CN104297467A - 分析用芯片及分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明为一种分析用芯片，所述分析用芯片具有表面固定有选择结合性物质的基板、和与该基板粘合的覆盖构件，在该基板与该覆盖构件之间具有空隙，在该空隙中容纳或注入有可移动的微粒，该微粒表面涂布有表面活性剂。根据本发明，可以抑制阻碍被检物质与被固定的选择结合性物质之间的选择反应的气泡的产生，抑制数据偏差和灵敏度降低，提高测定的重现性。

Description

分析用芯片及分析方法

本申请是PCT国际申请号为PCT/JP2008/050891、国际申请日为2008年1月23日、中国国家申请号为200880001700.5、发明名称为“分析用芯片及分析方法”的中国发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种分析用芯片及使用该分析用芯片的被检物质的分析方法，所述分析用芯片具有固定有选择结合性物质、即与被检物质选择性地结合的物质的基板。

背景技术

分析用芯片具有固定有基因、蛋白质、脂质、糖等选择结合性物质的基板，使该基板上的选择结合性物质被检物质作为通常溶液进行反应，用于由反应结果来分析被检物质是否存在、存在状态或量等。作为该基板，通常可以使用玻璃制、金属制、树脂制的基板。

作为分析用芯片的方案之一，有为了同时测定数百～数万的多个基因表达而在基板上高密度地配置DNA等分子的分析用芯片，有时称为微阵列(microarray)。通过使用微阵列，可以进行在各种疾病动物模型或细胞生物学现象中的系统性且包罗性的基因表达解析。具体而言，可以明确基因的功能即基因编码的蛋白质，同时可以特定蛋白质表达的时期及起作用的部位。一般认为利用微阵列解析在生物细胞或组织水平中的基因表达的变化，与生理学、细胞生物学、生化学方面的事件数据组合，构筑基因表达谱数据库(GeneExpression Profile Data Base)，由此可以进行疾病基因、与治疗相关的基因的检索及治疗方法的探索。

目前，制作分析用芯片主要采用两种基本方法，即GeneChip法及cDNA分析用芯片法。

GeneChip法是由Affymetrix公司开发的方法，利用光刻法在玻璃板上合成25mer左右的寡DNA，相对于每个基因，由碱基序列数据设定16处到20处的25mer，将25mer完全匹配的寡聚体单元与故意使第13个碱基错配的1个碱基错配的寡聚体单元进行组合，形成探针DNA。该方法中，探针DNA的长度固定，序列已知，所以可以使影响杂交强度的GC含量为固定，因此认为是表达量的定量解析中理想的分析用芯片。另一方面，cDNA分析用芯片法是采用由Stanford大学开发的方法，通过利用毛细管状笔的点样方式、或喷墨方式等措施，将DNA固定在玻璃板上的方法。通过任意方法制作的分析用芯片，均通过杂交使预先经荧光标记过的测定试样(基因)与分析用芯片上的探针DNA结合，使用扫描器测定其荧光强度，由此测定基因的表达。

作为分析用芯片数据的解析例之一，有层次聚类算法。该方法是收集表达模式类似的基因来制作系统树的方法，可以用颜色模式地表示多数基因的表达水平。通过上述聚类算法，可以识别参与某种疾病的基因。

分析用芯片逐渐被用作DNA等核酸、以及蛋白质及糖类等的检查、解析手段。尤其是，在蛋白质分析用芯片中，抗体、抗原、酶底物等蛋白质被固定于基板上。

使用分析用芯片时，其重要之处在于使用配制得到的含有被检物质的溶液，使其在分析用芯片上固定有选择结合性物质的整个区域内均等地展开。为此人们进行了研究，获知了一种分析用芯片，在该分析用芯片内部具备用于搅拌含有被检物质的溶液的微粒。

在专利文献1中公开了下述分析用芯片，将在被检物质DNA溶液中预先加入微粒的微粒分散溶液应用于分析用芯片，覆盖盖玻片(cover glass)，利用密封剂密封，通过盖玻片、分析用芯片基板及密封剂形成有规定的被密封的空隙。该分析用芯片利用微粒的运动一边搅拌，一边进行杂交且被检物质溶液不蒸发。

另外，在专利文献2中公开了下述分析用芯片，在分析用芯片基板上设置有凹凸，在凸部上端面固定有选择结合性物质，在凹部中可移动地容纳有搅拌用微粒，可以搅拌反应液。该分析用芯片中由于微粒不与凸部上端面接触，所以可以不损伤选择结合性物质地进行利用微粒的搅拌。

但是，在如上所述地使用微粒进行搅拌的分析用芯片中，施加含有被检物质的液体时，有时在分析用芯片基板内部的表面或微粒表面残留气泡，或者在反应液中产生气泡。产生的气泡成为阻碍，有在滞留有气泡的部分选择结合性物质与被检物质的反应被阻碍的问题。另外，由于在滞留有气泡的部分和除此之外的部分产生反应差异，所以具有在分析用芯片上产生检测灵敏度差异或检测灵敏度降低的问题。

另外，在分析用芯片基板与覆盖物之间的空隙中容纳或注入搅拌用微粒时，有时由于产生静电，使得向空隙内注入微粒的操作变得困难，或者不能注入充足量的微粒。并且，有时注入的微粒凝集变得不能移动，在该状态下向由覆盖物与基板所围成的空隙中注入被检物质溶液时，存在由于溶液不能扩散至微粒凝集的部位而导致混入气泡、结果产生反应差异的问题。

专利文献1：专利第3557419号公报

专利文献2：国际公开第2005/090997号说明书

发明内容

本发明可以解决上述课题，提供一种分析用芯片，所述分析用芯片抑制产生可以阻碍被检物质与被固定的选择结合性物质之间的选择反应的气泡，抑制因反应差异而引起的检测灵敏度差异及检测灵敏度降低。另外，本发明提供一种分析用芯片，所述分析用芯片可以防止搅拌用微粒的凝集，并且容易向分析用芯片基板与其覆盖物之间的空隙注入搅拌用微粒。

本发明人等经过潜心研究，结果发现通过在搅拌用微粒的表面涂布表面活性剂，可以解决上述课题，从而完成了本发明。

即，本发明为一种分析用芯片，所述分析用芯片具有表面固定有选择结合性物质的基板、和与该基板粘合的覆盖构件，在该基板与该覆盖构件之间具有空隙，在该空隙中容纳或注入有可移动的微粒，该微粒表面涂布有表面活性剂。

本发明的分析用芯片的优选方案之一为，涂布在微粒的表面上的表面活性剂为阴离子表面活性剂或非离子表面活性剂。

另外，本发明的分析用芯片的优选方案之一为，基板在其表面具有由凹部及凸部构成的凹凸部，在该凸部的上端面固定有选择结合性物质。

另外，本发明的分析用芯片的优选方案之一为，涂布有表面活性剂的微粒的材料包括陶瓷。

另外，本发明的分析用芯片的优选方案之一为，覆盖构件具有一个以上与上述空隙连通的贯通孔。

另外，本发明的分析用芯片的优选方案之一为，基板的固定有选择结合性物质的面与覆盖构件的间隔的最短距离小于微粒的直径。

另外，本发明的分析用芯片的优选方案之一为，选择结合性物质是DNA、RNA、蛋白质、肽、糖、糖链或脂质。

另外，本发明为一种被检物质的分析方法，即，使本发明的分析用芯片接触含有被检物质的溶液，使上述固定在基板表面的选择结合性物质选择性地结合该被检物质，测定经该选择结合性物质结合在分析用芯片上的该被检物质的量。

本发明的被检物质的分析方法的优选方案之一为，使含有被检物质的溶液接触分析用芯片之前，将含有被检物质的溶液进行脱气处理。

利用本发明的分析用芯片，可以抑制分析用芯片内部的反应液中的气泡的残留及产生。结果可以抑制由气泡阻碍选择结合性物质与被检物质之间的反应所产生的反应差异导致的检测灵敏度差异及检测灵敏度降低，可以以高灵敏度检测被检物质。

