋白轻链的样品。.
条项48N.获得免疫球蛋白轻链库的方法，其中至少60％的免疫球蛋白轻链包含人λ轻链，所述方法包括
提供条项40N的脊椎动物或细胞，及
分离包含免疫球蛋白轻链的样品。
条项49N.从免疫球蛋白轻链库获得包含人λ可变区的免疫球蛋白轻链的方法，所述方法包括
提供条项40N的脊椎动物或细胞，由此提供免疫球蛋白轻链库，其中至少60％的免疫球蛋白轻链包含人λ可变区，及
从所述库分离一或多个免疫球蛋白轻链，其中每个分离的免疫球蛋白轻链均包含人λ可变区。
条项50N.从免疫球蛋白轻链库获得包含人λ可变区的免疫球蛋白轻链的方法，所述方法包括
选择表达含有人可变区的免疫球蛋白λ轻链的小鼠，
其中所述小鼠包含位于轻链恒定区上游的靶向插入序列，
其中所述靶向插入序列包含人免疫球蛋白Vλ和Jλ基因区段，
其中至少70或80％的在所述脊椎动物中表达的包含λ可变区的免疫球蛋白轻链包含人λ可变区，
其中内源性κ和λ链表达是基本上无活性的，
从所述小鼠收集血清；及
从所述收集的血清分离一或多个免疫球蛋白轻链，其中每个分离的免疫球蛋白轻链均包含人λ可变区。
条项51N.从免疫球蛋白轻链库获得包含人λ可变区的免疫球蛋白轻链的方法，所述方法包括
选择表达含有人可变区的免疫球蛋白λ轻链的小鼠，
其中所述小鼠包含位于轻链恒定区上游的靶向插入序列，
其中所述靶向插入序列包含人免疫球蛋白Vλ和Jλ基因区段，
其中至少60％的由所述脊椎动物表达的免疫球蛋白轻链包含人λ可变区，
其中内源性κ和λ链表达是基本上无活性的，
从所述小鼠收集血清；及
从所述收集的血清分离一或多个免疫球蛋白轻链，其中每个分离的免疫球蛋白轻链均包含人λ可变区。
条项52N.从免疫球蛋白轻链库获得包含人λ可变区的免疫球蛋白轻链的方法，所述方法包括
选择表达含有人可变区的免疫球蛋白λ轻链的小鼠，
其中所述小鼠包含位于轻链恒定区上游的靶向插入序列，
其中所述靶向插入序列包含人免疫球蛋白Vλ和Jλ基因区段，
其中至少70或80％的在所述脊椎动物中表达的包含λ可变区的免疫球蛋白轻链包含人λ可变区，
其中至少60％的所述脊椎动物表达的免疫球蛋白轻链包含人λ可变区，
其中内源性κ和λ链表达是基本上无活性的，
从所述小鼠收集血清；及
从所述收集的血清分离一或多个免疫球蛋白轻链，其中每个分离的免疫球蛋白轻链均包含人λ可变区。
表达κ&λ可变区的非人脊椎动物
(i)以人样比率产生的K和L链
本发明的这个方面可用于产生不偏向于非人样比率的轻链。例如，在小鼠中κ型轻链远远超过λ型轻链(典型地在野生型小鼠中，95％κ轻链:5％λ轻链)。另一方面，人类典型展示约60％κ:约40％λ。因此，λ表达比在小鼠中发现的高得多。希望的是提供这样的非人脊椎动物，如小鼠或大鼠，其中可表达较高比例的λ型轻链。当脊椎动物表达携带人λ可变区的轻链及携带人κ可变区的其它轻链时，这是有用的。为此，发明人首次证实了表达升高水平λ轻链的这种脊椎动物，因此本发明提供了：
非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)，其基因组包含通过将人Ig基因区段靶向插入一或多个内源性Ig基因座而产生的Ig基因区段库集，所述基因组包含通过插入脊椎动物的内源性轻链基因座中恒定区的上游而提供的人Vλ和Jλ基因区段，所述基因组包含通过插入脊椎动物的内源性轻链基因座中恒定区的上游而提供的人Vκ和Jκ基因区段，其中所述脊椎动物表达包含κ轻链可变区的免疫球蛋白轻链及包含λ轻链可变区的免疫球蛋白轻链，其中超过20％的由所述脊椎动物表达的轻链包含λ可变区(例如由脾B细胞的FACS确定)。
其余轻链表达κ可变区。
WO03047336教导了希望产生人类样κ:λ比率，但是其未提供如何实现的可行的揭示。
(ii)用正常B细胞区室产生的K和L链
发明人成功产生了非人脊椎动物，其含有人V和Jλ基因区段的靶向插入，能够通过正常(即相当于野生型脊椎动物)B细胞区室表达包含人λ可变区的轻链。因此，发明人提供了可以用于产生具有良好库集的这样的轻链的这种脊椎动物，比现有技术转基因非人脊椎动物更可靠，现有技术转基因非人脊椎动物显示降低的大小和成熟度的B细胞区室，并且甚至不能产生具有人λ可变区的轻链。因此，本发明提供了：
非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)，其基因组包含通过将人Ig基因区段靶向插入一或多个内源性Ig基因座而产生的Ig基因区段库集，所述基因组包含通过插入脊椎动物的内源性轻链基因座中恒定区的上游而提供的人Vλ和Jλ基因区段，所述基因组包含通过插入脊椎动物的内源性轻链基因座中恒定区的上游而提供的人Vκ和Jκ基因区段，其中所述脊椎动物表达包含κ轻链可变区的免疫球蛋白轻链及包含λ轻链可变区的免疫球蛋白轻链，并且其中所述脊椎动物产生正常比例或百分比的成熟脾B细胞(例如由脾B细胞的FACS确定)。
对于非人脊椎动物(i)和(ii)，涉及下述实施方案(除非说明，每个实施方案适用于(i)或(ii)):
在一个实施方案中，人Vλ和Jλ插入至少包含功能性人V和J基因区段，所述基因区段包含在人λ链Ig基因座从Vλ3-27至Cλ7中。
在一个实施方案中，人Vλ和Jλ插入至少包含人V基因区段Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3和Vλ3-1。
在一个实施方案中，人Vλ和Jλ插入包含人J基因区段Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6和Jλ7之一个、多个或全部。
在一个实施方案中，人Vλ和Jλ插入包含人Jλ-Cλ簇的插入，其中所述簇包含来自Jλ1至Cλ7的J和C基因区段。
在一个实施方案中，人Vλ和Jλ插入包含人Eλ增强子的插入。例如，Eλ增强子针对也包含在插入中的人Jλ7以种系构型提供。例如，Eλ增强子针对也包含在插入中的人Jλ-Cλ簇以种系构型提供，其中所述簇包含人种系构型的Jλ1至Cλ7。在人种系构型中，Eλ增强子在Jλ-Cλ簇的3’。
在一个实施方案或脊椎动物(i)或(ii)中，人Vλ和Jλ插入由相应于人染色体22的坐标22886217至23327884的序列的插入而提供。
在一个实施方案或脊椎动物(ii)中，人Vλ和Jλ插入由相应于人染色体22的坐标23064876至23327884的序列的插入而提供。
在一个实施方案中，人Vκ和Jκ插入至少包含功能性人V和J基因区段，所述基因区段包含在人κ链Ig基因座从Vκ1-33至Jκ5中。
在一个实施方案中，人Vκ和Jκ插入至少包含人V基因区段Vκ1-33、Vκ2-30、Vκ2-29、Vκ2-28、Vκ1-27、Vκ2-24、Vκ3-20、Vκ1-17、Vκ1-16、Vκ3-15、Vκ1-13、Vκ1-12、Vκ3-11、Vκ1-9、Vκ1-8、Vκ1-6、Vκ1-5、Vκ5-2和Vκ4-1。
在一个实施方案中，人Vκ和Jκ插入包含人J基因区段Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4和Jκ5之一个、多个或全部。
在一个实施方案中，超过30％、35％、40％、45％或50％的由所述脊椎动物表达的轻链包含λ可变区。
在一个实施方案中，20-40％、45％或50％的由所述脊椎动物表达的轻链包含λ可变区。在一个实施方案中，30-40％、45％或50％的由所述脊椎动物表达的轻链包含λ可变区。
在一个实施方案中，所述κ轻链可变区是人κ轻链可变区。
在一个实施方案中，人Vκ和Jκ基因区段是在脊椎动物的内源性κ轻链基因座中κ恒定区的上游。
在一个实施方案中，人Vλ和Jλ基因区段是在脊椎动物的内源性κ轻链基因座中。
在一个实施方案中，人Vλ和Jλ基因区段是在脊椎动物的内源性λ轻链基因座中。
在一个实施方案中，所述脊椎动物表达包含人κ可变区的轻链及表达包含人λ可变区的轻链。在一个实例中，内源性(非人脊椎动物)κ链表达是基本上无活性的或者是无活性的和/或内源性(非人脊椎动物)λ链表达是基本上无活性的或者是无活性的。当脊椎动物是小鼠时，小鼠λ链表达典型地非常低(约5％或更低)，在这种情况中可以无需工程化小鼠基因组以进一步失活内源性λ链表达。因此，当脊椎动物是小鼠时，内源性κ链表达是基本上无活性的或者是无活性的，并且小鼠λ链表达是所有轻链表达的5％或更低。
在一个实施方案中，所述脊椎动物产生正常比例或百分比的成熟脾B细胞。例如，这可以通过分离自脊椎动物的脾B细胞的FACS确定。
在一个实施方案中，所述脊椎动物产生正常比率的T1、T2和成熟脾B细胞。例如，这可以通过分离自脊椎动物的脾B细胞的FACS确定。
在一个实施方案中，至少40％、50％、60％或70％的由所述脊椎动物产生的总脾B细胞是成熟B细胞。例如，这可以通过分离自脊椎动物的脾B细胞的FACS确定。
下述定义适用于本发明的任何构型、方面、条项、条款、属性、实例或实施方案
“衍生自”以该术语普通含义使用。举例的同义词包括“产生自”、“得自”、“接受自”、“获自”、“…的产物”、“…的结果”和“修饰自”。例如，重链的人可变区可以衍生自人VH、D和JH基因区段的重组，这反映了这些基因区段在例如本发明的转基因重链基因座中的体内重组，具有任何伴随突变(例如连接突变(junctional mutation))。
可以获得B细胞的样品包括但不限于血液、血清、脾、脾组织、骨髓、淋巴、淋巴结、胸腺和阑尾。抗体和免疫球蛋白链可以得自每种前面提到的样品，也可以得自如下非限制性列表：B细胞、腹水、杂交瘤和细胞培养物。
“多个”以该术语普通含义使用，是指“至少一个”或者“一个以上”。
术语“种系构型”是指种系基因组构型。例如，转基因免疫球蛋白基因座的人免疫球蛋白基因区段是在种系构型中，当所述基因区段的相对顺序与人种系基因组中相应基因区段的顺序相同时。例如，当转基因基因座是本发明的包含假设人免疫球蛋白基因区段A、B和C的重链基因座时，当人种系基因组的相应基因区段包含排列5’-A-B-C-3’时，它们可以以这种顺序(在基因座中5’到3’)提供。在一个实例中，当人免疫球蛋白基因座的元件(例如基因区段、增强子或其它调节元件)在本发明的转基因免疫球蛋白基因座中提供时，当所述基因区段的相对顺序与人种系基因组中的相应基因区段的顺序相同并且元件之间的人序列被包括并且它们相应于人种系基因组中相应元件之间的这种序列时，所述人Ig基因座元件是在种系构型中。因此，在假设实例中，转基因基因座包含人元件排列5’-A-S1-B-S2-C-S3-3’，其中A、B和C是人免疫球蛋白基因区段，S1-S3是人基因区段间序列，其中相应的排列5’-A-S1-B-S2-C-S3-3’存在于人种系基因组中。例如，这可以如下实现，即在本发明的转基因免疫球蛋白基因座中提供相应于人种系基因组中从A到C的DNA序列的DNA插入序列(或者插入序列包含从A到C的DNA序列)。人种系基因组和免疫球蛋白基因座中的排列是本领域已知的(例如参见在互联网(见上述)的IMGT，Kabat及本文参考的其它抗体来源)。
术语“抗体”包括单克隆抗体(包括全长抗体，其具有免疫球蛋白Fc区)，具有多表位特异性的抗体组合物，多特异性抗体(例如双特异性抗体，双抗体和单链分子及抗体片段(例如dAb、Fab、F(ab′)2和Fv)。术语“抗体”还包括H2抗体，其包含重链的二聚体(5’-VH-(任选的铰链)-CH2-CH3-3’)并且缺乏轻链(类似于天然发生的H2抗体；参见例如Nature.1993Jun 3；363(6428):446-8；Naturally occurring antibodies devoid of light chains；Hamers-Casterman C,Atarhouch T,Muyldermans S,Robinson G,Hamers C,Songa EB,Bendahman N,Hamers R)。因此，在本发明一个实施方案中，从转基因重链基因座产生的RNA编码缺乏CH1基因区段并且不包含功能性抗体轻链的重链。在一个实例中，从转基因重链基因座产生的RNA编码VH单可变结构域(dAb；结构域抗体)。它们可以任选地包含恒定区。
术语“免疫球蛋白(Ig)”在本文与“抗体”可互换使用。
“分离的”抗体是已从其(例如天然地或重组地)产生环境的成分中鉴别、分离和/或回收的抗体。优选地，分离的多肽与其产生环境的所有其它成分不相关联，由此抗体已被分离至FDA可批准的或已批准的标准。其产生环境的污染成分，如得自重组转染细胞的成分，是典型干扰抗体的研究、诊断或治疗用途的材料，可包括酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。在优选的实施方案中，多肽被纯化(1)至由例如Lowry方法测定的大于95％(重量)抗体，在一些实施方案中，至大于99％(重量)；(2)至足以通过使用旋转杯序列分析仪获得至少15个N-末端或内部氨基酸序列残基的程度，或者(3)至同质性，通过SDS-PAGE在非还原或还原条件下使用考马斯蓝或优选地银染测定。分离的抗体包括重组细胞内原位的抗体，因为抗体天然环境的至少一种成分不存在。但是通常，分离的多肽或抗体经至少一个纯化步骤制备。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合和/或可变区。抗体片段的例子包括dAb、Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子和从抗体片段形成的多特异性抗体。
“特异性结合”或者“特异于”特定多肽、抗原或表位的抗体是结合该特定多肽、抗原或表位而基本上不结合其它多肽、抗原或表位的抗体。例如，当抗体以100μM或更小、10μM或更小、1μM或更小、100nM或更小、例如10nM或更小、1nM或更小、500pM或更小、100pM或更小、或者10pM或更小的KD结合时，对抗原或表位的结合是特异性的。结合亲和性(KD)可以用本领域技术人员已知的标准程序确定，例如在ELISA中结合和/或用表面等离子共振确定亲和性(例如BiacoreTM或KinExATM溶液相亲和性测量，其可以检测低至fM的亲和性(SapidyneInstruments,Idaho))。
“药物学可接受的”是指由美国联邦或州政府的审批机构批准或可批准的或者列在美国药典或用于动物包括人类的其它通常认可的药典中。“药物学可接受的载体、赋形剂或佐剂”是指可以与药物例如本文描述的抗体或抗体链一起施用给对象的载体、赋形剂或佐剂，其不破坏药理学活性并且当以足以输送治疗量的药物的剂量施用时是无毒的。
附图简述
图1-8显示将一系列人BAC插入小鼠Ig基因座的重复过程。
图9-18显示针对IgH和κ基因座的图1-8的更详细的过程。
图19和20显示在嵌合小鼠中产生抗体的原理。
图21显示人DNA插入小鼠染色体中的可能的插入位点。
图22-26揭示了用于将一系列人BAC插入小鼠Ig基因座的替代重复过程。
图27-29示出宿主VDJ区的倒位机制。
图30示出用RMCE途径插入质粒的原理证明。
图31示出依次RMCE-整合进着陆垫。
图32示出成功插入着陆垫的证实。
图33示出3’末端消除(Curing)的PCR证实。
图34示出BAC#1的插入及PCR诊断剂
图35示出JH和JK使用
图36示出DH使用
图37示出来自嵌合小鼠的人VDJCμ转录物中CDR-H3长度的分布
图38示出在IGH-VDI或IGK-VJ连接处中缺失和插入核苷酸数目的分布。
图39示出每个VH内的JH使用的分布。
图40示出每个VH内的DH使用的分布。
图41示出在VJ Joints Generates IGK变体中的核苷酸获得或丢失。
图42示出在J Regions Generates IGK变体中的高变。
