CN104316633A - 一种蜂蜜中挥发性成分的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于测试领域，提出了一种蜂蜜中挥发性成分的检测方法，包括以下步骤：(1)称取蜂蜜样品置于的顶空瓶内，将固相微萃取装置的萃取头插入顶空瓶中；(2)自动热脱附系统的控制条件为：起始温度为35℃，保持1min，延迟3min；(3)气相色谱条件：毛细管色谱柱初始温度40℃，保持2min，进样口温度250℃；(4)质谱检测，进行挥发性成分的定性与定量检测。本发明采用顶空固相微萃取技术和气相色谱-质谱联用技术对其挥发性成分进行分析。本发明提出的方法，使蜂蜜挥发性成分的萃取效率和分析结果的准确性大为提高，可为揭示不同蜂蜜样品挥发性成分的整体信息，为蜂蜜的真实性评价提供一定理论基础。

Description

一种蜂蜜中挥发性成分的检测方法

技术领域

本发明属于测试领域，具体涉及一种利用色谱法将蜂蜜分离成各个组分后进行定性和定量分析的方法。

背景技术

蜂蜜是由蜜蜂(Apis mellifera)采集蜜源植物的花蜜或蜜露后，将其贮存于蜂巢内的巢脾中，并经充分酿造而成的。成熟蜂蜜是一种具有浓郁花香味的天然甜物质，自古至今，因其具有较高的营养价值而被人们广泛食用。一般情况下，蜂蜜的风味决定于其中的挥发性成分，其主要源自蜜蜂所采集的花蜜或蜜露，故不同蜜源蜂蜜的挥发性成分组成差异很大。另外，蜂蜜中的挥发性成分还可能受到了蜜蜂自身、热加工或储存方式的影响。

目前为止，已有超过400种物质从不同蜂蜜的挥发性组分中鉴别出来，另因蜂蜜品种繁多，新发现的挥发性成分依然在持续增加。某些特定蜜源蜂蜜中的典型挥发性成分，即特征标记物质已被广泛鉴别出。并且，这种研究模式也应用到了鉴别特定地区蜂蜜的标记物质，如1-戊烯-3-醇可作为英国地区蜂蜜的特征挥发性成分。但是，利用单一挥发性组分区别不同来源的蜂蜜显然比较困难，大多数蜂蜜的风味形成依赖于其中的一组挥发性物质。例如，糠硫醇、苯甲醇、-辛醇内酯、-癸内酯、丁香油酚、苯甲酸、异戊酸、苯乙醇和4-甲氧基苯酚均对巴西的腰果(Anacardiumoccidentale)蜂蜜风味具有重要影响。值得注意的是，苯乙醇是香料工业中的一种重要增香物质，其可用以产生花香、辛香和药香等。有报道称，苯乙醇是椴树(Tiliatuan)蜂蜜的重要风味物质，然而，Radovic等仅在4个椴树蜂蜜样品中的2个检测到了苯乙醇，其最终研究结论认为该椴树蜂蜜样品的特征挥发性组分应为2-甲基呋喃、-松油烯、-环氧蒎烷、甲基异丙基苯、芳香烃和4-甲基苯乙酮等物质。

虽然蜂蜜的挥发性成分主要决定于其蜜源种类，但是挥发性成分的萃取和鉴定技术对研究结果也会产生较大影响。目前，挥发性成分的萃取技术主要有同时蒸馏萃取法、动态顶空萃取法、静态顶空萃取法、超声波辅助萃取法、水蒸馏法、溶剂萃取法和固相微萃取法等，其中的部分技术可适用于蜂蜜中挥发性成分的萃取。以上方法各有利弊，如水蒸馏法比较耗时，尤其是当研究样品量较大时更为明显；溶剂萃取法中去除溶剂的过程易造成挥发性成分的损失；同时蒸馏萃取法中的加热程序会导致人工副产物的形成，如加热会造成蜂蜜中糖分的降解。利用以上技术萃取蜂蜜中的挥发性成分，除上述弊端外，还应考虑其挥发性成分的浓度非常低，萃取前应尽可能去除蜂蜜中的主要成分——糖的影响。因此，顶空萃取法显然比较合适，经前人对其进行大量的技术改进，降低了不利状况的影响，使其萃取物更加接近于蜂蜜挥发性组分的真实情况。

发明内容

针对本领域现有技术存在的不足之处，本发明的目的是提出一种纤维素接枝环糊精高分子吸水树脂的合成方法。

实现本发明目的的技术方案为：

一种蜂蜜中挥发性成分的检测方法，包括以下步骤：

(1)称取蜂蜜样品置于顶空瓶内，加入内标物2-甲基-3-庚酮，并加入饱和NaCl溶液；45-55℃下将顶空瓶于磁力搅拌器上混匀；将固相微萃取装置的萃取头插入顶空瓶中，推出萃取头的石英纤维后50℃吸附30-45min。