另外，利用本发明的分析用芯片，可以防止微粒的凝集、并且可以在分析用芯片基板与覆盖构件之间的空隙中容易且顺利地注入微粒。

附图说明

[图1]图1为表示构成本发明的分析用芯片的固定有选择结合性物质的基板的一例的剖面简图。

[图2]图2为表示通过使用图1的基板，在基板表面产生气泡的例子的剖面简图。

[图3]图3为表示构成本发明的分析用芯片的固定有选择结合性物质的基板的一例的侧视简图。

[图4]图4为表示图3的构成本发明的分析用芯片的固定有选择结合性物质的基板的一例的剖面简图。

[图5]图5为表示读取使用构成本发明的分析用芯片的固定有选择结合性物质的基板的反应结果的夹具及扫描器的一例的纵剖面简图。

[图6]图6为表示在本发明的分析用芯片中的贯通孔及液面休止用槽之一例的斜视图。

[图7]图7为表示本发明的分析用芯片的一例的剖面简图。

[图8]图8为表示本发明的分析用芯片的一例的剖面简图。

[图9]图9为表示本发明的分析用芯片的一例的剖面简图。

[图10]图10为表示具有分割结构的本发明的分析用芯片的一例的侧视简图。

[图11]图11为表示具有分割结构的本发明的分析用芯片的另一例的纵剖面简图。

[图12]图12为表示本发明的分析用芯片的凹凸部、覆盖构件及微粒的优选关系的一例的纵剖面简图。

符号说明

1  基板

2  微粒

3A  覆盖构件凸部

3、3B  覆盖构件

10  凹部

11  凸部

12  固定有选择结合性物质的区域(凹凸部)

13  平坦部

14  基板凸部

26  产生的气泡的例子

30、30C  粘合构件

30A、30B  分割结构的粘合构件

31  空隙或空间

32  贯通孔

33  液面休止用槽

34  密封构件(胶带)

35  基板与覆盖构件间的间隙

40  用于使微阵列接触夹具的弹簧

41  夹具

42  夹具接触面

43  物镜

44  激光激发光

45  固定在基板上的选择结合性物质

L1  凸部间距

具体实施方式

本发明的分析用芯片的特征在于，所述分析用芯片在其表面固定有选择结合性物质的基板、和与该基板粘合的覆盖构件之间存在空隙，在该空隙中容纳或注入有可移动的微粒，在该微粒的表面涂布有表面活性剂。所谓利用表面活性剂的涂布表示在微粒的部分或全部表面涂布、附着或覆盖表面活性剂，该涂布例如可通过下述方法进行。

容纳有本发明的微粒的分析用芯片的一例如图1所示。在图1所示的例子中，基板1的表面通过由凹部10及凸部11构成的凹凸部构成。凹部10中容纳有微粒2，在凸部11的上面，固定有选择结合性物质45(例如核酸)。

为了与固定在该基板1上的选择结合性物质45(例如核酸)反应，在分析用芯片中加入含有被检物质的溶液时，微粒2的表面附着的微小气泡游离到液体中，如图2所示变成气泡26覆盖了凸部，因此被覆盖的凸部表面上的选择结合性物质不能与被检物质反应。在本发明的分析用芯片中，通过在微粒2的表面涂布表面活性剂，在微粒表面不附着气泡或难以附着气泡，因此可以抑制气泡的产生。由此，基板1表面的全部选择结合性物质45能够与被检物质反应，可提高所得数据的可靠性和重现性。

作为用表面活性剂涂布微粒表面的方法，可使用下述公知的方法：将微粒浸渍于含有表面活性剂的溶液中之后取出并干燥的方法，向微粒表面喷雾含有表面活性剂的溶液之后使其干燥的方法，使微粒与含有表面活性剂溶液的物质接触的方法，使微粒与液体接触后撒上粉末状的表面活性剂使其附着的方法等。另外，也可以采用如下方法：采用上述方法通过喷射、附着等在微粒表面涂布表面活性剂之后，用水或有机溶剂清洗剩余的表面活性剂。上述方法中使用的含有表面活性剂的溶液的浓度优选为0.01％～10％，较优选使用0.05％～2％的浓度。

作为微粒的表面处理中使用的表面活性剂，可以举出阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂、非离子表面活性剂，其中优选使用阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂。

作为阴离子表面活性剂，可以举出十二烷基硫酸钠(SDS)、胆酸钠、去氧胆酸钠、月桂基肌氨酸钠(Sodium Lauryl Sarcosinate)、聚氧乙烯烷基醚磷酸酯、聚氧乙烯烷基苯基醚磷酸酯、十二烷基硫酸三乙醇胺、月桂酰肌氨酸钠(Sodium Lauroyl Sarcosinate)等。

作为阳离子表面活性剂，可以举出十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、乙基硫酸羊毛脂脂肪酸氨基丙基乙基二甲基铵、烷基三甲基氯化铵、二烷基二甲基氯化铵、二硬脂基二甲基氯化铵、二硬脂基二甲基苄基氯化铵、硬脂基三甲基氯化铵等。

作为两性表面活性剂，可以举出3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-2-羟基丙磺酸盐(CHAPSO)、3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-丙磺酸盐(CHAPS)、正十二烷基-N，N-二甲基-3-氨基-1-丙磺酸盐(ZWITTERGENT 3-12Detergent)等。

作为非离子表面活性剂，可以举出二甲基癸基氧膦(APO-10)、十二烷基二甲基氧膦(APO-12)、聚氧乙烯十二烷基醚(BRIJ-35)、聚氧乙烯(20)十六烷基醚(BRIJ-58)、聚氧乙烯(80)脱水山梨醇单油酸酯(聚山梨酸酯80、Tween80)、聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单月桂酸酯(聚山梨酸酯20、Tween20)、聚乙二醇对(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基醚(TRITON X-100)、TRITONX-114、正癸酰基-N-甲基-D-葡糖胺(MEGA-10)、正壬酰基-N-甲基-D-葡糖胺(MEGA-9)、正辛酰基-N-甲基-D-葡糖胺(MEGA-8)、壬基苯基-聚乙二醇(NP-40)、聚氧乙烯聚氧丙烯二醇、乙二醇单硬脂酸酯、失水山梨糖醇单硬脂酸酯、丙二醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单硬脂酸酯、聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇(Pluronic F-68)、聚氧乙烯(196)聚氧丙烯(67)二醇(Pluronic F 127)等。

其中，作为阴离子表面活性剂，由于表面活性效果强，所以特别优选使用十二烷基硫酸钠(SDS)、去氧胆酸钠，作为非离子表面活性剂，特别优选使用Pluronic F68、Pluronic F127。

微粒的形状没有特别限定，只要可以搅拌被检物质溶液即可，除了球状的形状之外，还可以为多边形以及圆柱形、棱柱形等微细杆状(微细的棒状)等任意的形状。

微粒的大小也没有特别限定，优选微粒的直径小于上述基板的固定有选择结合性物质的面与覆盖构件之间的间隔的最短距离。例如为球状的微粒时，可以为0.1μm～300μm的范围。微粒为圆柱形的微粒时，将其底面直径视为微粒的直径，优选底面直径小于上述基板的固定有选择结合性物质的面与覆盖构件之间的间隔的最短距离。例如，为圆柱形微粒时，可以为长度50μm～5000μm、底面直径10μm～300μm的范围。

微粒的材料也没有特别限定，可以使用玻璃、陶瓷(例如钇部分稳定氧化锆)、金、铂、不锈钢、铁、氧化铝(矾土)、氧化钛(二氧化钛)等金属或金属氧化物、尼龙或聚苯乙烯等塑料。

另外，涂布有表面活性剂的微粒的表面优选具有适当的粗糙度。即，优选微粒的表面的中心线平均粗糙度(Ra值)为40nm以上300nm以下。通过使用具有该范围的表面粗糙度的微粒，由于颗粒的表面积较大，所以可以将较多的表面活性剂涂布于微粒表面。为陶瓷制微粒的情况下，考虑到材料的强度时，优选Ra值为40nm以上200nm以下。

构成本发明的分析用芯片的基板，优选在其表面上具有由凹部及固定有选择结合性物质的凸部构成的凹凸部。通过形成上述结构，在检测时不检测被非特异地吸附的被检物质，因此噪声小，结果可以得到S/N较好的结果。噪声减小的具体原因如下所述。即，使用称为扫描器的装置扫描在凸部上面固定有选择结合性物质的基板时，激光的焦点在凹凸部的凸部上面聚焦，因此在凹部中，激光变得模糊，具有难以检测到凹部非特异地吸附的被检物质的不期望的荧光(噪声)的效果。

关于凹凸部的凸部的高度，优选各凸部上面的高度大致相同。此处，所谓高度大致相同，是指在高度不同的凸部的表面固定选择结合性物质，使其与被荧光标记的被检物质反应，然后用扫描器进行扫描时，其信号水平的强度差不会产生问题的高度。具体而言，所谓高度大致相同是指高度差在50μm以下。较优选高度差在30μm以下，更优选高度相同。需要说明的是，本发明中所谓相同的高度还包括由在生产等中产生的差异所引起的误差。最高的凸部上面的高度与最低的凸部上面的高度差大于50μm时，有时在高度不齐的凸部上面的激光变得模糊，来自与在该凸部上面固定的选择结合性物质反应的被检物质的信号强度变弱，故不优选。