图43示出Joint Diversity Produces Functional CDS。
图44示出JH基因区段相同性图，使用了5’-RACE Cμ-特异性文库，该文库产生自本发明的转基因小鼠的脾B淋巴细胞，其中内源性基因区段使用已被倒位失活。
图45示出小鼠VH与人VH使用的比率，是用来自本发明的转基因小鼠的脾B淋巴细胞的抗体序列确定的，其中内源性基因区段使用已被倒位失活。
图46示出倒位策略示意图。
图47示出用于倒位的靶向构建体R57。
图48示出S1inv1(一种具有倒位的内源性IGH基因座的人IGH BAC(即多个人VH，全部功能性人D和JH))小鼠的脾B淋巴细胞的Cμ-特异性5’-RACE文库的序列分析显示实际上所有转录物均来自重排的人VH-D-JH基因区段。
图49示出S1inv1小鼠显示与人类似的D和JH基因区段使用。
图50示出小鼠VH使用在第二次人BAC插入内源性重链基因座之后进一步显著降低。
图51示出凝胶，显示正常类别转换(至IgG型)在来自本发明小鼠的转录物中观测到。使用RT-PCR用人VH特异性和小鼠Cγ特异性引物从免疫的转基因小鼠的外周血细胞扩增检测到重排的转录物。
图52示出扩增片段的序列分析，证实在来自本发明的小鼠的这些IGγ链的人可变区内发生高变。
图53示出流式细胞术分析，显示本发明转基因小鼠中的正常B细胞区室。
图54和55示出在用抗原免疫后在本发明转基因动物中获得正常IgH同种型和血清水平。
图56第1部分示出用于插入小鼠内源性轻链基因座中的第一个和第二个BAC。示出每个BAC中的人DNA。图56第2部分示出人λIg基因座DNA插入小鼠内源性κ链基因座的插入点。图56第3部分示出人λIg基因座DNA插入小鼠内源性λ链基因座的插入点。
图57显示确定与野生型小鼠(WT)相比的来自P1纯合小鼠(P1/P1)的B220+脾B细胞中的小鼠和人Cλ表达(及因此相应的小鼠和人可变区表达)的FACS分析结果。
图58A显示确定与野生型小鼠(WT)相比的来自P2纯合小鼠(P2/P2)的B220+脾B细胞中的小鼠Cκ和Cλ表达的FACS分析结果。未见可检测到的Cκ表达。
图58B显示确定与野生型小鼠(WT)相比的来自P2纯合小鼠(P2/P2)的B220+脾B细胞中的人Cλ表达(及因此相应的人可变区表达)的FACS分析结果。
图59显示P2纯合小鼠(P2/P2)中的人Vλ使用及人中典型的Jλ使用(插图)。
图60显示P2纯合小鼠中的人Jλ使用及人中典型的Jλ使用(插图)。
图61显示Vλ使用在P2纯合小鼠(P2/P2)中非常高。
图62显示P2纯合小鼠(P2/P2)中来自嵌合κ基因座的小鼠Vκ和人Vλ基因区段使用的分布。
图63示出在λ和κ基因座中的RSS排列。
图64A显示确定与无插入的人λDNA并且其中内源性κ链表达已被失活的小鼠(KA/KA)相比的来自其中内源性κ链表达已被失活的L2纯合小鼠(L2/L2；KA/KA)的B220+脾B细胞中的小鼠和人Cλ表达(及因此相应的小鼠和人可变区表达)的FACS分析结果。在L2/L2；KA/KA小鼠中见到非常高的人Vλ使用，几乎排除了小鼠Vλ使用。
图64B：脾B细胞区室分析。这个图显示与来自仅表达小鼠抗体的小鼠(KA/KA小鼠)的脾B细胞相比，在来自转基因L2/L2；KA/KA小鼠(L2纯合子；对于插入到内源性λ基因座中的人λ基因区段是纯合的；内源性κ链表达已被失活)的脾B细胞的FACS分析结果。结果显示本发明小鼠中的脾B细胞区室是正常的(即等价于仅表达小鼠抗体链的小鼠的区室)。
图65：骨髓和脾区室中的B细胞发育和标记。
图66A：脾B细胞区室分析。这个图示出与来自仅表达小鼠抗体的小鼠的脾B细胞相比，来自本发明的转基因S1F/HA,KA/+小鼠的脾B细胞的FACS分析结果，本发明的转基因S1F/HA,KA/+小鼠表达全部是人的重链可变区(其中内源性重链表达已通过倒位而失活)。结果显示本发明小鼠中的脾B细胞区室是正常的(即等价于仅表达小鼠抗体链的小鼠的区室)。
S1F/HA,+/KA＝(i)S1F–第一内源性重链等位基因具有一个人重链基因座DNA插入，内源性小鼠VDJ区已通过倒位和向染色体上游移动而失活；(ii)HA–第二内源性重链等位基因已失活(通过内源性中断序列倒位)；(iii)+-第一内源性κ等位基因是野生型κ等位基因；(iv)KA–第二内源性κ等位基因已失活(通过内源性中断序列倒位)。这种排列仅编码来自第一内源性重链等位基因的重链。
图66B：脾B细胞区室分析。这个图示出与来自+/HA,K2/KA小鼠的脾B细胞相比，来自本发明的转基因S1F/HA,K2/KA小鼠的脾B细胞的FACS分析结果，本发明的转基因S1F/HA,K2/KA小鼠表达全部是人的重链可变区(其中内源性重链表达已通过倒位而失活)及人κ链可变区。结果显示本发明小鼠中的脾B细胞区室是正常的。
S1F/HA,K2/KA＝(i)K2–第一内源性κ等位基因在最3’内源性Jκ和小鼠Cκ之间有两个κ链基因座DNA插入，提供14个人Vκ和Jκ1-Jκ5的插入；和(ii)KA–第二内源性κ等位基因已失活(通过内源性中断序列倒位)。这种排列仅编码包含人可变区的重链和基本上来自第一内源性κ等位基因的κ轻链。
+/HA,K2/KA–这种排列编码小鼠重链和人κ链。
图67A：骨髓B祖细胞区室分析。这个图示出与来自仅表达小鼠抗体的小鼠的BM B细胞相比，来自本发明的转基因S1F/HA,KA/+小鼠的骨髓(BM)B细胞的FACS分析结果，本发明的转基因S1F/HA,KA/+小鼠表达全部是人的重链可变区(其中内源性重链表达已通过倒位而失活)。结果显示本发明小鼠中的BM B细胞区室是正常的(即等价于仅表达小鼠抗体链的小鼠的区室)。
图67B：骨髓B祖细胞区室分析。这个图示出与来自+/HA,K2/KA小鼠的BM B细胞相比，来自本发明的转基因S1F/HA,K2/KA小鼠的骨髓(BM)B细胞的FACS分析结果，本发明的转基因S1F/HA,K2/KA小鼠表达全部是人的重链可变区(其中内源性重链表达已通过倒位而失活)及人κ链可变区。结果显示本发明小鼠中的BM B细胞区室是正常的。
图68：示出在各种小鼠中的亚型和总Ig的Ig定量：S1F/HA,KA/+＝(i)S1F–第一内源性重链等位基因具有一个人重链基因座DNA插入，内源性小鼠VDJ区已通过倒位和向染色体上游移动而失活；(ii)HA–第二内源性重链等位基因已失活(通过内源性中断序列倒位)；(iii)KA–第一内源性κ等位基因已失活(通过内源性中断序列倒位)；(iv)+-第二内源性κ等位基因是野生型κ等位基因。这种排列仅编码来自第一内源性重链等位基因的重链。
S1F/HA,K2/KA＝(i)K2–第一内源性κ等位基因在最3’内源性Jκ和小鼠Cκ之间有两个κ链基因座DNA插入，提供14个人Vκ和Jκ1-Jκ5的插入；和(ii)KA–第二内源性κ等位基因已失活(通过内源性中断序列倒位)。这种排列仅编码包含人可变区的重链和基本上来自第一内源性κ等位基因的κ轻链。
+/HA,K2/+-这种排列编码小鼠重链以及小鼠和人κ轻链二者。
+/HA,+/KA–这种排列编码小鼠重链和κ链。
在此图中，“Sum Ig”是IgG和IgM同种型的总和。
图69：显示各种小鼠中亚型和总Ig的Ig定量：
S1F/HA,K2/KA(n＝15)和12个仅表达小鼠抗体链的小鼠(+/HA，+/KA(n＝6)和野生型小鼠(WT；n＝6))。
序列
SEQ ID No 1是大鼠转换序列
SEQ ID No 2是着陆垫靶向载体(长版本)
SEQ ID No 3是着陆垫靶向载体(短版本)
SEQ ID No 4是小鼠品系129转换序列
SEQ ID No 5是小鼠品系C57转换序列
SEQ ID No 6是着陆垫的5'同源臂
SEQ ID No 7是寡聚物HV2-5
SEQ ID No 8是寡聚物HV4-4
SEQ ID No 9是寡聚物HV1-3
SEQ ID No 10是寡聚物HV1-2
SEQ ID No 11是寡聚物HV6-1
SEQ ID No 12是寡聚物Cμ
SEQ ID No 13是寡聚物KV1-9
SEQ ID No 14是寡聚物KV1-8
SEQ ID No 15是寡聚物KV1-6
SEQ ID No 16是寡聚物KV1-5
SEQ ID No 17是寡聚物Cκ
SEQ ID No 18–20是大鼠转换序列
SEQ ID No 21是X1X2 T F G Q,其中X1X2＝PR、RT或PW
SEQ ID No 22是X1X2 T F G Q G T K V E I K R A D A,其中X1X2＝PR、RT或PW；
SEQ ID No 23是X3X4 T F G Q,其中X3X4＝PR或PW
SEQ ID No 24是X3X4 T F G Q G T K V E I K R A D A,其中X3X4＝PR或PW
SEQ ID No 25是引物E1554
SEQ ID No 26是引物E1555
SEQ ID No 27是引物ELP1352_Cγ1
SEQ ID No 28是引物ELP1353_Cγ2b
SEQ ID No 29是引物ELP1354_Cγ2a
SEQ ID No 30是引物ELP1356_VH4-4
SEQ ID No 31是引物ELP1357_VH1-2,3
SEQ ID No 32是引物ELP1358_VH6-1
SEQ ID No 33是引物mIgG1_2rev
SEQ ID No 34是引物mIgG2b rev
SEQ ID No 35是引物mIgG2a_2rev
SEQ ID No 36是引物mCH1unirev
SEQ ID No 37是引物mCH1unirev_2
SEQ ID No 38-45是CDRH3序列
SEQ ID No 46-50是3、4、5、6或更多个(直至82个)GGGCT重复
SEQ ID NO 51-55是针对CTB的重链CDR1序列(克隆的及参照)
SEQ ID NO 56-60是针对CTB的重链CDR2序列(克隆的及参照)
SEQ ID NO 61-63是针对CTB的重链CDR3序列(克隆的及参照)
SEQ ID NO 64-68是针对CTB的J区序列(克隆的及参照)
发明详细描述
应理解本文所述特定实施方案是举例示出而非限制本发明。本发明的主要特征可以在各种实施方案中采用而不偏离本发明范围。本领域技术人员理解或者能够使用不超出常规研究确定本文描述的具体程序的各种等价物。这种等价物被认为是在本发明范围内并由权利要求覆盖。
单词“一个”当与权利要求和/或说明书中的“包含”联用时，可以指“一个”，也可以是“一或多个”、“至少一个”及“一个或一个以上”。权利要求中的术语“或者”是指“和/或”，除非明确指出仅是择一的或者各个备选互相是排他的，尽管说明书支持仅是择一的和“和/或”的定义。在本申请中，术语“大约”用于指示数值包括装置、确定数值所采用的方法的固有误差，或者研究对象中存在的偏差。
如说明书和权利要求所用，术语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是包括的或开放的，不排除额外的、未提及的元件或方法步骤。
本文所用术语“或其组合”是指该术语之前列举项目的所有排列与组合。例如，“A、B、C或其组合”是指包括至少如下之一：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，且如果顺序在特定情况中是重要的，还包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。继续这个实例，明确包括的是含有一或多个项目或术语的重复的组合，如BB、AAA、MB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等等。本领域技术人员理解，除非根据上下文明显，典型地对于任何组合中项目或术语的数目没有限制。
作为抗体基因区段序列的来源，本领域技术人员意识到下述可利用的数据库和资源(包括其更新)，其内容引入本文：
Kabat数据库(G.Johnson and T.T.Wu,2002；World Wide Web(www)kabatdatabase.com).由E.A.Kabat和T.T.Wu在1966年建立，Kabat数据库公布了抗体、T细胞受体、主要组织相容性复合物(MHC)I和II类分子及免疫学感兴趣的其它蛋白质的比对的序列。可检索界面由SeqhuntII提供。
可利用工具及一系列用途用于序列比对、序列亚组分类及产生变异性图。也见Kabat,E.A.,Wu,T.T.,Perry,H.,Gottesman,K.,and Foeller,C.(1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest,5th ed.,NIH Publication No.91–3242,Bethesda,MD,其引入本文参考，特别是有关用于本发明的人基因区段。
KabatMan(A.C.R.Martin,2002；World Wide Web(www)bioinf.org.uk/abs/simkab.html).这是对Kabat序列数据库进行简单查询的网络界面。
IMGT(the International ImMunoGeneTics InformationM.-P.Lefranc,2002；World Wide Web(www)imgt.cines.fr).IMGT是专门针对所有脊椎动物物种的抗体、T细胞受体和MHC分子的集成信息系统。其提供了标准化数据的共同端口，所述数据包括核苷酸和蛋白质序列、寡核苷酸引物、基因图谱、遗传多态性、特异性和二维(2D)和三维(3D)结构。IMGT包括三个序列数据库(IMGT/LIGM-DB,IMGT/MHC-DB,IMGT/PRIMERDB),一个基因组数据库(IMGT/GENE-DB),一个3D结构数据库(IMGT/3Dstructure-DB)和一系列网络资源(“IMGT Marie-Paule page”)和交互工具。
V-BASE(I.M.Tomlinson,2002；World Wide Web(www)mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase).V-BASE是从超过1千个公布数据汇编的所有人抗体种系可变区序列的综合目录。其包括对比软件版本DNAPLOT(由Hans-Helmar Althaus和Werner Müller开发)，允许重排的抗体V基因与它们最接近种系基因区段的对比。
Antibodies—Structure and Sequence(A.C.R.Martin,2002；World Wide Web(www)bioinf.org.uk/abs).这个网页总结了抗体结构和序列的实用信息。其提供针对Kabat抗体序列数据的查询界面，抗体一般信息，晶体结构，及其它抗体相关信息的链接。其还发布对在Protein Databank(PDB)中保存的所有抗体结构的自动化总结。特别感兴趣的是对抗体可变区的各种编号方案的详细描述和比较。
AAAAA(A Ho’s Amazing Atlas of Antibody Anatomy；A.Honegger,2001；WorldWide Web(www)unizh.ch/～antibody).这个资源包括用于结构分析、建模和工程化的工具。针对抗体和T细胞受体序列的综合结构对比，其采用统一方案，并且包括Excel宏用于抗体分析和图形显示。
