CN104316603A - 猴头菌丝体标准特征图谱的构建方法及基于标准特征图谱的猴头菌丝体质量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猴头菌丝体标准特征图谱的构建方法及基于标准特征图谱的猴头菌丝体质量检测方法。方法包括：(1)对照品溶液的制备；(2)供试品溶液的制备；(3)色谱条件：色谱分离柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；采用梯度洗脱，流动相为甲醇与质量百分比浓度为1％冰乙酸溶液组成的梯度洗脱液；柱温为30—40℃；流速为0.8—1.2ml/min；检测波长为250—260nm；(4)测定：高效液相色谱法的特征图谱。

Description

猴头菌丝体标准特征图谱的构建方法及基于标准特征图谱的猴头菌丝体质量检测方法

技术领域

本发明涉及猴头菌丝体标准特征图谱的构建方法及基于标准特征图谱的猴头菌丝体质量检测方法。

背景技术

药用真菌是指能治疗疾病，具有药用价值的一类真菌，即在菌丝体、子实体、菌核或孢子中能产生诸如氨基酸、蛋白质、维生素、多糖及糖蛋白、甙类、生物碱、甾醇类、蒽醌类、黄酮类等多类物质，对人体有保健作用，对疾病有预防抑制或治疗作用的真菌。真菌作为药用在我国已有2000多年的历史，早在《神农本草经》中就记载了茯苓、猪苓等真菌药物，《本草纲目》中也收载了20多种生物药用菌，目前我国传统作为药用及试验证实具有药效的真菌已超过400种，主要集中在担菌亚门和子囊菌亚门。然而日常广泛应用于临床的却仅有20余种，《中国药典》2010年版明确收录了7种，这说明对生物药用菌的研究还很不完善，开发空间较大。现有的研究主要集中于灵芝、虫草等少数几个品种，并且主要针对真菌多糖作为剂型的研究及开发应用。

随着生物科学的发展，真菌、粘菌、地衣等已从植物界中分离出来，单独成立菌物界。除目前久负盛名的灵芝、茯苓、虫草、槐耳种类外，该界入选中药的品种还较少,但其中高等真菌数千种,今后无疑将会出现更多此类菌物药，潜力巨大，将会大大丰富中药宝库。此外，以药用真菌为主体的菌物药，除传统应用子实体外，现代已发展到采用液体(深层)发酵(应用菌球与发酵液)、固体发酵(应用菌质)等生产工艺。固体发酵产生的普通菌质其主要药用部位仍只是它所含的菌丝体及其次生物质，但值得注意的是药用菌子实体除可自身入药外，还可用以进行中药生物工程研究，以研制新药。而发酵工程，尤其是我国特有的固体发酵工程，它存在的时间已有2000多年历史，通过长时间的固体发酵，产生了生物代谢产物包括生物酶类物质，其生成的药用菌质比液体发酵药效好。但固体发酵存在缺陷，容易杂菌污染，现固体发酵技术研究是国内研究热点，主要研究的方向是无菌培养、二次培养、杂菌抑制、中药材作为营养基实施双向固体发酵技术，突破固体发酵技术的瓶颈，实现生物药用菌的大规模产业化。

猴头菌是一种猴头菌科蘑菇(真菌)，在中药用于治疗胃肠道疾病已经有2000年的历史了，含有的一系列小分子化合物如erinacines，被认为具有神经再生，并且可以透过血脑屏障修复受损神经组织，猴头菌还有抗溃疡，抗炎，和抗微生物，免疫调节，提高肝功能，抗衰老，降低血糖和血脂，提高抗缺氧能力，增加心脏输出、改善备注循环等作用，包含猴头菌的医用制剂在中国已广泛使用。