在构成本发明的分析用芯片的基板上，固定选择结合性物质(例如核酸)的区域为该基板的表面，只要为上述未被粗面化的区域即可，没有特别限定，具体而言，优选为上述凹凸部中凸部的上面(上端面)。选择结合性物质的固定可以预先进行固定，也可以先不固定仅准备基板，分析被检物质时适当选择与所期望的被检物质相对应的选择结合性物质并进行固定。

可固定于凸部上面的选择结合性物质(例如核酸)可适当选择作为数据所必须的物质，但也可以仅是虚设的选择结合性物质。另外，不必在全部凸部上面结合选择结合性物质，也可以具有未固定任何物质的凸部上面。

在构成本发明的分析用芯片的基板上，在凸部上面固定选择结合性物质时，优选该凸部上面的面积大致相同。通过使凸部上面的面积大致相同，可以使固定有多种选择结合性物质的部分的面积相同，因此有利于以后的解析。此处，所谓凸部上部的面积大致相同是指凸部中最大的上面面积除以最小的上面面积所得的值为1.2以下。

固定有选择结合性物质的凸部上面的面积没有特别限定，但从可减少选择结合性物质的量和操作的容易性的方面考虑，优选为10μm²以上、1mm²以下，较优选为300μm²以上、0.8mm²以下。

在构成本发明的分析用芯片的基板上，更优选其基板上的具有固定有选择结合性物质的区域的面的周围进一步被与凹凸部的凸部上端高度大致相同的平坦部包围。通过形成上述结构，在凹凸部中易于施加含有被检物质的溶液，可以使搅拌用微粒保持在凹部，不与选择结合性物质接触。

凹凸部的凸部上面的高度与平坦部的高度优选大致相同。即，平坦部的高度与凸部上面的高度差优选为50μm以下。凸部上面的高度与平坦部的高度差超过50μm时，有时可检测的荧光强度变弱，故不优选。平坦部的高度与凸部上面的高度差较优选为30μm以下，最优选平坦部的高度与凸部的高度相同。

本发明的分析用芯片中优选使用的基板的凹凸部中的凸部的高度，即，凸部上面与凹部底面的高度差优选为10μm以上、500μm以下，较优选为50μm以上、300μm以下。凸部的高度低于10μm时，有时能够检测到除点样之外的部分的非特异性吸附的被检物质试样，结果S/N变差，故不优选。另外，凸部的高度高于500μm时，有时产生凸部折断、容易破损等问题，不优选。

构成本发明的分析用芯片的基板的具体例如图3及图4所示。

在图3及图4所示的例子中，基板1的表面由具有多个凸部11的凹凸部12构成，其周围设置有平坦部13。在凸部11上面，固定有选择结合性物质(例如核酸)。使用该平坦部，可以容易地使扫描器的激发光等测定用光线的焦点在凸部上面聚焦。更具体而言，对基板的表面照射测定用激光等照射光使焦点聚焦时，如图5所示，通常用弹簧40加力使夹具41与基板1接触，利用透镜43等预先调节焦点使激光44在该夹具的接触面42的高度处聚焦。通过使本发明的分析用芯片的基板的平坦部与夹具的面42接触，可容易地使测定用光线(扫描器的激光)的焦点在基板的凸部上面聚焦。需要说明的是，在图5的例子中，固定基板1使固定有选择结合性物质的面为下侧。

本发明的分析用芯片的基板的材料没有特别限定，可以举出玻璃、陶瓷、有机硅树脂、聚对苯二甲酸乙二醇酯、醋酸纤维素、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)弹性体等有机硅橡胶等。其中，可优选使用聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯、聚二甲基硅氧烷(PDMS)弹性体、玻璃或有机硅树脂。

本发明的分析用芯片的基板优选至少一部分为黑色。由此可以减少来自基板自身的荧光。作为基板的黑色部分，可以为设置有凹凸部的基板主体，也可以为在凸部的侧面、凹部所设置的疏水材料或绝缘层，还可以为它们的全部。

此处，所谓基板为黑色，是指在可见光(波长400nm～800nm)范围内基板的黑色部分的光谱反射率不具有特定的光谱图(spectrum pattern)(特定的峰等)，一律为低值，并且基板的黑色部分的光谱透过率也不具有特定的光谱图，一律为低值。

作为该光谱反射率、光谱透过率的值，优选可见光(波长400nm～800nm)范围的光谱反射率为7％以下、在该波长范围内的光谱透过率为2％以下。需要说明的是，此处所谓的光谱反射率是指符合JIS Z 8722的条件C、在照明·受光光学系统中获取来自基板的正反射光时的光谱反射率。

作为制成黑色的方法，可通过使本发明的分析用芯片的基板含有黑色物质来实现。该黑色物质只要为不反射光或难以反射光的物质、或者不透过或难以透过光的物质即可，没有特别限定，列举优选黑色物质时，可使用炭黑、石墨、钛黑(Titanium Black)、苯胺黑、Ru、Mn、Ni、Cr、Fe、Co或Cu的氧化物、Si、Ti、Ta、Zr或Cr的碳化物等黑色物质。

上述黑色物质可以单独含有，除此之外也可以混合含有2种以上。例如，为聚对苯二甲酸乙二醇酯、有机硅树脂等聚合物时，其中的黑色物质中，可以优选含有炭黑、石墨、钛黑、苯胺黑，特别是可以优选使用炭黑。为玻璃、陶瓷等无机材料时，可以优选含有Ru、Mn、Ni、Cr、Fe、Co或Cu等的金属氧化物、Si、Ti、Ta、Zr或Cr的碳化物。

构成本发明的分析用芯片的基板可利用各种制法进行制造。例如，材料为聚合物等时，可通过注塑成型法、热压印法(hotembossing)、在铸模内使其聚合的方法等进行成型。另外，材料为玻璃或陶瓷等无机物时，可采用喷砂法进行成型，为有机硅树脂时可采用公知的半导体技术等进行成型。

成型后的基板，在将选择结合性物质固定于其表面之前，可以根据需要实施各种表面处理。作为所述表面处理，具体可以举出例如在特开2004-264289号公报中记载的表面处理等。

本发明的分析用芯片可用作用于分析被检物质(样品)的分析用芯片。

在本发明中，所谓分析用芯片是指在该芯片上施加含有被检物质的溶液，用于测定被检物质是否存在、被检物质的量、或被检物质的性状等的芯片。具体可以举出通过固定于基板表面的选择结合性物质与被检物质的反应，测定被检物质的量、或被检物质的有无的生物芯片。更具体可以举出在基板表面固定有核酸的DNA芯片、在基板表面固定有以抗体为代表的蛋白质的蛋白质芯片、在基板表面固定有糖链的糖链芯片、及在基板表面固定有细胞的细胞芯片等。

在本发明中，所谓选择结合性物质是指可以与被检物质直接或间接地、选择地进行结合的各种物质。作为可以与基板表面结合的选择结合性物质的代表例，可以举出核酸、蛋白质、肽、糖类、脂质。

作为核酸，可以为DNA或RNA，也可以为PNA。具有特定的碱基序列的单链核酸，和具有与该碱基序列或其一部分互补的碱基序列的单链核酸选择地杂交，进行结合，因此相当于本发明中所谓的“选择结合性物质”。

核酸可以为来自活细胞等天然物的核酸，也可以为通过核酸合成装置合成得到的核酸。由活细胞制备DNA或RNA，可采用公知的方法进行，例如对于DNA的提取可采用Blin等的方法(Blin etal.，Nucleic Acids Res.3：2303(1976))等进行，另外对于RNA的提取可采用Favaloro等的方法(Favaloro et al.，MethodsEnzymol.65：718(1980))等进行。进而，作为被固定的核酸，也可以使用链状或环状的质粒DNA或染色体DNA、将其利用限制酶或化学方法切断所得的DNA片段、在试验管内利用酶等合成得到的DNA、或化学合成得到的寡核苷酸等。

另外，作为蛋白质，可以举出抗体及Fab片段及F(ab’)₂片段之类、抗体的抗原结合性片段以及各种抗原。由于抗体或其抗原结合性片段与对应的抗原选择地结合，抗原与对应的抗体选择地结合，因此相当于“选择结合性物质”。

作为糖类，除各种单糖之外，还可以举出寡糖及多糖等的糖链。

作为脂质，除了单纯脂质之外，也可以为复合脂质。

进而，也可以固定除上述核酸、蛋白质、糖类、脂质之外的具有抗原性的物质。另外，作为选择结合性物质，也可以在基板表面固定细胞。

作为上述选择结合性物质中的特别优选的物质，可以举出DNA、RNA、蛋白质、肽、糖、糖链或脂质。

本发明的分析用芯片进一步具有覆盖该基板的表面、与该基板粘合的覆盖构件。通过具有覆盖构件，可以简便地密封保持含有被检物质的溶液，结果，可以稳定地进行被检物质与固定在基板的区域(图3或图4中的12)的选择结合性物质之间的反应。另外，可以预先在本发明的分析用芯片中注入(容纳)微粒，能够容易地施加被检物质溶液。由于在施加被检物质溶液后的堵塞贯通孔的作业中胶带或密封剂也不与被检物质溶液接触，所以也具有背景噪声(Background noise)不升高的优点。