WAM(Web Antibody Modeling；N.Whitelegg and A.R.Rees,2001；World WideWeb(www)antibody.bath.ac.uk).由Centre for Protein Analysis and Design at theUniversity of Bath,United Kingdom主管。使用已知理论方法的组合基于AbM包(之前由Oxford Molecular销售)构建抗体Fv序列的3D模型，这个网站也包括最新抗体结构信息。
Mike’s Immunoglobulin Structure/Function Page(M.R.Clark,2001；WorldWide Web(www)path.cam.ac.uk/～mrc7/mikeimages.html)这些网页提供了免疫球蛋白结构和功能的培训材料，通过许多彩色图像、模型和动画示出。可获得关于抗体人源化和MikeClark’s Therapeutic Antibody Human Homology Project的额外信息，目的在于将临床功效和抗免疫球蛋白应答与治疗抗体的可变区序列相关联。
The Antibody Resource Page(The Antibody Resource Page,2000；World WideWeb(www)antibodyresource.com).该网站自我描述为“抗体研究和供应商的完全指导”。提供了氨基酸测序工具、核苷酸抗体测序工具和杂交瘤/细胞培养物数据库的链接。
Humanization bY Design(J.Saldanha,2000；World Wide Web(www)people.cryst.bbk.ac.uk/～ubcg07s).这个资源提供了抗体人源化技术的总结。最实用特征是超过40个公布的人源化抗体的可检索数据库(通过序列和文字)，包括设计问题、构架选择、构架回复突变和人源化过构建体的结合亲和性信息。
还参见Antibody Engineering Methods and Protocols,Ed.Benny K C Lo,Methods in Molecular BiologyTM,Human Press.World Wide Web(www)blogsua.com/pdf/antibody-engineering-methods-and-protocolsantibody-enginee ring-methods-and-protocols.pdf
除非根据上下文很明显，本文的任何部分均可以组合本文的任何其它部分。
根据本发明揭示可以不用过度实验而产生和实施本文揭示和请求保护的所有组合物和/或方法。虽然本发明的组合物和方法已经在优选的实施方案中描述，但本领域技术人员应意识到在不偏离本发明观点、精神和范围的前提下可以对所述组合物和/或方法及所述方法的步骤或步骤顺序加以改变。为本领域技术人员已知的所有这些相似的替代和修饰被认为在所附权利要求书要求的本发明的精神、范围和观点内。
下述实施例为本领域技术人员提供了如何产生和使用本发明的完整揭示和描述，不是意在限制发明人所认为的发明范围。
实施例
实施例1
BAC重组工程(Recombineering)
总体策略:本发明的小鼠模型可以通过将含有全部V、D和J区的～960kb人重链基因座插入小鼠恒定区上游及将473kb的人κ区插入小鼠恒定区上游而实现。或者，或串联地，人λ区插入到小鼠恒定区上游。这个插入通过用本领域熟知技术在ES细胞中经基因靶向而实现。
完整V-D-J区以它们天然(野生型)构型高可靠性插入每个基因座中合适地通过将人细菌人工染色体(BAC)插入基因座而实现。合适地，BAC被修剪以便在最终基因座中与原始相比没有序列被复制或者丢失。这种修剪可以通过重组工程进行。
覆盖这些基因座的合适修剪的相关人BAC平均大小为90kb。
在一个途径中，在下述实验插入方案中人D和J元件的完全互补序列及7或8个人V区被待插入的第一个BAC覆盖。待插入IgH和IgK基因座的第一个BAC可以含有下述V区：IgH:V6-1、VII-1-1、V1-2、VIII-2-1、V1-3、V4-4、V2-5，和IgK:V4-1、V5-2、V7-3、V2-4、V1-5、V1-6、V3-7、V1-8。
合适地，每个基因座的性能在第一个BAC插入后用嵌合小鼠评估，并且也在每个后续BAC添加后评估。这个性能测试的详细描述如下。
IgH基因座需要9个额外BAC插入及IgK需要5个额外BAC插入以提供分别覆盖全部0.96Mb和0.473Mb的IgH和IgK基因座的人V区的完全互补序列。
当被插入ES细胞基因组中时不是所有BAC均保持其野生型构型。因此，配置了高密度基因组阵列以筛选ES细胞以鉴别具有完整BAC插入的那些(Barrett,M.T.,Scheffer,A.,Ben-Dor,A.,Sampas,N.,Lipson,D.,Kincaid,R.,Tsang,P.,Curry,B.,Baird,K.,Meltzer,P.S.,et al.(2004).Comparative genomic hybridization using oligonucleotidemicroarrays and total genomic DNA.Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America 101,17765-17770.)。这种筛选也使得能鉴别和选择去掉其中ES细胞基因组受损因此不能繁殖嵌合动物种系的ES克隆。促进这种评估的其它合适基因组工具包括测序和PCR验证。
因此在一个方面中，在进行下一步之前证实正确的BAC结构。
上述描述暗示，为了用90kb BAC完整工程化基因座，对于IgH需要进行最少10个靶向步骤，对于IgK需要最少5个步骤。具有IgL基因座的小鼠可以以类似于IgK基因座方式产生。需要额外步骤除去支持基因靶向所需的选择标记。因为这些操作在ES细胞中以逐步方式进行，在一个方面，种系传递能力在此过程中被保持。
在本发明中重要的是，在多轮操作中保持ES细胞克隆的性能，而无需在每个步骤中测试ES细胞系的种系潜力。目前用于KOMP和EUCOMM总体敲除计划中的细胞系在它们用于此计划之前已被修饰两次，它们的种系传递率与亲代细胞相比无变化(这些细胞系是公众可获得的，参见World Wide Web(www)komp.org和World Wide Web(www)eucomm.org)。称为JM8的这个细胞系在公布的培养条件下可以产生100％ES细胞衍生的小鼠(Pettitt,S.J.,Liang,Q.,Rairdan,X.Y.,Moran,J.L.,Prosser,H.M.,Beier,D.R.,Lloyd,K.C.,Bradley,A.,and Skarnes,W.C.(2009).Agouti C57BL/6N embryonic stem cells for mousegenetic resources.Nature Methods.)。使用标准小鼠ES细胞培养条件，这些细胞已证实可再现地贡献嵌合动物体细胞和种系组织的能力。用在标准饲养细胞系(SNL)上培养的细胞或者甚至无饲养细胞、仅在明胶包被组织培养平板上生长的细胞可以发现这种能力。一个特定的传代细胞系JM8A3，在几轮亚克隆后仍保持发展嵌合体种系的能力。经过例如同源重组(本发明中是这种情况)的广泛遗传操作不能损害所述细胞的多能性。产生具有如此高百分比ES细胞衍生组织的嵌合体的能力具有其它优势。首先，高水平嵌合度与种系传递潜力相关并且提供替代测定用于种系传递，其仅需要5-6周。第二，因为这些小鼠是100％ES细胞衍生的，工程化基因座可以被直接检测，消除了由于培育导致的延迟。在嵌合体中测试所述新Ig基因座的完整性是可能的，因为宿主胚胎将衍生自是RAG-1基因突变体的动物，如下节所述。
可以使用的另一个细胞系是HPRT-ve细胞系，如AB2.1，如Ramírez-Solis R,Liu Pand Bradley A,"Chromosome engineering in mice,”Nature,1995；378；6558；720-4所揭示。
RAG-1互补:尽管许多克隆会产生100％ES衍生小鼠，但是一些克隆不能。因此，在每个步骤，在RAG-1缺陷背景中产生小鼠。这提供了具有100％ES衍生的B细胞和T细胞的小鼠，其可以直接用于免疫和抗体产生。可以使用具有RAG-2缺陷背景或者组合的RAG-1/RAG-2缺陷背景的细胞，或者等价突变，其中小鼠仅产生ES细胞衍生的B细胞和/或T细胞。
为了仅人-小鼠IgH或IgK基因座在这些小鼠中是活性的，人-小鼠IgH或IgK基因座可以在细胞系中工程化，该细胞系中IgH或IgK基因座的一个等位基因已被失活。或者，宿主Ig基因座如IgH或IgK基因座的失活可以在插入后进行。
具有RAG-1基因突变的小鼠品系是免疫缺陷的，因为它们不具有成熟B或T淋巴细胞(US 5,859,307)。T和B淋巴细胞仅在正确V(D)J重组发生时分化。因为RAG-1是对于这种重组关键的酶，所以缺乏RAG-1的小鼠是免疫缺陷的。如果宿主胚胎在遗传上是RAG-1纯合突变体，则如果动物淋巴组织衍生自宿主胚胎，通过注射这种胚胎产生的嵌合体不能产生抗体。但是，JM8细胞和AB2.1细胞例如通常贡献嵌合动物的超过80％的体细胞组织，因此通常发展淋巴组织。JM8细胞具有野生型RAG-1活性，因此在嵌合动物中产生的抗体仅由工程化JM8 ES细胞基因组编码。因此，嵌合动物可以通过免疫用抗原攻击，随后产生针对该抗原的抗体。这使得本领域技术人员能检测如本发明所述的工程化人/小鼠IgH和IgK基因座的性能。参见图19和20。
本领域技术人员能使用所述嵌合动物确定抗体多样性程度(参见例如Harlow,E.&Lane,D.1998,5th edition,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLab.Press,Plainview,NY)。例如，嵌合动物血清中存在一些抗体表位可以通过例如在ELISA测定中与特异性抗独特型抗血清的结合而确定。本领域技术人员还可以测序衍生自嵌合动物的B细胞克隆的基因组并且将所述序列与野生型序列进行比较以确定高变水平，这种高变是正常抗体成熟的指征。
本领域技术人员还可以使用嵌合动物检查抗体功能，其中所述抗体从工程化Ig基因座编码(参见例如Harlow,E.&Lane,D.1998,5th edition,Antibodies:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Lab.Press,Plainview,NY)。例如，可以测试抗血清对抗原的结合，所述抗原用于免疫嵌合动物。这种测量可以用ELISA测定进行。或者，本领域技术人员可以通过加入从合适免疫的嵌合动物收集的抗血清而测试抗原的中和。
本领域技术人员熟知任何这些测试的阳性结果证实本发明的工程化Ig基因座编码具有人可变区和小鼠恒定区的抗体的能力，所述抗体能以野生型抗体的方式起作用。
实验技术:用于产生载体用于ES细胞中的同源重组的重组工程在例如WO9929837和WO0104288中描述，这些技术是现有技术中熟知的。在一个方面，人DNA的重组工程用BAC作为所述人DNA的来源。人BACDNA用BAC纯化试剂盒分离。每个人BAC的骨架用重组工程修饰至与已插入小鼠IgH区中的BAC完全相同或类似的构型。每个人BAC的基因组插入序列用重组工程修剪，从而一旦BAC被插入，则在小鼠IgH或IgK基因座形成人V(D)J基因组区域的无缝连续部分。BAC DNA通过电穿孔的转染及基因分型根据标准方案进行(Prosser,H.M.,Rzadzinska,A.K.,Steel,K.P.,and Bradley,A.(2008).“Mosaiccomplementation demonstrates a regulatory role for myosin VIIa in actindynamics of stereocilia.”Molecular and Cellular Biology 28,1702-1712；Ramirez-Solis,R.,Davis,A.C.,and Bradley,A.(1993).“Gene targeting in embryonic stemcells.”Methods inEnzymology 225,855-878.)。重组工程用由Pentao Liu and DonCourt实验室开发的程序和试剂进行(Chan,W.,Costantino,N.,Li,R.,Lee,S.C.,Su,Q.,Melvin,D.,Court,D.L.,and Liu,P.(2007).“A recombineering based approach forhigh-throughput conditional knockout targeting vector construction.”NucleicAcids Research 35,e64)。
用于将BAC衍生的染色体片段基因靶向和重组进非人哺乳动物基因组如小鼠中的这些及其它技术是本领域熟知的并且在例如World Wide Web(www)eucomm.org/information/targeting和World Wide Web(www)eucomm.org/information/publications中描述。
C57BL/6N衍生的细胞系如JM8雄性ES细胞的细胞培养将遵循标准技术。JM8ES细胞已显示能够广泛贡献体细胞组织及种系，正用于Sanger 研究所的大型小鼠诱变项目如EUCOMM和KOMP(Pettitt,S.J.,Liang,Q.,Rairdan,X.Y.,Moran,J.L.,Prosser,H.M.,Beier,D.R.,Lloyd,K.C.,Bradley,A.,and Skarnes,W.C.(2009).“Agouti C57BL/6Nembryonic stem cells for mouse genetic resources.”Nature Methods.)。JM8 ES细胞(1.0X107)用10μg I-SceI线性人BAC DNA电穿孔(500μF,230V；)。转染子用嘌呤霉素(3μg/ml)或G418(150μg/ml)选择。所述选择在电穿孔后24小时(用G418)或48小时(用嘌呤霉素)开始并且进行5天。10μg线性化人BAC DNA可以产生直至500嘌呤霉素或G418抗性ES细胞集落。将抗生素抗性ES细胞集落挑取到96孔细胞培养平板中用于基因分型以鉴别靶向的克隆。
一旦鉴别靶向的小鼠ES细胞克隆，经阵列比较基因组杂交(CGH)分析它们的总基因组完整性(total genome integrity)(Chung,Y.J.,Jonkers,J.,Kitson,H.,Fiegler,H.,Humphray,S.,Scott,C.,Hunt,S.,Yu,Y.,Nishijima,I.,Velds,A.,et al.(2004).“Awhole-genome mouse BAC microarray with 1-Mb resolution for analysis of DNAcopy number changes by array comparative genomic hybridization.”Genomeresearch 14,188-196.，及Liang,Q.,Conte,N.,Skarnes,W.C.,and Bradley,A.(2008).“Extensive genomic copy number variation in embryonic stem cells.”Proceedingsof the National Academy of Sciences of the United States of America 105,17453-17456.)。具有异常基因组的ES细胞不能有效贡献嵌合小鼠的种系。BAC完整性通过PCR扩增BAC中的每个已知功能性V基因而检查。例如，在一个途径中，选择用于IgH基因座的第一个人BAC具有6个功能性V基因。为证实这个BAC存在这6个IGH V基因的完整性，设计至少14对PCR引物用于PCR扩增来自靶向的ES细胞的基因组DNA。这些片段的人野生型大小和序列保证插入的BAC未重排。