猴头菌菌丝体的活性物质中最重要的是多糖及糖蛋白，目前国内外对猴头多糖的研究表明，猴头菌多糖具有多种生物活性和药理作用，能增强巨噬细胞的吞噬功能，促进溶血素的形成，抗白细胞下降，降血糖、抗凝血、抗血栓、抗突变和抗衰老等。因此，猴头菌多糖备受人们关注，成为近年来分子生物学、医药、食品科学等领域研究和开发应用的热点。《湖南省中药材标准》2009年版，122-123页记载了猴头菌培养物，本发明所述的猴头菌丝体是该标准记载的猴头菌培养物。

《湖南省中药材标准》2009年版现有质量标准中，仅有显微鉴别、薄层鉴别(5种氨基酸)、浸出物及含量测定，含量测定只检测多糖及总氮，不能控制产品质量，不能保证产品疗效。

中药品种包括药用菌丝体的鉴定和真伪鉴别常规的方法是根据药材的生药学特征和理化特性进行,但对外观性状、组织构造以及有机化学成分、理化鉴别相似的品种如药用真菌一类药材的鉴别、用常规方法就难以区别清楚。从现有的猴头菌内在质量控制现状来看,还存在很多问题需逐步解决。其中,最突出的问题之一就是整体化学特征的表征。因此建立准确有效的猴头菌丝体特征图谱，对于长期以来,缺乏系统的整理和归类,导致猴头菌丝体商品混乱,同名异物、同物异名的现象屡有发生,甚至出现有以假充真,以次充好的情况具有重要意义。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，提供猴头菌丝体特征图谱的构建方法，该方法构建的猴头菌丝体特征图谱可以防伪，因此可应用于鉴别猴头菌丝体。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

所述猴头菌丝体特征图谱的构建方法包括如下步骤：

(1)参照物溶液的制备：用甲醇将麦角甾醇配制成每1mL含0.02—0.10mg麦角甾醇的参照物溶液；

(2)供试品溶液的制备：用甲醇将猴头菌丝体供试品配制成每1mL含0.02—0.10g供试品的供试品溶液；

(3)高效液相色谱分析：分别精密吸取等量的参照物溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，记录35—40min的色谱图，即得猴头菌丝体特征图谱；

所述高效液相色谱分析中，色谱分离柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相A为甲醇，流动相B为质量百分比浓度为1％冰乙酸溶液；采用梯度洗脱方式(见表1)：

表1

柱温为30—40℃；流速为0.8—1.2ml/min；检测波长为250—260nm，理论板数按麦角甾醇峰计算≥5000；

(4)将猴头菌丝体特征图谱与猴头菌丝体标准特征图谱相比对，鉴别猴头菌丝体有效成分以及是否添加了其它成分；

所述生猴头菌丝体标准特征图谱按照如下步骤构建：

(a)参照物溶液的制备：用甲醇将麦角甾醇配制成每1mL含0.02—0.10mg麦角甾醇的参照物溶液；

(b)供试品溶液的制备：用甲醇将猴头菌丝体供试品配制成每1mL含0.02—0.10g供试品的供试品溶液；

(c)高效液相色谱分析：分别精密吸取等量的参照物溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，记录35—40min的色谱图，得猴头菌丝体特征图谱；

所述高效液相色谱分析中，色谱分离柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相A为甲醇，流动相B为质量百分比浓度为1％冰乙酸溶液；采用梯度洗脱方式(见表2)：

表2

柱温为30—40℃；流速为0.8—1.2ml/min；检测波长为250—260nm，理论板数按麦角甾醇峰计算≥5000；

对多批次猴头菌丝体建立特征图谱，通过分析比较，确定出4个共有特征峰，以与麦角甾醇参照物对应的峰为参照峰，4个特征峰的相对保留时间分别为：0.48、0.81、1.00和1.14，偏差为±10％以内；其中相对保留时间为1.00的峰是与麦角甾醇参照物对应的峰(3S)；特征峰相对峰宽为30，阈值为50，最小相对峰面积为1000，最小相对峰高为100；这些共有特征峰构成了猴头菌丝体的特征，作为猴头菌丝体的标准特征图谱(见图1)。