(2)将固相微萃取装置的萃取头插入气相色谱仪的进样孔，推出萃取头的石英纤维；自动热脱附系统条件：起始温度为35℃，保持1min，延迟3min；以60℃/min的速度升温至220℃，保持1min，热脱附系统与进样口之间传输线温度为300℃。

(3)气相色谱条件：毛细管色谱柱初始温度40℃，保持2min，以4℃/min升温到160℃，保持2min，再以10℃/min升至250℃，保持5min。进样口温度250℃；对5-27min之间出现的色谱峰进行质谱鉴定。

使用本发明的方法，各组分色谱峰分离完全，较少出现粘连现象。色谱分析过程中，蜂蜜样品挥发性成分的色谱峰最早出现于5min，最迟出现于27min，整个分析过程持续22min左右。

(4)质谱条件电子轰击(EI)离子源，离子源温度为200℃，电子能量为70eV，传输线温度为280℃，四级杆温度为150℃，溶剂延迟5min，质量扫描范围为m/z 30-500，进行挥发性成分的定性与定量检测。

优选地，步骤(1)中，所述顶空固相微萃取条件蜂蜜挥发性成分萃取前，先将固相微萃取装置的萃取头插入气相色谱注射孔中，270℃下老化处理50-80min。

步骤(1)中，称取蜂蜜样品7-9g置于100mL的顶空瓶内。

固相微萃取(SPME)装置由手柄(Holder)和萃取头两部分构成。萃取头是一根外套不锈钢细管的1cm长、涂有不同色谱固定相或吸附剂的熔融石英纤维，石英纤维在不锈钢管内可自由伸缩，用于萃取、吸附样品；手柄用于安装或固定萃取头。

其中，步骤(1)中，内标物2-甲基-3-庚酮用正丁烷溶解，浓度为1.5-1.8μg/mL，加入1μL的该内标物溶液，并加入10mL的饱和NaCl溶液。

其中，步骤(2)中，气相色谱仪内附的冷进样系统条件为：初始温度-100℃，平衡0.5min，以10℃/min的速度升温至280℃，保持0.5min。

其中，步骤(3)中，载气为氦气，流速1.5mL/min，不分流。载气的压力可控制为10-15psi，

本发明中，挥发性成分的定性主要通过2种途径，二者相互印证提高了目标化合物定性的准确性。

步骤(4)中，利用数据库检索目标化合物，进行定性分析；所述数据库为本领域可获得的资源，例如NIST2.0。

或者，步骤(4)中，采用相同条件对正构系列烷烃C8-C27进行气相色谱-质谱联用仪分析，利用色谱峰的保留时间计算目标相应化合物的保留指数LRI值，并与已知的LRI值比对认定范围为相差0-100内，实现化合物的辅助定性。色谱峰LRI值计算公式：

$\mathrm{LRI}=100\×n+\frac{100(t_a-t_n)}{t_{n+1}-t_n}---\left(1\right)$

式中：ta为色谱峰a的保留时间；tn为正构烷烃Cn的保留时间(色谱峰a的保留时间须在正构烷烃Cn和Cn+1之间)。

LRI值可在www.odour.org.uk中查询。

其中，步骤(4)中，挥发性成分的定量分析为：

根据蜂蜜样品中添加的内标化合物含量、内标化合物色谱峰面积及目标化合物色谱峰面积，计算目标化合物的含量，计算公式为：

$C_X=\frac{C_A\×S_X}{S_A}---\left(2\right)$

式中：CX为目标化合物的质量浓度；SX为目标化合物的色谱峰面积；CA为内标化合物的质量浓度；SA为内标化合物的色谱峰面积。

本发明的有益效果在于：

本发明以成熟蜂蜜作为实验材料，采用顶空固相微萃取技术和气相色谱-质谱联用技术对其挥发性成分进行分析。本发明提出的方法，选择在样品前处理过程中加入了饱和NaCl溶液，辅助挥发性成分的萃取；首次采用质谱库检索和LRI值对蜂蜜挥发性成分进行联合定性。

本发明提出的方法，使蜂蜜挥发性成分的萃取效率和分析结果的准确性大为提高，可为揭示不同蜂蜜样品挥发性成分的整体信息，为

蜂蜜的真实性评价提供一定理论基础。

附图说明

图1YC样品挥发性成分的总离子流图。图1的纵坐标为信号强度，数量级为×10⁵。

图2蜂蜜样品中挥发性成分种类分布图。

图3不同样品挥发性成分中主要共有物质的含量。

图4ZM样品中各挥发性成分的含量。

具体实施方式

现以以下实施例来说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中使用的手段，如无特别说明，均使用本领域常规的手段。