更详细的CGH也证实插入的BAC的完整性。例如，本领域技术人员可以使用寡聚物aCGH平台，其由Agilent Technologies,Inc开发。这个平台不仅能使人们以高分辨率研究基因组范围DNA拷贝数变异(Barrett,M.T.,Scheffer,A.,Ben-Dor,A.,Sampas,N.,Lipson,D.,Kincaid,R.,Tsang,P.,Curry,B.,Baird,K.,Meltzer,P.S.,et al.(2004).“Comparative genomic hybridization using oligonucleotide microarrays andtotal genomic DNA.”Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America 101,17765-17770.)，而且也允许使用定制设计阵列检查具体基因组区域。与依赖于cDNA探针或完整BAC探针的传统aCGH技术相比，60聚体(60-mer)寡核苷酸探针可以保证检测已制备的工程化染色体改变所需的特异性杂交及高灵敏性和精度。例如，设计沿完整长度的插入的BAC以固定间隔杂交的寡聚物甚至能检测非常小的缺失、插入或其它重排。另外，这个平台提供了最大灵活性供定制微阵列设计。靶向的ES细胞基因组DNA和正常人个体基因组DNA用染料分别标记并且与阵列杂交。阵列玻片用AglientTechnologies DNA微阵列扫描仪扫描。用Bluefuse软件(Bluegnome)提取每个阵列图像上的染料Cy5和染料Cy3的倒数荧光强度及log2比率值。具有不一致荧光模式的点(“置信度”<0.29或“质量”＝0)在标准化所有log比率值之前被排除。在实验内，来自任何寡聚物探针的信号的Log2比率值在-0.29和+0.29之间被认为是无拷贝数变化。“复制”的log2比率阈值通常>0.29999，缺失是<0.29999。
一旦第一个人BAC被插入小鼠IgH基因座并且证实是在其完整、天然构型，则用Flp位点特异性重组酶切除侧翼为FRT的BAC骨架。如果常规的Flp催化的FRT重组不够高，可以使用Flo，其是Flpo重组酶的改良版本，其在某些测试中在ES细胞中比原始Flp有效3-4倍。在切除BAC骨架后，ES细胞变得对嘌呤霉素(或G418)敏感及对FIAU抗性(因为丧失TK盒)。切除事件进一步用人基因组DNA引物通过PCR扩增连接片段而鉴定。这些不含侧翼为FRT的BAC骨架的ES细胞用于下一轮人BAC插入及用于胚泡注射。
靶向ES细胞基因组产生转基因小鼠可以用附图1-18所描述的方案进行。
图1示出3个基本骨架载体；一个初始盒和2个大插入序列载体1和2。初始盒包含与希望插入小鼠基因组的位点同源的序列，这些位点位于选择标记和用于基于PCR的基因分型以证实BAC正确插入的填充片段引物序列的侧翼。填充片段-引物序列提供了基因分型每个BAC添加步骤的基础。这个序列被认为为PCR引物提供了非常良好的验证的序列模版，可以位于ISceI位点，理想地距BAC插入序列～1kb。
大插入序列载体包含在具有选择标记和独特限制位点的质粒上的人DNA，所述限制位点用于线性化质粒以帮助同源重组进ES细胞基因组中。
图2示出初始盒通过同源重组插入小鼠基因组中小鼠J4和Cα外显子之间。嘌呤霉素选择使得鉴别具有盒插入的ES细胞。pu(Delta)tk是嘌呤霉素N-乙酰转移酶(Puro)和单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(DeltaTk)截短形式之间的双功能融合蛋白。用pu(Delta)tk转染的鼠胚胎干(ES)细胞变得对嘌呤霉素抗性及对1-(-2-脱氧-2-氟-1-β-D-阿拉伯糖-呋喃糖基)-5-碘尿嘧啶(FIAU)敏感。与其它HSV1tk转基因不同，puDeltatk容易在雄性种系中传递。因此，pu(Delta)tk是方便的阳性/阴性选择标记，可以广泛用于许多ES细胞应用中。
图3示出大插入序列载体1靶向小鼠ES细胞基因组。这个载体的线性化是在与填充片段引物序列相同的位置进行，其允许现有技术中熟知的缺口修复基因分型策略，见Zhenget al NAR 1999,Vol 27,11,2354–2360。重点而言，靶向载体随机插入基因组中不“修复”缺口，而同源重组事件会修复缺口。合适PCR引物序列的并置允许逐个筛选集落检测阳性PCR片段，指示正确插入。用G418的阳性选择允许鉴别含有neo选择标记的小鼠ES细胞。PCR验证可以对所有关键V、D和J区进行。阵列比较基因组杂交可以用于验证BAC结构。
图4示出puro-delta-tk盒，BAC质粒骨架用Flpe缺失并且在FIAU中选择。因为Flpe在小鼠ES细胞中不是有效的(5％缺失，用瞬时Flpe表达)，预期在大多数情况中，重组发生在BAC骨架的两个FRT位点之间。也可以测试Flpo以发现在距离10kb的两个FRT之间的重组效率。
鉴于FRT缺失步骤是可选择的，因此可以集合FIAU抗性克隆并立即进行与克隆分析平行的下一步。或者，可能希望通过短范围PCR显示人序列现在与小鼠序列相邻，如所示(Hu-引物1和Mo-引物)。
在这个阶段，已插入200kb人基因座。
图5示出第二个大插入序列载体靶向ES细胞染色体。使用相同的初始盒插入、然后ISce1BAC线性化、BAC靶向初始盒及缺口修复基因分型策略，人BAC靶向小鼠IgH基因座。BAC插入的验证如前所述进行。
图6示出大插入序列载体2的侧翼为FRTY的BAC骨架和neo标记经Flpo缺失。注意这不是可选择的，因此必需在此时进行克隆分析。这使得可以证实人2插入序列与人1插入序列的并置及其它验证努力。
在这个阶段已插入～200kb人基因座。
图7示出靶向小鼠IgH基因座的下一个大插入序列载体。pu-delta TK盒然后被除去，如图4所示。这个方法可以重复以掺入其它BAC。
图8示出最终预测的ES细胞构建体。
图9–18提供这一方法的进一步细节。
实施例2
位点特异性重组
在本发明进一步方法中，也可以采用位点特异性重组。位点特异性重组(SSR)在最近20年已被广泛用于将转基因整合进指定的染色体基因座。SSR涉及同源DNA序列之间的重组。
第一代基于SSR的染色体靶向涉及在(i)转染质粒中的单个重组靶位点(RT)如loxP或FRT与(ii)由先前的整合提供的染色体RT位点之间的重组。这个途径的主要问题是插入事件稀少，因为切除总是比插入更有效率。第二代SSR称为RMCE(重组酶介导的盒交换)由Schlake和Bode在1994年介绍(Schlake,T.；J.Bode(1994)."Use of mutated FLP-recognition-target-(FRT-)sites for the exchange of expression cassettes atdefined chromosomal loci".Biochemistry 33:12746–12751)。他们的方法基于使用转染质粒中的异种特异性和不相容RT，其可以与染色体上的相容RT位点重组，导致一段DNA与另一段交换，或盒交换。这个途径已成功用于各种有效的染色体靶向中，包括大于50kb的BAC插入序列的整合(Wallace,H.A.C.et al.(2007).“Manipulating the mouse genome toengineering precise functional syntenic replacements with human sequence”.Cell 128:197-209；Prosser,H.M.et al.(2008).“Mosaic complementationdemonstrates a regulatory role for myosin VIIa in actin dynamics ofStereocilia”.Mol.Cell.Biol.28:1702-12)。
BAC的最大插入序列大小是大约300kb，因此这给用于RMCE的盒大小设置了上限。
在本发明中，使用了称为相继RMCE(SRMCE)的新的基于SSR的技术，其使得能将BAC插入序列连续插入同一基因座。
所述方法包括步骤：
1.将形成初始盒(本文也称为着陆垫)的DNA插入细胞基因组中；
2.将第一个DNA片段插入插入位点，所述第一个DNA片段包含人DNA的第一部分和含有第一选择标记或在插入时产生选择标记的第一载体部分；
3.除去部分载体DNA；
4.将第二个DNA片段插入第一个DNA片段的载体部分，所述第二个DNA片段含有人DNA的第二部分和第二载体部分，所述第二载体部分含有第二选择标记或者在插入时产生第二选择标记；
5.除去任何载体DNA以允许第一个和第二个人DNA片段形成连续序列；及
6.按需要重复人V(D)J DNA部分插入和载体DNA除去的步骤，以产生具有全部或部分人VDJ或VJ区的细胞，足以能够产生与宿主恒定区组合的嵌合抗体,
其中至少一个DNA片段的插入使用位点特异性重组。
在一个具体方面，所述途径使用3个异种特异性和不相容loxP位点。所述方法包括图22-26示出的如下步骤：
1.将着陆垫靶向指定的基因座.将含有侧翼为倒位的piggyBac(PB)ITR的HPRT小基因的进入载体靶向指定区域(例如IGHJ和Eμ之间或者IGKJ和Eκ之间或者IGLC1和Eλ3-1之间的区域)以作为用于BAC靶向的着陆垫。所述HPRT小基因包含2个合成外显子和相关的内含子。5’HPRT外显子侧翼是两个异种特异性和不相容loxP位点(一个野生型，另一个是突变的位点，lox5171)，它们彼此倒位(图22)。这两个loxP位点提供重组位点用于通过RMCE进行BAC插入。
2.将第一个修饰的BAC插入靶向的着陆垫.第一个BAC具有待插入基因组的一段DNA，该DNA侧翼为工程化的修饰。5’修饰(loxP–neo基因-lox2272-PGK启动子–PB 5’LTR)和3’修饰(PB3’LTR-puroΔTK基因–lox5171)示于图23，绘出了lox位点和PB LTR的相对方向。利用来自共电穿孔载体的瞬时CRE表达，所述DNA序列通过RMCE被插入指定的基因座。可以如下选择已发生正确插入的细胞：(i)嘌呤霉素抗性(puroΔTK基因已从着陆垫获得启动子–“PGK”)，(ii)6TG抗性(HPRT小基因已被破坏)，及(iii)G418抗性(选择经5’区PGK-neo排列的任何插入)。可以使用这些选择方案的任意组合。G418抗性和6TG抗性选择5’末端的正确事件，而嘌呤霉素抗性选择3’末端的正确事件。
3.消除(除去)第一个插入的3’修饰.正确插入的第一个BAC产生具有侧翼为倒位的PB LTR的puroΔTK基因的3’末端(图24)–本质上是正确的转座子结构。这个转座子可以然后通过(从电穿孔载体)瞬时表达piggyBac转座酶而被除去。具有正确切除事件的细胞可以通过FIAU抗性选择，即没有来自puroΔTK基因的胸苷激酶活性。这完全除去了3’修饰，没有核苷酸痕迹留下。
4.将第二个修饰的BAC插入第一个插入的5’末端.第二个BAC具有待插入基因组中的一段DNA(通常目的是与用第一个BAC插入的DNA相连续)，该DNA侧翼为工程化的修饰。5’修饰(loxP–HPRT小基因5’部分–lox5171–PGK启动子–PB5’LTR)和3’修饰(PB3’LTR–puroΔTK–lox2272)示于图25，绘出了lox位点和PB LTR的相对方向。利用来自共电穿孔载体的瞬时CRE表达，所述DNA序列通过RMCE被插入指定的基因座。可以如下选择已发生正确插入的细胞：(i)HAT抗性(HPRT小基因通过正确插入事件而重建，即5’和3’外显子结构被合在一起)，及(ii)嘌呤霉素抗性(puroΔTK基因已从着陆垫获得启动子–“PGK”)。
5.消除(除去)第二个插入的3’修饰.正确插入的第二个BAC产生具有侧翼为倒位的PB LTR的puroΔTK基因的3’末端(图26)–本质上是正确的转座子结构，与成功的第一个BAC插入结果精确类似。因此，这个转座子类似地可以然后通过(从电穿孔载体)瞬时表达piggyBac转座酶而被除去。具有正确切除事件的细胞可以通过FIAU抗性选择，即没有来自puroΔTK基因的胸苷激酶活性。这完全除去了3’修饰，没有核苷酸痕迹留下。
6.在第二个BAC插入的3’修饰消除之后，着陆垫与原始的相同。整个过程，步骤2至5，可以重复多次以在基因组中建立大的插入。当完成时，除了希望的插入，没有残余核苷酸留下。
随着奇数个BAC插入Ig基因座，内源性VDJ或VJ序列可以通过经如下染色体工程进行的倒位而失活(见图27-29)：
1.将“翻转(flip-over)”盒靶向距内源性VDJ或VJ有10-40兆碱基的5’区域.翻转载体(PB3’LTR–PGK启动子–HPRT小基因5’部分–loxP–puroΔTK–CAGGS启动子–PB3’LTR)示于图27，绘出了lox位点和PBLTR的相对方向。
2.瞬时CRE表达导致“翻转”盒中的loxP位点与5’修饰中的loxP位点之间的重组。这个5’修饰如上述步骤2和5所述–本质上所述修饰产生自奇数个BAC的插入，在3’修饰被消除之后。loxP位点相对于彼此是倒位的，因此所述的重组事件导致如图28所示的倒位。具有正确倒位的细胞是HAT抗性的，因为HPRT小基因由正确倒位而重建。
3.正确倒位还留下两个转座子结构，位于“翻转”盒和5’修饰侧翼。两者可以用瞬时piggyBAC转座酶表达切除，无任一修饰残余留下(图29)。具有正确切除的细胞可以如下选择：(i)6TG抗性(HPRT小基因被缺失)和(ii)FIAU抗性(puroΔTK基因被缺失)。在Ig基因座中的所述倒位移动内源性IGH-VDJ或IGK-VJ区分别离开Eμ或Eκ增强子区，导致内源性IGH-VDJ或IGK-VJ区的失活。
本发明的插入方法合适地提供如下之一或多个：
在插入的DNA片段的5’和3’末端同时选择；
3’修饰的有效消除，优选通过转座酶介导的DNA切除；
内源性IGH或IGK活性通过倒位失活；及
修饰的切除，染色体中没有留下核苷酸痕迹。
实施例3
将测试载体插入基因组中指定位置
这个途径的概念验证示于图30。在图30中，如图22所示的着陆垫通过同源重组插入小鼠基因组中，随后通过cre介导的位点特异性重组将R21质粒插入着陆垫中。插入事件产生一些一般插入事件，360个G418抗性集落，其中～220个被插入希望的基因座，如HRPT小基因座的破坏所确定。
R21载体在5’和3’末端模拟第一个BAC插入载体，包括所有选择元件和重组酶靶位点。代替BAC序列，存在小的“填充片段(stuffer)”序列。这个载体测试本发明设计的所有原理，并使得容易测试结果，因为沿填充片段的PCR是可行的，因此使得插入的两个末端容易被测试。R21与cre表达载体共电穿孔进在IGH基因座携带着陆垫的ES细胞。4组转化细胞平行转染，然后置于不同选择方案下，如图30所示。G418选择(neo基因表达)导致最大数目的集落，因为不需要特异性着陆垫整合。R21任意整合进基因组均提供neo表达，导致G418抗性。Puro选择导致与Puro+6TG或G418+6TG类似的集落数目，提示Puro选择的严格性是由载体中缺乏启动子的PuroΔTK所致。Puro表达仅当整合发生在启动子元件附近时获得-在这个设计中最可能特别在着陆垫中。这些结论由连接PCR(junction PCR)结果支持，如图31所示。