图6为表示除了上述基板之外还含有覆盖构件、粘合构件、贯通孔及液面休止用槽的本发明的分析用芯片的概略方案的例子的侧视图，图7为将图6的分析用芯片以沿着箭头A1的面切断所得的剖面图。在图7所示的例子中，基板1经粘合构件30被覆盖构件3覆盖，形成包括固定有选择结合性物质的区域12的空隙31。空隙31为除了经多个贯通孔32与外部连通之外，与外部不连通的密闭空间。

上述覆盖构件，覆盖上述基板的表面的至少一面的一部分，与其粘合，使基板与覆盖构件之间具有空隙。基板优选具有选择结合性物质，所述选择结合性物质被固定在其表面、且位于上述空隙内的区域上。即，优选上述覆盖构件与上述基板粘合，使固定有上述选择结合性物质的区域存在于该空隙内。上述覆盖构件只要能形成上述空隙即可，可以以任意方式进行粘合，但优选经双面胶带、树脂组合物等粘合构件进行粘合。

上述覆盖构件可以具有1个以上与上述空隙连通的贯通孔，优选具有多个贯通孔。更具体而言，相对于一个空隙优选具有多个贯通孔，其中通过形成3个至6个贯通孔可容易填充含有被检物质的溶液，故特别优选。需要说明的是，如下所述，空隙被分割为互不连通的多个空间时，优选每个空间具有多个、较优选含有3～6个贯通孔。覆盖构件具有多个贯通孔时，它们的孔径可以相同或不同，将多个贯通孔中的一个作为施加口、其他的贯通孔用作空气排出口时，从施加被检物质溶液的容易性及该溶液的密封保持性方面考虑，优选仅将施加口形成施加所需的宽孔径，将其他贯通孔形成较窄的孔径。具体而言，优选如上所述使施加口的贯通孔大小在直径0.01mm至2.0mm的范围内，使其他贯通孔的直径为0.01mm～1.0mm。

贯通孔32中的至少一个也可以形成如下结构：改变其直径，使上端具有直径较宽的部分、即所谓的液面休止用槽33。通过具有液面休止用槽，可以抑制从贯通孔32施加的填充到空隙31中的被检物质溶液的液面的上升，在用密封构件34(图12)密封贯通孔时能够容易且确实地进行密封，同时可以防止空气流入被检物质溶液中或被检物质溶液流出，所以优选。液面休止用槽的形状没有特别限定，可以制成圆柱形、棱柱形、圆锥形、角锥形、半球形、或与其近似的形状。其中，从制造的容易性及抑制被检物质溶液上升的效果的高低等观点考虑，特别优选圆柱形。

关于贯通孔的孔径大小没有特别限定，以组合圆柱形贯通孔32及液面休止用槽33的情况作为例子示出时，贯通孔32的孔径大小(直径)优选为0.01mm至2.0mm、较优选为0.3mm至1.0mm。通过使孔径为0.01mm以上，可以容易地施加被检物质溶液。另一方面，通过使贯通孔32的直径为1.5mm以下，可以更有效地抑制在施加后密封前的被检物质溶液的蒸发等。关于液面休止用槽33的孔径大小(直径)，优选为1.0mm以上。通过使其为1.0mm以上，可以使其与贯通孔32的大小的差异充分，可得到充分的液面休止效果，为优选方案。液面休止用槽33的直径的上限没有特别限定，可以设为10mm以下。另外，液面休止用槽33的深度，没有特别限定，可以在0.1mm～5mm的范围内。

上述覆盖构件优选可脱离地粘合在上述基板上。将本发明的分析用芯片用作DNA芯片时，通常必须用专用扫描器读取DNA芯片，但在粘合覆盖构件的状态下，难以设置在专用扫描器中，即使设置在专用扫描器中，在进行扫描操作时，有时覆盖构件与扫描器的光学类部件接触，导致故障。另外，即使经覆盖构件可以读取，所读取的值可能变得不正确。因此，优选覆盖构件可脱离，在读取工序中能取下覆盖构件。

将覆盖构件可脱离地粘合在基板上的方式没有特别限定，优选可以进行脱离且不损坏覆盖构件与基板的方式。例如，可以经双面胶带、树脂组合物等粘合构件进行粘合。

使用双面胶带作为粘合构件时，优选使用两面的粘合力不同的双面胶带，具体而言，优选将该双面胶带的粘合力弱的面与基板侧粘合、将粘合力强的面与覆盖构件侧粘合。通过采用上述方式，在剥离覆盖构件时，容易使双面胶带在粘合于覆盖构件的状态下同时从基板脱离，由此，可以避免由粘合构件残留在基板上所引起的读取工序中的不良情况。作为上述双面胶带，可以举出日东电工株式会社制的产品编号No.53SA、住友3M株式会社制产品编号9415PC及4591HL、以及株式会社寺冈制作所制产品编号No.7691等。

使用树脂组合物作为粘合构件时，作为该树脂组合物，可以使用含有选自丙烯酸类聚合物、有机硅类聚合物、及它们的混合物中的聚合物的树脂组合物等。通过利用上述树脂组合物，与双面胶带相比能提高密封性，同时与双面胶带相比，即使长期培养也很稳定，因此对于上述需要长期培养的分析体系来说特别优选。特别是，使用有机硅类的弹性体作为粘合构件时，密封性良好，并且能够以可以容易脱离的状态粘合覆盖物。作为上述弹性体，具体而言可以举出SILL GUARD(SILL GUARD为道康宁公司的注册商标)及信越化学工业公司制二液型RTV橡胶(装模用)。

上述覆盖构件的形状只要可以覆盖上述基板表面的至少一面的一部分、与基板粘合使基板与覆盖构件之间具有空隙即可，没有特别限定，在其外周部分，可以设置与离基板近的部分相比在离基板较远的部分中具有突出部分的结构，即悬空(overhang)结构。通过设置悬空结构，可以容易地脱离覆盖构件且不损伤基板，所以优选。

另外，在构成本发明的分析用芯片的、固定有选择结合性物质的基板上，具有由含有覆盖构件及任意粘合构件的结构所规定的空隙，但该空隙可以为一个空间，也可以为多个分割的空间。多个分割的空间例如可以通过如图8所示的分割结构进行设置。在图8所示的例子中，覆盖构件的凸部3A及基板1经粘合构件30A粘合，由此设置多个分割空间31。作为设置多个分割空间的其他例子，也可以设置例如如图9所示的分割结构。在图9所示的例子中，基板的凸部14及覆盖构件3经粘合构件30B粘合，由此设置多个分割空间31。另外，作为其他的例子，也可以在基板及覆盖构件中不特别设置用于设置分割结构的凸部，仅用粘合构件30A分割空隙，设置多个分割空间。在设置有多个分割空间的上述例子中，空间31不相互连通，各自分别具有一个以上的贯通孔32及液面休止用槽33。如上所述，通过设置多个分割空间，能够在1片分析用芯片中应用多种被检物质溶液，因此用1片分析用芯片可以同时测定多种被检物质。

本发明的分析用芯片，每一片基板可以具有一片覆盖构件，也可以具有二片以上的覆盖构件。具体而言如图10或图11所示，在一片基板1上，可以具有多个覆盖构件3B。多个覆盖构件3B可以分别经各自不同的粘合构件30C设置于基板1上。优选多个覆盖构件3B，与基板1之间均具有空隙31，且可以具有与各空隙相连通的一个以上的贯通孔，各覆盖构件3B可以具有各自的固定有选择结合性物质的区域12。通过采用所述方式，与上述具有多个分割空间的方式相同，可以得到用1片分析用芯片同时测定多种被检物质等效果。进而，通过采用上述方式，对于各个区域12可以使覆盖构件独立地脱离，因此例如可以独立使用，即分析一个区域12后使用其他的区域12进行分析。

作为构成本发明的分析用芯片的覆盖构件的材料，没有特别限定，应用被检物质溶液时，为了可以观察溶液状态，优选透明材料。作为上述材料，可以举出玻璃或塑料。特别是，从能容易地制作贯通孔及液面休止槽等结构方面考虑，可以优选使用聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯等透明树脂。覆盖构件的制作方法也没有特别限定，可以进行切削加工及利用注塑成型法进行加工。从能大量生产方面考虑，可优选使用注塑成型法。