实施例1：

本实验中所采用的样品信息列于表1。

表1样品采集及蜜源信息

蜂蜜样品中挥发性成分的萃取及色谱分离：

(1)顶空固相微萃取条件蜂蜜挥发性成分萃取前，首先将固相微萃取装置的萃取头插入气相色谱注射孔中，270℃下老化处理60min。称取蜂蜜样品8g置于100mL的顶空瓶内，用微量进样器加入1μL的内标物(正丁烷溶解2-甲基-3-庚酮，浓度为1.632μg/mL)，并加入10mL的饱和NaCl溶液。50℃下将顶空瓶于磁力搅拌器上混匀30min，以达体系的平衡状态。将固相微萃取装置的萃取头插入顶空瓶中，推出萃取头的石英纤维后50℃吸附40min。

(2)自动热脱附系统条件将固相微萃取装置的萃取头插入气相色谱的进样孔，推出萃取头的石英纤维。起始温度为35℃，保持1min，延迟3min；以60℃/min的速度升温至220℃，保持1min，热脱附系统与进样口之间传输线温度为300℃。内附的冷进样系统条件为：初始温度-100℃，平衡0.5min，以10℃/min的速度升温至280℃，保持0.5min。

(3)气相色谱条件：HP-5MS毛细管色谱柱(30m×250μm，0.25μm)；初始温度40℃，保持2min，以4℃/min升温到160℃，保持2min，再以10℃/min升至250℃，保持5min。进样口温度250℃；载气为高纯氦气，流速1.5mL/min，压力11.962psi，不分流。

所有样品的顶空挥发性成分经色谱检测，总离子流图的轮廓较为相似，差别集中于少数挥发性成分色谱峰的有无或峰面积大小上。其中，较为典型的为油菜蜂蜜样品YC，见图1。各组分色谱峰分离完全，较少出现粘连现象。色谱分析过程中，蜂蜜样品中的挥发性成分最早出现于5min左右，最迟出现于27min左右，整个分析过程持续22min左右。图中可以明显看出，面积较大的峰分别代表了乙醇、乙酸和苯甲醇，经计算其含量分别为6.0108μg/μL、0.2542μg/μL和0.2038μg/μL。

蜂蜜样品中挥发性成分的定性与定量：

(1)质谱条件：电子轰击(EI)离子源，离子源温度为200℃，电子能量为70eV，传输线温度为280℃，四级杆温度为150℃，溶剂延迟5min，质量扫描范围为m/z 30-500。

(2)挥发性成分的定性：利用设备中NIST2.0数据库检索目标化合物，进行定性分析。

(3)挥发性成分的定量

根据蜂蜜样品中添加的内标化合物含量、内标化合物色谱峰面积及目标化合物色谱峰面积，计算目标化合物的含量，计算公式为式(2)。

实施例2：

样品和色谱进样方式同实施例1。

蜂蜜样品中挥发性成分的定性与定量：

(1)质谱条件：电子轰击(EI)离子源，离子源温度为200℃，电子能量为70eV，传输线温度为280℃，四级杆温度为150℃，溶剂延迟5min，质量扫描范围为m/z 30-500。

(2)挥发性成分的定性：采用相同条件对正构系列烷烃C8-C27进行气相色谱-质谱联用仪分析，利用色谱峰的保留时间计算目标相应化合物的保留指数LRI值，并与www.odour.org.uk中查询的LRI值比对认定范围为相差0-100内，实现化合物的辅助定性。色谱峰LRI值计算公式为式(1)。

本发明通过实施例1和实施例2两种途径定性测定挥发性成分，并相互验证。

利用顶空固相微萃取方法对17种蜜源蜂蜜样品的挥发性成分进行萃取，发现其组成非常复杂，经GC-MS分析共检测到79种物质，其中27种经过了质谱库和LRI值的双重鉴定，且检索值和计算值相符(相差在0～100范围内，见表2)。未发现某种物质在所有蜂蜜样品的挥发性成分中存在，苯乙醇在16个样品中被检出，乙酸在15个样品中被检出，糠醛在14个样品中被检出，甲苯和苯甲醛在13个样品中被检出，乙醇在8个样品中被检出，其他挥发性成分则在少数蜂蜜样品中被检出。另外，蜂蜜样品ZM中所检测到的挥发性成分最多，为22种；蜂蜜样品DSH次之，为18种。