本发明中下一步是“消除”整合的BAC载体中的3’末端，留下插入与侧翼基因组之间的无缝过渡。这个消除通过扩增来自上述(R21插入着陆垫)的个体克隆并通过转染表达质粒而在这个克隆中表达piggyBac重组酶而证实。使用FIAU选择其中3’修饰被切除的集落-即，通过丧失piggyBac末端重复之间的“PGK-puroΔTK”元件。从106个细胞的转染产生50个这种克隆，针对预期的基因组结构测试了其中6个克隆。成功的消除在图32中标为“3”的引物组之间产生阳性PCR。6个克隆中，4个具有正确切除，1个克隆保持原始构型，另一个具有缺失。
这些数据证实了使用上述途径在指定的基因组基因座中的着陆垫中重复插入了DNA。
实施例4
将人IG基因座的大的部分插入小鼠基因组中的指定位置
实施例3证实本发明的设计能够提供测试载体插入基因组中指定位置，在这种情况中R21载体插入小鼠IGH基因座。使用合适的选择培养基和cre重组酶表达产生了具有预测结构的基因组改变。
本发明中描述的相同设计元件被构建到BAC插入序列的5’和3’末端。所述插入序列包含来自IGH基因座的人序列，大约166kb。这个工程化BAC与cre表达质粒DNA一起电穿孔进在小鼠IGH基因座携带着陆垫的小鼠ES细胞。转染的细胞群在含有嘌呤霉素的培养基中生长以选择合适的插入事件。
分离了7个所得克隆并进一步分析。预期的重组事件和所得结构如图33所示。基于来自实施例3所述的R21实验数据，当转染的细胞群在含有嘌呤霉素的培养基中选择时预期对正确克隆的严格选择。这是因为puro编码区需要启动子元件，在重组后这优先由着陆垫提供。因此，7个分离克隆的大多数正确插入到基因组中着陆垫，这根据诊断PCR确定。用于诊断正确插入的引物示于图33。如果在引物“A”和“X”之间扩增出610bp片段并且在引物“Y”和“B”之间扩增出478bp片段，则基因组中存在正确连接(图33和34)。注意“A”和“1”引物之间和“2”和“B”引物之间有扩增片段说明存在亲代基因组(即，仅着陆垫)。来自亲代细胞的这些结果内部存在于在嘌呤霉素选择下由于集落的几何形状而逃避选择的细胞集落中。在将所述集落通过含有嘌呤霉素的培养基传代时，这些亲代连接片段消失，表明亲代细胞从群体中除去。另外，所有克隆均示出6-TG抗性，正如如果HPRT基因由正确插入事件而失活所预期的那样。
这些数据表明所揭示的用于将人IG基因座的大的部分插入小鼠基因组中指定位置的策略能够构建所述的具有位于小鼠恒定区上游的多个人IG区的可变区的小鼠。
实施例5
插入的基因座在基因重排、连接多样性及表达方面是功能性的
创建了细菌人工染色体(BAC)，其中所述BAC具有人Ig基因区段的插入序列(人V、D和/或J基因区段)。使用本文所述方法，着陆垫用于方法中以在小鼠胚胎干细胞(ES细胞)中构建嵌合Ig基因座，由此提供了嵌合IgH和IgK基因座，其中人基因区段功能性插入内源性恒定区的上游。为测试在衍生自人BAC插入的ES细胞克隆的嵌合小鼠中的人IgH-VDJ或IgK-VJ基因区段是否合适地重排和表达，对来自那些小鼠的白细胞的RNA样品用人可变区(V)和小鼠恒定区(C)的引物对进行RT-PCR。寡聚物序列如下所示(表1)。每个V寡聚物与C寡聚物配对(HV与Cμ；KV与Cκ)用于PCR反应。
表1
| 寡聚物 | 序列 |
| HV2-5 | AGATCACCTTGAAGGAGTCTGGTCC(SEQ ID NO 7) |
| HV4-4 | TGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTC(SEQ ID NO 8) |
| HV1-3 | CACTAGCTATGCTATGCATTGGGTG(SEQ ID NO 9) |
| HV1-2 | ATGGATCAACCCTAACAGTGGTGGC(SEQ ID NO 10) |
| HV6-1 | GGAAGGACATACTACAGGTCCAAGT(SEQ ID NO 11) |
| Cμ | TAGGTACTTGCCCCCTGTCCTCAGT(SEQ ID NO 12) |
| KV1-9 | AGCCCAGTGTGTTCCGTACAGCCTG(SEQ ID NO 13) |
| KV1-8 | ATCCTCATTCTCTGCATCTACAGGA(SEQ ID NO 14) |
| KV1-6 | GGTAAGGATGGAGAACACTGGCAGT(SEQ ID NO 15) |
| KV1-5 | TTAGTAGCTGGTTGGCCTGGTATCA(SEQ ID NO 16) |
| Cκ | CTTTGCTGTCCTGATCAGTCCAACT(SEQ ID NO 17) |
使用SuperScriptTM III One-Step RT-PCR系统和Taq HighFidelity(InvitrogenTM；World Wide Web(www)invitrogen.com/site/us/en/home/ References/protocols/nucleic-acid-amplification-and-expression-profiling/pcr- pr otocol/superscript-3-one-step-rt-pcr-system-with-platinum-taq-high- fidelity.htm l#prot3)的一步配方，在一个试管中用基因特异性引物和靶RNA同时实现cDNA合成和PCR扩增。
RT-PCR结果显示大多数人IGH-VDJ或IGK-VJ基因区段在嵌合小鼠中合适地重排和表达。为研究关于从VDJ/VJ重排产生的多样性的细节，将这些特异性RT-PCR片段克隆进常用载体用于测序。
测序结果显示JH、DH和JK使用(图35和图36)与人类结果相似。另外，来自IGH-VDJCμ转录物的结果显示CDR-H3长度的范围和平均值(图37)与人类中观测到的相似。还观测到从外切核酸酶和核苷酸添加活性产生的连接多样性(图38)。与IGK重排相比IGH重排具有更高频率的这些活性。这些数据提示插入的基因座在基因重排、连接多样性及表达方面是功能性的。
实施例6
可以获得生产性(Productive)VJ重排和体细胞高变
图41示出来自携带重排的VJ的小鼠B细胞的κmRNA的分析，所述VJ已从人种系κV1-8和J1重排，证实可以获得生产性VJ重排及体细胞高变，后者从mRNA编码的抗体在种系序列方面的变化而见。图42展示了针对V1-6和J1的同样分析。重要地，重组消除了由(未突变的)人种系基因区段的组合编码的终止密码子，由此允许编码抗体mRNA序列。图43证实插入的人κV1-5J1和V1-5J4可以在体内产生功能性编码序列和连接多样性。
实施例7
对于表达的重排重链，通过倒位失活内源性IGHV基因区段
介绍
从称为S1小鼠的转基因小鼠的脾B淋巴细胞产生5’-RACE Cμ-特异性文库。这些小鼠包含转基因重链基因座，每个基因座含有6个最3’功能性人VH基因区段(VH2-5、7-4-1、4-4、1-3、1-2、6-1)和全部人D和JH基因区段(包含功能性人D基因区段D1-1、2-2、3-3、4-4、5-5、6-6、1-7、2-8、3-9、5-12、6-13、2-15、3-16、4-17、6-19、1-20、2-21、3-22、6-25、1-26和7-27；及功能性人J基因区段J1、J2、J3、J4、J5和J6)，插入到内源性重链基因座中内源性IGHJ4和Eμ之间(小鼠染色体12：坐标114666435和114666436之间)。人DNA得自含有人染色体14从坐标106328951至坐标106494908的序列的细菌人工染色体(BAC)。用sRMCE构建转基因抗体基因座的进一步细节在本文它处及WO2011004192(引入本文作参考)中给出。4x96孔平板的克隆被随机挑取用于测序以确定基因区段使用。所有检测的免疫球蛋白重链均从小鼠VH或人VH与人D-JH重排。在重排产物中未检测到小鼠D和JH区段(图44)。
这个结果表明人VH-D-JH基因区段插入到内源性基因座中最后一个内源性J区(在此情况中，JH4)和Eμ增强子之间，对于表达的重排的免疫球蛋白重链，有效失活内源性D和JH基因区段的使用。
小鼠VH与人VH使用的比率是大约3比1(图45)。为完全消除用于抗体产生的小鼠VH使用，内源性小鼠VH-D-JH被倒位并移动到同一染色体上远端区域。小鼠VH与人D-JH区段重排被倒位作用及与重链基因座的距离而完全阻断。
倒位策略包括三个步骤：(a)倒位盒的靶向，(b)倒位内源性VDJ及(c)切除标记(图46)。
(a)倒位盒的靶向：
倒位盒由4个成分组成：CAGGS启动子驱动的嘌呤霉素抗性delta胸苷激酶(puroΔtk)基因，在PGK启动子控制下的5’HPRT基因区段，在它们之间的loxP位点(其针对已经存在于重链基因座中的另一个loxP位点方向是倒位的)，及两个侧翼piggyback LTR(PB3’LTR)。所述倒位靶向盒被插入染色体12上内源性IGH基因座的5’并远离其的区域，如图46所示。靶向的ES克隆被鉴别并用PCR证实。
(b)倒位：
在插入后，从转染质粒瞬时表达cre导致包括内源性VH-D-JH基因座和间插序列的染色体12片段部分通过两个倒位的loxP位点(即分别在倒位盒中的位点和用于BAC插入的着陆垫中的位点)的重组而倒位。倒位子(invertant)经HAT选择并通过跨过两个重组loxP位点的连接PCR证实。
(c)标记切除：
倒位重排了PB3’LTR与倒位盒及PB5’LTR与着陆垫的相对方向，产生两个piggyBac转座子结构，位于倒位区的侧翼。随着piggyBac转座酶(PBase)的瞬时表达，这两个转座子从染色体(及因此小鼠细胞基因组)切除。消除的ES克隆通过1-(-2-脱氧-2-氟-1-b-D-阿拉伯糖呋喃糖基)-5-碘尿嘧啶(FIAU)和6TG选择，并经跨越切除区域的连接PCR证实。
方法
组织培养:ES细胞培养、电穿孔和药物选择的程序先前已描述(Ramirez-Solis,R.,A.C.Davis,and A.Bradley.1993.Gene targeting in mouse embryonic stemcells.Methods Enzymol.225:855–878)。
靶向基因座用于倒位:简而言之，S1细胞系(S1.11.1)在M15培养基(补加15％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、抗生素和0.1mM 2-巯基乙醇的KnockoutTM DMEM)中培养。靶向构建体R57(图47)通过NotI在同源性区域之外线性化。总共20μg线性化构建体用GenePulserTM电穿孔进S1细胞系(AB2.1衍生的)，107个细胞铺板到3个90mm直径的含有M15培养基的SNL76/7饲养平板上。在电穿孔后24小时，向每个90mm直径平板中加入含有嘌呤霉素(每毫升3μg活性成分)的M15，细胞在选择下保持9天。然后挑取96个嘌呤霉素抗性克隆并在96孔板中扩增。靶向事件通过长范围PCR(long-range PCR)鉴别。
Cre-loxP介导的倒位:12个阳性克隆被合并在一起并在具有M15培养基的6孔组织培养平板中培养。细胞用10μg用于小鼠内源性基因座倒位的pCAGGS-Cre质粒转染，然后铺板在3个含有M15培养基的90mm直径SNL76/7饲养平板上。在电穿孔后24小时，向每个90mm直径平板加入含有1XHAT(次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷)的M15，细胞在选择下保持7天，然后用1XHT(次黄嘌呤-胸苷)处理2天。挑取48个HAT抗性集落，PCR扩增Cre-loxP介导的倒位后的连接处而基因分型。
HyPBase介导的标记切除:12个阳性克隆被合并在一起并在具有M15培养基的6孔组织培养平板中培养。细胞用5μg HyPBase质粒转染以激活两个选择标记(Hprt-小基因和PGK-puroΔtk基因)侧翼的PB转座子LTR并铺板在一个含有M15培养基的90mm直径SNL76/7饲养平板上。电穿孔后72小时，细胞系列稀释液然后铺板在3个含有补加1-(-2-脱氧-2-氟-1-b-D-阿拉伯糖呋喃糖基)-5-碘尿嘧啶(FIAU)的M15培养基的90mm直径SNL76/7饲养平板上。细胞在选择下保持10天，计数FIAU抗性集落，挑取，在96孔平板中扩增。阳性克隆通过PCR扩增切除选择标记后的连接处而鉴别。然后扩增阳性克隆用于胚泡显微注射。
嵌合体产生和培育:通过将ES细胞显微注射进C57/BL6胚泡并转移至假孕受体中产生小鼠嵌合体。雄性嵌合体与C57/BL6小鼠试验杂交。Agouti F1后代通过S1 3’连接PCR而基因分型。试验杂交阳性杂合子进一步互交产生纯合子。
通过快速扩增5’cDNA末端(5’RACE)PCR确定VH-D-JH使用:用Reagent(InvitrogenTM,Life Technologies LtdTM)从S1inv1小鼠(KMSF30.1d)脾中提取总RNA，用DNaseI处理。用5'/3'RACE试剂盒(第2代,Roche)根据厂商方案进行5′-cDNA末端(5’RACE)PCR的快速扩增。第一链cDNA用引物E1554(5’-ATGACTTCAGTGTTGTTCTGGTAG-3’；SEQ ID No25)合成，所述引物位于小鼠内源性Cμ区。合成的第一cDNA链用High Pure PCR ProductPurification Kit(Roche)纯化。Poly(A)尾根据5'/3'RACE试剂盒(第2代,Roche)提供的方案进行添加。VH-D-JH重排转录物的5’末端用嵌套式PCR用包括在试剂盒中的正向引物OligodT和嵌套式Cμ特异性反向引物E1555(5’-CACCAGATTCTTATCAGAC-3’；SEQ ID No 26)进行扩增。反应后，5’RACE PCR产物在1％琼脂糖凝胶上检查并用Gel ExtractionKit(QIAGEN)根据试剂盒提供的方案进行纯化，然后用QIAGEN PCR克隆试剂盒(QIAGEN)克隆进pDrive载体用于测序分析。
结果
从S1inv1(一个具有倒位的内源性IGH基因座版本1的人IGH BAC(即多个人VH、全部功能性人D和JH))小鼠的脾B淋巴细胞的Cμ特异性5’-RACE文库的序列分析显示，实际上所有转录物均来自重排的人VH-D-JH基因区段(图48)。小鼠VH使用极少检测到(0.4％)，并且未检测到小鼠D和JH使用。人VH使用是99.6％且仅人D和JH被使用；推测稀少的小鼠VH使用是由于与另一个染色体的反式转换所致，不是由于使用来自倒位序列的小鼠VH。倒位导致内源性VH使用的完全失活。
这一结果表明倒位是失活内源性VH基因区段的重排的有效方式。S1inv1小鼠也示出与人相似的D和JH基因区段的使用(图49)(Link,JM et al.Mol.Immunol.2005.42,943-955)。因此，产生了这样的小鼠，其包含表达包含人可变区但是无小鼠可变区的重链的转基因重链基因座，另外人可变区证实相应于在人类中观测到的人D和J使用的正常人序列分布。
实施例8
通过插入人IgH基因组DNA失活用于表达的重排重链的内源性IGHV基因区段的使用
介绍