在本发明的分析用芯片中，在附有覆盖构件的基板中注入(容纳)微粒的方法没有特别限定，可以举出如下方法：使用具有微粒可通过内部的管状、且具有可插入覆盖构件的贯通口的细管部的器具，将其插入覆盖构件的贯通口中使微粒通过该器具中注入空隙内的方法。作为此处使用的器具，例如可以使用吸管、吸管头(pipettetip)、柱、毛细管、管等。另外，也可以在贴附覆盖构件之前向基板的固定有选择结合性物质的区域(例如，图3的凹部10)中加入微粒，之后贴附覆盖构件。

在本发明的分析用芯片中，参照图12说明凹凸部、覆盖构件及微粒的关系的优选例子。在图12所示的例子中，DNA等选择结合性物质45被固定于基板1的凸部11的上面。微粒(此时为球状颗粒)2置于基板1的凹部的空隙内。选择结合性物质45及微粒2与含有被检物质的溶液(图中未示出)接触。被检物质溶液被保持在由基板1、粘合构件30及覆盖构件3所规定的空隙内。在图12的例子中，基板的凸部11上面与覆盖构件3之间的间隔的最短距离小于微粒2的直径。由此，微粒不能与凸部11上面接触，可以防止损坏凸部11上面上的选择结合性物质45。微粒例如为椭圆形等非球状的形状时，凸部上面与容器的最短距离小于微粒的最小径时，同样可以防止凸部11上面与微粒的接触，可以防止损坏选择结合性物质45。

上述本发明的分析用芯片可以用于多种被检物质的分析。即，使本发明的分析用芯片的固定有选择结合性物质的基板与被检物质接触，与该选择结合性物质选择地结合，测定经该选择结合性物质与基板结合的该被检物质的有无或量，由此可以分析被检物质。

作为可用于使用本发明的分析用芯片的测定方法的被检物质，可以举出应测定的核酸、例如，病原菌或病毒等的基因、或遗传病的致病基因等以及其中的一部分、具有抗原性的各种活体成分、病原菌或病毒等的抗体等，但并不限于这些。另外，作为含有上述被检物质的样品，可以举出血液、血清、血浆、尿、便、脑脊髓液、唾液、各种组织液等体液、或各种饮食品以及它们的稀释物等，但不限于此。另外，作为被检物质的核酸，可以对利用常用方法从血液或细胞提取得到的核酸进行标记，也可以为将该核酸作为模板，通过PCR等核酸扩增法进行扩增所得到的产物。为后者的情况下，可以大幅度地提高测定灵敏度。将核酸扩增产物作为被检物质时，在用荧光物质等标记的核苷三磷酸存在下进行扩增，由此可以标记扩增核酸。另外，被检物质为抗原或抗体时，可以利用常用方法直接标记作为被检物质的抗原或抗体，也可以使作为被检物质的抗原或抗体与选择结合性物质结合后，清洗基板，使其与同该抗原或抗体进行抗原抗体反应的经标记的抗体或抗原反应，测定与基板结合的标记。

在本发明的被检物质的分析方法中，首先，使被检物质与上述构成本发明的分析用芯片的固定有选择结合性物质的基板接触，使其选择性地结合。即，在基板上形成了将实施了上述标记、扩增等的被检物质溶解于水溶液或适当的缓冲液等中的溶液(在本说明书中有时称为“被检物质溶液”)，使其与基板接触。

与结合有选择结合性物质的基板接触，可以如下进行，将被检物质制成水溶液或适当的缓冲液等的溶液，通过吸管等常用的器具注入该基板的凹凸部中。

在将被检物质的溶液注入本发明的分析用芯片中使其与结合有选择结合性物质的基板接触之前，对该溶液进行脱气处理，由此可以有效地防止气泡产生，所以优选。作为脱气处理的方法，可以优选使用利用真空泵或吸气器形成减压状态进行脱气的方法、通过离心操作进行脱气的方法、超声波处理的方法、加热处理的方法等公知的方法。其中，使用吸气器或真空泵形成减压状态进行脱气的方法，作为容易且简便的方法较优选使用。此时脱气时的真空度只要为溶液不暴沸的程度即可，压力可以使用10hPa(百帕)～300hPa、优选使用20hPa～200hPa、较优选使用50hPa～100hPa。另外，进行脱气操作的时间优选为2分钟至1小时，较优选为3分钟至30分钟，更有选为5分钟至20分钟。

另外，利用本发明的分析用芯片时，可以从上述覆盖构件的贯通孔施加被检物质，在上述覆盖构件上贴附密封构件密封上述贯通孔，使上述被检物质选择性地与构成上述分析用芯片的上述基板结合。

从贯通孔施加被检物质，例如，可以用吸管等常用的器具从上述贯通孔注入。

对覆盖构件贴附密封构件，可以以密封贯通孔的一部分或全部、优选密封全部的方式进行。作为上述密封构件，例如可以优选举出Kapton(注册商标、东丽·杜邦公司制)等聚酰亚胺膜制、聚酯制、玻璃纸制或氯乙烯制的粘着胶带等挠性的胶带，但不限于此，也可以使用非挠性的板状的可粘合的任意的构件，还可以使用非定型的密封剂。从可以更良好地得到由液面休止用槽产生的本发明的效果的观点考虑，优选挠性的胶带及板状的构件，从操作的简便性等观点考虑，更有选挠性的胶带。使用胶带或板状构件作为密封构件时，其使用片数任意。具体而言，可以将覆盖构件上的全部贯通孔用一片密封构件密封，也可以使用多个密封构件分别密封多个贯通孔的一部分。另外，如上所述在一片基板上设置多个覆盖构件时，各个覆盖构件可以分别使用密封构件，也可以将多个覆盖构件上的贯通孔共用一片密封构件进行密封。通常情况下，每一片覆盖构件使用一片密封构件，由于能够简便且确实地实现密封，所以优选。

再次参照图12说明密封的具体例。在图12的例子中，通过贯通孔32施加被检物质溶液(图中未示出)后，作为密封构件贴附挠性的粘着胶带34，使其覆盖液面休止用槽33的整个面，密封贯通孔。通过上述方案，可以简便地进行密封且不会导致被检物质溶液泄露及测定误差。

在本发明的分析方法中，所谓选择性地结合，表示使选择结合性物质与被检物质相互作用，通过上述选择结合性物质使上述被检物质与固定有上述选择结合性物质的基板结合。为本发明的分析用芯片时，通过使上述芯片摇动、旋转，利用重量、振动、离心力使微粒在被检物质溶液中移动，因此可以效率良好地进行选择性结合。

进行选择结合时的反应温度及时间，可以根据杂交的被检物质的核酸的链长、及参与免疫反应的抗原及/或抗体的种类等适当地选择，在核酸杂交时，通常在40℃～70℃左右下反应1分钟～十几个小时，免疫反应时，通常在室温～50℃左右下反应1分钟～数小时左右。另外，根据需要可以使固定有选择结合性物质的基板摇动、旋转等，促进选择性结合。

本发明的分析用芯片，通过在杂交时使微粒移动，可以有效地搅拌被检物质液体。作为使微粒移动的方法，可以优选采用如下方法：使分析芯片旋转、沿着重力方向使微粒降落的方法；将含有微粒的分析芯片设置在振荡器中使基板振荡或摇动的方法；或使用磁性微粒利用磁力使微粒移动的方法，但优选使用将芯片设置在振荡器中，使其在水平面内回旋旋转的方法，其原因在于微粒的移动范围大、不偏离地进行移动，结果可以效率良好地搅拌液体。此时，回旋旋转的旋转数优选为10～1000转/分钟，较优选为100～500转/分钟。

选择性结合结束后，通常可以在脱离覆盖构件后，用于如下工序。

本发明的分析方法中，在上述选择性结合之后，测定经上述选择结合性物质结合在上述基板上的上述被检物质的质量。该测定也可以与现有的分析用芯片中的操作完全相同地进行。例如，关于进行适当荧光标记的、与选择结合性物质结合后的被检物质的质量，可以利用公知的扫描器等读取其荧光量，由此进行测定。

在本发明的分析方法中，作为选择结合性物质固定核酸时，可以测定具有与该核酸或其一部分互补的序列的核酸。另外，作为选择结合性物质固定抗体或抗原时，可以测定与该抗体或抗原进行免疫反应的抗原或抗体。需要说明的是，本说明书中的所谓“测定”包括检测与定量两种意思。