附图说明

图1为本发明中猴头菌丝体的标准特征图谱；

图2为猴头菌丝体样品和甲醇溶剂空白的HPLC色谱图；

图3为不同流动相HPLC图；

图4为流动相不同起始梯度HPLC图；

图5为六种提取溶剂考察HPLC图；

图6为两种提取方法考察HPLC图；

图7为四种超声时间的HPLC图；

图8为三个检测波长下的HPLC图；

图9为标准品麦角甾醇与样品的HPLC图；

图10为标准品麦角甾醇与3号特征峰的紫外吸收图；

图11为整体模式样品导出图谱；

图12为对照图谱。

具体实施方式

1仪器与试药

Waters2695-2996高效液相色谱系统，Empower工作站，含四元梯度泵、自动进样器(Waters公司)

SK3300H型超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；

T-214型电子分析天平(Denver公司)；

麦角甾醇对照品(中国食品药品检定研究院，批号111845-201102，含量97.7％)；

冰乙酸(色谱纯，天津市化学试剂研究所)；

甲醇(色谱纯，TEDIA公司)；

猴头菌丝体湖南新汇制药股份有限公司10批，批号分别为20101024、20110413、20110622、20110907、20120204、20120322、20120511、20120708、20120916、20130315；江苏神华药业有限公司1批，批号为20121011；荆州市天瑞生物科技有限公司1批，批号为20130523。2对照品溶液的制备

取麦角甾醇对照品约5mg，精密称定，置100ml量瓶中，加甲醇适量，密塞，超声处理(功率160W，频率59kHz)使溶解，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

3供试品溶液的制备

3.1猴头菌丝体溶液的制备

取猴头菌丝体约2.0g，精密称定,置具塞锥形瓶中，精密加甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率160W，频率59kHz)60分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量,摇匀，滤过，取续滤液，即得。

4方法学研究

4.1特征峰的选择

取猴头菌丝体约2.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率160W，频率59kHz)60分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。以甲醇为流动相A，以1.0％冰乙酸溶液为流动相B，按表3中的规定进行梯度洗脱，猴头菌丝体样品和甲醇溶剂空白的HPLC色谱图如图2所示。

表3

由图2可发现：猴头菌丝体样品中的色谱峰在保留时间45分钟之前均较小，不选为特征峰；保留时间在45分钟至55分钟间时，猴头菌丝体样品中的主要峰均与甲醇溶剂峰相对应，不选为特征峰；保留时间60分钟后的紫外吸收较明显，峰1、峰2、峰3和峰4可选为猴头菌丝体的特征峰。

4.2流动相组成的选择

取猴头菌丝体约2.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率160W，频率59kHz)60分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液进行HPLC分析，流动相组成及梯度洗脱见表4，结果如图3所示。

表4

由图3可知，流动相为甲醇-1.0％冰乙酸溶液时，色谱峰形相对较好，基线也比较平稳，主要特征峰保留时间也较为合适，故选择流动相组成为甲醇-1.0％冰乙酸溶液。

4.3流动相起始梯度的选择

取猴头菌丝体约2.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率160W，频率59kHz)60分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液进行HPLC分析，流动相组成为甲醇(A)-1.0％冰乙酸溶液(B)，起始梯度见表5，得图4。

表5

由图4可知，流动相甲醇(A)-1.0％冰乙酸溶液(B)的起始梯度为90∶10时，图中主要色谱峰的保留时间较为适宜，且基线较为平稳，故选择流动相甲醇(A)-1.0％冰乙酸溶液(B)的起始梯度为90∶10。

4.4提取溶剂的选择

取同一批号猴头菌丝体约2.0g(共6份)，各精密称定,置具塞锥形瓶中，依次分别精密加甲醇、95％乙醇、75％甲醇、75％乙醇、50％甲醇和50％乙醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率160W，频率59kHz)60分钟，放冷，再称定重量，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液进行HPLC分析。结果见图5，主要色谱峰峰面积见表6。