将具有VH-D-JH基因区段的人BAC插入染色体12中内源性小鼠重链基因座中JH4和Eμ之间使得人VH-D-JH基因区段有效使用小鼠Eμ和3’增强子并且重排以产生具有人可变区和小鼠恒定区的嵌合抗体。同时，内源性VH-D-JH基因区段被迫使离开内源性增强子和恒定区。这种距离效应导致用于表达的重排抗体产物的小鼠D和JH使用失活。随着距离通过逐步BAC插入而增加，预期小鼠VH使用会显著降低。
结果
将来自第一个人BAC(包含小鼠染色体14从坐标106328951至坐标106494908的序列的BAC；含有6个最3’功能性VH基因区段(VH2-5、7-4-1、4-4、1-3、1-2、6-1)和全部人D和JH基因区段)的人DNA插入AB2.1ES细胞基因组的重链内源性基因座中的内源性IGHJ4和Eμ之间(在小鼠染色体12：坐标114666435和114666436之间)，有效失活用于表达的重排的免疫球蛋白重链的内源性D和JH基因区段的使用(图44)。具有小鼠VH基因区段的重排的转录物在所得S1小鼠中降低。使用小鼠VH的转录物比例是全部观测序列的大约75％(图45)。
在第一个BAC DNA插入后，来自第二个人BAC(Chr14:106494909-106601551)(包含小鼠染色体14从坐标106494909至坐标106601551的序列的BAC；含有再多5个功能性VH基因区段(VH3-13、3-11、3-9、1-8、3-7))的人DNA被插入第一个BAC插入消除后剩下的着陆垫中(见例如图24)。小鼠VH使用在将第二个BAC插入到基因座中后进一步显著降低。使用小鼠VH的转录物比例进一步降低至全部观测序列的35％(图50)。
这个结果表明内源性VH-D-JH基因区段可以通过来自一或多个BAC的人VDJ序列的插入而失活(即不用于表达的重排重链)。随着距离通过逐步BAC插入而增加，预期小鼠VH使用会显著降低。
实施例9
本发明转基因小鼠中正常类别转换和高变
介绍
免疫系统的B细胞臂(arm)进化为应答抗原攻击时产生高亲和性、抗原特异性抗体。抗体通过基因重排过程在B淋巴细胞中产生，在基因重排中可变区(V)、多样性区(D；对于IGH基因座)和连接区(J)基因区段被重组、转录及剪接至Cμ(对于IGH)或者Cκ或Cλ(对于IGL)恒定区基因区段以形成IgM抗体。根据B细胞发育阶段，IgM位于细胞表面或者被分泌。重组过程产生一抗库集(primary antibody repertoire)，其具有足够种系多样性以结合广泛抗原。但是，其通常不够大到足以提供对抗原如感染因子的有效免疫应答所需的高亲和性抗体。因此，免疫系统采取两阶段多样化过程以进一步增加多样性。当用抗原攻击时，B细胞通过所谓的体细胞突变过程经历选择和成熟.。表达结合抗原的抗体的B细胞在二级淋巴器官的生发中心(germinal centre)(GC)经历多轮多样化、克隆扩增及抗原选择。在此过程期间，免疫球蛋白基因的重排的可变区通过核苷酸取代、添加或缺失获得体细胞高变。这个逐步过程从最初选择自一级库集的弱结合物产生二级库集，并组合抗原反应性B细胞的快速增殖与对结合质量的强力选择，最终产生具有广泛表位覆盖的高亲和性抗体。在此过程期间，抗体经历类别转换，其中Cμ恒定区由Cγ、Cα或Cε置换，分别产生具有不同效应功能的IgG、IgA或IgE类抗体。
将含有6个最3’功能性VH基因区段(VH2-5、7-4-1、4-4、1-3、1-2、6-1)和全部D和JH基因区段的第一个人BAC(Chr14:106328951-106494908)插入基因座中内源性IGHJ4和Eμ之间(Chr12:114666435和114666436)，产生转基因小鼠，其产生含有人可变区和小鼠恒定区的嵌合免疫球蛋白重链。这个结果证实人免疫球蛋白基因区段能够在小鼠中重排和表达。在此，进行RT-PCR实验和序列分析以进一步证实免疫的转基因小鼠具有对于产生的抗体正确的类别转换和高变。
方法
RT-PCR和序列分析:6-8周龄的野生型或S1嵌合小鼠通过腹膜内注射悬浮在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的106个绵羊RBC而初免。免疫的小鼠在初免后2和4周用同样量的绵羊RBC加强2次。最后一次加强后4天，从免疫的小鼠收集外周血细胞。用试剂(InvitrogenTM)从外周血细胞中分离总RNA并用DNase I处理。用IIIFirst-Strand Synthesis System(InvitrogenTM)根据厂商方案进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。用特异性Cγ引物(Cγ1、Cγ2a、Cγ2b)合成第一链cDNA，随后用特异性人V引物(VH1-2,3、VH4-4、VH6-1)和Cγ引物(表2)进行PCR。反应后，RT-PCR产物在1％琼脂糖凝胶上检查并用凝胶提取试剂盒(QIAGEN)根据试剂盒提供的方案进行纯化，然后用QIAGEN PCR克隆试剂盒(QIAGEN)克隆进pDrive载体用于测序分析。
表2
| ELP1352_Cγ1 | 5’-AGAGCGGCCGCTGGGCAACGTTGCAGGTGACGGTC-3’ | SEQ ID No 27 |
| ELP1353_Cγ2b | 5’-AGAGCGGCCGCTTTGTCCACCGTGGTGCTGCTGG-3’ | SEQ ID No 28 |
| ELP1354_Cγ2a | 5’-AGAGCGGCCGCACATTGCAGGTGATGGACTGGC-3’ | SEQ ID No 29 |
| ELP1356_VH4-4 | 5’-AGGACGCGTGAAACACCTGTGGTTCTTCCTCCTGC-3’ | SEQ ID No 30 |
| ELP1357_VH1-2,3 | 5’-AGGACGCGTCACCATGGACTGGACCTGGAGGAT-3’ | SEQ ID No 31 |
| ELP1358_VH6-1 | 5’-AGGACGCGTATGTCTGTCTCCTTCCTCATCTTCC-3’ | SEQ ID No 32 |
结果
用人VH特异性和小鼠Cγ特异性引物扩增免疫的转基因小鼠的外周血细胞而使用RT-PCR检测重排的转录物(图51)。这些扩增片段的进一步序列分析证实在这些IGγ链的人可变区内发生高变(图52)。这些结果提示包含人IGH BAC的插入的本发明基因座在抗原攻击后具有正常类别转换和高变功能性(IgM至IgG)，所述人IGH BAC含有插入在所述基因座中内源性IGHJ4和Eμ区之间的VH、D和JH基因区段。
实施例10
在本发明转基因小鼠中的正常B细胞区室
介绍
在小鼠中，每天产生大约2X107骨髓未成熟B细胞。在它们中，仅10-20％的这些细胞存活离开骨髓并进入脾。未成熟脾B细胞群分成两个独立亚集：过渡1型B细胞(T1)和过渡2型B细胞(T2)。体内实验表明T1细胞产生T2细胞，而T2细胞可以进一步分化成成熟(M)B细胞。与未成熟B细胞(3-4天龄)相反，成熟B细胞是寿命长的(15-20周龄)并且准备好应答抗原(Pillai S et al；Immunol.Reviews.2004.197:206-218)。因此，成熟B细胞群的成分直接与体液免疫应答的效率相关联。
T1、T2和M细胞群可以通过它们的细胞表面IgM和IgD水平分类。脾B细胞区室的正常表型是产生强免疫应答所需的。
方法
成熟B淋巴细胞的流式细胞术分析:为从脾获得单细胞悬液，如下列出的小鼠的脾轻轻通过30μm细胞滤器。单细胞重悬于补加3％热失活胎牛血清(FCS；)的PBS中。下述抗体用于染色：
与别藻蓝蛋白(APC)缀合的抗B220/CD45R的抗体(eBioscience，克隆RA3-6B2)，与藻红蛋白(PE)缀合的抗IgD受体的抗体(eBioscience，克隆11-26)及与荧光素异硫氰酸酯(FITC)缀合的IgM受体的抗体(eBioscience，克隆11/41)。
5x106个细胞用于每种染色。向每个含有脾细胞的小瓶中加入由IgD(PE)(eBioscience，克隆11-26)、IgM(FITC)和B220/CD45R(APC)组成的抗体混合物。细胞在6℃保温15分钟，洗涤除去过量的未结合抗体，用来自Miltenyi Biotech的荧光激活细胞淘选(FACS)分析仪进行分析。B细胞门控为针对T1群的B220+IgM+IgD-，针对T2群的B220+IgM+IgD+及针对M群的B220+IgM-IgD+。细胞百分比用门控系统计算。
结果
产生了4种不同基因型的小鼠：
·野生型(WT)；
·对于包含上述第一个BAC人DNA的插入的重链转基因是纯合的转基因小鼠(S1/S1)，其中所述人DNA中有6个人VH、全部功能性人D和JH基因区段；
·对于包含人VH、全部功能性人D和JH基因区段的插入的重链转基因是纯合的转基因小鼠(H1/H1)；及
·对于包含6个功能性人Vκ和5个功能性Jκ基因区段的插入的κ链转基因是纯合的转基因小鼠(K1/K1)。
收集来自这些首次用于实验的小鼠的脾并分析它们的B细胞区室。这些小鼠中的T1、T2和M细胞数和百分比是相似的(图53)，表明在本发明的转基因小鼠中的内源性IG基因座的遗传操作不损害它们的B细胞发育。这些数据有助于确立本发明动物提供了抗体发现的有力平台。
如下述实施例16解释，在S1小鼠中进行进一步分析，所述小鼠中内源性重链表达已失活(S1F小鼠，其中通过本文所述倒位失活)。如所解释的，在本发明这种小鼠中可见正常脾和骨髓区室(即等价于仅表达小鼠抗体链的小鼠的区室)。
实施例11
在本发明转基因动物中的正常IgH同种型&血清水平
携带在大鼠转换区控制下的全部人JH、全部人DH和人Vh2-5的转基因小鼠(H1)或者携带在小鼠转换区控制下的全部人JH、全部人DH和人Vh2-5、Vh7-41、Vh4-4、Vh1-3、Vh1-2和Vh6-1的小鼠(S1)用100μg在弗氏完全佐剂(CFA；F 5881)中乳化的霍乱毒素B亚基(CTB；C9903)免疫。至少3只动物经皮下或腹膜内注射，然后用25μg在弗氏不完全佐剂(IFA；F 5506)中的抗原在初免后(i)14天和21天或者(ii)28天加强。在初免前在第“-1”天(放血前)及在取脾当天(通常最后一次加强后4天)取血。用Ig同种型的抗原不依赖性评估经ELISA分析血清。这个测定检测所有物种的总血清抗体。使用针对小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和IgM的特异性检测((抗小鼠IgG1 HRP AbDSerotec STAR132P，抗小鼠IgG2a HRP AbD Serotec STAR133P，抗小鼠IgG2b HRP AbDSerotec STAR134P，抗小鼠IgM HRPab97230)，从标准曲线读出浓度，所述标准曲线针对每种同种型用多克隆同种型对照(IgG1，κ小鼠骨髓瘤M9269，IgG2a，κ小鼠骨髓瘤M9144，IgG2b，κ来自小鼠骨髓瘤M8894，IgM，κ来自小鼠骨髓瘤M3795)产生。结果(图54和55，涉及H1纯合和S1纯合和杂合小鼠)显示甚至使用这些相对较短的免疫方案，小鼠也示出免疫后总体IgG水平相对于放血前的增加。当不携带任何人免疫球蛋白基因的对照小鼠(+/+)被包括进来并免疫时，这些小鼠显示总观测Ig水平的相当变化(图54)。个体同种型水平在动物之中更可变，可能显示类别转换的各种阶段。IgM水平从未超过800μg/ml，而IgG水平在一些动物中达到6mg/ml以上。未免疫对照的转换的同种型Ig水平没有这种增加。
这些结果证实包含在大鼠Sμ或小鼠转换序列控制下的多个人VDJ基因区段的小鼠能够应答抗原攻击经历生产性重组和类别转换，所述小鼠产生与未修饰小鼠广泛相当的抗体水平。转基因小鼠在免疫后能够产生IgG1、IgG2a、IgG2b和IgM同种型的每一种的抗体。确定放血前和最终放血动物中的CTB特异性Ig的效价，所有免疫动物均示出至少1/100 000的CTB特异性效价。
实施例12
从本发明动物产生具有50nM以下亲和性的抗卵白蛋白抗体
携带在大鼠Sμ转换区控制下的全部人JH、全部人DH和人Vh2-5的转基因小鼠用25μg在佐剂(Sigma AdjuvantS6322)中的卵白蛋白(OVA；A7641)腹膜内免疫，然后用相同量的在佐剂中的OVA在第14天和21天加强。4天后取脾细胞，并用1ml聚乙二醇(PEG平均MW1450；P7306)与骨髓瘤系融合。融合的杂交瘤细胞铺板在5个96孔平板上，用次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)选择后，用ELISA测试各孔OVA特异性抗体的表达。ELISA阳性克隆用表面等离子共振(SPR)重新测试，用ProteOnTM XPR36()确定结合动力学。简而言之，抗小鼠IgG(GEBiacoreTM BR-1008-38)通过伯胺偶联与GLM生物传感器芯片偶联，其用于从组织培养上清直接捕获待测抗体。卵白蛋白用作分析物并以1024nM、256nM、64nM、16nM、4nM通过捕获的抗体表面，用0nM(即仅缓冲液)作为结合数据的双重参照。抗小鼠IgG捕获表面的再生是用10mM甘氨酸pH1.7，其除去捕获的抗体并允许表面用于另一个相互作用。结合数据拟合进ProteOnTM XPR36分析软件的1:1模型。用1xHBS-EP(10mM Hepes、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05％聚山梨醇酯，pH7.6(Teknova H8022))作为电泳缓冲液进行电泳，在25℃进行。
对于8个阳性克隆，用特异于Ig信号序列的正向引物(Wardemann et al Science301,1374(2003))和下述用于小鼠IgG的恒定区的反向引物(表3)经RT-PCR(Access RT-PCRSystem,A1250,Promega)回收重链V区。
表3
| 引物名称 | 序列 | bp | |
| mIgG1_2rev | GGGGCCAGTGGATAGACAGAT | 21 | SEQ ID No 33 |
| mIgG2b rev | CAGTGGATAGACTGATGG | 18 | SEQ ID No 34 |
| mIgG2a_2rev | CAGTGGATAGACCGATGG | 21 | SEQ ID No 35 |
| mCH1 unirev | KCAGGGGCCAGTGGATAGAC | 20 | SEQ ID No 36 |
| mCH1 unirev_2 | TARCCYTTGACMAGGCATCC | 20 | SEQ ID No 37 |
RT-PCR产物用相同引物对直接测序或者克隆进TA质粒(TAKitfor Sequencing,K4595-40,InvitrogenTM)并递交用于质粒测序。结果(表4)显示CDRH3序列具有可变CDR，除了两个相同克隆(16C9和20B5)，它们具有接近相同的KD动力学值。用SPR在25℃确定，确定的平衡结合常数KD范围从0.38nM到40.60nM。
这些结果证实包含在大鼠Cμ转换序列控制下的多个人VDJ基因区段的小鼠能够经历生产性重组并产生高亲和性抗原特异性抗体，所述抗体的CDR3区域具有由人基因区段编码的序列(人JH独立地由V-Quest,IMGT鉴别)。
表4
实施例13
从本发明动物产生具有人Vh区的抗霍乱毒素B抗体