实施例

通过以下实施例进一步详细说明本发明。本发明不限于下述实施例。

实施例1

(1)分析用芯片的基板的制作

使用作为公知的方法的LIGA(Lithographie GalvanoformungAbformung)技术，制作注塑成型用的模，通过注射成型法得到具有下述形状的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)制的基板。使用的PMMA的平均分子量为5万，在PMMA中以1重量％的比例含有炭黑(三菱化学制#3050B)，将基板制成黑色。测定该黑色基板的光谱反射率和光谱透过率，结果光谱反射率在可见光区域(波长为400nm至800nm)中的任意波长下均为5％以下，另外，在相同范围的波长下，穿透率为0.5％以下。光谱反射率、光谱透过率在可见光区域中均无特定的光谱图(峰等)，光谱同样平坦。需要说明的是，光谱反射率是使用装载有符合JIS Z 8722的条件C的照明·受光光学系统的装置(Minolta camera制、CM-2002)，测定获得来自基板的正反射光时的光谱反射率。

作为基板，使用下述基板(以下称为“基板A”)，所述基板具有图3及图4所列举的形状，外形为长76mm、宽26mm、厚1mm，在基板的中央部设置有长39.4mm、宽19.0mm、深0.15mm的凹部(相当于图3的凹部10)，在该凹部中设置有9248处直径0.1mm、高0.15mm的凸部(相当于图3的凸部11)。在该基板A中，凸部(相当于图3的凸部11)上面与平坦部(相当于图3的凸部13)上面的高度差(凸部为其高度的平均值)为3μm以下。另外，凸部(相当于图3的凸部13)上面的高度的差异(最高的凸部上面的高度与最低的凸部上面之间的高度差)为3μm以下。另外，使凸部的间距(图4的L1；从凸部中央部到相邻的凸部中央部的距离)为0.5mm。

在70℃下将上述基板A在10N的氢氧化钠水溶液中浸渍12小时。将其依次用纯水、0.1N的HCl水溶液、纯水清洗，使基板表面生成羧基。

(2)选择结合性物质的固定

在基板A上，在下述条件下，作为各选择结合性物质(探针DNA)固定寡核苷酸。作为寡核苷酸，使用Operon公司制DNA微阵列用寡核苷酸单元“Homo sapiens(human)AROS V4.0(各60碱基)”。将该寡核苷酸溶解于纯水中使浓度为0.3nmol/μL，制成储备溶液。将该储备溶液在基板上进行点样(点滴)时，用PBS(将8g NaCl、2.9g Na₂HPO₄·12H₂O、0.2gKCl、及0.2gKH₂PO₄一并溶解于纯水中，混合为1L后加入盐酸调节至pH5.5)稀释10倍，使探针DNA的最终浓度为0.03nmol/μL，并且为了使在PMMA制基板表面生成的羧基与探针DNA的末端氨基缩合，加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)，使该最终浓度为50mg/mL。使用阵列仪(Arrayer)(点样器)(日本激光电子制；GeneStamp-II)，在基板A的全部凸部上面点样该溶液。然后，将点样后的基板装入密封后的塑料容器中，在37℃、湿度100％的条件下培养20小时左右。最后用纯水清洗基板，用旋转式干燥机(spindryer)进行离心并干燥。

(3)向分析用芯片基板贴附覆盖构件

如下所述，在固定有选择结合性物质的上述基板A中贴附覆盖构件。

作为覆盖构件，通过切削加工制作长41.4mm、宽21mm、厚1mm的PMMA平板，制成覆盖构件。如图7中的32、33所示，在制作得到的该覆盖构件中设置贯通孔及液面休止用槽。在长41.4mm、宽21mm的范围内使用宽1mm的双面胶带作为粘合构件，使此双面胶带与覆盖构件的边缘对齐，并且使其以50μm厚度层合进行贴附，然后将该覆盖构件贴附在基板A上。

(4)搅拌用微粒表面的表面活性剂涂布

将直径180μm的氧化锆制微粒(东丽(株)制)10g装入不锈钢制容器(10cm×10cm×5cm)中，向其中加入50ml 0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)水溶液作为表面活性剂。将其进行10分钟超声波处理后，除去上清液(SDS成分)，使用烘箱将微粒在70℃下干燥12小时。需要说明的是，测定处理前的微粒的表面粗糙度，结果表面的中心线平均粗糙度(Ra值)为165nm。微粒表面的Ra值的测定如下所述，将其表面用Au真空蒸镀后，用扫描型电子显微镜(株式会社elionix制，型式ESA-2000)进行测定。中心线平均粗糙度在观察倍数为10,000倍、加工余量为0的条件下，对任意10个样品进行测定，求出其平均值。

(5)向分析用芯片中注入(容纳)微粒及注入(容纳)操作性的评价

在上述(3)的贴附有覆盖构件的基板A中，将在上述(4)中涂布了表面活性剂的氧化锆制微粒120mg注入(容纳)由基板A和覆盖构件所形成的空隙(基板A表面的凹凸结构的凹部)中。从覆盖构件的贯通孔(图7或图12中所列举的贯通孔32)注入微粒。将如上所述得到的分析用芯片作为“分析用芯片1”。

此处，如下评价将微粒注入分析用芯片时的操作性。注入120mg微粒时，操作非常容易且注入所需时间小于3分钟时，将操作性评价为“A”，操作比较容易且注入所需时间为3分钟以上、小于5分钟时为“B”，操作困难或不容易导致在5分钟内未将全部微粒注入时评价为“C”。

分析用芯片1中的微粒的注入操作性为“A”(表1)。

(6)被检物质DNA的制备

作为被检物质，使用作为微阵列的被检物质常用的aRNA(反义RNA)。使用Ambion公司制aRNA制备试剂盒，由来自市售人培养细胞的total RNA(CLONTECH公司制Human Reference RNA)5μg，得到5μg的Cy3标记aRNA。

在本实施例及以下的实施例、比较例中，只要没有特别说明，杂交时的被检物质溶液，均使用将上述制备的标记aRNA用1重量％BSA、5×SSC、0.01重量％鲑鱼精子DNA、0.1重量％SDS的溶液(各浓度均为最终浓度)进行稀释后的产物。

(7)杂交反应与气泡产生数的评价

使用微型吸管，从贯通孔向分析用芯片1的基板A与覆盖构件的空隙(反应槽)中注入含有200ng Cy3标记aRNA的杂交被检物质溶液165μL。此时，可以容易地注入溶液，不会发生混入气泡的情况。作为密封材料使用Kapton胶带(as one)，堵塞4个贯通孔。使杂交槽(Takara Hybridization chamber(TaKaRa BIO(株)制)与片式振荡台(东京理化器械(株)制MMS FIT-S)密合进行固定，将分析用芯片1设置在杂交槽内。此时，向设置有分析用芯片1的位置的两端的凹处，各滴入15μL超纯水。关闭杂交槽盖以后，用6根固定螺丝进行固定，设置并固定在振荡机(东京理化器械(株)制MMS-310)上，所述振荡机安装在设定为42℃的恒温槽(东京理化器械(株)制FMS-1000)内。将恒温槽的前面用铝箔进行遮光，一边以250转/分钟进行旋转振荡一边在42℃下培养16小时。培养后，从杂交槽中取出分析用芯片1。

通过覆盖构件对在分析用芯片1的基板A上所观察到的被检物质溶液中的气泡数进行计数。将使用分析用芯片1的杂交反应进行10次，结果在被检物质溶液中产生的气泡数以每次的平均值计为4.5个(表1)。

(8)荧光信号值的测定与检测灵敏度差异的评价

脱离粘合在分析用芯片1的基板A上的覆盖构件与双面胶带之后，清洗、干燥基板A。在DNA芯片用扫描器(Axon Instruments公司制GenePix 4000B)中设置上述处理后的基板A，在激光输出功率33％、光电倍增管的电压设定为500的状态下，测定杂交反应后的被检物质的标记体信号值(荧光强度)、背景噪声。在全部9248个斑点中，将32个作为背景荧光值测定用阴性对照斑点，从各个信号值中减去背景信号值，算出各斑点的真实的信号值。

作为由杂交反应的反应差异引起的检测灵敏度差异的评价，如下进行：将使用分析用芯片1的杂交反应进行10次，计算各次的背景信号值的差异(CV值＝所有次数的背景信号值的标准差/所有次数的背景信号值的平均值(％))。结果，10次评价的背景信号值的差异(CV值)的平均值为8.4％(表1)。

实施例2

除了将在实施例1(6)中制备的被检物质溶液如下所述地进行脱气处理之外，与实施例1同样地实施使用分析用芯片1的评价。

将被检物质溶液175μl加入0.2ml PCR管(Ashisuto公司制72.737.002)中，在打开盖子的状态下置于脱气装置(ULVAC社制吸气器NDA-015型)中进行脱气。脱气时的极限压力在装置的显示中为50hPa，脱气时间为25分钟。