表6

结合图5和数据可知，提取溶剂为50％甲醇、50％乙醇和75％甲醇时，所得图谱中的特征峰均不完整；提取溶剂分别为75％乙醇、95％乙醇和甲醇时，所得图谱中的特征峰均完整，且选择提取溶剂为甲醇时，四个特征峰物质的提取得率均最高，故选择甲醇为提取溶剂。

4.5提取方法的选择

取同一批号猴头菌丝体约2.0g(共2份)，各精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加甲醇25ml，密塞，称定重量，分别超声处理(功率160W，频率59kHz)60分钟和70℃水浴加热回流60分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液进行HPLC分析。结果见图6，主要色谱峰峰面积见表7。

表7

从表7中可知，超声处理与加热回流提取效力相当，但考虑到提取方法的便捷，故选择超声提取。

4.6超声时间的选择

取同一批号猴头菌丝体约2.0g(共4份)，各精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加甲醇25ml，密塞，称定重量，分别超声处理(功率160W，频率59kHz)15分钟、30分钟、45分钟和60分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液进行HPLC分析。结果见图7，主要色谱峰峰面积见表8。

表8

结合图7和数据可知，选择超声时间为60分钟较为合适。

4.7检测波长的选择

在上述色谱条件下，比较254nm、290nm和330nm三个波长下的特征峰，结果见图8。从图8可知，波长选择254nm时，杂质峰较少，特征峰数量相对较多，而且峰面积较大，可适当反映出样品的综合信息。因此，选择检测波长为254nm。

4.8精密度考察

精密吸取同一份猴头菌丝体供试品溶液，在上述色谱条件下，连续进样6次，记录特征图谱，结果表明，各色谱峰与麦角甾醇内参比峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3.0％，符合要求。具体数据见表9、表10、表11和表12。

表9保留时间精密度

表10相对保留时间精密度

表11峰面积精密度

表12相对峰面积精密度

4.9重复性考察

取同一批号猴头菌丝体共6份，按“供试品溶液的制备”项下操作，在上述色谱条件下进样分析，计算各色谱峰与内参比峰麦角甾醇的相对保留时间和相对峰面积，其RSD均小于3.0％，符合要求。具体数据见表13、表14、表15和表16。

表13保留时间重复性

表14相对保留时间重复性

表15峰面积重复性

表16相对峰面积重复性

4.10稳定性考察

取供试品溶液，于室温下放置，分别在0、2、4、6、12、24h进样分析，计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，其RSD均小于3.0％，实验结果表明，猴头菌丝体溶液在24h内稳定性良好。具体数据见表17、表18、表19和表20。

表17保留时间稳定性

表18相对保留时间稳定性

表19峰面积稳定性

表20相对峰面积稳定性

4.11对照品与样品图谱

采用优化的色谱条件，对标准品麦角甾醇和猴头菌丝体进行进样分析，得色谱图9。从图9可知，标准麦角甾醇保留时间为26.627分钟，与样品3号色谱峰的保留时间26.620一致；从图10中可知，标准品麦角甾醇与样品3号色谱峰的紫外吸收图一致。因此，判断样品中的3号特征峰为麦角甾醇。

5猴头菌丝体特征图谱研究结果

5.1样品信息

共收集样品10个，均选自同一公司生产的不同批号猴头菌丝体。样品信息见表21。

表21

5.2猴头菌丝体图谱

使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2.0版)，导入模式样品后，参照图谱为S2，对照图谱生成方法采用平均数法，时间窗宽度分别设在0.01-0.05之间，相似度结果稳定，所以选择时间窗宽度为0.03，自动匹配生成对照谱图，整体输出见图11。使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2.0版，导入对照图谱，输出图像，得到图12。

5.3色图谱信息

模式样品按照相同方法处理，均有4个特征峰，且各特征峰保留时间RSD％均小于0.20％；其他样品也按相同方法处理，均没有4个特征峰。样品具体信息如表22。

表22

由以上数据可知，1-10号样品为同一生产企业不同批号的猴头菌丝体，10批猴头菌丝体样品均能检测出4个特征峰，特征图谱中特征峰峰面积的差别在一定程度上反映了批间产品质量情况。