携带在小鼠Sμ转换区控制下的全部人JH、全部人DH和人Vh2-5、Vh7-41、Vh4-4、Vh1-3、Vh1-2和Vh6-1的转基因小鼠如实施例11所述免疫和融合。融合的杂交瘤细胞铺板在5个96孔平板上，用次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)或G418(Cat No 10131-027，Lot503317)选择后，用ELISA测试各孔CTB特异性抗体的表达。ELISA阳性克隆用表面等离子共振SPR重新测试，用ProteOnTM XPR36TM()确定结合动力学。
简而言之，抗小鼠IgG(GE BiacoreTM BR-1008-38)通过伯胺偶联与GLM生物传感器芯片偶联，其用于从组织培养上清直接捕获待测抗体。霍乱毒素B用作分析物并以256nM、64nM、16nM、4nM和1nM通过捕获的抗体表面，用0nM(即仅缓冲液)作为结合数据的双重参照。抗小鼠IgG捕获表面的再生是用10mM甘氨酸pH1.7，其除去捕获的抗体并允许表面用于另一个相互作用。结合数据拟合进ProteOnTM XPR36TM分析软件的1:1模型。用1xHBS-EP(10mMHepes,150mM NaCl,3mM EDTA,0.05％聚山梨醇酯,pH7.6(Teknova H8022))作为电泳缓冲液在37℃进行电泳。
从最初由ELISA鉴别的克隆，经SPR证实与CTB的结合。然而，由于霍乱毒素B的五聚体性质，大部分拟合进1:1模型不良，并且不能精确确定平衡结合常数KD。当拟合可接受时，确定的平衡结合常数KD范围从0.21nM至309nM，但是由于霍乱毒素B的五聚体性质，这些可能是多聚体相互作用的结果并因此是具有可能亲合力成分的表观亲和性。
由SPR鉴别的结合CTB的克隆如实施例12所述进行RT-PCR以回收Vh区。RT-PCR产物用相同引物对直接测序。仅14个克隆获得结果，可能是因为Wardemann et al描述的人引物不是设计用于扩增小鼠Vh区，因此可能不能扩增某些小鼠Vh类别。结果显示14个CTB特异性回收重链V区序列中有3个是人V、D和J区，如V-Quest,IMGT鉴别(表5)。
表5:鉴别为结合CTB的3个克隆的重链CDR和J区的序列对比，优先与来自IMGT数据库的人参照序列匹配；注意此处给出的KD值由于CTB-抗体相互作用的亲合力而是表观值
实施例14:
在包含插入到内源性κ基因座中的人λ基因区段的转基因小鼠中人λ可变区的高表达
将来自第一个IGL BAC的人λ基因区段插入小鼠AB2.1ES细胞(Baylor College ofMedicine)的IGK基因座中，以产生嵌合轻链等位基因，称为P1等位基因(图56)。插入的人序列相应于人染色体22从位置23217291至位置23327884的序列并且包含功能性λ基因区段Vλ3-1、Jλ1-Cλ1、Jλ2-Cλ2、Jλ3-Cλ3、Jλ6-Cλ6和Jλ7-Cλ7。插入是在小鼠染色体6上位置70674755和706747756之间，其在小鼠Cκ区和3’Eκ上游(即，距内源性轻链增强子100kb内)，如图56所示。小鼠Vκ和Jκ基因区段保留在嵌合基因座中，位于插入的人λDNA的立即上游。小鼠λ基因座完整保留。从所述ES细胞用标准程序产生对于嵌合P1基因座是纯合的小鼠。
产生第二种类型的小鼠(P2小鼠)，其中通过依次插入BAC1人DNA和然后BAC2DNA产生P2等位基因，更多人功能性Vλ基因区段被插入人Vλ3-1的上游(5’)。来自BAC2的插入的人序列相应于人染色体22从位置23064876至位置23217287的序列并且包含功能性λ基因区段Vλ2-18、Vλ3-16、V2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8和Vλ4-3。从所述ES细胞用标准程序产生对于嵌合P2基因座是纯合的小鼠。
对来自P1和P2纯合子的脾B细胞进行FACS分析以评估转基因小鼠中λ比κ表达及人λ比小鼠λ表达。
进行标准5’-RACE以分析来自P2纯合子中轻链基因座的RNA转录物。
轻链表达&FACS分析
为从脾获得单细胞悬液，脾轻轻通过30μm细胞滤器。单细胞重悬于补加3％热失活胎牛血清(FCS)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。
如下抗体用于染色：
大鼠抗小鼠λ(mCλ)藻红蛋白(PE)抗体(Southern Biotech)，大鼠抗小鼠κ(mCκ)(BD Pharmingen,克隆187.1)荧光素异硫氰酸酯(FITC)，抗人λ(hCλ)(eBioscience,克隆1-155-2)藻红蛋白(PE)，抗-B220/CD45R(eBioscience,克隆RA3-6B2)别藻蓝蛋白(APC)。NB：携带人Cλ的轻链预期具有衍生自插入的人Vλ和人Jλ的重排的可变区。携带小鼠Cλ的轻链预期具有衍生自内源性λ基因座的小鼠Vλ和Jλ的重排的可变区。
5x106个细胞加入到各试管中，离心除去过量液体，重悬于新鲜的100μl PBS+3％FCS中。向每个试管加入下述抗体：
为染色mλ和mκ，除1μl B220/CD45R抗体之外还加入1μl每种抗体。为检测表达人λ轻链的B细胞，用hλ抗体替代mλ抗体。细胞在黑暗中于6℃保温15分钟，随后用新鲜PBS+3％FCS洗涤几次以除去未结合抗体。细胞用来自Miltenyi Biotech的荧光激活细胞淘选(FACS)分析仪进行分析。
用侧向散射(SSC)和正向散射(FSC)门控活脾细胞。在SSC和FSC门控群中，用APC荧光染料检测B220/CD45R亚群(小鼠B细胞)。单阳性B220/CD45R群进一步亚分成与mκFITC荧光染料组合的携带mλ或hλPE荧光染料的细胞。每群的百分比用门控系统计算。
令人惊奇地，来自P1纯合子的脾B细胞的FACS分析显示无可检测到的小鼠Cκ表达(图57)，表明来自BAC1的人λ基因座DNA的插入中断了内源性IGK链的表达。
在这些小鼠中由FACS分析分组的脾B细胞中内源性Cλ的强表达和人Cλ的弱表达(小鼠Cλ:人Cλ＝65:32)提示插入的人IGL序列尽管中断IGK活性，但是不能完全与内源性IGL基因竞争。
FACS分析再次令人惊奇地显示在P2纯合子中无可检测的小鼠Cκ表达(图58A&B)。但是在FACS分析后分组为小鼠或人Cλ的来自P2纯合子的表达的B细胞中人Cλ大大占优(小鼠Cλ:人Cλ＝15:80，相应于15个小鼠λ可变区：80个人λ可变区的比率，即相对于分组的B细胞84％人λ可变区-其相应于80％总B细胞)。尽管不希望受任何理论限制，我们认为来自第二个BAC的插入的人λ基因座序列提供了一些优势，以与内源性λ基因区段重排或表达竞争。
我们分析了在P2纯合子中人Vλ和Jλ使用。参见图59，其示出在P2纯合子中人Vλ使用。观测的使用与人中所见类似(J Mol Biol.1997Apr 25；268(1):69-77；“The creationof diversity in the human immunoglobulin V(λ)repertoire”；Ignatovich O et al)。另外，人Jλ使用与人中所见类似(图60)。通过无偏向5’-RACE(cDNA末端快速扩增)PCR克隆的测序进行的人Cλ转录物的Vλ和Vκ使用分析显示，在278个克隆序列中，仅一个使用Vκ与Jλ(人Jλ)重排，所有其它的(277个克隆)使用人Vλ(图61&62；Vλ2-5在RNA转录物水平检测到，但是这是假基因，通常在蛋白质水平不被使用挑取)。尽管不希望受任何理论限制，我们认为保留的小鼠Vκ基因区段本质上不能有效与插入的人Jλ基因区段重排，因为它们具有相同类型的RSS(重组信号序列；见如下解释)并且是重排不相容的(图63)。这个结果还表明内源性IGK活性的失活及插入的人λ序列占主导的表达可以无需进一步修饰IGK基因座而实现，例如缺失或倒位内源性κ基因座基因区段不是必须的，这大大简化了表达携带人λ可变区(即人Vλ和Jλ基因区段的重组产生的可变区)的轻链的实用转基因小鼠的产生。
介导V(D)J体内重组的重组信号序列(RSS)的排列在例如Cell.2002Apr；109Suppl:S45-55；“The mechanism and regulation of chromosomal V(D)Jrecombination”；Bassing CH,Swat W,Alt FW(文章内容引入本文参考)中讨论。已鉴别两种类型RSS元件：单转角RSS(one-turn RSS)(12-RSS)和双转角(two-turn RSS)(23-RSS)。在λ轻链基因座中的天然VJ重组中，重组在位于Vλ3’的双转角RSS和位于Jλ5’的单转角RSS之间，RSS呈相反方向。在κ轻链基因座中的天然VJ重组中，重组如果在位于Vκ3’的单转角RSS和位于Jκ5’的双转角RSS之间，RSS呈相反方向。因此，通常双转角RSS与相反方向的单转角RSS相容。
因此，发明人已证实(i)如何通过将人λ基因区段插入κ基因座而失活内源性κ链表达；及(ii)如何实现非常高人λ可变区表达(因此提供实用轻链库集用于针对靶抗原进行选择)-甚至在内源性λ和κV基因区段存在下。因此，发明人已示出如何通过插入包含在BAC1和2中的至少功能性人λ基因区段而显著除去(λ)或完全除去(κ)V基因区段竞争及因此的内源性轻链表达。在本实施例中，令人惊奇地实现了非常高水平的人λ可变区表达(84％总λ链和总轻链，如上所解释)。
实施例15:
在包含插入到内源性λ基因座中的人λ基因区段的转基因小鼠中人λ可变区的高表达
将来自第一个和第二个IGL BAC的人λ基因区段插入小鼠AB2.1ES细胞(BaylorCollege of Medicine)的λ基因座中，产生λ轻链等位基因，称为L2等位基因(图56)。插入的人序列相应于人染色体22从位置23064876至位置23327884的序列并且包含功能性λ基因区段Vλ2-18、Vλ3-16、V2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3、Vλ3-1、Jλ1-Cλ1、Jλ2-Cλ2、Jλ3-Cλ3、Jλ6-Cλ6和Jλ7-Cλ7。插入是在小鼠染色体16上位置19047551和19047556之间，其在小鼠Cλ区上游和在Eλ4-10和Eλ3-1之间(即，距内源性轻链增强子100kb内)，如图56所示。小鼠Vλ和Jλ基因区段保留在基因座中，位于插入的人λDNA的立即上游。小鼠κ基因座被失活以防止κ链表达。从所述ES细胞用标准程序产生对于L2基因座是纯合的小鼠。
使用类似于实施例14的方法，对来自L2纯合子的脾B细胞进行FACS分析以评估转基因小鼠中λ比κ表达及人λ比小鼠λ表达。
轻链表达&FACS分析
在IGK敲除背景(其中Vκ和Jκ基因区段已保留)下的L2纯合子中脾B细胞的FACS分析令人惊奇地显示在FACS分析后分组为小鼠或人Cλ的B细胞中人Cλ表达大大占优(小鼠Cλ:人Cλ＝5:93，相应于5个小鼠λ可变区：93个人λ可变区的比率，即相对于分组的B细胞95％人λ可变区-其相应于93％总B细胞)(图64A)，证实在内源性IGλ基因座中插入的人IGλ基因区段可以竞争胜出内源性IGλ基因区段重排或表达。
因此，发明人已证实如何实现非常高人λ可变区表达(因此提供实用轻链库集用于针对靶抗原进行选择)-甚至在内源性λ和κV基因区段存在下。因此，发明人已示出如何通过插入包含在BAC1和2中的至少功能性人λ基因区段而显著除去内源性λV基因区段竞争及因此的内源性λ轻链表达。在本实施例中，令人惊奇地实现了非常高水平的人λ可变区表达(95％总λ链和总轻链，如上所解释)。
这些数据表明，携带通过BAC1和BAC2提供的功能性基因区段的靶向插入产生的P(实施例14)或L(实施例15)等位基因的小鼠可以在成熟B细胞中的重排和表达中起作用。这两种类型的等位基因对于提供产生人Igλ链用于治疗抗体开发和作为研究工具的转基因小鼠非常有用。
表达人λ可变区的本发明转基因小鼠发育正常脾区室
在脾中，B细胞基于细胞表面标记IgM和IgD的水平鉴定为未成熟(T1和T2)和成熟(M)。T1细胞具有高IgM和低IgD。T2细胞具有中等水平的两者。M细胞具有低IgM但是高IgD(图65)。也参见J Exp Med.1999Jul 5；190(1):75-89；“B cell development in thespleen takes place in discrete steps and is determined by the quality of Bcell receptor-derived signals”；Loder F et al.
使用类似于以下实施例16描述的方法，来自动物的脾B细胞用FACS针对IgD和IgM表达评分。我们将对照小鼠KA/KA(其中内源性κ链表达已被失活，但是内源性λ链表达未失活)与L2/L2；KA/KA小鼠(L2纯合子)进行了比较。L2纯合子令人惊奇地示出与对照小鼠相当的脾B细胞区室(图64B)。
实施例16:
评估本发明转基因小鼠中的B细胞和Ig发育
我们观测到本发明转基因小鼠中的正常Ig亚型表达和B细胞发育，所述转基因小鼠表达具有人重链可变区基本上不存在内源性重链和κ表达的抗体。
使用上述ES细胞和RMCE基因组操作方法，构建了具有下述Ig基因座等位基因组合的小鼠：
S1F/HA,+/KA＝(i)S1F-第一个内源性重链等位基因具有一个人重链基因座DNA插入，内源性小鼠VDJ区已通过倒位及在染色体是向上游移动而失活(见上述，其中这个等位基因被称为S1inv1)；(ii)HA–第二个内源性重链等位基因已被失活(通过插入内源性中断序列而失活)；(iii)+-第一个内源性κ等位基因是野生型κ等位基因，及(iv)KA–第二个内源性κ等位基因已被失活(通过插入内源性中断序列而失活)。这种排列仅编码来自第一个内源性重链等位基因的重链。
S1F/HA,K2/KA＝(i)K2-第一个内源性κ等位基因具有在最3’内源性Jκ和小鼠Cκ之间的两个κ链基因座DNA插入，提供14个人Vκ和Jκ1-Jκ5的插入；及(ii)KA–第二个内源性κ等位基因已被失活(通过插入内源性中断序列而失活)。这种排列仅编码包含人可变区的重链及基本上来自第一个内源性κ等位基因的κ轻链。
+/HA,K2/KA-这种排列编码小鼠重链和人κ链。
+/HA,+/KA-这种排列编码小鼠重链和κ链-小鼠仅产生小鼠重链和轻链。
在骨髓中，B祖细胞群基于它们的表面标记B220和CD43而鉴定。前原B细胞携带种系IGH和IGK/L构型并且在它们的细胞表面具有低B220和高CD43。原B细胞开始启动在IGH基因座中的VDJ重组并且携带中等水平的B220和CD43。前B细胞携带重排的IGH VDJ基因座并且开始启动轻链VJ重排，并且具有高B220但是低CD43。在脾中，B细胞基于细胞表面标记IgM和IgD的水平被鉴定为未成熟(T1和T2)和成熟(M)。T1细胞具有高IgM和低IgD。T2细胞具有中等水平的两者。M细胞具有低IgM但是高IgD(图65)。还参见J Exp Med.1991 May 1；173(5):1213-25；“Resolution and characterization of pro-B and pre-pro-B cellstages in normal mouse bone marrow”；Hardy RR et al and J Exp Med.1999 Jul 5；190(1):75-89；“B cell development in the spleen takes place in discrete stepsand is determined by the quality of B cell receptor-derived signals”；Loder Fet al.