与实施例1(7)相同地，对在杂交反应后的基板上所观察到的被检物质溶液中的气泡数进行计数，实施6次后结果得到的每1次的气泡数平均值，为0.4个(表1)。

另外，与实施例1(8)相同地，计算背景信号值的差异(CV值)时，为6.7％(表1)。

比较例1

在实施例1中仅作如下改变，即对微粒不进行表面活性剂的涂布(实施例1(4))，直接使用氧化锆制微粒，制作“分析用芯片2”。使用该分析用芯片2，与实施例1同样地进行评价。

与实施例1(5)相同地评价微粒的注入操作性，结果向分析用芯片2中封入微粒困难，所需时间超过5分钟，因此操作性的评价为“C”(表1)。

该分析用芯片2，与实施例1(7)相同地对杂交反应后的被检物质溶液中产生的气泡数进行计数，结果实施24次后的气泡数平均值为13.0个(表1)。

另外，与实施例1(8)相同地，计算背景信号值的差异(CV值)，结果为12.1％(表1)。

比较例2

在实施例2中，除了使用在比较例1中制作的分析用芯片2代替分析用芯片1之外，与实施例2同样地操作，对被检物质溶液进行脱气处理，进行评价。

与实施例1(7)相同地，对杂交反应后的产生气泡数进行计数，结果3次评价的平均为9.0个(表1)。

另外，与实施例1(8)相同地，计算背景信号值的差异(CV值)，结果为10.5％(表1)。

实施例3

在实施例1(4)中，使用去氧胆酸钠(阴离子表面活性剂的1种)代替十二烷基硫酸钠(SDS)作为表面活性剂，以相同的步骤注入120mg经表面活性剂涂布处理的微粒，制作“分析用芯片3”。使用该分析用芯片3，与实施例2同样地对被检物质溶液进行脱气处理，进行评价。

与实施例1(5)相同地评价微粒的注入操作性，结果由于实施10次后所需时间平均值为3分钟以上5分钟以内，故向分析用芯片3中封入微粒的操作性评价为“B”(表2)。

该分析用芯片3，与实施例1(7)相同地在杂交反应后对被检物质溶液中产生的气泡数进行计数，结果实施10次后的气泡数平均值为0.6个(表2)。

另外，与实施例1(8)相同地计算背景信号值的差异(CV值)，结果为7.2％(表1)。

实施例4

在实施例1(4)中，使用Pluronic F-68(非离子表面活性剂的1种)代替十二烷基硫酸钠(SDS)作为表面活性剂，按照下述步骤使用经表面活性剂涂布处理的微粒制作“分析用芯片4”。即，按照与实施例1(4)同样的步骤对氧化锆制微粒进行处理后，进一步用400mL去离子水(Milli-Q水)清洗1次，在70℃下干燥4小时。将120mg该微粒注入分析用芯片中，制作分析用芯片4。

与实施例1(5)相同地，对向分析用芯片4中注入该微粒的操作性进行10次评价，结果所需时间均在3分钟以内。因此，操作性评价为“A”(表2)。

与实施例2相同地，将165μL脱气处理后的被检物质溶液应用于分析用芯片4中，与实施例1(7)相同地进行杂交反应。对被检物质溶液中产生的气泡数进行计数，结果6次评价的平均值为1.2个(表2)。

另外，与实施例1(8)相同地，计算背景信号值的差异(CV值)，结果为8.4％(表2)。

实施例5

在实施例1(4)中，使用Pluronic F 127(非离子表面活性剂的1种)代替十二烷基硫酸钠(SDS)作为表面活性剂，按以下步骤使用经表面活性剂涂布处理的微粒制作“分析用芯片5”。即，按照与实施例1(4)同样的步骤对氧化锆制微粒进行处理后，进一步用400mL去离子水(Milli-Q水)清洗1次，在70℃下干燥4小时。将120mg该微粒注入分析用芯片中，制作分析用芯片5。

与实施例1(5)相同地对注入该微粒的操作性评价10次，结果所需时间均在3分钟以内。因此，操作性评价为“A”(表2)。

将与实施例2相同地进行了脱气处理的被检物质溶液165μL应用于分析用芯片5中，与实施例1(7)相同地进行杂交反应。对在被检物质溶液中产生的气泡数进行计数，结果6次评价的平均值为1.8个(表2)。

另外，与实施例1(8)相同地计算背景信号值的差异(CV值)，结果为为7.6％(表2)。

实施例6

在实施例1(4)中，使用TritonX-100(非离子表面活性剂的1种)代替十二烷基硫酸钠(SDS)作为表面活性剂，按以下的步骤使用经表面活性剂涂布处理的微粒制作“分析用芯片6”。即，按与实施例1(4)同样的步骤对氧化锆制微粒进行处理后，进一步在400mL去离子水(Milli-Q水)中进行30秒钟超声波清洗，在70℃下干燥4小时。将120mg该微粒注入分析用芯片中制作分析用芯片6。

与实施例1(5)相同地对注入该微粒的操作性评价10次，结果所需时间为，7片在3分钟以内、3片在3分钟以上5分钟以内。因此，操作性评价为“B”(表2)。

将与实施例2相同地进行了脱气处理的被检物质溶液165μL应用于分析用芯片6中，与实施例1(7)相同地进行杂交反应。对在被检物质溶液中产生的气泡数进行计数，结果6次评价的平均值为2.1个(表2)。

另外，与实施例1(8)相同地计算背景信号值的差异(CV值)，结果为8.3％(表2)。

实施例7

在实施例1(4)中，使用Tween20(非离子表面活性剂的1种)代替十二烷基硫酸钠(SDS)作为表面活性剂，按以下步骤使用经表面活性剂涂布处理的微粒制作“分析用芯片7”。即，按与实施例1(4)同样的步骤对氧化锆制微粒进行处理后，进一步用400mL去离子水(Milli-Q水)清洗1次，在70℃下干燥4小时。将120mg该微粒注入分析用芯片中制作分析用芯片7。

与实施例1(5)相同地对注入该微粒的操作性评价10次，结果所需时间为，6片在3分钟以内，4片在3分钟以上5分钟以内。因此，操作性评价为“B”(表2)。

将与实施例2相同地进行了脱气处理的被检物质溶液165μL应用于分析用芯片7中，与实施例1(7)相同地进行杂交反应。对在被检物质溶液中产生的气泡数进行计数，结果6次评价的平均值为2.2个(表2)。

另外，与实施例1(8)相同地计算背景信号值的差异(CV值)，结果为7.0％(表2)。

实施例8

在实施例1(4)中，使用3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-2-羟基丙磺酸(CHAPSO；两性离子表面活性剂的1种)代替十二烷基硫酸钠(SDS)作为表面活性剂，按以下步骤使用经表面活性剂涂布处理的微粒制作“分析用芯片8”。即，按与实施例1(4)同样的步骤对氧化锆制微粒进行处理后，进一步用400mL去离子水(Milli-Q水)清洗1次，在70℃下干燥4小时。将120mg该微粒注入分析用芯片中制作分析用芯片8。

与实施例1(5)相同地对注入微粒的操作性评价10次，结果所需时间为，8片在3分钟以内、2片在3分钟以上5分钟以内。因此，操作性评价为“B”(表2)。

将与实施例2相同地进行了脱气处理的被检物质溶液165μL应用于分析用芯片8中，与实施例1(7)相同地进行杂交反应。对在被检物质溶液中产生的气泡数进行计数，结果6次评价的平均值为2.5个(表2)。

另外，与实施例1(8)相同地计算背景信号值的差异(CV值)，结果为7.6％(表2)。

实施例9

在实施例1(4)中，使用十六烷基三甲基溴化铵(Cetyltrimethylammonium Bromide、CTAB；阳离子表面活性剂的1种)代替十二烷基硫酸钠(SDS)作为表面活性剂，按以下步骤使用经表面活性剂涂布处理的微粒制作“分析用芯片9”。即，按与实施例1(4)同样的步骤对氧化锆制微粒进行处理后，进一步用400mL去离子水(Milli-Q水)清洗1次，在70℃下干燥4小时。将120mg该微粒注入分析用芯片中制作分析用芯片9。

与实施例1(5)相同地对注入该微粒的操作性评价10次，结果所需时间为，7片在3分钟以内、3片在3分钟以上5分钟以内。因此，操作性评价为“B”(表2)。

将与实施例2相同地进行了脱气处理的被检物质溶液165μL应用于分析用芯片9中，与实施例1(7)同样地进行杂交反应。对在被检物质溶液中产生的气泡数进行计数，结果6次评价的平均值为3.0个。

另外，与实施例1(8)相同地计算背景信号值的差异(CV值)，结果为7.9％(表2)。

实施例10

在实施例1(1)中，使用“基板B”代替基板A作为分析用芯片的基板，所述“基板B”为在基板的中央部仅设置有长39.4mm、宽19.0mm、深0.05mm的凹部的基板(在图3及图4所列举的形状的基板中，无凸部11)。另外，实施例1(2)的选择结合性物质的固定如下进行，在凹部底面上，在上下39.4mm、宽19.0mm的方形中，以与基板A同样的间隔点样9248个。