将所有蜂蜜样品中挥发性成分进行分类汇总，结果见图2。其中的所有挥发性成分主要分属于醇类、醛类、芳香族类、酯类、酮类、醚类、酸类、酚类、萜烯类和烷烃类。其中醇类、醛类、芳香类和酯类物质含量最高，分别为22.78％18种、17.72％14种、17.72％14种和16.46％13种，与前人关于酯类和醛类物质可作为蜂蜜香味主要来源的报道一致。蜂蜜样品的挥发性成分中还含有其他类的物质，如酮类7.59％、醚类7.59％、酸类5.06％、酚类2.53％、萜烯类1.27％和烷烃类1.27％。

由图3可以得到，苯乙醇、乙酸和糠醛分别在16种、15种和14种蜂蜜样品的挥发性成分中被检测到，为主要的共有物质。三类物质在不同样品中的含量差异较大，如乙酸和糠醛在WWZ中含量最高，分别达到了0.9765±0.0012μg/μL和0.4402±0.0009μg/μL，而DSH和JT中未发现乙酸，HQ、LZ和DS中未发现糠醛。苯乙醇在DSH中含量最高，为0.8216±0.0011μg/μL，而其在LZ中未被检出。

所有蜂蜜样品中，ZM的挥发性成分中所检测到的物质种类最多，为22种，按照不同物质在色谱图上出现的先后次序制作图4。可以看出乙醇、乙酸乙酯和苯乙醛等物质的含量较高，均达到了0.80μg/μL以上。另外，ZM挥发性成分中还检测到了部分不常见物质，如2-甲基-1-丙醇、琥珀酸二乙酯、棕榈酸乙酯、苯丙酮酸乙酯和2,4,5-三甲基苯酚等物质仅在该样品中被发现。

以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案做出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims (8)

1.一种蜂蜜中挥发性成分的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)称取蜂蜜样品置于的顶空瓶内，加入内标物2-甲基-3-庚酮，并加入饱和NaCl溶液；45-55℃下将顶空瓶于磁力搅拌器上混匀，将固相微萃取装置的萃取头插入顶空瓶中，推出萃取头的石英纤维后50℃吸附30-45min；

(2)将固相微萃取装置的萃取头插入气相色谱仪的进样孔，推出萃取头的石英纤维；自动热脱附系统的控制条件为：起始温度为35℃，保持1min，延迟3min；以60℃/min的速度升温至220℃，保持1min，热脱附系统与进样口之间传输线温度为300℃；

(3)气相色谱条件：毛细管色谱柱初始温度40℃，保持2min，以4℃/min升温到160℃，保持2min，再以10℃/min升至250℃，保持5min；进样口温度250℃；

对5-27min之间出现的色谱峰进行质谱鉴定；

(4)质谱条件：电子轰击离子源，离子源温度为200℃，电子能量为70eV，传输线温度为280℃，四级杆温度为150℃，溶剂延迟5min，质量扫描范围为m/z 30-500，进行挥发性成分的定性与定量检测。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述顶空固相微萃取条件蜂蜜挥发性成分萃取前，先将固相微萃取装置的萃取头插入气相色谱注射孔中，在270℃下老化处理50-80min。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，内标物2-甲基-3-庚酮用正丁烷溶解，浓度为1.5-1.8μg/mL，加入1μL的该内标物溶液，并加入10mL的饱和NaCl溶液。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，气相色谱仪内附的冷进样系统条件为：初始温度-100℃，平衡0.5min，以10℃/min的速度升温至280℃，保持0.5min。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中，载气为氦气，流速1.4-1.8mL/min，不分流。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(4)中，蜂蜜样品中挥发性成分的定性分析方法为：利用数据库检索目标化合物，进行定性分析。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(4)中，挥发性成分的定性分析方法为：采用相同条件对正构系列烷烃C8-C27进行气相色谱-质谱联用仪分析，利用色谱峰的保留时间计算目标相应化合物的保留指数LRI值，已知LRI值比对认定范围为相差0-100内，实现化合物的定性分析；色谱峰LRI值计算公式：

$\mathrm{LRI}=100\×n+\frac{100(t_a-t_n)}{t_{n+1}-t_n}---\left(1\right)$

式中：ta为色谱峰a的保留时间；tn为正构烷烃Cn的保留时间。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(4)中，蜂蜜样品中挥发性成分的定量分析方法为：

根据蜂蜜样品中添加的内标化合物含量、内标化合物色谱峰面积及目标化合物色谱峰面积，计算目标化合物的含量，计算公式为：

$C_X=\frac{C_A\×S_X}{S_A}---\left(2\right)$

式中：CX为目标化合物的质量浓度；SX为目标化合物的色谱峰面积；CA为内标化合物的质量浓度；SA为内标化合物的色谱峰面积。