本发明转基因小鼠发育正常脾和BM区室
(a)脾区室分析
对于每个小鼠，为从脾获得单细胞悬液，脾轻轻通过30μm细胞滤器。单细胞重悬于补加3％热失活胎牛血清(FCS)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。将5x106个细胞加入到各试管中，离心除去过量液体，重悬于新鲜的100μl PBS+3％FCS中。向每个试管加入下述抗体：与别藻蓝蛋白(APC)缀合的抗B220/CD45R(eBioscience,克隆RA3-6B2)，与藻红蛋白(PE)缀合的抗IgD受体的抗体(eBioscience,克隆11-26)及与荧光素异硫氰酸酯(FITC)缀合的抗IgM受体的抗体(eBioscience,克隆11/41)。
为染色IgM vs IgD，每次染色使用5x106个细胞。向含有脾细胞的每个小瓶中加入由抗-IgD(PE)、抗-IgM(FITC)和抗-B220/CD45R(APC)组成的抗体混合物。细胞在6℃保温15分钟，洗涤除去过量的未结合抗体，用来自Miltenyi Biotech的荧光激活细胞淘选(FACS)分析仪进行分析。B细胞门控为针对T1群的B220HIGH IgMHIGH IgDLOW(即B220+IgM+IgD-)，针对T2群的B220HIGH IgMHIGH IgDHIGH(B220+IgM+IgD+)及针对M群的B220HIGH IgMLOWIgDHIGH(B220+IgM-IgD+)。细胞百分比用门控系统计算。我们使用门控鉴别和定义细胞群的亚集，以对数规格绘图。在施加门控之前，使用每种荧光染料的单染色抗体区分阳性(高强度荧光染料)和阴性(无可检测强度荧光染料)群。对所有样品以相同方式基于荧光染料强度施加门控。单染色是：
IgD-PE
IgM-FITC
B220-APC
用侧向散射(SSC)和正向散射(FSC)门控活脾细胞。在SSC和FSC门控的群中，用APC荧光染料检测B220/CD45R阳性细胞的亚群(小鼠B细胞)。单阳性B220/CD45R群进一步亚分成与mκFITC荧光染料组合的携带IgM荧光素异硫氰酸酯(FITC)或IgD荧光染料的细胞。每群的百分比用门控系统计算。本发明小鼠中的脾B细胞区室是正常的(即等价于仅表达小鼠抗体链的小鼠的区室)。
(b)骨髓B祖细胞分析
为从每个小鼠骨髓获得单细胞悬液，用补加3％热失活胎牛血清(FCS)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗股骨和胫骨。细胞进一步通过30μm细胞滤器以除去骨碎片或细胞块。细胞重悬于补加3％血清的冷PBS中。将2x106个细胞加入到各试管中，离心除去过量缓冲液，重悬于新鲜的100μl PBS+3％FCS中。向每个试管加入下述抗体：抗-Leukosialin(CD43)荧光素异硫氰酸酯(FITC)(eBioscience,克隆eBioR2/60)和抗-B220/CD45R(eBioscience,克隆RA3-6B2)别藻蓝蛋白(APC)。细胞在黑暗中在6℃保温15分钟，之后用新鲜PBS+3％FCS洗涤几次除去未结合抗体。细胞用来自Miltenyi Biotech的荧光激活细胞淘选(FACS)分析仪进行分析。用侧向散射(SSC)和正向散射(FSC)门控活骨髓细胞。我们使用门控鉴别和定义细胞群的亚集，以对数规格绘图。在施加门控之前，使用每种荧光染料的单染色抗体区分阳性(高强度荧光染料)和阴性(无可检测强度荧光染料)群。对所有样品以相同方式基于荧光染料强度施加门控。单染色是：
B220-APC
CD43-FITC
在活细胞群内，B220/CD45R和CD43双重阳性细胞群被鉴别为前B细胞、原B细胞和前原B细胞。本发明小鼠中的脾B细胞区室是正常的(即等价于仅表达小鼠抗体链的小鼠的区室)。
本发明转基因小鼠发生正常Ig表达
血清IgM和IgG的定量
96孔NUNC平板最初用捕获抗体(山羊抗小鼠Fab抗体，1μg/ml)在4℃包被过夜。IgG平板用抗Fab(M4155 Sigma)，IgM平板用抗Fab(OBT1527AbD Serotec)。用含有0.1％v/vTween20的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤3次后，平板用200μl含有1％w/v牛血清白蛋白(BSA)的PBS在室温(RT)封闭1小时。平板如上所述洗涤3次，然后向每孔中加入50μl标准(对照小鼠同种型抗体IgG1(M9269Sigma)、IgG2a(M9144Sigma)、IgG2b(M8894sigma)、IgM(M3795Sigma)或在具有0.1％BSA的PBS中稀释的血清样品，在RT保温1小时。在如上所述洗涤3次后，向每孔中加入100μl检测抗体(山羊抗小鼠同种型特异性抗体-辣根过氧化物酶缀合的，1/10000于具有0.1％Tween的PBS中)(抗小鼠IgG1(STAR132P AbD Serotec)、抗小鼠IgG2a(STAR133P AdD Serotec)、抗小鼠IgG2b(STAR134P AbD Serotec)和抗小鼠IgM(ab97230Abcam)，在RT保温1小时。平板如上所述洗涤3次，用四甲基联苯胺底物(TMB,Sigma)在RT、在黑暗中显色4-5分钟。加入50μl/孔1M硫酸终止显色。平板用Biotek SynergyHT平板分析仪在450nm读数。
结论：
在人IGH BAC插入之后内源性VH-D-JH的倒位导致内源性VH与插入的人D-JH的重排的失活。然而，发明人令人惊奇地观测到，内源性重链表达的失活不改变在脾区室(图66)或骨髓B祖细胞区室(图67)中的B细胞比率并且血清中的免疫球蛋白水平是正常的，正确的Ig亚型被表达(图68)。这在表达人重链可变区与小鼠轻链的小鼠中(图66A和67A)以及在表达人重链可变区和人轻链可变区的小鼠中(图66B和67B)示出。这些数据证实，插入的人IGH基因区段(至少人VH基因区段VH2-5、7-4-1、4-4、1-3、1-2、6-1和全部人D和JH基因区段D1-1、2-2、3-3、4-4、5-5、6-6、1-7、2-8、3-9、5-12、6-13、2-15、3-16、4-17、6-19、1-20、2-21、3-22、6-25、1-26和7-27；及J1、J2、J3、J4、J5和J6的插入)在重排、BCR信号传导和B细胞成熟方面是完全功能性的。当人轻链VJ基因区段被插入以提供转基因轻链时，如用于产生K2等位基因的插入，功能性也被保留。这个插入是包含人基因区段Vκ2-24、Vκ3-20、Vκ1-17、Vκ1-16、Vκ3-15、Vκ1-13、Vκ1-12、Vκ3-11、Vκ1-9、Vκ1-8、Vκ1-6、Vκ1-5、Vκ5-2、Vκ4-1、Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4和Jκ5的插入。超过90％的由S1F/HA；K2/KA小鼠表达的抗体包含人重链可变区和人κ轻链可变区。这些小鼠因此在用人抗原免疫小鼠后选择具有特异性结合人抗原的人可变区的抗体中非常有用。在分离这种抗体后，本领域技术人员可以用常规技术用人恒定区置换小鼠恒定区以获得完全人抗体，它们可用作候选药物给予人类(任选地在突变或适应而产生进一步的衍生物之后，例如具有Fc增强或失活或者在缀合于毒性有效负载或报道分子或标记或其它活性部分之后)。
进行了进一步实验以评估表达具有人重链和轻链(κ)可变区的抗体的本发明转基因小鼠(S1F/HA,K2/KA小鼠；n＝15)中的IgG和IgM水平和相对比例。这些小鼠与12个仅表达小鼠抗体链的小鼠(+/HA,+/KA(n＝6)和野生型小鼠(WT；n＝6))进行比较。结果见下表(表6)和图69。
可以看出本质上所有重链可变区均是人重链可变区的本发明小鼠表达正常比例的IgM和IgG亚型，并且相对于IgM的总IgG也是正常的。
表6:
实施例17:
本发明转基因小鼠中κ:λ比率&脾B细胞区室的评估
获得包含下述基因组的小鼠。
WT/WT＝野生型；
KA/KA＝每个内源性κ等位基因已被失活；并且内源性λ基因座完整保留；
K3F/K3F＝每个内源性κ等位基因具有3个在最3’内源性Jκ和小鼠Cκ之间的κ链基因座DNA插入，提供人V基因区段VK2-40、VK1-39、Vκ1-33、Vκ2-30、Vκ2-29、Vκ2-28、Vκ1-27、Vκ2-24、Vκ3-20、Vκ1-17、Vκ1-16、Vκ3-15、Vκ1-13、Vκ1-12、Vκ3-11、Vκ1-9、Vκ1-8、Vκ1-6、Vκ1-5、Vκ5-2和Vκ4-1及人J基因区段Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4和Jκ5(人V基因区段是在人J基因区段的5’)的插入；每个内源性κVJ已通过倒位和在染色体上向上游移动而失活；及内源性λ基因座完整保留；
L2/L2＝如实施例15所述(L2纯合子，其中人λ可变区DNA已被插入内源性λ基因座；内源性κ基因座完整保留)；
L2/L2；KA/KA＝与L2/L2相同，但是内源性κ等位基因已被失活(通过插入内源性中断序列＝KA)；
L3/L3；KA/KA＝与L2/L2；KA/KA相同，但是补充有在内源性λ基因座的第二个λDNA插入的5’的第三个人λ可变区DNA插入，由此，下述人λ基因区段插入在最3’内源性Jλ和小鼠Cλ之间：人V基因区段Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3和Vλ3-1、人J和C基因区段Jλ1-Cλ1、Jλ2-Cλ2、Jλ3-Cλ3、Jλ6-Cλ6和Jλ7-Cλ7(还包括非功能性区段Jλ4-Cλ4、Jλ5-Cλ5)，由此提供在小鼠染色体16上的位置19047551之后立即插入的相应于人染色体22的坐标22886217至23327884的插入；
S3F/HA；KA/KA；L3/L3＝第一个内源性重链等位基因具有3个在最3’内源性JH和Eμ之间的人重链可变区DNA插入，提供人基因区段VH2-26、VH1-24、VH3-23、VH3-21、VH3-20、VH1-18、VH3-15、VH3-13、VH3-11、VH3-9、VH1-8、VH3-7、VH2-5、VH7-4-1、VH4-4、VH1-3、VH1-2、VH6-1、D1-1、D2-2、D3-9、D3-10、D4-11、D5-12、D6-13、D1-14、D2-15、D3-16、D4-17、D5-18、D6-19、D1-20、D2-21、D3-22、D4-23、D5-24、D6-25、D1-26、D7-27、JH1、JH2、JH3、JH4、JH5和JH6的插入(顺序为：人V基因区段、人D基因区段和人J基因区段)；内源性重链VDJ序列已通过倒位和在染色体上向上游移动而失活；内源性λ基因座完整保留；第二个内源性重链等位基因已通过插入内源性中断序列而失活＝HA；内源性κ等位基因已被失活(＝KA/KA)；内源性λ等位基因已通过插入人λ可变区DNA而修饰(＝L3/L3)；
P2/WT＝在一个内源性κ基因座的P2等位基因(人λ可变区DNA，如实施例14所述)；另一个内源性κ基因座完整保留；两个内源性λ基因座完整保留；
P2/P2＝见实施例14，两个内源性λ基因座完整保留；
P2/K2＝在一个内源性κ基因座的P2等位基因；另一个内源性κ基因座具有两个在最3’内源性Jκ和小鼠Cκ之间的DNA插入，提供人V基因区段Vκ2-24、Vκ3-20、Vκ1-17、Vκ1-16、Vκ3-15、Vκ1-13、Vκ1-12、Vκ3-11、Vκ1-9、Vκ1-8、Vκ1-6、Vκ1-5、Vκ5-2和Vκ4-1及人J基因区段Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4和Jκ5的插入(人V基因区段在人J基因区段的5’)；两个内源性λ基因座完整保留；
P3/K3F＝一个内源性κ基因座具有插入，下述人λ基因区段插入在最3’内源性Jκ和小鼠Cκ之间，提供人V基因区段Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3和Vλ3-1及人J和C基因区段Jλ1-Cλ1、Jλ2-Cλ2、Jλ3-Cλ3、Jλ6-Cλ6和Jλ7-Cλ7(还包括非功能性区段Jλ4-Cλ4、Jλ5-Cλ5)的插入，由此提供在小鼠染色体6上的位置70674755之后立即插入的相应于人染色体22的坐标22886217至23327884的插入；另一个内源性κ基因座具有上述K3F等位基因(插入人V和Jκ基因区段)；两个内源性λ基因座完整保留；
P2/P2；L2/WT＝与P2/P2相同，但是其中一个内源性λ基因座具有L2等位基因(插入人λV和J基因区段)，另一个内源性λ基因座是野生型；及
P2/P2；L2/L2＝对于分别在内源性κ和λ基因座的P2和L2等位基因是纯合的。
进行脾B细胞的FACS分析(如上所述)并且确定轻链表达比例。我们还确定了T1、T2和成熟(M)脾B细胞的比例并与野生型小鼠对比，以评估是否获得了在转基因小鼠中正常的脾B细胞区室。结果示于表7和表8。还评估了B220阳性细胞比例，作为脾细胞样品中B细胞比例的指示。
表7:与在内源性λ基因座具有人λ可变区插入序列的小鼠的比较
表8:在内源性κ基因座具有人λ可变区插入序列的小鼠
结论
如由L2/L2；KA/KA和L3/L3；KA/KA所证实，在内源性λ基因座(具有内源性κ敲除)的人λ可变区DNA插入展示携带人λ可变区的轻链表达占优(由Cλ阳性链表达在大约93％而指示)。即使内源性小鼠λ可变区DNA仍存在，这也令人惊奇地发生，提示插入的人λ可变区DNA可以竞争胜出内源性IGλ重排。
另外，具有在纯合L3插入中存在的人V和J基因区段的小鼠产生比例与野生型类似的B细胞(B220阳性细胞)，另外产生正常比例或百分比的成熟脾B细胞(即类似于野生型)。这不仅通过L3/L3；KA/KA小鼠证实，在也包含嵌合(人-小鼠)IgH基因座的S3F/HA；KA/KA；L3/L3中观测到。
另外，我们观测到具有在纯合K3F插入中存在人V和J基因区段的小鼠产生比例与野生型类似的B细胞(B220阳性细胞)，另外产生正常比例或百分比的成熟脾B细胞(即类似于野生型)。
具有在内源性κ基因座的纯合P2插入中存在人V和J基因区段的小鼠显示包含人λ可变区的轻链的高表达(由观测到的76％的比例所示)。通过在内源性κ和λ基因座组合插入人λV和J基因区段，我们可以实现甚至更高的总体百分比(参见P2/P2；L2/WT约为94％，P2/P2；L2/L2约为95％)。另外，包含P2/P2；L2/L2的人V和J基因区段排列的小鼠产生正常比例或百分比的成熟脾B细胞(即类似于野生型)。
当人λV和J基因区段插入在一个内源性κ基因座并且另一个内源性κ基因座包含人κV和J基因区段的插入时，我们获得了可以表达包含λ可变区的轻链及包含κ可变区的轻链的小鼠。令人惊奇地观测到我们可以使包含λ可变区的轻链比例提高到高于在野生型小鼠中见到的比例，在野生型小鼠中典型地仅5％或更少的轻链包含λ可变区。我们观测到在P2/K2基因型中是大约22％的比例，在P3/K3F基因型中是大约31％的比例。用后一基因型观测到的比例与在人中见到的近似，在人中典型地大约60％轻链包含κ可变区，大约40％轻链包含λ可变区。另外，在P2/K2和P3/K3F情况中，小鼠产生与野生型小鼠相比正常比例的B细胞。另外，包含P3/K3F的人V和J基因区段排列的小鼠产生正常比例或百分比的成熟脾B细胞(即类似于野生型)。
其它实施方案
从前述描述，很显然可以对本文描述的本发明进行变化和修改以使其适合各种使用和条件。这种实施方案也在下述权利要求范围内。
在任何变量定义中引述元件列表包括该变量作为任何单个元件或所列元件组合(或亚组合)的定义。本文实施方案的引述包括作为任何单个实施方案或者与任何其它实施方案或其部分的组合的实施方案。
说明书中提到的所有出版物和专利申请是指示本发明相关领域技术人员的水平。所有出版物和专利申请并入本文做参考，就像每个出版物或专利申请具体和逐个指示并入参考。
Claims (8)
1.具有正常比例的成熟脾B细胞的小鼠用于在B细胞中生产免疫球蛋白(Ig)轻链的应用，其中至少50％由小鼠产生的总脾B细胞是成熟B细胞，其中所述小鼠表达携带人λ可变区的Ig轻链和携带人κ可变区的免疫球蛋白轻链，其中超过30％的由所述小鼠表达的轻链包含λ可变区，
其中所述小鼠的基因组包含通过将人Ig基因区段靶向插入一或多个内源性Ig基因座而产生的Ig基因区段库集，
所述基因组包含通过插入所述小鼠的一个内源性κ轻链基因座中恒定区上游最3’内源性Jκ和小鼠Cκ之间而提供的人Vλ和Jλ基因区段，所述人Vλ和Jλ插入至少包含人V基因区段Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3和Vλ3-1以及包含人J和C基因区段Jλ1-Cλ1、Jλ2-Cλ2、Jλ3-Cλ3、Jλ6-Cλ6和Jλ7-Cλ7，和
所述基因组包含通过插入所述小鼠的另一个内源性κ轻链基因座中κ恒定区的上游最3’内源性Jκ和小鼠Cκ之间而提供的人Vκ和Jκ基因区段，其中所述人Vκ和Jκ插入至少包含人V基因区段Vκ2-40、Vκ1-39、Vκ1-33、Vκ2-30、Vκ2-29、Vκ2-28、Vκ1-27、Vκ2-24、Vκ3-20、Vκ1-17、Vκ1-16、Vκ3-15、Vκ1-13、Vκ1-12、Vκ3-11、Vκ1-9、Vκ1-8、Vκ1-6、Vκ1-5、Vκ5-2和Vκ4-1以及包含人J基因区段Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4和Jκ5，
其中内源性κ链表达是无活性的。
2.权利要求1的应用，用于生产Ig轻链，其中超过35％的由所述小鼠表达的轻链包含λ可变区。
3.权利要求1的应用，用于生产Ig轻链，其中超过40％的由所述小鼠表达的轻链包含λ可变区。
4.权利要求1的应用，用于生产Ig轻链，其中超过45％的由所述小鼠表达的轻链包含λ可变区。
5.权利要求1的应用，用于生产Ig轻链，其中超过50％的由所述小鼠表达的轻链包含λ可变区。
6.权利要求1或2的应用，其中所述人Vλ和Jλ插入包含人Eλ增强子的插入。
7.权利要求1或2的应用，其中所述人Vλ和Jλ基因区段插入在内源性小鼠轻链增强子的100kb内。
8.权利要求7的应用，其中所述增强子是小鼠iEκ或3’Eκ。
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