进而，作为实施例1(3)的覆盖构件，通过切削加工制作长41.4mm、宽21mm、厚1mm的PMMA平板进行使用。在制作得到的该覆盖构件中，如图7的32、33所示设置贯通孔及液面休止用槽。在长41.4mm、宽21mm的范围内使用宽1mm的双面胶带作为粘合构件，使此双面胶带与覆盖构件的边缘对齐，并且使其以50μm厚度层合进行贴附，将该覆盖构件贴附于基板B上。

除此之外，按照与实施例1的(1)～(4)相同的步骤，制作“分析用芯片10”，其中注入了120mg涂布十二烷基硫酸钠(SDS)作为表面活性剂的氧化锆制微粒。

与实施例1(5)相同地，对注入微粒的操作性评价10次，结果所需时间均在3分钟以上5分钟以内。因此，操作性评价为“B”(表3)。

将与实施例2相同地进行了脱气处理的被检物质溶液165μL应用于分析用芯片10中，与实施例1(7)相同地进行杂交反应。对在被检物质溶液中产生的气泡数进行计数，结果6次评价的平均值为0.5个(表3)。

另外，与实施例1(8)相同地计算背景信号值的差异(CV值)，结果为9.5％(表3)。

实施例11

在实施例1(1)中，使用“基板C”代替基板A作为分析用芯片的基板，所述“基板C”为凹部及凸部均未设置的平板(在图3及图4所示的形状的基板上，不具有凹部10及凸部11)。另外，实施例1(2)的选择结合性物质的固定如下进行，在基板C的平面上面，在具有上下39.4mm、左右19.0mm的间隔的方形中，以与基板A相同的间隔点样9248个。

进而，作为实施例1(3)的覆盖构件，通过切削加工制作长41.4mm、宽21mm、厚1mm的PMMA平板进行使用。在制作得到的该覆盖构件中，如图7中的32、33所示设置贯通孔及液面休止用槽。在长41.4mm、宽21mm的范围内使用宽1mm的双面胶带作为粘合构件，使此双面胶带与覆盖构件的边缘对齐，并且使其以200μm厚度层合进行贴附，之后将该覆盖构件贴附于基板C上。

除此之外，按照与实施例1中的(1)～(4)相同的步骤，制作“分析用芯片11”，其中注入120mg涂布有十二烷基硫酸钠(SDS)作为表面活性剂的氧化锆制微粒。

与实施例1(5)相同地，将注入微粒的操作性评价10次，结果所需时间为，7片在3分钟以内、3片在3分钟以上5分钟以内。因此，操作性评价为“B”(表3)。

将与实施例2相同地进行了脱气处理的被检物质溶液165μL应用于分析用芯片11中，与实施例1(7)相同地进行杂交反应。对在被检物质溶液中产生的气泡数进行计数，结果6次评价的平均值为0.6个(表3)。

另外，与实施例1(8)相同地计算背景信号值的差异(CV值)，结果为9.3％(表3)。

实施例12

在实施例1(4)中，作为微粒，使用直径200μm的铁制微粒(三昌研磨株式会社制)代替直径180μm的氧化锆制微粒，与实施例1(4)相同地注入120mg经涂布十二烷基硫酸钠(SDS)作为表面活性剂的处理的微粒，制作“分析用芯片12”。

与实施例1(5)相同地，将注入微粒的操作性评价10次，结果所需时间均在3分钟以上5分钟以内。因此，操作性评价为“B”(表3)。

将与实施例2相同地进行了脱气处理的被检物质溶液应用于分析用芯片12中，与实施例1(7)相同地进行杂交反应。对在被检物质溶液中产生的气泡数进行计数，结果6次评价的平均值为2.2个(表3)。

另外，与实施例1(8)相同地计算背景信号值的差异(CV值)，结果为8.0％(表3)。

比较例3

在实施例12中，不进行表面活性剂的涂布处理(实施例1(4))直接使用直径200m的铁制微粒作为微粒，除此之外与实施例12相同地制作“分析用芯片13”。使用该分析用芯片13，与实施例1相同地进行评价。

与实施例1(5)相同地将注入微粒的操作性评价10次，结果注入操作困难，所需时间均超过5分钟。因此，操作性评价为“C”(表3)。

将与实施例2相同地进行了脱气处理的被检物质溶液应用于分析用芯片13中，与实施例1(7)相同地进行杂交反应。对在被检物质溶液中产生的气泡数进行计数，结果6次评价的平均值为10.0个(表3)。

另外，与实施例1(8)相同地计算背景信号值的差异(CV值)，结果为13.3％(表3)。

实施例13

在实施例1(4)中，作为微粒，使用直径200μm的玻璃制微粒(株式会社Biomedical Science制)代替直径180μm的氧化锆制微粒，与实施例1(4)相同地注入120mg经涂布十二烷基硫酸钠(SDS)作为表面活性剂的处理的微粒，制作“分析用芯片14”。

与实施例1(5)相同地将注入微粒的操作性评价10次，结果所需时间均为3分钟以上5分钟以内。因此，操作性评价为“B”(表3)。

将与实施例2相同地进行了脱气处理的被检物质溶液应用于分析用芯片14中，与实施例1(7)相同地进行杂交反应。对在被检物质溶液中产生的气泡数进行计数，结果6次评价的平均值为1.0个(表3)。

另外，与实施例1(8)相同地计算背景信号值的差异(CV值)，结果为8.2％(表3)。

比较例4

在实施例13中，不进行表面活性剂的涂布处理(实施例1(4))，直接使用直径200m的玻璃制微粒作为微粒，除此之外与实施例13相同地制作“分析用芯片15”。使用该分析用芯片15，与实施例1相同地进行评价。

与实施例1(5)相同地将注入微粒的操作性评价10次，结果注入操作困难，所需时间均超过5分钟。因此，操作性的评价为“C”(表3)。

将与实施例2相同地进行了脱气处理的被检物质溶液应用于分析用芯片15中，与实施例1(7)相同地进行杂交反应。对在被检物质溶液中产生的气泡数进行计数，结果6次评价的平均值为8.8个(表3)。

另外，与实施例1(5)相同地计算背景信号值的差异(CV值)，结果为12.9％(表3)。

[表1]

[表2]

[表3]

由以上实施例1～13、比较例1～4的结果可知，通过将微粒表面用表面活性剂涂布，可以抑制气泡产生，降低数据的偏差(背景信号的CV值)，能够提高向分析用芯片中注入微粒时的操作性，另外通过与被检物质溶液的脱气处理组合可以进一步有效地抑制气泡的产生。

产业上的可利用性

本发明的分析用芯片具有固定有与被检物质选择性结合的选择结合性物质的基板，通过微粒可以搅拌被检物质溶液，该分析用芯片能够抑制检测灵敏度差异，高灵敏度地进行检测。本发明作为药物·医疗领域中用于各种生物体相关物质的检测等的分析用芯片特别有用，此外，作为食品、环境领域中用于微量物质检测的分析用芯片也有用。

Claims (8)

1.一种分析用芯片，所述分析用芯片具有在表面固定有选择结合性物质的基板、和与所述基板粘合的覆盖构件，在所述基板与所述覆盖构件之间具有空隙，在所述空隙中容纳或注入有可移动的微粒，在所述微粒表面涂布有表面活性剂，在微粒表面涂布的表面活性剂为阴离子表面活性剂或非离子表面活性剂。

2.如权利要求1所述的分析用芯片，其中，所述基板在其表面上具有由凹部及凸部构成的凹凸部，在所述凸部的上端面固定有选择结合性物质。

3.如权利要求1或2所述的分析用芯片，其中，涂布有表面活性剂的微粒的材料包括陶瓷。

4.如权利要求1～3中任一项所述的分析用芯片，其中，所述覆盖构件具有1个以上与所述空隙连通的贯通孔。

5.如权利要求1～4中任一项所述的分析用芯片，其中，所述基板的固定有选择结合性物质的面与覆盖构件之间的间隔的最短距离小于微粒的直径。

6.如权利要求1～5中任一项所述的分析用芯片，其中，所述选择结合性物质为DNA、RNA、蛋白质、肽、糖、糖链或脂质。

7.一种被检物质的分析方法，所述分析方法使含有被检物质的溶液接触权利要求1～5中任一项所述的分析用芯片，使所述被检物质选择性地结合在被固定在所述基板表面上的选择结合性物质上，测定通过所述选择结合性物质结合在分析用芯片上的所述被检物质的量。

8.如权利要求7所述的被检物质的分析方法，其中，使所述分析用芯片接触所述含有被检物质的溶液之前，将含有被检物质的溶液进行脱气处理。