麦角甾醇又称麦角固醇,大量存在于酵母中，是脂溶性维生素D2的前体，当受到紫外线照射时可转化为维生素D2。麦角甾醇是真菌细胞膜的重要结构组成成分,在真菌生活中起重要作用。一些不同类型的化合物通过作用于真菌麦角甾醇生物合成途径中不同环节的酶,干扰真菌麦角甾醇生物合成,发挥抗真菌作用。经药效实验表明，麦角甾醇在无毒剂量下，与化疗药物阿霉素联用，可以促进化疗药物在细胞内的积累而逆转肿瘤细胞的耐药性。有多篇文献报道，麦角甾醇具有抗肿瘤效果。因此，本色谱图以麦角甾醇类有效物质作为特征峰，其他三个峰也为甾醇类物质，能够反映属于真菌类物质，加上四个峰比较稳定、可重现，能够作为猴头菌丝体的特征图谱，以此来反映产品疗效和真伪，是科学和可行的。

6相似度

共有模式(10个模式样品)与对照图谱比较相似度，结果见表23：

表23

从上面相似度可知，模式样品的相似度均大于0.94。说明这些模式样品选择合适，模式样品的工艺稳定。

Claims (2)

1.一种猴头菌丝体标准特征图谱的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)参照物溶液的制备：用甲醇将麦角甾醇配制成每1mL含0.02—0.10mg麦角甾醇的参照物溶液；

(2)供试品溶液的制备：用甲醇将猴头菌丝体供试品配制成每1mL含0.02—0.10g供试品的供试品溶液；

(3)高效液相色谱分析：分别精密吸取等量的参照物溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，记录35—40min的色谱图，得猴头菌丝体特征图谱；

其中，步骤(3)所述的高效液相色谱分析中，色谱分离柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相A为甲醇，流动相B为质量百分比浓度为1％冰乙酸溶液；采用梯度洗脱方式：

时间(min)       流动相A(％)      流动相B(％)

0～20           90→100          10→0

20～35          100              0

柱温为30—40℃；流速为0.8—1.2ml/min；检测波长为250—260nm，理论板数按麦角甾醇峰计算≥5000；

对多批次猴头菌丝体建立特征图谱，通过分析比较，确定出4个共有特征峰，以与麦角甾醇参照物对应的峰为参照峰，4个特征峰的相对保留时间分别为：0.48、0.81、1.00和1.14，偏差为±10％以内，其中相对保留时间为1.00的峰是与麦角甾醇参照物对应的峰；特征峰相对峰宽为30，阈值为50，最小相对峰面积为1000，最小相对峰高为100；这些共有特征峰构成了猴头菌丝体的特征，作为猴头菌丝体的标准特征图谱。

2.一种猴头菌丝体的质量检测方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)参照物溶液的制备：用甲醇将麦角甾醇配制成每1mL含0.02—0.10mg麦角甾醇的参照物溶液；

(2)供试品溶液的制备：用甲醇将猴头菌丝体供试品配制成每1mL含0.02—0.10g供试品的供试品溶液；

(3)高效液相色谱分析：分别精密吸取等量的参照物溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，记录35—40min的色谱图，即得猴头菌丝体特征图谱；

所述高效液相色谱分析中，色谱分离柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相A为甲醇，流动相B为质量百分比浓度为1％冰乙酸溶液；采用梯度洗脱方式：

时间(min       流动相A(％      流动相B(％)

0～2           90→10          10→0

20～3          10              0

柱温为30—40℃；流速为0.8—1.2ml/min；检测波长为250—260nm，理论板数按麦角甾醇峰计算≥5000；

(4)将猴头菌丝体特征图谱与猴头菌丝体标准特征图谱相比对，鉴别猴头菌丝体有效成分以及判别猴头菌丝体的真伪。